CN106153942A - 一种定量测定生物样品中白蛋白含量的方法及应用 - Google Patents

一种定量测定生物样品中白蛋白含量的方法及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN106153942A
CN106153942A CN201510212648.XA CN201510212648A CN106153942A CN 106153942 A CN106153942 A CN 106153942A CN 201510212648 A CN201510212648 A CN 201510212648A CN 106153942 A CN106153942 A CN 106153942A
Authority
CN
China
Prior art keywords
albuminous
albumin
biological sample
sample
acdm
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201510212648.XA
Other languages
English (en)
Inventor
杨凌
崔京南
王儒
王一儒
葛广波
冯磊
金强
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Original Assignee
Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dalian Institute of Chemical Physics of CAS filed Critical Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority to CN201510212648.XA priority Critical patent/CN106153942A/zh
Publication of CN106153942A publication Critical patent/CN106153942A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6486—Measuring fluorescence of biological material, e.g. DNA, RNA, cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6827—Total protein determination, e.g. albumin in urine

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)

Abstract

一种定量测定生物样品中白蛋白含量的方法及应用，该方法将ACDM与白蛋白特异性结合并形成荧光缀合物，该缀合物在pH值1-9的条件下可被激发产生稳定的荧光信号，其荧光值强度与白蛋白的浓度成正比，根据检测到的荧光值可推算出生物样品中白蛋白的含量。该方法可用于测定血浆、尿液、细胞培养液等多种生物样品中白蛋白的绝对含量，同时还具有灵敏度高、准确度高、抗环境干扰能力强、易于高通量检测等优势。

