CN111735888B - 用于诊断元宝枫籽油中神经酸起效的生物标记物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于诊断元宝枫籽油中神经酸起效的生物标志物，该生物标志物包括SM(d17:1/24:1)或/和Cer(d18:1/24:1(15Z))。本发明还提供了该生物标志物在制备检测试剂中的应用。本发明提供的用于诊断元宝枫籽油中神经酸起效的生物标志物，可以用于判断神经酸是否被机体吸收并转化，为食用元宝枫籽油后神经酸是否发挥作用提供了指导意义。

Description

用于诊断元宝枫籽油中神经酸起效的生物标记物及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于诊断神经酸起效的生物标记物及其应用。
背景技术
神经酸(Nervonic Acid)，又名鲨鱼酸(Selacholeic Acid)，学名为:顺- 15-二十四碳烯酸(cis- 15- Te-tracosenic Acid)分子式为C24H46O2，分子量为366.6，纯品在常温下为白色针状固体，是一种n- 9型特长链单烯脂肪酸。神经酸最早发现于哺乳动物的神经组织，故命名为神经酸。神经酸在神经组织和脑组织中含量较高，是生物膜的重要组成成分，通常作为脑甙中髓质(白质)的标志物，参与生物膜有关的多种特殊生理功能。神经酸主要以鞘糖脂和鞘磷脂形式存在于人体大脑蛋白质、视网膜、精子和神经组织中。由于人体自身合成神经酸效率低，只有从自然界中鲨鱼脑及少数几种植物提取，其在国际上也属于昂贵的医药和保健品原料。
国内外研究表明，神经酸是大脑神经细胞和神经组织的核心天然成分，是迄今为止世界上发现的能促进受损神经组织修复和再生的特效物质。随着年龄的增长，机体中神经酸的缺乏将会增加脑中风后遗症、老年痴呆、脑瘫、脑萎缩、记忆力减退、失眠健忘等退行性脑病的发生几率。未发病的中老年人群适当的补充神经酸，可以预防发生上述疾病。人体试食试验结果表明，每日食神经酸，连续服用1个月，试验组各项测验指标与对照组相比，心智、图片、再认、联想、触觉、理解和值均显著提高，说明神经酸对受试者的记忆能力和值均有显著改善和提高。用腹水型肿瘤模型对元宝枫油的抗肿瘤活性研究表明，元宝枫油对艾氏腹水瘤小鼠的平均生命延长率为81.19%。因此，元宝枫籽油的服用，可以提高记忆力，提高认知能力。
动植物油脂的化学本质是脂酰甘油，其中最主要的是三酰甘油或称甘油三酯(TG)。服用元宝枫籽油后，其含有的独特成分——神经酸是否可以被机体吸收利用，同时TG型的神经酸在体内，会转化为什么结构的代谢物，它的起效标志物是什么，这些非常重要的问题，迄今为止，还没有明确的研究可以证明，甚至少有研究。因此，本发明提供了一种方法，确定了神经酸起效的时间，同时寻找确定神经酸起效的分子标志物。
发明内容
为了能够确定神经酸在机体内是否有作用，本发明提供用于诊断神经酸起效的生物标志物。
为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：
用于诊断神经酸起效的生物标志物，该生物标志物包括SM(d17:1/24:1)或/和Cer(d18:1/24:1(15Z))。
如上所述的神经酸起效的生物标志物在制备检测神经酸起效试剂中的应用。
如上所述的应用，优选地，所述神经酸起效的生物标志物在食用元宝枫籽油或含神经酸的产品前后，血清中含量变化≥1.2倍，说明元宝枫籽油或含神经酸的产品有作用。
如上所述的应用，优选地，神经酸起效的生物标志物SM(d17:1/24:1)在食用元宝枫籽油或含神经酸的产品前后，血清中含量变化≥1.2倍，说明元宝枫籽油或含神经酸的产品有作用。
如上所述的应用，优选地，神经酸起效的生物标志物Cer(d18:1/24:1(15Z))在食用元宝枫籽油或含神经酸的产品前后，血清中含量变化≥1.3倍，说明元宝枫籽油或含神经酸的产品有作用。
