CN107727777B - 一种从南极磷虾中提取β-蜕皮激素的方法及高效薄层层析扫描检测方法 - Google Patents

一种从南极磷虾中提取β-蜕皮激素的方法及高效薄层层析扫描检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107727777B
CN107727777B CN201711262716.9A CN201711262716A CN107727777B CN 107727777 B CN107727777 B CN 107727777B CN 201711262716 A CN201711262716 A CN 201711262716A CN 107727777 B CN107727777 B CN 107727777B
Authority
CN
China
Prior art keywords
ecdysone
solution
detection method
scanning
standard
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201711262716.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107727777A (zh
Inventor
韩香凝
刘代成
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shandong Normal University
Original Assignee
Shandong Normal University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shandong Normal University filed Critical Shandong Normal University
Priority to CN201711262716.9A priority Critical patent/CN107727777B/zh
Publication of CN107727777A publication Critical patent/CN107727777A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107727777B publication Critical patent/CN107727777B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G01N30/14—Preparation by elimination of some components
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/90—Plate chromatography, e.g. thin layer or paper chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/90—Plate chromatography, e.g. thin layer or paper chromatography
    • G01N30/94—Development

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Sampling And Sample Adjustment (AREA)

Abstract

本发明公开了一种从南极磷虾中提取β‑蜕皮激素的方法及高效薄层层析扫描检测方法，属于蜕皮激素类物质的提取分离技术领域。本发明用甲醇作为提取南极磷虾中β‑蜕皮激素的提取溶剂，用DMF作为复溶溶剂，用该方法提取南极磷虾中的β‑蜕皮激素，提取完全，效率高，且提取过程简单、快速，能除去影响检测的杂质；利用高效薄层层析扫描检测方法分析南极磷虾β‑蜕皮激素的含量，自动化程度高，灵敏性强，且需要较少的试剂，分析过程快速，结果准确性高，对环境有很好的保护作用的同时达到快速、准确的检测目的。本发明首次建立一种针对南极磷虾的β‑蜕皮激素的提取方法及有效的检测分析方法，扩展了南极磷虾的开发利用价值。

Description

