CN117451889A - 受小分子影响的阳离子层析动态载量检测方法、应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了受小分子影响的阳离子层析动态载量检测方法、应用，所述方法包括：(1)平衡阳离子层析柱后，用含小分子的反应液上样至A280吸收值达到平台；(2)分段收集流穿样品，并记录其对应的上样载量；(3)将上样样品与收集流穿样品等体积上样进行SEC液相色谱检测，得出各样品主峰峰面积；(4)计算各流穿样品SEC液相色谱主峰峰面积的比值；(5)根据比值拟合载量‑流穿上样SEC液相色谱主峰峰面积比值曲线；(6)根据拟合曲线计算产品流穿量为10％时对应载量。优点在于：(1)结合SEC液相色谱和拟合模型，分离并定量小分子杂质，通过模型曲线计算上样样品在层析柱填料上的最大动态结合载量；(2)检测灵敏度高、准确性好、适用范围广。
Description
技术领域
本发明属于生物化学技术领域，涉及阳离子层析动态结合载量的测定方法，具体为在抗体偶联药物的生产过程中，受小分子影响的阳离子层析动态载量检测方法、应用。
背景技术
在抗体偶联药物的生产过程中，阳离子层析是ADC反应液的常用纯化方式。若游离小分子有紫外吸收，会直接影响阳离子层析流穿液的紫外吸收值，从而影响动态结合载量的测定。传统的阳离子层析动态载量测定方法是通过实时监测流穿液A280吸收值，当流穿吸收值达到上样吸收值的10％时，即ADC分子流穿浓度达到上样浓度的10％，此时所对应的载量即为ADC分子在该填料上的最大动态结合载量。这种测定方法的缺点是若游离小分子有紫外吸收，层析流穿液的紫外吸收值是由小分子和流穿的ADC分子共同产生的，从而无法准确判断出动态结合载量，计算出的载量结果误差较大。
利用SEC液相色谱可分离小分子杂质的特性，对流穿液中目的ADC分子含量进行定量检测，从而准确计算出阳离子层析的动态结合载量。但SEC液相色谱得出的检测结果不是一个直观的数据，需要对流穿液对应SEC液相色谱主峰峰面积比值进行作曲线，拟合模型后，得出目的流穿比例对应的载量。
发明内容
解决的技术问题：为了克服现有技术的不足，针对因小分子有紫外吸收导致的阳离子层析动态载量不准确的问题，结合SEC液相色谱和模型拟合，提出受小分子影响的阳离子层析动态载量检测方法、应用。
技术方案：受小分子影响的阳离子层析动态载量检测方法，所述方法包括以下步骤：
S1、平衡阳离子层析柱，设定保留时间，用含小分子的反应液进行上样，至A280吸收值达到平台；
S2、上样过程中分段收集流穿样品，并记录每管流穿样品对应的上样载量；
S3、将S1中的上样样品与S2收集的各流穿样品等体积上样，进行SEC液相色谱检测，得出各样品主峰峰面积；
S4、分别计算各流穿样品与上样样品的SEC液相色谱主峰峰面积的比值，即ADC含量在总蛋白量中的占比值；
S5、根据S4中的比值拟合载量-流穿上样SEC液相色谱主峰峰面积比值曲线，拟合模型为线性模型、双参数logistic模型或三参数logistic模型；
S6、根据S5中拟合的曲线计算含小分子的反应液流穿量为10％时的对应载量。
优选的，S1中，反应液中的小分子为具有紫外吸收特性。
优选的，S5中，采用数据统计工具进行拟合，其中，
双参数logistic模型的公式为y＝1/(1+exp(-a*(x-b)))(更正公式)，x为上样载量，y为各流穿样品与上样样品的SEC液相色谱主峰峰面积的比值，a为增长率、b为拐点，exp为自然指数函数；
三参数logistic模型的公式为y＝c/(1+exp(-a*(x-b)))，x为上样载量，y为各流穿样品与上样样品的SEC液相色谱主峰峰面积的比值，a、b、c为模型的参数，a为增长率、b为拐点、c为渐近线，exp为自然指数函数。
以上任一所述方法在检测受小分子紫外吸收影响的ADC产品阳离子层析动态载量中的应用。