Description

一种定量测定生物样品中白蛋白含量的方法及应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种定量测定生物样品中白蛋白含量的方法及应用。
背景技术
人血浆白蛋白是血浆中含量最丰富的蛋白，约占到血浆中蛋白总量的50–60％【Biochem.Pharmacol.2005,70，1673】。人白蛋白是由肝脏合成的非糖基化单链蛋白，血液中浓度可以达到35-55mg/mL。人血清白蛋白在维持人体健康中发挥着不可替代的重要作用，其不仅能维持血液正常的渗透压，还肩负运输脂肪酸、胆色素、氨基酸、类固醇激素、金属离子和许多药物分子的重任，同时还具有抗氧化、清除毒物等作用【Nat.Struct.Biol.1998,5,827】。白蛋白的多个位点可结合各类内源性及外源性物质，从而影响上述物质在体内的转运及处置。多种疾病，比如肝病(尤其是肝硬化)、肾病综合症、肿瘤、蛋白丢失性肠病、烧伤以及营养不良等会导致血清白蛋白的水平下降，而高蛋白饮食以及慢性脱水则会造成白蛋白水平升高。因此人血中白蛋白含量的定量测定已作为临床常规检测项目并被广泛用于多种疾病的辅助诊断。大量临床实践已证实，监测血中白蛋白水平对于肝肾功能异常患者的早期诊断以及疾病的愈后都有十分重要的诊断参考价值。更为重要的是，尿液中出现微量白蛋白一般可作为肾脏疾病(如糖尿病、高血压、链球菌感染后的肾小球肾炎)、血管内皮功能障碍、心脏疾病以及静脉血栓栓塞的标志物及诊断指标【J.Am.Soc.Nephrol.2006,17,2120】。此外，血浆及白蛋白制品在存放和运输过程中往往会造成部分白蛋白变性从而给患者带来不可预料的后果。因此，准确评判血浆及白蛋白制品的质量对于临床治疗也具有重要意义。
目前，白蛋白的检测和定量方法包括：电泳法、免疫法和染料结合法等方法。其中电泳法耗时耗力，特异性较差，易造成白蛋白浓度的高估【ClinicalChemistry:Theory,Analysis,Correlation,Mosby,5th edition,2009】。而免疫法虽然其特异性较好，但成本较高，因此目前临床应用较少。染料结合显色法应用相对较为广泛，溴甲酚绿(bromocresol green)和溴甲酚紫(bromocresol purple)作为简单、便宜且特异性相对较好的两种染料分子，在临床上被较多的用来定量白蛋白。但由于这两种染料的灵敏度较低、无法保证定量的准确性，常出现高估【J Clin Pathol.2003,56,780.】或低估现象【Clin.Chim.Acta.1986,155,83.】，且不可避免受到生物样品中的非特异性干扰【Clin.Chem.2009,55,583.】。本发明提到的方法属于染料结合法，相比于目前的几种染料，其具有简单易操作、特异性高、准确可靠等特点。
本发明提供了一种定量测定生物样品中白蛋白含量的方法及应用，具体为ACDM可与白蛋白特异性结合生成荧光缀合物。该荧光缀合物在生理pH值条件下被激发后(激发波长λex＝560nm)产生稳定的荧光信号(发射波长λem＝612nm)。其荧光值强度与白蛋白的浓度成正比，根据检测到的荧光值可推算出生物样品中白蛋白的含量。该方法可用于测定血浆、尿液、细胞培养液等多种生物样品中白蛋白的绝对含量，同时还具有灵敏度高、准确度高、抗环境干扰能力强、易于高通量检测等优势。
发明内容
本发明的目的在于提供一种定量测定生物样品中白蛋白含量的方法及其应用。具体为ACDM可与白蛋白特异性结合生成荧光缀合物。该荧光缀合物在生理pH值条件下被激发后(激发波长λex＝560nm)产生稳定的荧光信号(发射波长λem＝612nm)。其荧光值强度与白蛋白的浓度成正比，根据检测到的荧光值可推算出生物样品中白蛋白的含量。该方法可用于测定血浆、尿液、细胞培养液等多种生物样品中白蛋白的绝对含量，同时还具有灵敏度高、准确度高、抗环境干扰能力强、易于高通量检测等优势。
一种定量测定生物样品中白蛋白的方法，将ACDM与白蛋白特异性结合并形成荧光缀合物，该缀合物在pH值1-9的条件下可被激发产生稳定的荧光信号，其荧光值强度与白蛋白的浓度成正比，根据检测到的荧光值可推算出生物样品中白蛋白的含量；反应式如下：
该方法具体按照以下步骤进行：
(1)A液配制：配制pH 5.5-9.5磷酸盐缓冲液0.1M，
(2)将待测样本加入A液中混匀并孵育1-3min，孵育温度为0-60℃，
(3)B液配制：以ACDM作为特异性结合配体，配制2mM的ACDM溶液，溶剂选择二甲基亚砜、甲醇或乙腈；
(4)样本测定：将步骤(2)中孵育好的溶液加入B液，混匀后用荧光检测仪检测，激发波长560nm，发射波长612nm；读取荧光值；同步测定无待测样本的本底荧光值；
(5)标准曲线绘制：配制不同浓度的白蛋白标准曲线工作液(0,5,10,20,50,75,100,200,300,400mg/L)，采用上述流程测定其荧光值并绘制标准曲线；
(6)将样本实测值代入标准曲线换算白蛋白的含量。
质控液配制：配制50mg/L的白蛋白标准液(溶于缓冲液中)作为质控样本，定期进行方法质控。
所述磷酸盐缓冲液pH优选7.4；孵育温度优选为37℃。
一种定量测定生物样品中白蛋白的方法的应用，该方法可用于多种白蛋白类产品的质量控制，包括重组表达的白蛋白、白蛋白注射液及含有白蛋白的制剂等各类医药产品。
一种定量测定生物样品中白蛋白的方法的应用，该方法可用于临床样本的体外常规检验，包括人血浆、尿液等临床样品中白蛋白含量的定量测定。
一种定量测定生物样品中白蛋白的方法的应用，该方法可用于体外定量评判肝细胞合成白蛋白的功能。
该方法检测原理如下：在生理pH条件下，一分子ACDM与一分子白蛋白特异性结合后产生一分子荧光缀合物，其荧光强度与白蛋白的含量成正比。该方法具有荧光强度增益明显，检测灵敏度高、适于高通量检测等特点。
本发明提供的白蛋白定量测定方法借助荧光检测仪实现不同生物样品中目标蛋白的快速超灵敏检测，该方法可用于重组表达的白蛋白、含有白蛋白的各类医药产品、人血浆、尿液等临床样品、体外人肝细胞中白蛋白的定量测定。
本发明所述白蛋白的定量检测方法具有以下突出优势：
(1)高特异性：该方法具有良好的特异性(如图1所示)，ACDM可与白蛋白高特异性地结合成荧光缀合物(如图4所示)；
(2)高灵敏度：ACDM具有良好的荧光发射光谱特性(560nm)，该底物与白蛋白结合产物具有荧光发射光谱特征，能较好的进行检测(如图4所示)。
(3)易高通量检测：该方法可在实验室常见各类荧光酶标仪及临床大生化仪上测定，可利用96或386微孔板进行批量检测。
(4)抗干扰能力强：内源性物质与离子等对该方法定量的影响较小(如图3所示)。
附图说明
图1.特异性筛选结果；
图2.ACDM与白蛋白的结合动力学；
图3.抗离子及内源性物质干扰试验结果；
图4.ACDM-白蛋白缀合物的荧光发射光谱图(激发波长560nm)；
图5.白蛋白定量标准曲线。
具体实施方式
下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。
所述B液：以ACDM作为特异性结合配体，配制2mM的ACDM溶液，溶剂选择二甲基亚砜、甲醇或乙腈。
实施例1.
检测方法的特异性
(1)含有转铁蛋白、肌红蛋白、胃蛋白酶、α-糜蛋白酶、胰蛋白酶、碳酸酐酶、巨球蛋白、C反应蛋白(10mg/L)、血浆(0.1％)、人血清白蛋白(150mg/L)的A液198μL，于37℃条件下震荡混匀；
(2)加入2μL的B液，以使待测样品中的ACDM的终浓度为20μM(如图2所决定)；37℃震荡混匀；
(3)5秒后，检测ACDM-白蛋白缀合物(λex＝560nm，λem＝612nm)在采集波长处的荧光强度值(见图4)。
实施例2.
白蛋白定量标准曲线的绘制
(1)采用1mg/mL的人血清白蛋白(HSA)的标准溶液，采用A液稀释成不同浓度的标准曲线工作液(0,5,10,20,50,75,100,200,300,400mg/L)(见表2)，37℃下震荡混匀；
(2)向每个所述溶液样本(198μL)中加入2μL的B液，使待测样品中的ACDM的终浓度为20μM(如图2所决定)；37℃震荡混匀5s；
表2制备系列浓度的HSA标准液
(3)分别检测ACDM-白蛋白的缀合物(λex＝560nm，λem＝612nm)在采集波长处的荧光强度值，将荧光强度比值对HSA浓度进行线性拟合作图，建立白蛋白的定量标准曲线；曲线方程为Y＝241.0×X+1277，相关系数平方为0.9994(见图5)。
实施例3.
人血浆样本中白蛋白的定量分析
(1)吸取1μL(约1小滴)人血浆样本，采用,A液稀释1000倍，于37℃条件下震荡混匀；
(2)吸取198μL样品，加入2μL的B液，以使待测样品中的ACDM的终浓度为20μM(如图2所决定)；37℃震荡孵育5秒左右；
(3)检测ACDM-白蛋白缀合物(λex＝560nm，λem＝612nm)在采集波长处的荧光强度值；将荧光比值代入实施例2中的标准曲线中，求得血浆中的白蛋白浓度为41.91mg/mL。
实施例4.
人尿液样本中白蛋白的定量分析
(1)吸取198μL人尿液样本，37℃下混匀；
(2)加入2μL的B液，以使待测样品中的ACDM的终浓度为20μM(如图2所决定)；37℃震荡混匀；
(3)检测ACDM-白蛋白缀合物(λex＝560nm，λem＝612nm)在采集波长处的荧光强度值；在标准曲线中找到对应的白蛋白浓度值，计算出待测样品中的白蛋白浓度为26.61mg/L。
实施例5.
人肝细胞白蛋白合的定量分析
(1)吸取198μL培养24h的人肝细胞培养基液，37℃下混匀；
(2)加入2μL的B液，以使待测样品中的ACDM的终浓度为20μM(如图2所决定)；37℃震荡混匀；
(3)检测ACDM-白蛋白缀合物(λex＝560nm，λem＝612nm)在采集波长处的荧光强度值；在标准曲线中找到对应的白蛋白浓度值，计算出待测样品中的白蛋白浓度为21.22mg/L。

