CN106443028B - 一种同时测定贝类中谷胱甘肽和游离氨基酸的方法 - Google Patents

一种同时测定贝类中谷胱甘肽和游离氨基酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于化学分析检测领域，特别涉及同时测定贝类中谷胱甘肽和游离氨基酸的方法。该方法优化了样品前处理，对分离树脂有保护作用，有利于分离，同时氨基酸提取效率更好，添加了抗氧化剂，防止谷胱甘肽被氧化,使用了自制的国产缓冲液和反应液，通过改变缓冲液的pH和洗脱程序，来消除峰型的相互重叠或相互影响。并且极大的降低了成本，消耗的成本为原试剂的十分之一，测量数据精确，测量种类更广泛。

Description

一种同时测定贝类中谷胱甘肽和游离氨基酸的方法
技术领域
本发明属于化学分析检测领域，特别涉及同时测定贝类中谷胱甘肽和游离氨基酸的方法。
背景技术
贝类属软体动物门中的瓣鳃纲(或双壳纲)，常见的螺类、蛤类、扇贝、牡蛎等都属于该类，贝类不仅具有食用价值，而且药用价值也很高。贝类由于其生存环境的复杂性，使得贝类含有很多陆地生物没有的具有特殊生理活性的物质，体内含有丰富的活性肽和氨基酸等非挥发性的含氮物质，根据种类的不同，它们体内组成以及含量也不尽相同，也为贝类资源的开发利用提供了良好的基础。谷胱甘肽((glutathione，GSH))一直因为其独特和重要的生理功能为国内外学者研究，如参与氨基酸的吸收和转运、维持细胞正常生长、抗氧化作用等，对于植物和血浆中的GSH中含量的测定作出过很多研究，但是关于贝类中GSH含量的测定方法的研究比较少。
游离氨基酸(free amino acids，FAA)是非蛋白氮的重要组成部分，它们对水产食品新鲜度的评价和风味的贡献有非常重要作用，如丙氨酸、谷氨酸以及甘氨酸都会影响其风味以及口感。丙氨酸和谷氨酸具有甜味，谷氨酸尤其在甲壳类动物肌肉中起重要的鲜味作用。此外，FAA可能还可以被用作许多鱼类以及甲壳类动物品质评价的重要鲜度潜在指标。章超桦等在研究翡翠贻贝肉的食品化学特性时认为呈味游离氨基酸对甜味、甘味有重要贡献；杨文鸽等通过对缢蛏冰藏保活期间呈味物质的变化研究发现FAA对缢蛏鲜味风味起到重要作用，精氨酸能够赋予海鲜一个适宜的整体风味。
目前国内外相关测定GSH和FAA的方法有很多，主要有高效液相色谱法、比色法、毛细管电泳法、氨基酸自动分析仪法(Amino acid analyzer，AAA)等。AAA法是最常用的一种分析方法，它是以阳离子交换树脂为固定相，酸性缓冲液为流动相，在柱后采用茚三酮溶液与氨基酸衍生生成具有可见光吸收的衍生物进行检测，具有重现性好，仪器稳定、结果可靠等优点。现有的方法主要单独对GSH或者FAA的含量进行了测定，并且对于测定贝类中GSH或者FAA的方法相关的研究比较少，然而针对贝类中GSH和FAA的同时测定并没有一直快速、有效的方法，
本文将通过调节缓冲液pH以及优化洗脱程序，建立了一种同时测定贝类可食部分GSH和FAA的AAA法，同时对该法进行方法学验证，确定该法准确稳定，并将该法用于贝类可食部分GSH及FAA的测定，为建立贝类资源的开发提供新的基础数据和思路。
发明内容
本发明的目的是提供一种同时测定贝类中谷胱甘肽和游离氨基酸的方法，该方法不仅大大降低了成本，而且可以测定更多种的氨基酸种类。
为了实现以上技术效果，本发明是通过如下步骤实现：
一种同时测定贝类中谷胱甘肽和游离氨基酸的方法，包括如下步骤：
(1)准确称量76.83mg谷胱甘肽标准品，用超纯水定容至100ml容量瓶中，即得2.5μmol/ml的标准溶液，从中准确取出2ml混合溶液，加入2ml2.5μmol/mL含有多种标准氨基酸组分的混合液，用超纯水定容至50ml，即为0.10μmol/mL的混合标准溶液，保存至4℃冰箱中；
