CN113495160B - 用于诊断高原环境下的缺血缺氧性脑病补充神经酸起效的分子标志物及其应用 - Google Patents

用于诊断高原环境下的缺血缺氧性脑病补充神经酸起效的分子标志物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了用于诊断高原环境下的缺血缺氧性脑病补充神经酸起效的分子物标志物及其应用。具体地说，是分子标志物磷脂酰乙醇胺‑神经酰胺(d16:1(4E)/24:1(15Z))在制备用于诊断高原环境下的缺血缺氧性脑病补充神经酸起效试剂中的应用。通过检测该分子标志物，可以用于判断元宝枫神经酸油或类似神经酸产品是否被机体吸收并转化，为食用元宝枫神经酸油或类似产品是否有效果提供了指导意义。

Description

用于诊断高原环境下的缺血缺氧性脑病补充神经酸起效的分 子标志物及其应用
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及用于诊断高原环境下的缺血缺氧性脑病补充神经酸起效的分子标志物及其应用。
背景技术
缺血缺氧性脑病指因脑急性缺氧导致氧的供应和利用不能满足大脑组织代谢需求而造成的弥漫性脑组织损害，多见于新生儿。新生儿缺血缺氧性脑病（hypoxie-ischemicencephalopathy，HIE） 是临床上导致新生儿病死以及神经发育障碍的重要因素，是新生儿后期病残儿中最常见的病因之一。尽管近年来产科和新生儿护理取得了进展，但妊娠期和围产期缺氧缺血性脑病(HIE)仍是全球新生儿发病和死亡的主要原因。这种由低氧血症和脑灌注不足引起的急性和慢性脑组织损伤常与神经元发育障碍有关。据统计，每1000名新生儿中约有3至6名患有HIE，其中约40%的婴儿面临更多神经后遗症的风险，包括脑瘫、癫痫、认知障碍、发育迟缓和社交困难。西藏那曲，素有“世界屋脊”之称，平均海拔4500多米，空气中的氧气和气压只有沿海地区的一半。HIE的发病率较高，严重威胁着藏北地区儿童的身心健康。因此，迫切需要解决其他安全有效的药物和治疗方法来缓解HIE后脑损伤。大量研究资料显示，新生儿缺血缺氧性脑病的治疗关键在于早期诊断和早期治疗。该病预后较差，早期诊断、早期干预可明显改善预后。
元宝枫籽油是中国独有资源，其中含有5%-6%为神经酸，除此之外，还含有多种维生素、氨基酸、脂肪酸、矿质营养元素、微量元素等对人体健康有益的物质。神经酸(Nervonic Acid)，又名鲨鱼酸，学名为:顺- 15-二十四碳烯酸(cis- 15- Te-tracosenicAcid)，是一种n- 9型特长链单烯脂肪酸。神经酸(Neuroic acid，NA)是最早发现于哺乳动物神经组织中的一种超长链脂肪酸。它是大脑神经纤维和神经细胞的核心天然成分，对大脑的发育和维持至关重要。NA通过酰胺键与神经鞘结合形成鞘脂，鞘脂是脑白质和有髓神经纤维的重要组成部分。在恢复神经末梢的活性，促进神经细胞的生长发育，减少脑细胞中脂褐素的积累，延缓细胞衰老等方面具有重要作用。同时，NA是母乳中的天然成分，能促进婴儿神经系统的发育，促进婴儿的生长。研究表明，NA是胎儿和婴儿大脑和视觉功能发育所必需的营养素。1 ~ 5岁儿童的脑内NA水平显著升高。高原环境下的HIE患者在服用元宝枫神经酸油后，其含有的独特成分——神经酸是的起效标志物是什么，并不清楚，迄今为止，还没有明确的研究可以证明，甚至少有研究。因此，本发明提供了一种方法，寻找确定高原环境下的缺血缺氧性脑病补充神经酸起效的分子标志物。
发明内容
为了能够确定高原环境下的缺血缺氧性脑病补充神经酸是否有作用，本发明提供了用于诊断高原环境下的缺血缺氧性脑病补充神经酸起效的分子标志物。
为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：
用于诊断缺血缺氧性脑病补充神经酸起效的分子标志物，其包括磷脂酰乙醇胺-神经酰胺(d16:1(4E)/24:1(15Z))。
分子标志物磷脂酰乙醇胺-神经酰胺(d16:1(4E)/24:1(15Z))在制备用于诊断高原环境下的缺血缺氧性脑病补充神经酸起效试剂中的应用。
