CN102735512B - 一种从南极磷虾中提取生物素的方法及高效薄层扫描分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从南极磷虾中提取生物素的方法及高效薄层扫描分析方法：用二甲基甲酰胺从南极磷虾中提取生物素，经离心除杂和浓缩制备样品液，同生物素标准品液采用外标一点法，在涂有硅胶GF254高效薄层板上展开，展开剂为按比例配制的二氯甲烷、异丙醇、甲醇和冰乙酸的混合液。展完后的展板，用染色液喷雾染色。将板放进通风橱5分钟后，喷上10%的石蜡氯仿溶液。以530nm吸收波长进行薄层扫描，计算得到南极磷虾中的生物素含量。方法简单、准确、快速、可靠、稳定。
Description
技术领域
本发明涉及一种从南极磷虾中提取生物素的方法及高效薄层扫描分析方法。
背景技术
南极磷虾（学名Euphausia superba），又名大磷虾或南极大磷虾，是一种生活在南极洲水域的磷虾。南极磷虾是似虾的无脊椎动物，并以群集方式生活，有时密度达到每立方米10,000—30,000只。它们以微小的浮游植物作为食物，它们长成约6厘米长，2克重，有6年的寿命。它们是南极生态系统的关键物种，若以生物质能来说，它们可能是地球上最成功的动物物种（大约共有5-50亿吨，因估量方法不同有较大差异）。因南极磷虾蕴藏量巨大，加上群体的生活容易捕捞，所以吸引很多国家对它进行开发。目前，南极磷虾用于虾油生产和作为鱼的饲料。
过去有人检测生物体中生物素含量的方法有微生物法、高效液相色谱法、气相色谱法、ELISA法和荧光法等等，其中微生物法和高效液相色谱法是最常用的方法。微生物方法操作麻烦和耗时（检测一个样品需2～3天的时间），而高效液相方法投资大、溶剂用量大、成本较高。高效薄层色谱法是南极磷虾中生物素提取，快速，准确，可靠的检测方法。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种从南极磷虾中提取生物素的方法及检测生物素的高效薄层扫描分析方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种从南极磷虾中提取生物素的方法，步骤如下：
（1）取1公斤冷冻的南极磷虾，在40～60℃烘干，然后加入3～9升的氯仿，在常温下搅拌提取1～3次，每次时间为30～60分钟，过滤得处理虾粉；
（2）将上述得到的处理虾粉按虾粉（W）：二甲基甲酰胺（V）=1g：25～40ml的比例加入二甲基甲酰胺，在75～95℃水浴上搅拌提取1～2小时，得提取液；
（3）上述得到的提取液在10,000rpm下离心10分钟，取上清液，向上清液中加入等体积量的乙醇，50～65℃下旋转蒸发浓缩，得浓缩液，即为含有生物素的样品液，干燥后即得含有生物素的粉末状物质。
一种检测生物素的高效薄层扫描分析方法，步骤如下：
（1）取待检测样品液（即上述方法制备得到的浓缩液）4μl，点在涂有硅胶GF254高效薄层板（10cm×10cm）上，以体积比二氯甲烷：异丙醇：甲醇：冰乙酸=1～3：1～3：2～3：0.01～0.15作为展开剂，在展开缸（10cm×12cm×15cm）内展开，展距为6cm，并采用外标一点法点1μl（0.19,0.3,0.66,1.28,3.31mg/ml）生物素标准品溶液，同时展开，展开的时间为40分钟，展开的距离为6cm，然后晾干；
（2）将2,4-二甲氨基肉桂醛、浓硫酸和无水乙醇混合，配成染色液，其中2,4-二甲氨基肉桂醛终浓度为0.1～0.2%（质量体积分数，单位g/ml），硫酸终浓度为10～20%（质量体积分数，单位g/ml）；展完后晾干的展板，用染色液喷雾染色，将板放进通风橱5分钟后，喷上10%的石蜡氯仿溶液（质量体积分数，单位g/ml），这样可以增加检测灵敏度，可得到与背景对比明显的标准品的斑点和样品的斑点，其Rf=0.50；冷却后放入Camag薄层扫描仪-Ⅲ扫描，扫描波长为530nm，通过检测样品和标准品对紫外线的吸光度计算得到生物素的含量。