一种从南极磷虾中提取β-蜕皮激素的方法及高效薄层层析扫 描检测方法
技术领域
本发明属于食品和化工技术领域，涉及蜕皮激素类物质的提取分离技术领域，尤其是涉及一种从南极磷虾中提取β-蜕皮激素的方法及高效薄层层析扫描检测方法。
背景技术
β-蜕皮激素，又名β-蜕皮甾酮、20-羟基蜕皮甾酮；分子式为C27H44O7，分子量为480.63道尔顿，是一种淡黄色结晶粉末。在动植物体内，β-蜕皮激素参与蜕皮、生殖、寿命、滞育及免疫应答等众多方面的调节，对维持基本的生理功能具有重要作用。β-蜕皮激素作用于人体可以促进细胞的生长分裂，加速胶原蛋白的合成，刺激真皮细胞分裂，促进皮肤再生。同时大量的动物实验证明，β-蜕皮激素能够排除体内胆固醇，促进蛋白质、碳水化合物、脂质代谢，具有显著的降血脂和降血糖的功效，能够保护神经系统、肝脏和心血管系统，促进伤口愈合，延缓衰老，是一种重要的天然抗癌制剂。
南极磷虾(Euphausia superba)，主要生活在南极洲的南冰洋水域，是南极洲生态系统的重点物种，为鲸鱼、海豹、企鹅等提供了重要的食物来源。南极磷虾储量巨大，并多以群居方式生活，易采集捕捞。南极磷虾含有丰富的脂类和高质量的蛋白质，具有巨大的应用价值。目前，对于南极磷虾的应用主要集中于作为鱼类饵料以及加工磷虾油保健产品。因此，若以南极磷虾为原料，提取β-蜕皮激素，对于增加其利用价值，具有广阔的应用前景。
目前对于β-蜕皮激素的研究植物中较多，β-蜕皮激素系在露水草中首次发现，其在植物中含量丰富，如CN103788162 A公开了一种从菠菜中提取蜕皮激素的方法，许栗榕公开了露水草β-蜕皮甾酮的提取、纯化工艺及其质量标准研究，王强等公开了19种资源植物中β-蜕皮激素的含量测定；对于植物中β-蜕皮激素的提取多采用水煮联合乙醇提取，并经柱层析或石油醚脱脂提纯，提取步骤复杂，耗时长，而对于植物中β-蜕皮激素的检测，因其含量很高，多采用薄层层析的检测方法，但存在前处理较为繁琐，薄层斑点不显著，耗时长，结果准确性低等缺点。对于动物中的β-蜕皮激素在昆虫和甲壳动物十足目的报道较多，多采用取动物血清或淋巴液，再经多次提取，纯化，并用配置的溶解液溶解，进行酶联免疫检测或高效液相检测，操作较为复杂，且酶联免疫价格昂贵，耗时较长；因为动物中β-蜕皮激素的含量很低，并没有通过薄层层析进行检测的报道。
目前尚未有关于从南极磷虾中提取β-蜕皮激素的方法及分析检测的报道，因此，有必要建立一种针对南极磷虾的β-蜕皮激素的提取方法及有效的检测分析方法，以便增加南极磷虾的开发利用价值。
发明内容
针对上述现有技术存在的问题，本发明的目的之一在于提供一种操作简单、提取充分的南极磷虾β-蜕皮激素的提取方法。
本发明的另一目的在于提供一种操作简单、快速、准确、可靠的南极磷虾β-蜕皮激素的高效薄层层析检测方法。
为实现上述目的，具体的，本发明采用以下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种南极磷虾β-蜕皮激素的提取方法，步骤如下：
(1)取冷冻干燥的南极磷虾用高速组织粉碎机进行粉碎；
(2)取粉碎的南极磷虾和甲醇混合进行超声提取，过滤提取液，收集滤液；
(3)将滤液旋转蒸发，得到β-蜕皮激素的粗提物。
(4)将粗提物用N’N-二甲基亚酰胺进行溶解，离心取上清液；
(5)将上清液加入无水乙醇，旋转蒸发至干，即提取获得南极磷虾β-蜕皮激素。
南极磷虾体型小，无法采取取血清或淋巴液的β-蜕皮激素的提取和检测方法，且体内脂含量及虾青素含量十分高，提取物呈鲜艳红色，极大的影响了β-蜕皮激素的提取和检测。本发明采用甲醇提取+DMF复溶提取的方式，提取效率高，能除去大部分杂质，两种溶剂有效配合提取南极磷虾中的β-蜕皮激素，提取完全，效率高，且提取过程简单，快速，能除去影响检测的杂质。
本发明步骤(1)中用高速粉碎机进行粉碎，有助于增大与溶剂的接触面积，能够完全提取南极磷虾中的β-蜕皮激素。
具体的实施方式中，步骤(2)中取粉碎的南极磷虾(W)和甲醇(V)以1：10-15的比例混合进行超声提取；优选的，超声提取的条件为:30℃-38℃、250-350W、30-50kHz的条件下超声提取1-2h；更为优选，超声提取的条件为：35℃、300W、40kHz的条件下超声提取1h。通过超声提取，使得甲醇提取溶剂充分的浸入南极磷虾粉碎组织中，最大化的发挥甲醇的提取效率。