本发明的有益效果在于：
本发明提供的用于诊断神经酸起效的生物标志物，检测该生物标志物，可以用于判断神经酸是否被机体吸收并转化，为是食用元宝枫籽油或神经酸产品是否有效果提供了指导意义。
本发明还提供了用于诊断神经酸起效的生物标志物在检测试剂中的应用。可用于评估个体补充神经酸产品后的效果。
附图说明
图1为补充元宝枫籽油1天后，正负离子模式下VIP＞1的化合物；
图2 为补充元宝枫籽油1天后，正负离子模式下(O)PLS-DA的得分图；
图3 为补充元宝枫籽油1天后，正负离子模式下S-plot图；
图4为补充元宝枫籽油3天后，正负离子模式下VIP＞1的样本；
图5 为补充元宝枫籽油3天后，正负离子模式下(O)PLS-DA的得分图；
图6 为补充元宝枫籽油3天后，正负离子模式下S-plot图；
图7为补充元宝枫籽油7天后，正负离子模式下VIP＞1的样本；
图8 为补充元宝枫籽油7天后，正负离子模式下(O)PLS-DA的得分图；
图9为补充元宝枫籽油7天后，正负离子模式下S-plot图；
图10为服用元宝枫油不同天数时，血清中的含神经酸链的脂质SM(d17:1/24:1)的变化结果；
图11为服用元宝枫油不同天数时，血清中的含神经酸链的脂质Cer(d18:1/24:1(15Z))的变化结果。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。
本发明中所用的元宝枫籽油由宝枫生物科技（北京）有限公司提供，其神经酸含量由第三方检测公司-谱尼进行检测，检测结果为含顺- 15-二十四碳烯酸为6.89%。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
一、样品采集
将30只5-6周龄雄性SD大鼠随机分为2组，分别为元宝枫籽油组（NA组）、正常对照组（CK组）各组大鼠适应性喂养1周后进入实验，元宝枫籽油组根据人与大鼠间药物剂量换算方法计算给药量按所含神经酸0.03g/kg/d灌胃给药，每天给药1次，连续给药1天后分别采集血液。正常对照组常规饲养，取样方法同上。
二、实验仪器及试剂：
实验仪器：
1.冷冻离心机：型号D3024R，Scilogex公司，美国；
2.漩涡振荡器：型号MX-S，Scilogex公司，美国；
3.高分辨质谱仪：ESI-QTOF/MS；型号：Xevo G2-S Q-TOF；厂家：Waters,Manchester, UK；
4.超高效液相色谱：UPLC；型号：ACQUITY UPLC I-Class系统；厂家：Waters,Manchester, UK；
5.数据采集软件：MassLynx4.1; 厂家：Waters
6.分析鉴定软件：Progenesis QI; 厂家：Waters；
实验试剂：
异丙醇、乙腈，甲酸，甲酸氨，亮氨酸脑啡肽，甲酸钠。厂家均为Fisher。
三、实验方法
1.样品前处理
收集的血清样本在冰上解冻，200μL的血浆用600μL的预冷异丙醇萃取，涡流1min，室温孵育10min，然后将萃取混合物在-20℃下储存过夜，4000r离心20min后，将上清液转移到新的离心管，用异丙醇/乙腈/水(2：1：1，v：v：v)稀释至1：10。样品在LC-MS分析前保存在-80℃。此外，还将每个萃取混合物的10μL组合在一起制备混合血浆样品。
2. 脂质组学的超高效液相色谱-质谱联用方法