(2)准确称取1g贝类肉组织，加入10-20ml 0.02mol/L的稀盐酸，并添加1ml浓度为1-4％的抗氧化剂，充分均质后用超声波清洗5min，然后用冷冻离心机，4℃5000-10000r离心10min，收取上清液，将剩余残渣加入10ml0.02-0.04mol/L稀盐酸后搅拌，再次4℃5000-10000r离心5min，合并上清液，定容至50ml，定容后移取2ml，加入2ml 2-5％的磺基水杨酸，4℃10000-15000r离心10min，然后用0.22μm水相过滤膜过滤，全自动氨基酸分析仪测定，全自动氨基酸分析仪所需试剂包括缓冲液和茚三酮反应液，取3组平行实验，测定结果取平均值。添加抗氧化剂保护肽类，同时用5％的磺基水杨酸溶液(对分离树脂有保护作用，有利于分离)沉淀蛋白质。
所述抗氧化剂为二硫苏糖醇、连二亚硫酸钠、维生素C中的一种。
优选的，所述抗氧化剂为二硫苏糖醇，DTT对于贝类肉组织中GSH的含量有着更好的保护和抗氧化作用。
所述缓冲液的制备方法如下：
(1)B1试剂的制备：称取二水柠檬酸钠6.0-6.40g、1mol/L氢氧化钠6-7ml、氯化钠5.66g、柠檬酸19.80g、乙醇135.0ml，充分混合后用超纯水定容至1L，pH 3.1-3.5；
(2)B2试剂的制备：称取二水柠檬酸钠7.60-7.80g、1mol/L氢氧化钠20-22ml、氯化钠7.07g、柠檬酸22.00g、乙醇25.0ml，充分混合后用超纯水定容至1L，pH 3.0-3.6；
(3)B3试剂的制备：称取二水柠檬酸钠13.20-13.31g、氯化钠3.74g、柠檬酸12.80g、乙醇9.0ml，充分混合后用超纯水定容至1L，pH 4.0-4.4；
(4)B4试剂的制备：称取二水柠檬酸钠26.60-26.80g、氯化钠54.35g、柠檬酸6.0-6.30g充分混合后用超纯水定容至1L，pH 4.5-5.5；
(5)B5试剂的制备：称取氢氧化钠8.0-10g、乙醇100.0ml，充分混合后用超纯水定容至1L。在B1缓冲液中添加了1mol/mL的NaOH氢氧化钠溶液6-7ml，在B2缓冲液中添加了1mol/mL的NaOH溶液20-22ml，从而实现GSH和氨基酸完全分离的效果。
所述茚三酮反应液的制备方法如下：
(1)R1试剂的制备：称取茚三酮39.0-45.0g、硼氢化钠81.0-100mg，加入200ml乙二醇单甲基醚充分溶解后，用乙二醇单甲基醚定容至1L；硼氢化钠是抗氧化剂，防止茚三酮被氧化，影响测定结果，但是过多的硼氢化钠会导致系统压力很高。
(2)R2试剂的制备：称取乙二醇单甲基醚401ml、冰醋酸123-130ml、乙酸钠190-204g，充分混合溶解后用超纯水定容至1L；
(3)R3试剂的制备：称取50-80ml乙醇，用超纯水定容至1L。
所述氨基酸自动分析仪的参数条件:分离柱树脂为4.6mm×60mm阳离子交换树脂；分离柱温度为57℃；检测波长为570nm，脯氨酸为440nm；进样量20μL；缓冲液流速为0.35mL/min；茚三酮试剂流量0.35mL/min，单元温度135℃。
述缓冲液的洗脱程序：首先用B1试剂洗脱2.5-3min，之后使用B2试剂洗脱2-2.5min，然后用B3试剂洗脱8-9min，再用B4试剂洗脱15-15.5min，再用B5试剂洗脱3.5-4.0min，再用B2试剂洗脱0.5-1.0min，最后用B1试剂洗脱18.5-19min。原程序为：先用B1试剂洗脱3-3.5min，之后使用B2试剂洗脱3.5-4min，然后用B3试剂洗脱7.5-8min，再用B4试剂洗脱14-14.5min，再用B5试剂洗脱3.5-4.0min，再用B2试剂洗脱0.5-1.0min，最后用B1试剂洗脱18.5-19min，通过优化了程序来消除峰型的相互重叠或相互影响。