具体的实施方式中，步骤(3)中将滤液在旋转蒸发仪中蒸发至干，旋蒸温度为45-55℃，得到β-蜕皮激素的粗提物；更为优选的，旋蒸温度为50℃。
优选的，步骤(4)中将粗提物用N’N-二甲基亚酰胺进行溶解，2500-3500r/min离心，取上清液，重复2-3次，合并上清液。最优选的实施方式中，离心条件为3000r/min离心，取上清液，重复三次，合并上清液。通过DMF多次复溶-离心，不仅有助于β-蜕皮激素完全溶解，同时有效的去除了脂类、虾青素等杂质，提升β-蜕皮激素提取物的纯度，而且排除了部分可干扰检测的杂质。
本发明步骤(5)中通过加入无水乙醇进行旋蒸的方式，可以加快蒸干的速度，充分蒸干溶剂，提高了β-蜕皮激素的提取速率。
本发明的第二方面，提供一种南极磷虾中β-蜕皮激素的检测方法，
采用上述方法步骤(1)-(5)提取南极磷虾β-蜕皮激素；此外还包括如下步骤：
(6)取步骤(5)提取的南极磷虾β-蜕皮激素和β-蜕皮激素标准品溶于甲醇，配成待检测样品液和标准品液；
(7)取一定量的样品液和标准品液点于同一块高效薄层硅胶板上进行展开；
(8)用显色剂进行显色；
(9)用薄层扫描仪扫描，扫描波长500nm，通过标准品和样品的扫描峰面积对β-蜕皮激素定量。
具体的实施方式中，步骤(7)中展开剂配方为甲醇：氯仿：丙酮：石油醚：冰醋酸＝11:3:3:3:2；本发明对现有的β-蜕皮激素的展开剂配方(乙酸乙酯-乙醇、氯仿-乙醇)进行了实验，发现不能把南极磷虾中β-蜕皮激素的点分开，且拖尾严重，点都混合在一起，发明人对展开剂进行了多次实验，确定了步骤(7)所述的展开剂，可以将南极磷虾中β-蜕皮激素的点分离出来，且点圆，与标准品对的很齐，是一种较好的南极磷虾中β-蜕皮激素的展开剂配方。
优选的，步骤(8)中显色剂为磷钼酸溶液，所述磷钼酸溶液为磷钼酸溶解于乙醇中；具体的，步骤(8)中显色剂为0.667g/ml的磷钼酸溶液；本发明改良的显色剂减小了磷钼酸的浓度，这样能使显色清晰，且在烤板时不易出现花板。
具体的实施方式中，步骤(9)所述的500nm的检测波长，是通过试验确定的，本发明试验过程中发现，200,300,400,500,600nm的检测波长，β-蜕皮激素标准品和南极磷虾β-蜕皮激素样品的全波长扫描重合性差，确定重合性最好的是500nm处的波长，因此，确定为β-蜕皮激素的检测波长。
本发明一个具体的实施方式中，步骤(6)为：取步骤(5)提取的南极磷虾β-蜕皮激素用10mL甲醇溶解，作为样品液备用，准确称取1mgβ-蜕皮激素的标准品，溶解到1mL甲醇中，配置成1.0mg/mL的β-蜕皮激素标准品液；
步骤(7)为：取样品液和1.0mg/mL的标准品液5μL点于同一块GF254高效薄层硅胶板上，以体积比为甲醇：氯仿：丙酮：石油醚：冰醋酸＝11:3:3:3:2的展开剂，在展开缸中展开，展距为9cm，展完后晾干展板；
步骤(8)为：用改良的磷钼酸显色剂(10g磷钼酸溶解在15mL乙醇中，充分摇晃混匀)喷板，在105℃条件下烘烤5min，在黄绿色背景下，β-蜕皮激素显棕黑色；
步骤(9)为：用CAMAG薄层扫描仪-III扫描，扫描波长500nm，通过标准品和样品的扫描峰面积定量。
本发明取得了以下有益效果：
(1)本发明用甲醇作为提取南极磷虾中β-蜕皮激素的提取溶剂，提取效率高，用DMF作为复溶溶剂，对于β-蜕皮激素的溶解性好，且能除去大部分杂质(杂质在沉淀部分)，用这种方法提取南极磷虾中的β-蜕皮激素，提取完全，效率高，且提取过程简单、快速，能除去影响检测的杂质，是一种较好的南极磷虾β-蜕皮激素的提取方法。
(2)本发明利用高效薄层层析扫描检测方法分析南极磷虾β-蜕皮激素的含量，自动化程度高，灵敏性强，且需要较少的试剂，分析过程快速，结果准确性高，对环境有很好的保护作用的同时达到快速、准确的检测目的。
(3)本发明以体积比为甲醇：氯仿：丙酮：石油醚：冰醋酸＝11:3:3:3:2的展开剂，能将β-蜕皮激素的点清晰的分离出来，标准品的点与样品的点准确对应，Rf值为0.36，是南极磷虾β-蜕皮激素展开分离的良好配方；采用改良的磷钼酸作为显色剂，在黄绿色背景上β-蜕皮激素显棕黑色，显色剂配置简单，方便易得，且检测效果好。因此，该β-蜕皮激素的检测方法简单、快速、准确、可靠、稳定。
附图说明
图1：β-蜕皮激素标准品5μL和南极磷虾样品5μL中β-蜕皮激素染色后的薄层板，
其中1为β-蜕皮激素标准品，2为南极磷虾样品，a、b分别是展开后它们的点。