优选的，所述小分子为一甲基澳瑞他汀E。
优选的，拟合的三参数logistic模型公式为y＝0.980/(1+exp(-0.255*(x-118.94)))其中，x为上样载量，y为流穿样品与上样样品的SEC液相色谱主峰峰面积的比值，exp为自然指数函数。
有益效果：(1)本发明所述方法结合SEC液相色谱和拟合模型，一方面分离并定量小分子杂质，另一方面通过模型曲线计算反应液的流穿量为10％时对应的载量，即上样样品在层析柱填料上的最大动态结合载量；(2)所述方法的检测灵敏度高、准确性好、适用范围广。
附图说明
图1是实施例1在实验室规模2.16mL Tricorn 5/150层析柱上测定ADC反应液阳离子动态载量的层析图谱；
图2是实施例1中的SEC-HPLC检测图谱；
图3为实施例1中载量-流穿上样SEC-HPLC主峰峰面积比值拟合的曲线；
图4是实施例2在实验室规模6.158mL 0.66cm x 20cm层析柱上测定ADC反应液阳离子动态载量的层析图谱；
图5为实施例2中载量-流穿上样SEC-HPLC主峰峰面积比值拟合的曲线。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1采用三参数logistic模型
本实施例对抗体偶联药物生产过程中的ADC反应液进行阳离子层析填料的动态载量进行预测，采用Praeato SP65填料，Tricorn 5层析柱(11cm高，2.16mL，As＝1.36,HETP:0.04cm)制备出流穿样品，首先利用SEC-HPLC检测受小分子(MMAE)紫外吸收影响的阳离子层析的上样和流穿样品，再通过拟合的曲线预测阳离子层析填料的动态载量。具体包括以下步骤：
S1、平衡阳离子层析柱后，设定保留时间5分钟，用ADC反应液进行上样至A280吸收值达到平台为2155mAU，上样样品浓度7.0mg/ml；
S2、上样过程中即每上样2.73ml收集0.25ml流穿样，即每上样10mg/ml载量进行取样，每管样品对应上样载量详见表1，层析图谱见图1；
S3、将上样与收集流穿样品(只检测有紫外吸收的样品)等体积上样进行SEC-HPLC检测，得出各样品主峰峰面积见表1，SEC-HPLC检测图谱见图2；
S4、计算各流穿样品与上样样品主峰峰面积的比值，结果详见表1；
S5、根据S4中的比值拟合载量-流穿上样SEC-HPLC主峰峰面积比值拟合曲线，拟合模型见图3，公式为y＝0.980/(1+expP(-0.255*(x-118.94)))其中，x为上样载量，y为流穿与上样样品SEC-HPLC主峰峰面积的比值，exp为自然指数函数；
S6、根据S5的拟合公式计算ADC产品在保留时间为5分钟时，流穿量为10％对应载量，即y＝0.1，计算x＝ln(0.980/0.1 -1)/(-0.255)+118.94＝110.41mg/ml resin。
S7、若按照传统的阳离子层析动态载量测定方法，当流穿吸收值达到上样吸收值的10％即2155mAU*10％＝216mAU时，此时所得对应的载量112.77mg/ml resin，是S6中载量的102％。
表1实施例1中的载量、主峰面积及各流穿样品与上样样品主峰峰面积的比值
实施例2采用双参数logistic模型
本实施例对抗体偶联药物生产过程中的ADC反应液进行阳离子层析填料的动态载量进行预测，采用Praeato SP65填料，0.66cm层析柱(18.0cm高，6.158mL，As＝0.82,HETP:0.04cm)制备出流穿样品，首先利用SEC-HPLC检测受小分子(MMAE)紫外吸收影响的阳离子层析的上样和流穿样品，再通过拟合的曲线预测阳离子层析填料的动态载量。具体包括以下步骤：
S1、平衡阳离子层析柱后，设定保留时间3分钟，用ADC反应液进行上样至A280吸收值达到平台为1531mAU，上样样品浓度5.9mg/ml；