本发明的有益效果是：
(1)本发明通过对样品前处理来保护肽类，对分离树脂有保护作用，有利于分离。
(2)使用本发明的试剂极大的降低了成本，消耗的成本为原试剂的十分之一。
(3)本发明测量数据精确，测量种类更广泛。
附图说明
图1是使用原试剂和原方法测定混合标准溶液图谱。
图2,3是本发明方法测定混合标准溶液图谱。
图4是本发明方法测定文蛤肌肉组织样品图谱。
图5是本发明方法测定青蛤肌肉组织样品图谱。
图6是本发明方法测定缢蛏肌肉组织样品图谱。
图7是本发明方法测定牡蛎肌肉组织样品图谱。
图8，9是不同缓冲液pH对本发明的对比图谱。
图10是原洗脱程序对本发明的对比图谱
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步说明：
以下实施例中均采用L-8800日立氨基酸全自动分析仪测定。
实施例1
混合标准溶液的制备：准确称量76.83mg谷胱甘肽标准品，用超纯水定容至100ml容量瓶中，即得2.5μmol/ml的标准溶液，从中准确取出2ml混合溶液，加入2ml2.5μmol/mL含有多种标准氨基酸组分的混合液，用超纯水定容至50ml，即为0.10μmol/mL的混合标准溶液，保存至4℃冰箱中。
缓冲液的制备：
(1)B1试剂的制备：称取二水柠檬酸钠6.0g、1mol/L氢氧化钠7ml、氯化钠5.66g、柠檬酸19.80g、乙醇135.0ml，充分混合后用超纯水定容至1L，pH为3.5；
(2)B2试剂的制备：称取二水柠檬酸钠7.80g、1mol/L氢氧化钠20ml、氯化钠7.07g、柠檬酸22.00g、乙醇25.0ml，充分混合后用超纯水定容至1L，pH为3.6；
(3)B3试剂的制备：称取二水柠檬酸钠13.20g、氯化钠3.74g、柠檬酸12.80g、乙醇9.0ml，充分混合后用超纯水定容至1L，pH为4.4；
(4)B4试剂的制备：称取二水柠檬酸钠26.60g、氯化钠54.35g、柠檬酸6.0g充分混合后用超纯水定容至1L，pH为5.5；
(5)B5试剂的制备：称取氢氧化钠10.0g、乙醇100.0ml，充分混合后用超纯水定容至1L。
茚三酮反应液的制备：
(1)R1试剂的制备：称取茚三酮39.0g、硼氢化钠81mg，加入200ml乙二醇单甲基醚充分溶解后，用乙二醇单甲基醚定容至1L；
(2)R2试剂的制备：称取乙二醇单甲基醚401ml、冰醋酸123ml、乙酸钠190g，充分混合溶解后用超纯水定容至1L；
(3)R3试剂的制备：称取50ml乙醇，用超纯水定容至1L。
实施例2
缓冲液的制备：
(1)B1试剂的制备：称取二水柠檬酸6.40g、1mol/L氢氧化钠6ml、氯化钠5.66g、柠檬酸21.50g、乙醇135.0ml，充分混合后用超纯水定容至1L，pH为3.1；
(2)B2试剂的制备：称取二水柠檬酸7.60g、1mol/L氢氧化钠20ml、氯化钠7.07g、柠檬酸24.00g、乙醇25.0ml，充分混合后用超纯水定容至1L，pH为3.0；
(3)B3试剂的制备：称取二水柠檬酸13.31g、氯化钠3.74g、柠檬酸15.60g、乙醇9.0ml，充分混合后用超纯水定容至1L，pH为4.0；
(4)B4试剂的制备：称取二水柠檬酸26.80g、氯化钠54.35g、柠檬酸6.30g充分混合后用超纯水定容至1L，pH为4.5；
(5)B5试剂的制备：称取氢氧化钠8.0g、乙醇100.0ml，充分混合后用超纯水定容至1L。
茚三酮反应液的制备：