图2：β-蜕皮激素标准品的峰，Rf＝0.36。
图3：南极磷虾β-蜕皮激素样品的峰，Rf＝0.36。
图4：β-蜕皮激素标准品和南极磷虾β-蜕皮激素样品的全波长扫描图，其中a为β-蜕皮激素标准品的全波长扫描图，b为南极磷虾中β-蜕皮激素样品的全波长扫描图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，应当强调的是，下述实施例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
实施例1：南极磷虾β-蜕皮激素的提取及高效薄层层析扫描检测
1、南极磷虾β-蜕皮激素的提取
(1)取冷冻干燥的南极磷虾100g，用高速组织粉碎机进行粉碎。
(2)取粉碎的南极磷虾(W)和甲醇(V)以1：10-15的比例在35℃、300W、40kHz的条件下超声提取1h，过滤提取液，收集滤液。
(3)将滤液在旋转蒸发仪中蒸发至干，旋蒸温度为50℃，得到β-蜕皮激素的粗提物。
(4)将粗提物用15mLN’N-二甲基亚酰胺进行溶解，3000r/min离心，取上清液，重复三次，合并上清液。
(5)将上清液转入旋蒸瓶，加入无水乙醇，旋转蒸发至干，将剩余物质用10mL甲醇溶解。作为样品液备用。
2、南极磷虾中β-蜕皮激素的高效薄层层析扫描检测，步骤如下：
(1)准确称取1mgβ-蜕皮激素的标准品(Sigma公司)，溶解到1mL甲醇中，配置成1.0mg/mL的β-蜕皮激素标准品液。
(2)取上述提取的样品液和1.0mg/mL的标准品液5μL点于同一块GF254高效薄层硅胶板上，以体积比为甲醇：氯仿：丙酮：石油醚：冰醋酸＝11:3:3:3：2的展开剂，在展开缸中展开，展距为9cm，展完后晾干展板。
(3)用改良的磷钼酸显色剂(10g磷钼酸溶解在15mL乙醇中，充分摇晃混匀)喷板，在105℃条件下烘烤5min，在黄绿色背景下，β-蜕皮激素显棕黑色。
(4)用CAMAG薄层扫描仪-III扫描，扫描波长500nm，通过标准品和样品的扫描峰面积定量。
建立β-蜕皮激素薄层层析检测的标准曲线：
(1)精密称取1.0000mgβ-蜕皮激素标准品(Sigma公司)溶于1.0mL甲醇中得到浓度为1.0mg/mL的标准液；
(2)取上述配置好的β-蜕皮激素标准液1μL、2μL、4μL、4.5μL、5μL，点样于同一块GF254高效薄层硅胶板，按照β-蜕皮激素的展开条件展开，晾干。
(3)用改良的磷钼酸显色剂染色后，用CAMAG薄层扫描仪-III，500nm吸收波长扫描，经薄层扫描软件Wincats1.4.1统计数据(表1)，得到回归方程Y＝129.335+1587.843×X，r＝0.99959，sdv＝1.68％。
表1
点样量(μg) 峰面积(AU)
1 1654.41
2 3415.87
4 6419.70
4.5 7233.76
5 8122.36
本发明检测南极磷虾β-蜕皮激素的高效薄层扫描检测方法，其精密度、重复性、稳定性、回收率情况如下：
精密度测定：精密吸取标准品液，在同一块高效薄层硅胶板上水平点样2.5μL,展开，晾干，用磷钼酸染色后用CAMAG薄层扫描仪-III,以500nm吸收波长扫描峰面积如下表(表2)：
表2
Figure BDA0001493985460000061
重复性测定：精密吸取标准品液，在5块高效薄层硅胶板上分别点样2.5μL，展开，晾干，用磷钼酸显色剂染色后用CAMAG薄层扫描仪-III，以500nm吸收波长扫描峰面积如下表(表3)。
表3
Figure BDA0001493985460000071
稳定性测定：精密吸取标准品液2.5μL、3μL、4μL点于高效薄层板上，展开，晾干，磷钼酸染色后用CAMAG薄层扫描仪-III,以500nm吸收波长扫描，以后每隔10min扫描一次，记录每次的峰面积，计算相应的RSD，多次试验证明，染色后10-40min内比较稳定，平均RSD＝0.77％,具体数据见表4。
表4
Figure BDA0001493985460000072
回收率试验：精密吸取5μL样品液3次，分别加入，0.941μg，1.881μg,2.822μgβ-蜕皮激素标准品，点样，展开，晾干，用磷钼酸染色剂染色后用CAMAG薄层扫描仪-III，以500nm吸收波长扫描，计算得平均回收率为102.2％，RSD＝1.186％。数据如表5所示。