具体地，所以应用为将分子标志物磷脂酰乙醇胺-神经酰胺(d16:1(4E)/24:1(15Z))与结合神经酰胺(d18:1/24:1(15Z))、磷脂酰乙醇胺(22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/19:1(9Z))、鞘磷脂(d17:1/24:1)、磷脂酰胆碱(22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/16:1(9Z))、磷脂酰胆碱(22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/20:2(11Z,14Z))、神经酰胺(m18:1(4E)/24:1(15Z))、磷脂酰丝氨酸(22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/20:0)、磷脂酰胆碱(22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/20:3(8Z,11Z,14Z))中的任一种用于诊断缺血缺氧性脑病补充神经酸后是否起效。
如上所述的应用，优选地，将磷脂酰乙醇胺-神经酰胺(d16:1(4E)/24:1(15Z))的含量记为F8，神经酰胺(d18:1/24:1(15Z)) 的含量记为F1，根据公式TC= -2033.1+1539.5×F8+680.1×F1计算TC值，若TC≥1，则判定为神经酸起效；若TC＜1，则为神经酸未起效果。
如上所述的应用，优选地，将磷脂酰乙醇胺-神经酰胺(d16:1(4E)/24:1(15Z))的含量记为F8，磷脂酰乙醇胺(22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/19:1(9Z))的含量记为F2，根据公式TC= TC=-9.088+2.496×F8+8.477×F2计算TC值，若TC≥0.595，则判定为神经酸起效；若TC＜0.534，则为神经酸未起效果。
如上所述的应用，优选地，将磷脂酰乙醇胺-神经酰胺(d16:1(4E)/24:1(15Z))的含量记为F8，鞘磷脂(d17:1/24:1)的含量记为F3，根据公式TC= -81.62+40.98×F8+54.57×F3计算TC值，若TC≥0.531，则判定为神经酸起效；若TC＜0.531，则为神经酸未起效果。
如上所述的应用，优选地，将磷脂酰乙醇胺-神经酰胺(d16:1(4E)/24:1(15Z))的含量记为F8，磷脂酰胆碱(22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/16:1(9Z))的含量记为F4，根据公式TC= -8.708+4.081×F8+5.662×F4计算TC值，若TC≥0.304，则判定为神经酸起效；若TC＜0.304，则为神经酸未起效果。
如上所述的应用，优选地，将磷脂酰乙醇胺-神经酰胺(d16:1(4E)/24:1(15Z))的含量记为F8，磷脂酰胆碱(22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/20:2(11Z,14Z))的含量记为F5，根据公式TC= -8.452+3.377×F8+4.823×F5计算TC值，若TC≥0.580，则判定为神经酸起效；若TC＜0.580，则为神经酸未起效果。
如上所述的应用，优选地，将磷脂酰乙醇胺-神经酰胺(d16:1(4E)/24:1(15Z))的含量记为F8，神经酰胺(m18:1(4E)/24:1(15Z))的含量记为F6，根据公式TC=-27.43+11.78×F8+13.92×F6计算TC值，若TC≥0.123，则判定为神经酸起效；若TC＜0.123，则为神经酸未起效果。
如上所述的应用，优选地，将磷脂酰乙醇胺-神经酰胺(d16:1(4E)/24:1(15Z))的含量记为F8，磷脂酰丝氨酸(22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/20:0)的含量记为F7，根据公式TC= -5.092+4.140×F8+2.303×F7计算TC值，若TC≥0.518，则判定为神经酸起效；若TC＜0.518，则为神经酸未起效果。