(1)R1试剂的制备：称取茚三酮45.0g、硼氢化钠100mg，加入200ml乙二醇单甲基醚充分溶解后，用乙二醇单甲基醚定容至1L；
(2)R2试剂的制备：称取乙二醇单甲基醚401ml、冰醋酸130ml、乙酸钠204g，充分混合溶解后用超纯水定容至1L；
(3)R3试剂的制备：称取80ml乙醇，用超纯水定容至1L。
实施例3
取20μl实施例1所得的标准混合液，使用原试剂及其系统参数，全自动氨基酸分析仪测定，3组平行实验，测定结果取平均值。具体测试结果如图1。
实施例4
取20μl实施例1所得的标准混合液，分别使用使用实施例1，实施例2中的的缓冲液及茚三酮反应液，所述氨基酸自动分析仪的参数条件:分离柱树脂为4.6mm×60mm阳离子交换树脂；分离柱温度为57℃；检测波长为570nm，缓冲液流速为0.35mL/min；茚三酮试剂流量0.35mL/min，单元温度135℃，洗脱程序为首先用B1试剂洗脱2.8min，之后使用B2试剂洗脱2.3min，然后用B3试剂洗脱8.5min，再用B4试剂洗脱15.1min，再用B5试剂洗脱3.9min，再用B2试剂洗脱0.9min，最后用B1试剂洗脱18.9min，全自动氨基酸分析仪测定，3组平行实验，测定结果取平均值。具体测试结果如图2,3。
实施例5
取文蛤肌肉组织1g，加入15ml 0.02mol/L的稀盐酸，并添加1ml浓度为1％的二硫苏糖醇，充分均质后用超声波清洗5min，然后用冷冻离心机，4℃5000r离心10min，收取上清液，将剩余残渣加入10ml 0.02mol/L稀盐酸后搅拌，再次4℃5000r离心5min，合并上清液，定容至50ml，定容后移取2ml，加入2ml 5％的磺基水杨酸，4℃10000r离心10min，然后用0.22μm水相过滤膜过滤，用实施例3的方法测定3组平行实验，测定结果取平均值。具体测试结果如图4。
实施例6
取青蛤肌肉组织1g，加入15ml 0.02mol/L的稀盐酸，并添加1ml浓度为1％的二硫苏糖醇，充分均质后用超声波清洗5min，然后用冷冻离心机，4℃5000r离心10min，收取上清液，将剩余残渣加入10ml 0.02mol/L稀盐酸后搅拌，再次4℃5000r离心5min，合并上清液，定容至50ml，定容后移取2ml，加入2ml 5％的磺基水杨酸，4℃10000r离心10min，然后用0.22μm水相过滤膜过滤，用实施例3的方法测定3组平行实验，测定结果取平均值。具体测试结果如图5。
实施例7
取缢蛏肌肉组织1g，加入15ml 0.02mol/L的稀盐酸，并添加1ml浓度为1％的二硫苏糖醇，充分均质后用超声波清洗5min，然后用冷冻离心机，4℃5000r离心10min，收取上清液，将剩余残渣加入10ml 0.02mol/L稀盐酸后搅拌，再次4℃5000r离心5min，合并上清液，定容至50ml，定容后移取2ml，加入2ml 5％的磺基水杨酸，4℃10000r离心10min，然后用0.22μm水相过滤膜过滤，用实施例3的方法测定3组平行实验，测定结果取平均值。具体测试结果如图6。
实施例8
取牡蛎肌肉组织1g，加入15ml 0.02mol/L的稀盐酸，并添加1ml浓度为1％的二硫苏糖醇，充分均质后用超声波清洗5min，然后用冷冻离心机，4℃5000r离心10min，收取上清液，将剩余残渣加入10ml 0.02mol/L稀盐酸后搅拌，再次4℃5000r离心5min，合并上清液，定容至50ml，定容后移取2ml，加入2ml 5％的磺基水杨酸，4℃10000r离心10min，然后用0.22μm水相过滤膜过滤，用实施例3的方法测定3组平行实验，测定结果取平均值。具体测试结果如图7。
实施例9
线性范围、检测限