将混合血浆样品用ACQUITY UPLC(Waters，美国)连接到带有ESI的Xevo-G2XS高分辨飞行时间 (QTOF)质谱仪(Waters)进行分析。采用CQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1×100 mm，1.7μm，Waters)，流动相为10 mM甲酸铵-0.1%甲酸-乙腈(A，6 0：40，v/v)和10 mM甲酸铵-0.1%甲酸-异丙醇-乙腈(B，90：10，v/v)。在大规模研究之前，进行了包括10分钟、15分钟和20分钟洗脱期的中试实验，以评估流动相组成和流速对脂质保留时间的潜在影响。在PIM中，丰富的脂质前体离子和碎片以相同的顺序分离，具有相似的峰形和离子强度。此外，具有10分钟洗脱期的混合质控（QC）也表现出与测试样品相似的前体和碎片的基峰强度。流动相流速为0.4mL/min。该柱最初用40%B洗脱，然后在2分钟内线性梯度到43%B，然后在0.1min内将B的百分比增加到50%。在接下来的3.9分钟内，梯度进一步增加到54%B，然后B的量0.1分钟内增加到70%。在梯度的最后部分，B的量在1.9分钟内增加到99%。最后，溶液B在0.1分钟内返回到40%，并且在下一次进样之前将色谱柱平衡1.9分钟。每次进样量为5μL，用Xevo-G2XS型QTOF质谱仪检测正负两种模式下的脂质，采集范围为 m/z50~1200年，采集时间为0.2s/次。离子源温度为120℃，去溶温度为600℃，气体流量为1000L/h，以氮气为流动气体。毛细管电压为2.0kV(+)/锥体电压为1.5kV(-)，锥体电压为30V。以亮氨酸脑啡肽进行标准质量测定，用甲酸钠溶液进行校正。样品被随机排序。每10个样本注入一个质控（QC）样本并进行分析，以调查数据的重复性。
四、结果
1、利用多元统计学寻找血清差异物
正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）结合了正交信号矫正（OSC）和偏最小二乘回归分析法（PLS-DA） 方法，通过去除不相关的差异来筛选差异变量。如附图中所示：图1为正负离子模式下 VIP＞1的代谢物，其中，A正离子模式，B为负离子模式， VIP值为正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）第一主成分的变量重要性投影，通常以VIP>1为代谢组学常用评判标准，作为差异代谢物筛选的标准之一；图2正负离子模式下(O)PLS-DA的得分图，C为正离子模式下(O)PLS-DA的得分图，（图中N-A表示元宝枫籽油组，CK表示空白对照组）和D为负离子模式下(O)PLS-DA的得分图，即两个分组中的第一主成分和第二主成分通过降维的方式所得的得分图，横坐标表示组间差异，纵坐标表示组内差异，且两组结果分离较好，说明此方案可以使用。图3为正负离子模式下S-plot图，E为正离子模式下S-plot图，F负离子模式下S-plot图，横坐标表示主成分与代谢物的协相关系数，纵坐标表示主成分与代谢物的相关系数，同时满足p<0.05，VIP>1的条件下，负离子模式有24个差异物，正离子模式有49个差异物。为了进一步缩小范围，将VIP阈值提高到5，同时体现正常和模型之间的倍数差异在0.7倍以下，或者增加1.4倍以上，最终得到以下5个化合物:TG(16:1(9Z)/22:5(7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z))，TG(18:3(6Z,9Z,12Z)/20:3(8Z,11Z,14Z)/20:4,(5Z,8Z,11Z,14Z))， TG(14:1(9Z)/20:2(11Z,14Z)/22:5(7Z,10Z,13Z,16Z,19Z))，TG(16:0/20:3(8Z,11Z,14Z)/22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z))，TG(16:1(9Z)/18:4(6Z,9Z,12Z,15Z)/22:1(11Z))。
2、约登分析
对5个化合物，进行youden 约登指数计算，通过AUC来用来反映单个指标对整体的诊断和预测效果，从而确定这些指标是分子标志物。结果如表1.