表5
样品量/μg 加入标准品量/μg 测得量/μg 回收率％
1.881 0.941 2.916 103.3
1.881 1.881 3.799 100.9
实施例2：南极磷虾β-蜕皮激素的提取及高效薄层层析扫描检测
取冷冻干燥的南极磷虾100g，用高速组织粉碎机进行粉碎，加入甲醇1000mL，在35℃、300w、40kHz的超声波清洗机中超声加热提取，提取1h，过滤提取液，收集滤液。将滤液在旋转蒸发仪中蒸发至干，旋蒸温度为50℃，得到β-蜕皮激素的粗提物。将粗提物用15mLN’N-二甲基亚酰胺进行溶解，3000r/min离心，取上清液，重复三次，合并上清液。将上清液转入旋蒸瓶，加入无水乙醇，旋转蒸发至干，将剩余物质用10mL甲醇溶解，即得到南极磷虾β-蜕皮激素的样品液。
精密称取1.000mgβ-蜕皮激素标准品溶于1.0mL甲醇中，得到浓度为1mg/mL的标准品溶液。
将样品液和标准品液点于同一块GF254高效薄层硅胶板上(5×10cm2)上，展开剂体积比为甲醇：氯仿：丙酮：石油醚：冰醋酸＝11:3:3:3:2，将展开剂加入展开缸(10×12×15cm3)，在室温下预平衡30min，再放入高效薄层板，当展距达到9cm，展开结束，将展板展开后晾干。用改良的磷钼酸染色液染色，然后置于105℃下烘烤5min，样品液和标准品液对应的点染成棕黑色。用CAMAG薄层扫描仪-III，以500nm吸收波长扫描，得到Rf＝0.36，经检测和计算得到冷冻干燥南极磷虾中β-蜕皮激素含量为37.69μg/g。
实施例3：南极磷虾β-蜕皮激素的提取及高效薄层层析扫描检测
取冷冻干燥的南极磷虾100g，用高速组织粉碎机进行粉碎，加入甲醇1500mL，在35℃、300w、40kHz的超声波清洗机中超声加热提取，提取1h，过滤提取液，收集滤液。将滤液在旋转蒸发仪中蒸发至干，旋蒸温度为55℃，得到β-蜕皮激素的粗提物。将粗提物用15mLN’N-二甲基亚酰胺进行溶解，3000r/min离心，取上清液，重复三次，合并上清液。将上清液转入旋蒸瓶，加入无水乙醇，旋转蒸发至干，将剩余物质用10mL甲醇溶解，即得到南极磷虾β-蜕皮激素的样品液。
精密称取1.000mgβ-蜕皮激素标准品溶于1.0mL甲醇中，得到浓度为1mg/mL的标准品溶液。
将样品液和标准品液点于同一块GF254高效薄层硅胶板上(5×10cm2)上，展开剂体积比为甲醇：氯仿：丙酮：石油醚：冰醋酸＝11:3:3:3:2，将展开剂加入展开缸(10×12×15cm3)，在室温下预平衡30min，再放入高效薄层板，当展距达到9cm，展开结束，将板展开后晾干。用改良的磷钼酸染色液染色，然后置于105℃下烘烤5min，样品液和标准品液对应的点染成棕黑色。用CAMAG薄层扫描仪-III，以500nm吸收波长扫描，得到Rf＝0.36，经检测和计算得到南极磷虾中β-蜕皮激素含量为37.58μg/g。
实施例4：南极磷虾β-蜕皮激素的提取及高效薄层层析扫描检测
取冷冻干燥的南极磷虾100g，用高速组织粉碎机进行粉碎，加入甲醇1200mL，在35℃、300w、40kHz的超声波清洗机中超声加热提取，提取1h，过滤提取液，收集滤液。将滤液在旋转蒸发仪中蒸发至干，旋蒸温度为45℃。得到β-蜕皮激素的粗提物。将粗提物用15mLN’N-二甲基亚酰胺进行溶解，3000r/min离心，取上清液，重复三次，合并上清液。将上清液转入旋蒸瓶，加入无水乙醇，旋转蒸发至干，将剩余物质用10mL甲醇溶解，即得到南极磷虾β-蜕皮激素的样品液。
精密称取1.000mgβ-蜕皮激素标准品溶于1.0mL甲醇中，得到浓度为1mg/mL的标准品溶液。
将样品液和标准品液点于同一块GF254高效薄层硅胶板上(5×10cm2)上，展开剂体积比为甲醇：氯仿：丙酮：石油醚：冰醋酸＝11:3:3:3:2，将展开剂加入展开缸(10×12×15cm3)，在室温下预平衡30min，再放入高效薄层板，当展距达到9cm，展开结束，将板展开后晾干。用改良的磷钼酸染色液染色，然后置于105℃下烘烤5min，样品液和标准品液对应的点染成棕黑色。用CAMAG薄层扫描仪-III，以500nm吸收波长扫描，得到Rf＝0.36，经检测和计算得到南极磷虾中β-蜕皮激素含量为37.74μg/g。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种南极磷虾中β-蜕皮激素的检测方法，其特征在于，