将标准混合溶液用0.02mol/L的盐酸溶液进行适当稀释，使其浓度分别为1、10、50、100、250μg/mL，按实施例3的方法用氨基酸分析仪进行测定，每个浓度的标准混合溶液分别进样3次，通过保留时间作为定性的依据，以所测色谱的峰面积和其相对应的浓度作出标准曲线，用线性相关系数(R2)评价；根据信噪比，当所测物质色谱峰的峰高为噪音3倍时(S/N＝3)，确定其混合标准组分的最低检测限(LOD)，当色谱峰的峰高为噪音10倍时(S/N＝3)，确定其混合标准组分定量限(LOQ)。具体检测结果如表1。
表1
通过上表表分析发现，在1-250μg/mL范围内，GSH和FAA的线性相关系数R2在0.9991-0.9999之间，表明优化过后的全自动氨基酸分析仪法中色谱峰的面积与浓度之间有着比较好的线性关系，混合标准溶液中的各组分的定量限在0-0.94μmol/L之间，最低检测限在0.07-0.27μmol/L之间。表明优化过后的全自动氨基酸分析仪法对于同时测定GSH和FAA有着较好的灵敏度。
实施例10
回收率、精密度
各取3组1g文蛤肉组织，分别添加1μmol/L、10μmol/L、50μmol/L三种不同浓度的混合标准溶液10ml，加入15ml 0.02mol/L的稀盐酸，并添加1ml浓度为1％的二硫苏糖醇，充分均质后用超声波清洗5min，然后用冷冻离心机，4℃5000r离心10min，收取上清液，将剩余残渣加入10ml 0.02mol/L稀盐酸后搅拌，再次4℃5000r离心5min，合并上清液，定容至50ml，定容后移取2ml，加入2ml5％的磺基水杨酸，4℃10000r离心10min，然后用0.22μm水相过滤膜过滤，按照实施例3的方法对每种浓度进样5次进行测定，用外标法计算其实际含量和加标平均回收率。其中精密度试验对同一样本溶液在1天内进行5次重复试验分析日内变化，对同一样本溶液连续测定5天(每天测定1次)的变化，分别确定日内和日间精密度。回收率公式为：
回收率＝(加入标品后含量-样品含量)/加入标品量*100％
表2
由上表可以得出，通过加标试验以及加标回收率的计算，混合标准溶液各组分加标平均回收率在86.40-102.42％之间，日内相对标准偏差在0.31-0.73％之间，日间相对标准偏差在1.14-2.60％之间，符合实验室质量控制规范-食品理化检测的相关要求。同时也表明该方法回收率以及准确率较高，适用于贝类肌肉组织GSH和FAA的测定。
对比例1
缓冲液的制备：
(1)B1试剂的制备：称取二水柠檬酸钠6.19g、1mol/L氢氧化钠2ml、氯化钠5.66g、柠檬酸23.84g、乙醇135.0ml，充分混合后用超纯水定容至1L，pH为2.8；
(2)B2试剂的制备：称取二水柠檬酸钠7.74g、1mol/L氢氧化钠15ml、氯化钠7.07g、柠檬酸25.00g、乙醇25.0ml，充分混合后用超纯水定容至1L，pH为3.0；
(3)B3试剂的制备：称取二水柠檬酸钠15.71g、氯化钠3.74g、柠檬酸16.23g、乙醇9.0ml，充分混合后用超纯水定容至1L，pH为3.5；
(4)B4试剂的制备：称取二水柠檬酸钠30.62g、氯化钠54.35g、柠檬酸7.80g充分混合后用超纯水定容至1L，pH为4.0；
(5)B5试剂的制备：称取氢氧化钠6.0g、乙醇100.0ml，充分混合后用超纯水定容至1L。
茚三酮反应液的制备：
(1)R1试剂的制备：称取茚三酮39.0g、硼氢化钠8mg，加入200ml乙二醇单甲基醚充分溶解后，用乙二醇单甲基醚定容至1L；
(2)R2试剂的制备：称取乙二醇单甲基醚401ml、冰醋酸123ml、乙酸钠204g，充分混合溶解后用超纯水定容至1L；