如上所述的应用，优选地，将磷脂酰乙醇胺-神经酰胺(d16:1(4E)/24:1(15Z))的含量记为F8，磷脂酰胆碱(22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/20:3(8Z,11Z,14Z))的含量记为F9，根据公式TC= -10.236+6.543×F8+5.743×F9计算TC值，若TC≥0.566，则判定为神经酸起效；若TC＜0.566，则为神经酸未起效果。
本发明的有益效果在于：
本发明提供的用于诊断高原环境下的缺血缺氧性脑病补充神经酸起效的分子标志物，通过检测该分子标志物，可以用于判断元宝枫神经酸油或类似神经酸产品是否被机体吸收并转化，为食用元宝枫神经酸油或类似产品是否有效果提供了指导意义。
本发明还提供了用于诊断高原环境下的缺血缺氧性脑病补充神经酸后起效的分子标志在检测试剂中的应用，可用于评估缺血缺氧性脑病个体在补充神经酸产品或元宝枫神经酸油后是否有效果。
附图说明
图1为VIP＞1的样本；
图2为 (O)PLS-DA的得分图;
图3 为S-plot图；
图4为基于逻辑回归模型的ROC曲线（变量为F8+F1）；
图5 为基于逻辑回归模型的ROC曲线（变量为F8+F2）；
图6 为基于逻辑回归模型的ROC曲线（变量为F8+F3）；
图7为基于逻辑回归模型的ROC曲线（变量为F8+F4）；
图8 为基于逻辑回归模型的ROC曲线（变量为F8+F5）；
图9为基于逻辑回归模型的ROC曲线（变量为F8+F6）；
图10为基于逻辑回归模型的ROC曲线（变量为F8+F7）；
图11为基于逻辑回归模型的ROC曲线（变量为F8+F9）。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，除另有规定，本发明所用试剂均为分析纯或以上规格，所用的仪器及软件为：冷冻离心机：型号D3024R，Scilogex公司，美国；低速离心机：型号：SC-2556，安徽中科中佳科学仪器有限公司，中国；台式高速冷冻离心机：型号：Legend Micro 21R，Thermo Scientific公司，美国；电热恒温水浴箱：北京医疗设备厂，中国；高原低压环境模拟仓：型号：ProOx-810,上海塔望智能科技有限公司，中国；漩涡振荡器：型号MX-S，Scilogex公司，美国；高分辨质谱仪：ESI-QTOF/MS；型号：Xevo G2-S Q-TOF；厂家：Waters， Manchester，UK；超高效液相色谱：UPLC，型号：ACQUITY UPLC I-Class系统，厂家：Waters， Manchester，UK；数据采集软件：MassLynx4.1，厂家：Waters；分析鉴定软件：Progenesis QI，厂家：Waters。所用的染剂来源为TTC染剂：北京索莱宝科技有限公司；苏木素染剂，伊红染剂，二甲苯，异氟烷：深圳市瑞沃德生命科技有限公司。
实施例1
1. 1.高原环境下的缺血缺氧性脑病模型
新生7日龄SD大鼠购自辽宁长生生物科技有限公司(许可证编号:SCXK辽宁2020-0002)。所有的老鼠都被安置在一个温度控制的房间(22-26)，光照和黑暗周期为12小时，在整个研究期间提供免费的食物和水。所有鼠出生后7日龄雌雄大鼠均吸入乙醚麻醉。在颈部中线处做了一个切口。暴露左侧颈总动脉，分离神经、静脉，用6-0手术丝结扎，切断结扎间动脉。然后用手术缝线缝合伤口，让动物恢复。每次手术时间控制在5 min内，术中使用温度毯将动物体温维持在37℃。与母鼠在笼中恢复2h后，将幼鼠置于低氧室(6%氧与94%氮平衡)，在30-33℃条件下静置2.5h。经缺氧处理后，存活的幼鼠回到母鼠身边，直至被处死。假手术组只暴露左侧颈动脉，不结扎。处理后的鼠放入模拟4500m高原环境的氧仓中进行饲养。
2. 样品采集
将29只HIE模型鼠随机分为2组，分别喂元宝枫神经酸油组（NA组）16只、安慰剂组（CK组）13只。根据人与大鼠间药物剂量换算方法计算给药量确定，元宝枫神经酸油组按0.03g/kg/d（神经酸含量）灌胃给药，每天给药1次，连续给药30天后采集血液，分离并收集血清。