Claims (6)

1.一种定量测定生物样品中白蛋白的方法，其特征在于：将ACDM与白蛋白特异性结合并形成荧光缀合物，该缀合物在pH值1-9的条件下可被激发产生稳定的荧光信号，其荧光值强度与白蛋白的浓度成正比，根据检测到的荧光值可推算出生物样品中白蛋白的含量；反应式如下：
2.如权利要求1所述的一种定量测定生物样品中白蛋白的方法，其特征在于具体按照以下步骤进行：
(1)A液配制：配制pH 5.5-9.5磷酸盐缓冲液0.1M；
(2)将待测样本加入A液中混匀并孵育1-3min，孵育温度为0-60℃；
(3)B液配制：以ACDM作为特异性结合配体，配制2mM的ACDM溶液，溶剂选择二甲基亚砜、甲醇或乙腈；
(4)样本测定：将步骤(2)中孵育好的溶液加入B液，混匀后用荧光检测仪检测，激发波长560nm，发射波长612nm；读取荧光值；同步测定无待测样本的本底荧光值；
(5)标准曲线绘制：配制不同浓度的白蛋白标准曲线工作液：0,5,10,20,50,75,100,200,300,400mg/L；采用上述流程测定其荧光值并绘制标准曲线；
(6)将样本实测值代入标准曲线换算白蛋白的含量。
3.如权利要求2所述的一种定量测定生物样品中白蛋白的方法，其特征在于具体步骤优选如下：磷酸盐缓冲液pH优选7.4；孵育温度优选为37℃。
4.一种如权利要求1或2所述定量测定生物样品中白蛋白的方法的应用，其特征在于：该方法可用于多种白蛋白类产品的质量控制，包括重组表达的白蛋白、白蛋白注射液及含有白蛋白的制剂等各类医药产品。
5.一种如权利要求1或2所述定量测定生物样品中白蛋白的方法的应用，其特征在于：该方法可用于临床样本的体外常规检验，包括人血浆、尿液等临床样品中白蛋白含量的定量测定。
6.一种如权利要求1或2所述定量测定生物样品中白蛋白的方法的应用，其特征在于：该方法可用于体外定量评判肝细胞合成白蛋白的功能。
CN201510212648.XA 2015-04-28 2015-04-28 一种定量测定生物样品中白蛋白含量的方法及应用 Pending CN106153942A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510212648.XA CN106153942A (zh) 2015-04-28 2015-04-28 一种定量测定生物样品中白蛋白含量的方法及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510212648.XA CN106153942A (zh) 2015-04-28 2015-04-28 一种定量测定生物样品中白蛋白含量的方法及应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106153942A true CN106153942A (zh) 2016-11-23