(3)R3试剂的制备：称取50ml乙醇，用超纯水定容至1L。
按照实施例3的方法进行标准溶液的测定，测定结果如图8。
对比例2
(1)B1试剂的制备：称取二水柠檬酸钠6.19g、1mol/L氢氧化钠10ml、氯化钠5.66g、柠檬酸19.80g、乙醇135.0ml，充分混合后用超纯水定容至1L，pH为3.8；
(2)B2试剂的制备：称取二水柠檬酸钠7.74g、1mol/L氢氧化钠15ml、氯化钠7.07g、柠檬酸22.00g、乙醇25.0ml，充分混合后用超纯水定容至1L，pH为4.3；
(3)B3试剂的制备：称取二水柠檬酸钠10.24g、氯化钠3.74g、柠檬酸11.35g、乙醇9.0ml，充分混合后用超纯水定容至1L，pH为4.2；
(4)B4试剂的制备：称取二水柠檬酸钠24.85g、氯化钠54.35g、柠檬酸5.54g充分混合后用超纯水定容至1L，pH为4.0；
(5)B5试剂的制备：称取氢氧化钠10.0g、乙醇100.0ml，充分混合后用超纯水定容至1L。
茚三酮反应液的制备：
(1)R1试剂的制备：称取茚三酮39.0g、硼氢化钠8mg，加入200ml乙二醇单甲基醚充分溶解后，用乙二醇单甲基醚定容至1L；
(2)R2试剂的制备：称取乙二醇单甲基醚401ml、冰醋酸123ml、乙酸钠204g，充分混合溶解后用超纯水定容至1L；
(3)R3试剂的制备：称取50ml乙醇，用超纯水定容至1L。
按照实施例3的方法进行标准溶液的测定，测定结果如图9。
对比例3
缓冲液的制备：
(1)B1试剂的制备：称取二水柠檬酸钠6.19g、1mol/L氢氧化钠6ml、氯化钠5.66g、柠檬酸19.80g、乙醇135.0ml，充分混合后用超纯水定容至1L，pH为3.3；
(2)B2试剂的制备：称取二水柠檬酸钠7.74g、1mol/L氢氧化钠20ml、氯化钠7.07g、柠檬酸22.00g、乙醇25.0ml，充分混合后用超纯水定容至1L，pH为3.5；
(3)B3试剂的制备：称取二水柠檬酸钠13.31g、氯化钠3.74g、柠檬酸12.80g、乙醇9.0ml，充分混合后用超纯水定容至1L，pH为4.0；
(4)B4试剂的制备：称取二水柠檬酸钠26.67g、氯化钠54.35g、柠檬酸6.10g充分混合后用超纯水定容至1L，pH为5.0；
(5)B5试剂的制备：称取氢氧化钠8.0g、乙醇100.0ml，充分混合后用超纯水定容至1L。
茚三酮反应液的制备：
(1)R1试剂的制备：称取茚三酮39.0g、硼氢化钠81mg，加入200ml乙二醇单甲基醚充分溶解后，用乙二醇单甲基醚定容至1L；
(2)R2试剂的制备：称取乙二醇单甲基醚401ml、冰醋酸123ml、乙酸钠204g，充分混合溶解后用超纯水定容至1L；
(3)R3试剂的制备：称取50ml乙醇，用超纯水定容至1L。
取20μl实施例1所得的标准混合液，使用上述所得的的缓冲液及茚三酮反应液，所述氨基酸自动分析仪的参数条件:分离柱树脂为4.6mm×60mm阳离子交换树脂；分离柱温度为57℃；检测波长为570nm，缓冲液流速为0.35mL/min；茚三酮试剂流量0.35mL/min，单元温度135℃，洗脱程序为首先用B1试剂洗脱3.2min，之后使用B2试剂洗脱4min，然后用B3试剂洗脱8min，再用B4试剂洗脱14min，再用B5试剂洗脱3.9min，再用B2试剂洗脱0.9min，最后用B1试剂洗脱18.9min，全自动氨基酸分析仪测定，3组平行实验，测定结果取平均值。具体测试结果如图10。
由上述对比例可得，当缓冲液超出本发明pH后，开始出现峰的重叠，使用原洗脱程序也不利于峰的形成。

Claims (4)

1.一种同时测定贝类中谷胱甘肽和游离氨基酸的方法，包括如下步骤：