计算生物素含量时，还需要做以下辅助工作：绘制标准曲线：
取Sigma公司销售的生物素标准品溶解于二甲基甲酰胺，其浓度分别为0.19,0.3,0.66,1.28,3.31mg/ml，在高效薄层板上各点1μl，用Camag薄层扫描仪3，以530nm的吸收波长扫描，经扫描仪的软件Wincats 1.4.1统计，得到的线性方程y=5801.1051+13.5261x。相关系数r=0.99984，RSD=1.67%。
本发明的检测生物素的高效薄层扫描分析方法，其精确度、板内变异、板间变异、加样回收率等情况如下：
1.精确度的测定
制备1.28mg/ml生物素标准溶液，在同一块高效薄层板上点四个点，每点为1μl，分别在0，2，4和6小时扫描测量，证明了4小时后才稳定，如表1所示。
2.板内变异和板间变异
在板上分别滴1μl即1.28mg/ml和3.31mg/ml标准品溶液每隔12小时扫描定量，共测定2天。测得板内变异分别为0.87，0.54，0.75和0.49%，而板间变异分别为0.70，1.22，0.29和0.73%，如表2所示。
3.加样回收率
向提取配制的样品液中，加50,100和150%的生物素标准品，其加样平均回收率为99.58%，如表3所示。
表1精确度
表2板内变异和板间变异
表3加样回收率
本发明利用了二甲基甲酰胺对生物素良好的溶解性，改进了传统的热水提取法，从而减少了杂质对检测生物素的干扰，得到了一个很好的分离和检测的效果。以二氯甲烷、异丙醇、甲醇和冰乙酸按本发明的配比混合而成的展开剂，使样品液中的生物素和其他成分分离清楚，斑点圆、标准品点和样品点准确对应，Rf值相同，是南极磷虾中生物素展开分离的良好配方。2,4-二甲氨基肉桂醛作为染色剂，可以让斑点和背景对比明显达到定性的目的，还可以让生物素产生530nm的吸收波长，从而解决了生物素对紫外吸收不灵敏的现象。染色后喷上10%的石蜡氯仿溶液，可以增加检测灵敏度。该检测方法简单、快速、准确、可靠、稳定。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1：
将冷冻的南极磷虾在40℃烘干，然后按虾粉（W）：氯仿（V）=1：3（g：ml）的比例，在常温下搅拌提取1次，时间为30分钟，之后进行过滤。称取已处理的南极磷虾粉1克，加入25ml二甲基甲酰胺，在水浴槽进行搅拌提取，温度在75℃，时间为1小时。将提取液在高速离心机（10,000rpm）分离，离心时间为10分钟，取出上清液加入等量的乙醇，在50℃下旋转蒸发浓缩。将浓缩的提取液点（即样品液）4μl点在涂有硅胶GF254高效薄层板（10cmX10cm）上，并采用外标一点法点生物素标准品为1μI（0.19,0.3,0.66,1.28,3.31mg/ml）。展开剂为二氯甲烷（v）：异丙醇（v）：甲醇（v）：冰乙酸（v）=1：1：2：0.01，在10cmX12cmX15cm展开缸内展开，展距6cm，展开时间为40分钟。展开后先把板晾干。将2,4-二甲氨基肉桂醛、浓硫酸和无水乙醇混合，配成染色液，其中2,4-二甲氨基肉桂醛终浓度为0.1%，硫酸终浓度为10%。展完后的展板，用染色液喷雾染色。将板放进通风橱5分钟后，喷上10%的石蜡氯仿溶液。Rf值为0.50。冷却后放入Camag薄层扫描仪3扫描，扫描波长为530nm。经检测和计算得南极磷虾生物素含量为1.1310mg/g。
实施例2：