Family

ID=57347713

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510212648.XA Pending CN106153942A (zh) 2015-04-28 2015-04-28 一种定量测定生物样品中白蛋白含量的方法及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106153942A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106841128A (zh) * 2016-12-07 2017-06-13 苏州尚稷电子科技有限公司 一类检测人血清白蛋白的高特异性荧光探针的应用
CN108548798A (zh) * 2018-03-07 2018-09-18 南京中医药大学 与细胞内胶体渗透压相关的生物大分子光学检测方法及其相关药物筛选方法的构建和应用

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106841128A (zh) * 2016-12-07 2017-06-13 苏州尚稷电子科技有限公司 一类检测人血清白蛋白的高特异性荧光探针的应用
CN106841128B (zh) * 2016-12-07 2019-12-27 苏州尚稷电子科技有限公司 一类检测人血清白蛋白的高特异性荧光探针的应用
CN108548798A (zh) * 2018-03-07 2018-09-18 南京中医药大学 与细胞内胶体渗透压相关的生物大分子光学检测方法及其相关药物筛选方法的构建和应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Wang et al. A highly selective turn-on near-infrared fluorescent probe for hydrogen sulfide detection and imaging in living cells
Bainor et al. Bicinchoninic acid (BCA) assay in low volume
Skurup et al. New creatinine sensor for point-of-care testing of creatinine meets the National Kidney Disease Education Program guidelines
US9340821B2 (en) Specific fluorescent probe based on albumin pseudo-esterase hydrolysis reaction and use thereof
CN101503732B (zh) 一种葡萄糖氧化酶单一液体测定试剂
CN102081100B (zh) 一种肝癌多标志物微阵列试剂盒、其制备方法及其应用
Tang et al. Photo-controlled fluorescence “Double-Check” for human serum albumin and its applications
JP6218894B2 (ja) Ｌ−グルタミン酸測定キット
Wu et al. Colorimetric detection of glucose based on the binding specificity of a synthetic cyclic peptide
CN103048282B (zh) 一种胆红素的检测方法及检测试剂盒
JP2023106453A (ja) 酵素組成物を用いたクレアチンレベルの検出
Wen et al. Specific fluorescence release based on synergistic activation of enzymes and position-dependent of electrophilic groups to diagnose intrahepatic cholestasis of pregnancy
CN106153942A (zh) 一种定量测定生物样品中白蛋白含量的方法及应用
Chao et al. A fluorescent sensor recognized by the FA1 site for highly sensitive detection of HSA
CN106367471A (zh) 用于测定总胆固醇的试剂盒和方法
CN109613232A (zh) 一种完全均相测定脂联素的检测试剂盒及检测方法
CN106443014B (zh) 缺血修饰白蛋白的检测试剂盒及其制备方法
CN106353505B (zh) 基于催化信号放大的ApoE试剂盒
CN108007922B (zh) 一种采用酶化学发光法检测葡萄糖的试剂盒
CN106319029B (zh) 用于测定葡萄糖的试剂盒和方法
CN105510572A (zh) 一种甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶检测试剂盒
CN106324234B (zh) 修饰的n-乙酰神经氨酸醛缩酶及其制备方法和应用
JP2009532692A (ja) リポタンパク質センサ
CN110343740A (zh) 一种高灵敏的乳酸测定方法及乳酸检测试剂盒
CN108593905A (zh) 一种地高辛免疫检测试剂及其制备和检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20161123