(1)准确称量76.83mg谷胱甘肽标准品，用超纯水定容至100ml容量瓶中，即得2.5μmol/ml的标准溶液，从中准确取出2ml混合溶液，加入2ml2.5μmol/mL含有多种标准氨基酸组分的混合液，用超纯水定容至50ml，即为0.10μmol/mL的混合标准溶液，保存至4℃冰箱中；
(2)准确称取1-2g贝类肉组织，加入10-20ml 0.02mol/L的稀盐酸，并添加1ml浓度为1-4％的抗氧化剂，充分均质后用超声波清洗5min，然后用冷冻离心机，4℃5000-10000r离心10min，收取上清液，将剩余残渣加入10ml0.02-0.04mol/L稀盐酸后搅拌，再次4℃5000-10000r离心5min，合并上清液，定容至50ml，定容后移取2ml，加入2ml 2-5％的磺基水杨酸，4℃10000-15000r离心10min，然后用0.22μm水相过滤膜过滤，全自动氨基酸分析仪测定，全自动氨基酸分析仪所需试剂包括缓冲液和茚三酮反应液，取3组平行实验，测定结果取平均值；
所述氨基酸自动分析仪的参数条件:分离柱树脂为4.6mm×60mm阳离子交换树脂；分离柱温度为57℃；检测波长为570nm，脯氨酸为440nm；进样量20μL；缓冲液流速为0.35mL/min；茚三酮试剂流量0.35mL/min，单元温度135℃；
所述缓冲液的洗脱程序：首先用B1试剂洗脱2.5-3min，之后使用B2试剂洗脱2-2.5min，然后用B3试剂洗脱8-9min，再用B4试剂洗脱15-15.5min，再用B5试剂洗脱3.5-4.0min，再用B2试剂洗脱0.5-1.0min，最后用B1试剂洗脱18.5-19min；
所述缓冲液的制备方法如下：
S1：B1试剂的制备：称取二水柠檬酸钠6.0-6.40g、1mol/L氢氧化钠6-7ml、氯化钠5.66g、柠檬酸19.80-21.50g、乙醇135.0ml，充分混合后用超纯水定容至1L，pH 3.1-3.5；
S2：B2试剂的制备：称取二水柠檬酸钠7.60-7.80g、1mol/L氢氧化钠20-22ml、氯化钠7.07g、柠檬酸22.00-24.0g、乙醇25.0ml，充分混合后用超纯水定容至1L，pH 3.0-3.6；
S3：B3试剂的制备：称取二水柠檬酸钠13.20-13.31g、氯化钠3.74g、柠檬酸12.80-15.60g、乙醇9.0ml，充分混合后用超纯水定容至1L，pH 4.0-4.4；
S4：B 4试剂的制备：称取二水柠檬酸钠26.60-26.80g、氯化钠54.35g、柠檬酸6.0-6.30g充分混合后用超纯水定容至1L，pH 4.5-5.5；
S5：B5试剂的制备：称取氢氧化钠8.0-10g、乙醇100.0ml，充分混合后用超纯水定容至1L。
2.根据权利要求1所述的同时测定贝类中谷胱甘肽和游离氨基酸的方法，其特征在于：所述抗氧化剂为二硫苏糖醇、连二亚硫酸钠、维生素C中的一种。
3.根据权利要求2所述的同时测定贝类中谷胱甘肽和游离氨基酸的方法，其特征在于：所述抗氧化剂为二硫苏糖醇。
4.根据权利要求1所述的同时测定贝类中谷胱甘肽和游离氨基酸的方法，其特征在于，所述茚三酮反应液的制备方法如下：
(1)R1试剂的制备：称取茚三酮39.0-45.0g、硼氢化钠81.0-100mg，加入200ml乙二醇单甲基醚充分溶解后，用乙二醇单甲基醚定容至1L；
(2)R2试剂的制备：称取乙二醇单甲基醚401ml、冰醋酸123-130ml、乙酸钠190-204g，充分混合溶解后用超纯水定容至1L；
(3)R3试剂的制备：称取50-80ml乙醇，用超纯水定容至1L。
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