(1)取冷冻干燥的南极磷虾用高速组织粉碎机进行粉碎；
(2)取粉碎的南极磷虾和甲醇混合进行超声提取，过滤提取液，收集滤液；
(3)将滤液旋转蒸发，得到β-蜕皮激素的粗提物；
(4)将粗提物用N’N-二甲基亚酰胺进行溶解，离心取上清液；
(5)将上清液加入无水乙醇，旋转蒸发至干，即提取获得南极磷虾β-蜕皮激素；
(6)取步骤(5)提取的南极磷虾β-蜕皮激素用10mL甲醇溶解，作为样品液备用，准确称取1mgβ-蜕皮激素的标准品，溶解到1mL甲醇中，配置成1.0mg/mL的β-蜕皮激素标准品液；
(7)取样品液和标准品液点于同一块高效薄层硅胶板上进行展开；
展开剂配方为甲醇：氯仿：丙酮：石油醚：冰醋酸＝11:3:3:3:2；
(8)用显色剂进行显色，显色剂为磷钼酸溶液，所述磷钼酸溶液为磷钼酸溶解于乙醇中；
(9)用薄层扫描仪扫描，扫描波长500nm，通过标准品和样品的扫描峰面积对β-蜕皮激素定量。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中取粉碎的南极磷虾和甲醇以W/V为1：10-15的比例混合进行超声提取,所述W/V为g/ml。
3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，超声提取的条件为:30℃-38℃、250-350W、30-50kHz的条件下超声提取1-2h。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，超声提取的条件为：35℃、300W、40kHz的条件下超声提取1h。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)中将滤液在旋转蒸发仪中蒸发至干，旋蒸温度为45-55℃，得到β-蜕皮激素的粗提物。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，旋蒸温度为50℃。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(4)中将粗提物用N’N-二甲基亚酰胺进行溶解，2500-3500r/min离心，取上清液，重复2-3次，合并上清液。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，离心条件为3000r/min离心，取上清液，重复三次，合并上清液。
9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(8)中显色剂为0.667g/ml的磷钼酸溶液。
10.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，
步骤(7)为：取样品液和1.0mg/mL的标准品液5μL点于同一块GF254高效薄层硅胶板上，以体积比为甲醇：氯仿：丙酮：石油醚：冰醋酸＝11:3:3:3:2的展开剂，在展开缸中展开，展距为9cm，展完后晾干展板；
步骤(8)为：用改良的磷钼酸显色剂喷板，在105℃条件下烘烤5min，在黄绿色背景下，β-蜕皮激素显棕黑色；所述磷钼酸显色剂为10g磷钼酸溶解在15mL乙醇中充分摇晃混匀形成的溶液；
步骤(9)为：用CAMAG薄层扫描仪-III扫描，扫描波长500nm，通过标准品和样品的扫描峰面积定量。
11.根据权利要求10所述的检测方法，其特征在于，步骤(9)中建立β-蜕皮激素薄层层析检测的标准曲线：
(a)精密称取1.0000mgβ-蜕皮激素标准品溶于1.0mL甲醇中得到浓度为1.0mg/mL的标准液；
(b)取配置好的β-蜕皮激素标准液1μL、2μL、4μL、4.5μL、5μL，点样于同一块GF254高效薄层硅胶板，按照步骤(7)β-蜕皮激素的展开条件展开，晾干；
(c)用改良的磷钼酸显色剂染色后，用CAMAG薄层扫描仪-III，500nm吸收波长扫描，经薄层扫描软件统计数据，得到回归方程。