表1 补充元宝枫籽油1天后相关脂质的约登指数分析
编号 化合物名称 AUC值 特异性 敏感度
R1 TG(16:1(9Z)/22:5(7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)) 0.96 0.8 1
R2 TG(18:3(6Z,9Z,12Z)/20:3(8Z,11Z,14Z)/20:4(5Z,8Z,11Z,14Z)) 0.96 0.8 1
R3 TG(14:1(9Z)/20:2(11Z,14Z)/22:5(7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)) 1 1 1
R4 TG(16:0/20:3(8Z,11Z,14Z)/22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)) 0.92 0.8 1
R5 TG(16:1(9Z)/18:4(6Z,9Z,12Z,15Z)/22:1(11Z)) 0.88 0.8 1
表1列出来单个代谢物预测服用补充元宝枫籽油1天的曲线下面积（AUC）、敏感度和特异性，相关参数显示以上5种脂质中，R3的预测能力最好（AUC=1）。
结果证明，以上5个化合物，就是服用1天元宝枫籽油后，血液中特异出现的分子标志物，其中并不含有24：1结构的化合物，说明还没有起效果。
实施例2
本实施例是在实施例1的基础上连续给药3天后采集的血液进行检测结果分析，实验操作及方法同实施例1。结果如下：
1、利用多元统计学寻找血清差异物
正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）结合了正交信号矫正（OSC）和 偏最小二乘回归分析法（PLS-DA）方法，通过去除不相关的差异来筛选差异变量。结果如图4，其中，A为正离子模式下VIP>1的代谢物，B为负离子模式下VIP>1的代谢物，VIP值为正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）第一主成分的变量重要性投影，通常以VIP>1为代谢组学常用评判标准，作为差异代谢物筛选的标准之一；图5为元宝枫籽油组（N-A表示）和空白对照组（CK表示）两个分组中的第一主成分和第二主成分通过降维的方式所得的得分图，其中，C为正离子模式下(O)PLS-DA的得分图，D为负离子模式下(O)PLS-DA的得分图；横坐标表示组间差异，纵坐标表示组内差异，且两组结果分离较好，说明此方案可以使用。图6为S-plot图，E为正离子模式下的S-polt图，F为正离子模式下的S-polt图，横坐标表示主成分与代谢物的协相关系数，纵坐标表示主成分与代谢物的相关系数，同时满足p<0.05,VIP>1的条件下，负离子模式有73个差异物，正离子模式有65个差异物。为了进一步缩小范围，将VIP阈值提高为5，同时体现正常和模型之间的倍数差异在0.7倍以下，或者增加1.4倍以上，最终得到以下9个化合物：SM(d17:1/24:1)，18:1-Glc-Campesterol；Cer(d18:1/24:1(15Z))；PI(18:0/20:3(8Z,11Z,14Z))；PS(21:0/20:2(11Z,14Z))；SM(d18:2/24:0)；TG(17:2(9Z,12Z)/18:1(9Z)/22:1(11Z))[iso6]；PC(20:5(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)/20:3(8Z,11Z,14Z))；PC(20:3(5Z,8Z,11Z)/18:0)。
2、约登分析
然后对9个化合物，进行youden 约登指数计算，用来反映单个指标对整体的诊断和预测效果，确定分子标志物，结果见表2。
表2补充元宝枫籽油3天后相关脂质的约登指数分析
Figure DEST_PATH_IMAGE002AAAAAAA
表2列出来单个代谢物预测服用补充元宝枫籽油3天的曲线下面积（AUC）、敏感度和特异性，相关参数显示以上9种脂质中，R1、R2、R3、R6和R7的预测能力最好（AUC=1），说明他们是血液中的分子标志物。而R1和R3中含有24：1，就是表示含有神经酸链，说明服用元宝枫籽油开始起效果。
实施例3
本实施例是在实施例1的基础上连续给药的7天后采集的血液进行检测结果分析，实验操作及方法同实施例1。结果如下：
1、利用多元统计学寻找血清差异物