S2、上样过程中即每上样10.33ml收集0.83ml流穿样，即每上样10mg/ml载量进行取样，每管样品对应上样载量详见表2，层析图谱见图4；
S3、将上样与收集流穿样品(只检测有紫外吸收的样品)等体积上样进行SEC-HPLC检测，得出各样品主峰峰面积见表2；
S4、计算各流穿样品与上样样品主峰峰面积的比值，结果详见表2；
S5、根据S4中的比值拟合载量-流穿上样SEC-HPLC主峰峰面积比值拟合曲线，拟合模型见图3，公式为c/c0＝1/(1+exp(-0.049*(DBC-133.51)))其中，DBC为上样载量，c/c0为流穿与上样样品SEC-HPLC主峰峰面积的比值，exp为自然指数函数；
S6、根据S5的拟合公式计算ADC产品在保留时间为3分钟时，流穿量为10％时对应载量，即c/c0＝0.1，计算DBC＝ln(1/0.1 -1)/(-0.049)+133.51＝88.67mg/ml resin。
S7、若按照传统的阳离子层析动态载量测定方法，当流穿吸收值达到上样吸收值的10％即1531mAU*10％＝153mAU时，此时所得对应的载量11.2mg/ml resin，只有S6中载量的12％。
表2实施例2中的载量、主峰面积及各流穿样品与上样样品主峰峰面积的比值
Claims (6)
1.受小分子影响的阳离子层析动态载量检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
S1、平衡阳离子层析柱，设定保留时间，用含小分子的反应液进行上样，至A280吸收值达到平台；
S2、上样过程中分段收集流穿样品，并记录每管流穿样品对应的上样载量；
S3、将S1中的上样样品与S2收集的各流穿样品等体积上样，进行SEC液相色谱检测，得出各样品主峰峰面积；
S4、分别计算各流穿样品与上样样品的SEC液相色谱主峰峰面积的比值，即ADC含量在总蛋白量中的占比值；
S5、根据S4中的比值拟合载量-流穿上样SEC液相色谱主峰峰面积比值曲线，拟合模型为线性模型、双参数logistic模型或三参数logistic模型；
S6、根据S5中拟合的曲线计算含小分子的反应液流穿量为10％时的对应载量。
2.根据权利要求1所述的受小分子影响的阳离子层析动态载量检测方法，其特征在于，S1中，反应液中的小分子为具有紫外吸收特性。
3.根据权利要求1所述的受小分子影响的阳离子层析动态载量检测方法，其特征在于，S5中，采用数据统计工具进行拟合，其中，
双参数logistic模型的公式为y＝1/(1+exp(-a*(x-b)))(更正公式)，x为上样载量，y为各流穿样品与上样样品的SEC液相色谱主峰峰面积的比值，a为增长率、b为拐点，exp为自然指数函数；
三参数logistic模型的公式为y＝c/(1+exp(-a*(x-b)))，x为上样载量，y为各流穿样品与上样样品的SEC液相色谱主峰峰面积的比值，a、b、c为模型的参数，a为增长率、b为拐点、c为渐近线，exp为自然指数函数。
4.权利要求1-3任一所述方法在检测受小分子紫外吸收影响的抗体偶联药物ADC产品阳离子层析动态载量中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述小分子为一甲基澳瑞他汀E。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，拟合的三参数logistic模型公式为y＝0.980/(1+exp(-0.255*(x-118.94)))其中，x为上样载量，y为流穿样品与上样样品的SEC液相色谱主峰峰面积的比值，exp为自然指数函数。
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