CN201711262716.9A 2017-12-04 2017-12-04 一种从南极磷虾中提取β-蜕皮激素的方法及高效薄层层析扫描检测方法 Expired - Fee Related CN107727777B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711262716.9A CN107727777B (zh) 2017-12-04 2017-12-04 一种从南极磷虾中提取β-蜕皮激素的方法及高效薄层层析扫描检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711262716.9A CN107727777B (zh) 2017-12-04 2017-12-04 一种从南极磷虾中提取β-蜕皮激素的方法及高效薄层层析扫描检测方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107727777A CN107727777A (zh) 2018-02-23
CN107727777B true CN107727777B (zh) 2020-06-30

Family

ID=61220298

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711262716.9A Expired - Fee Related CN107727777B (zh) 2017-12-04 2017-12-04 一种从南极磷虾中提取β-蜕皮激素的方法及高效薄层层析扫描检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107727777B (zh)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102735512A (zh) * 2012-07-18 2012-10-17 山东师范大学 一种从南极磷虾中提取生物素的方法及高效薄层扫描分析方法
CN102746205A (zh) * 2012-07-18 2012-10-24 山东师范大学 一种从南极磷虾中提取虾青素一酯的方法
CN103788162A (zh) * 2014-01-07 2014-05-14 青岛农业大学 一种从菠菜中提取蜕皮激素的方法
CN103808855A (zh) * 2014-01-24 2014-05-21 山东师范大学 一种从南极磷虾中提取雌酮的方法及高效薄层层析扫描检测方法
US8822441B2 (en) * 2010-05-07 2014-09-02 Chongqing Zen Pharmaceutical Co., Ltd. Ecdysterone synthesis derivative, preparation method and use thereof
CN105440095A (zh) * 2014-08-28 2016-03-30 江苏柯菲平医药股份有限公司 一种富含β-蜕皮甾酮的露水草提取纯化方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8822441B2 (en) * 2010-05-07 2014-09-02 Chongqing Zen Pharmaceutical Co., Ltd. Ecdysterone synthesis derivative, preparation method and use thereof
CN102735512A (zh) * 2012-07-18 2012-10-17 山东师范大学 一种从南极磷虾中提取生物素的方法及高效薄层扫描分析方法
CN102746205A (zh) * 2012-07-18 2012-10-24 山东师范大学 一种从南极磷虾中提取虾青素一酯的方法
CN103788162A (zh) * 2014-01-07 2014-05-14 青岛农业大学 一种从菠菜中提取蜕皮激素的方法
CN103808855A (zh) * 2014-01-24 2014-05-21 山东师范大学 一种从南极磷虾中提取雌酮的方法及高效薄层层析扫描检测方法
CN105440095A (zh) * 2014-08-28 2016-03-30 江苏柯菲平医药股份有限公司 一种富含β-蜕皮甾酮的露水草提取纯化方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
13一蜕皮甾酮衍生物前导化合物的合成、分离及鉴定;陈丽秋等;《江西农业大学学报》;20130331;第35卷(第3期);全文 *