正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）结合了正交信号矫正（OSC）和 PLS-DA 方法，通过去除不相关的差异来筛选差异变量。结果如图7为正负离子模式下 VIP＞1的代谢物，其中，A为正离子模式，B为负离子样本，VIP值为正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）第一主成分的变量重要性投影，通常以VIP>1为代谢组学常用评判标准，作为差异代谢物筛选的标准之一；图8正负离子模式下(O)PLS-DA的得分图，其中，C为正离子模式下(O)PLS-DA的得分图，（图中N-A表示元宝枫籽油组，CK表示空白对照组）和D为负离子模式下(O)PLS-DA的得分图，即为元宝枫籽油组（N-A表示）和空白对照组（CK表示）两个分组中的第一主成分和第二主成分通过降维的方式所得的得分图，横坐标表示组间差异，纵坐标表示组内差异，且两组结果分离较好，说明此方案可以使用。图9为正负离子模式下S-plot图，其中，E为正离子模式下的S-polt图，F为负离子模式下的S-polt图，横坐标表示主成分与代谢物的协相关系数，纵坐标表示主成分与代谢物的相关系数，同时满足p<0.05,VIP>1的条件下，负离子模式有51个差异物，正离子模式有21个差异物。为了进一步缩小范围，将VIP阈值提高到5，同时体现正常和模型之间的倍数差异在0.7倍以下，或者增加1.4倍以上，最终得到以下4个化合物：SM(d17:1/24:1)，1,2-didocosanoyl-sn-glycero-3-phosphosulfocholine，Cer(d18:1/24:1(15Z))，SM(d18:2/24:0)。
2、约登分析
然后对这4个化合物，进行youden 约登指数计算，用来反映单个指标对整体的诊断和预测效果，结果如下表3。
表3 补充元宝枫籽油7天后相关脂质的约登指数分析
编号 化合物名称 AUC值 特异性 敏感度
R1 SM(d17:1/24:1) 1 1 1
R2 1,2-didocosanoyl-sn-glycero-3-phosphosulfocholine 1 1 1
R3 Cer(d18:1/24:1(15Z)) 1 1 1
R4 SM(d18:2/24:0) 1 1 1
表3列出来单个代谢物预测服用补充元宝枫籽油7天的曲线下面积（AUC）、敏感度和特异性，相关参数显示以上4种脂质中，SM(d17:1/24:1)，1,2-didocosanoyl-sn-glycero-3-phosphosulfocholine，Cer(d18:1/24:1(15Z))和SM(d18:2/24:0)的预测能力最好（AUC=1），说明他们都是血液的分子标志物。而SM(d17:1/24:1)和Cer(d18:1/24:1(15Z))中含有24：1，就是表示含有神经酸链，说明服用元宝枫籽油后发生了效果。
实施例4 服用元宝枫油不同天数血清中的含神经酸链的脂质变化
将50只5-6周龄雄性SD大鼠随机分为2组，分别为元宝枫籽油组（NA组）、正常对照组（CK组）各组大鼠适应性喂养1周后进入实验，元宝枫籽油组按所含神经酸0.03g/kg/d灌胃给药，每天给药1次，连续给药1天、3天和7天时，分别采集血液，正常对照组常规饲养，与元宝枫籽油组同时采集血液进行神经酸链的脂质SM(d17:1/24:1)和Cer(d18:1/24:1(15Z))的检测，检测结果如表4所示，其中，SM(d17:1/24:1)的变化见图10所示，Cer(d18:1/24:1(15Z))的检测结果见图11所示。
表4
SM(d17:1/24:1)和Cer(d18:1/24:1(15Z))的变化化合物 第1天（NA1） 第3天(NA3) 第7天(NA7) NA7/NA1
SM(d17:1/24:1) 245574.2 340912.8 291861.8 1.2
Cer(d18:1/24:1(15Z)) 135883.1 209352.5 172840.3 1.3
结果发现，与正常组相比，SM(d17:1/24:1)和Cer(d18:1/24:1(15Z))两种含神经酸链的脂质含量增加。同时，第三天和第七天，服用元宝枫籽油的大鼠，两种化合物含量上并没有显著差异。因此，服用元宝枫油3天以后，效果稳定。
结果说明，与服用元宝枫油之前比较，当服用元宝枫籽油后，血液中的SM(d17:1/24:1)≥1.2倍或者Cer(d18:1/24:1(15Z))≥1.3倍，则证明服用元宝枫籽油后，其含有的TG型神经酸被机体吸收并转化为SM(d17:1/24:1)和Cer(d18:1/24:1(15Z))发挥效果。

Claims (1)

1.生物标志物SM(d17:1/24:1)或/和Cer(d18:1/24:1(15Z))在制备检测神经酸起效试剂中的应用， 其中，所述神经酸起效的生物标志物SM(d17:1/24:1)在食用元宝枫籽油或含神经酸的产品前后，血清中含量变化≥1.2倍，说明元宝枫籽油或含神经酸的产品有作用；其中，所述神经酸起效的生物标志物Cer(d18:1/24:1(15Z))在食用元宝枫籽油或含神经酸的产品前后，血清中含量变化≥1.3倍，说明元宝枫籽油或含神经酸的产品有作用。
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