将冷冻的南极磷虾在50℃烘干，然后按虾粉（W）：氯仿（V）=1：7的比例，在常温下搅拌提取2次，每次时间为40分钟，之后进行过滤。称取已处理的南极磷虾粉1克，加入35ml的二甲基甲酰胺，在水浴槽进行搅拌提取，温度在85℃，时间为1.5小时。将提取液在高速离心机（10,000rpm）分离，离心时间为10分钟，取出上清液加入等量的乙醇，在55℃下旋转蒸发浓缩。将浓缩的提取液点（即样品液）4μl点在涂有硅胶GF254高效薄层板（10cmX10cm）上，并采用外标一点法点生物素标准品为1μI（0.19,0.3,0.66,1.28,3.31mg/ml）。展开剂为二氯甲烷（v）：异丙醇（v）：甲醇（v）：冰乙酸（v）=2：2：2.5：0.1，在10cmX12cmX15cm展开缸内展开，展距6cm，展开时间为40分钟。展开后先把板晾干。将2,4-二甲氨基肉桂醛、浓硫酸和无水乙醇混合，配成染色液，其中2,4-二甲氨基肉桂醛终浓度为0.15%，硫酸终浓度为15%。展完后的展板，用染色液喷雾染色。将板放进通风橱5分钟后，喷上10%的石蜡氯仿溶液。Rf值为0.50。冷却后放入Camag薄层扫描仪3扫描，扫描波长为530nm。经检测和计算得南极磷虾生物素含量为1.1315mg/g。
实施例3：
将冷冻的南极磷虾在60℃烘干，然后按虾粉（W）：氯仿（V）=1：9的比例，在常温下搅拌提取3次，每次时间为60分钟，之后进行过滤。称取已处理的南极磷虾粉1克，加入40ml的二甲基甲酰胺，在水浴槽进行搅拌提取，温度在95℃，时间为2小时。将提取液在高速离心机（10,000rpm）分离，离心时间为10分钟，取出上清液加入等量的乙醇，在65℃下旋转蒸发浓缩。将浓缩的提取液点（即样品液）4μl点在涂有硅胶GF254高效薄层板（10cmX10cm）上，并采用外标一点法点生物素标准品为1I（0.19,0.3,0.66,1.28,3.31mg/ml）。展开剂为二氯甲烷（v）：异丙醇（v）：甲醇（v）：冰乙酸（v）=3：3：3：0.15，在10cmX12cmX15cm展开缸内展开，展距6cm，展开时间为40分钟。展开后先把板晾干。将2,4-二甲氨基肉桂醛、浓硫酸和无水乙醇混合，配成染色液，其中2,4-二甲氨基肉桂醛终浓度为0.2%，硫酸终浓度为20%。展完后的展板，用染色液喷雾染色。将板放进通风橱5分钟后，喷上10%的石蜡氯仿溶液。Rf值为0.50。冷却后放入Camag薄层扫描仪3扫描，扫描波长为530nm。经检测和计算得南极磷虾生物素含量为1.1320mg/g。
Claims (1)
1.一种检测生物素的高效薄层扫描分析方法，其特征在于：步骤如下：
(1)取待检测样品液4μL，点在涂有硅胶GF254高效薄层板上，以体积比二氯甲烷：异丙醇：甲醇：冰乙酸＝1～3：1～3：2～3：0.01～0.15作为展开剂，在展开缸内展开，展距为6cm，并采用外标一点法点1μL生物素标准品溶液，同时展开，展开的时间为40分钟，展开的距离为6cm，然后晾干；
(2)将2,4-二甲氨基肉桂醛、浓硫酸和无水乙醇混合，配成染色液，其中2,4-二甲氨基肉桂醛终浓度为0.1～0.2％，硫酸终浓度为10～20％；展完后晾干的展板，用染色液喷雾染色，将板放进通风橱5分钟后，喷上10％的石蜡氯仿溶液；冷却后放入Camag薄层扫描仪-Ⅲ扫描，扫描波长为530nm，通过检测样品和标准品对紫外线的吸光度并计算得到生物素的含量；
步骤(1)中，生物素标准品溶液的浓度分别为0.19mg/mL、0.3mg/mL、0.66mg/mL、1.28mg/mL和3.31mg/mL；
所述样品液是通过以下方法制备得到的：
(1)取1公斤冷冻的南极磷虾，在40～60℃烘干，然后加入3～9升的氯仿，在常温下搅拌提取1～3次，每次时间为30～60分钟，过滤得处理虾粉；
(2)将上述得到的处理虾粉按虾粉：二甲基甲酰胺＝1g：25～40mL的比例加入二甲基甲酰胺，在75～95℃水浴上搅拌提取1～2小时，得提取液；
(3)上述得到的提取液在10,000rpm下离心10分钟，取上清液，向上清液中加入等体积量的乙醇，50～65℃下旋转蒸发浓缩，得浓缩液，即为含有生物素的样品液。
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