C-25 epimeric 26-haloponasterone A: Synthesis, absolute configuration and moulting activity;Boon-ek Yingyongnarongkul等;《Steroids》;20051231;第70卷;全文 *
高效液相色谱-三重四级杆质谱分析海洋甲壳动物淋巴和肌肉中的20-羟基蜕皮酮;赵鹏 等;《分析化学研究报告》;20110131;第39卷(第1期);第57-61页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN107727777A (zh) 2018-02-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105954453A (zh) 一种同时定量检测烟酸、烟酰胺和泛酸的试剂盒
WO2020206821A1 (zh) 一种高效薄层色谱联用生物发光法筛查茶叶中贝特类降脂化学药掺伪的方法
CN104306745A (zh) 一种天麻醒脑胶囊的质量控制方法
CN110201012A (zh) 一种马齿苋提取物的制备方法及用途
Berry Procedures for testing urine specimens dried on filter paper
CN105974018B (zh) 基于多功能净化柱-高效液相色谱法检测食品中毒黄素的方法
Gao et al. Hypoglycemic effects and mechanisms of action of Cortex Lycii Radicis on alloxan-induced diabetic mice
CN107727777B (zh) 一种从南极磷虾中提取β-蜕皮激素的方法及高效薄层层析扫描检测方法
CN103808855B (zh) 一种从南极磷虾中提取雌酮的方法及高效薄层层析扫描检测方法
CN103954726B (zh) 从谷氨酸棒状杆菌菌渣中提取胞壁酸的方法及检测方法
CN110632236B (zh) 一种利用薄层色谱快速鉴别杜仲叶和皮三种活性成分的方法
Kim et al. Fungal extracts that induce phytoalexins in sweet potato roots
Wheat et al. Comparison of Coccidioides immitis arthrospore, mycelium, and spherule cell walls, and influence of growth medium on mycelial cell wall composition
CN104045729A (zh) 从天花粉中综合提取多种生物活性成分的方法
CN103543235B (zh) 一种快速鉴别延胡索生熟饮片的方法
CN104198637A (zh) 一种基于山奈酚3,4’-双-O-β-D-葡萄糖苷含量鉴别蜂花粉的方法
CN110746514B (zh) 一种黑果枸杞多糖的提取方法及其应用
CN107505417A (zh) 生鲜肉及肉制品中瘦肉精的检测方法
CN109030680B (zh) 一种南极磷虾中泼尼松龙、醛固酮、睾酮和雌二醇的提取以及检测方法
CN107759710A (zh) 大叶白麻提取物的制备方法及其在烟草方面的应用
Salvat et al. A simple thin-layer chromatographic method for the detection of ergovaline in leaf sheaths of tall fescue (Festuca arundinacea) infected with Neotyphodium coenophialum
CN102735790B (zh) 一种从燕窝中提取牛磺酸的方法及其检测方法
CN108707200B (zh) 狭山野豌豆中多糖的制备方法
CN113759050B (zh) 一种绵萆薢供试品的制备方法及其薄层鉴别方法
CN107513526A (zh) 农残速测用酶的快速制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20200630

Termination date: 20211204