其中，所用的元宝枫神经酸油中经酸含量由第三方检测公司-谱尼进行检测，具体检测结果如下：棕榈酸C16:0 4.02%，棕榈油酸C16:1n7 0.07%，十七碳酸C17:0 0.07%，顺-10-十七碳一烯酸C17:1n7 0.04%，硬脂酸C18:0 2.48%，油酸C18:1n9 21.8%，亚油酸18:2n6 30.7%，花生酸C20:0 0.28%，γ-亚麻酸18:3n6 0.74%，顺-11-二十碳一烯酸C20:1 8.54%，α-亚麻酸18:3n31.65%，顺-顺-11,14-二十碳二烯酸C20:2 0.34%，山嵛酸C22:0 0.96%，芥酸22:1n9 18.7%，顺-11,14,17-二十碳三烯酸20:3n3 0.16%，二十三碳酸C23:00.04%，顺-13,16-二十二碳二烯酸22:2n6 0.02%，二十四碳酸C24:0 0.42%，顺-15-二十四碳烯酸24:1n9 (神经酸)为6.89%。
3. 实验方法：
1）样品前处理
取收集的血清200μL加入600μL的预冷异丙醇进行萃取，涡流1min，室温孵育10min，然后将萃取混合物在-20◦C下储存过夜，4000r离心20min后，将上清液转移到新的离心管，用异丙醇/乙腈/水(2：1：1，v：v：v)稀释至1：10。样品在LC-MS分析前保存在-80◦C。此外，还将每个萃取混合物的10μL组合在一起制备混合血清样品。
2）脂质组学的超高效液相色谱-质谱联用方法
样品用ACQUITY UPLC(Waters，美国)连接到带有ESI的Xevo-G2XS高分辨飞行时间(QTOF)质谱仪(ESI-QTOF/MS，型号：Xevo G2-S Q-TOF，厂家：Waters，Manchester，UK)进行分析。采用CQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1×10 0 mm，1.7μm，Waters)，流动相为10 mM甲酸铵-0.1%甲酸-乙腈(A，6 0：40，v/v)和10 mM甲酸铵-0.1%甲酸-异丙醇-乙腈(B，90：10，v/v)。在大规模研究之前，进行了包括10分钟、15分钟和20分钟洗脱期的中试实验，以评估流动相组成和流速对脂质保留时间的潜在影响。在PIM中，丰富的脂质前体离子和碎片以相同的顺序分离，具有相似的峰形和离子强度。此外，具有10分钟洗脱期的混合QC样品也表现出与测试样品相似的前体和碎片的基峰强度。流动相流速为0.4mL/min。该柱最初用40%B洗脱，然后在2分钟内线性梯度到43%B，然后在0.1min内将B的百分比增加到50%。在接下来的3.9分钟内，梯度进一步增加到54%B，然后B的量0.1分钟内增加到70%。在梯度的最后部分，B的量在1.9分钟内增加到99%。最后，溶液B在0.1分钟内返回到40%，并且在下一次进样之前将色谱柱平衡1.9分钟。每次进样量为5μL，用Xevo-G2XS型QTOF质谱仪检测正负两种模式下的脂质，采集范围为 m/z50~1200年，采集时间为0.2s/次。离子源温度为120℃，去溶温度为600℃，气体流量为1000L/h，以氮气为流动气体。毛细管电压为2.0kV(+)/锥体电压为1.5kV(-)，锥体电压为30V。以亮氨酸脑啡肽进行标准质量测定，用甲酸钠溶液进行校正。样品被随机排序。每10个样本注入一个质控（QC）样本并进行分析，以调查数据的重复性。
4. 结果分析
（1）利用多元统计学寻找血清差异物质
正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）结合了正交信号矫正（OSC）和 PLS-DA（偏最小而成判别分析） 方法，通过去除不相关的差异来筛选差异变量。如上图所示：图1 VIP值为PLS-DA第一主成分的变量重要性投影，通常以VIP>1为代谢组学常用评判标准，作为差异代谢物筛选的标准之一；图2为元宝枫神经酸油组（OT表示）和安慰剂组（CK表示）两个分组中的第一主成分和第二主成分通过降维的方式所得的得分图，横坐标表示组间差异，纵坐标表示组内差异，且两组结果分离较好，说明此方案可以使用。图3为S-plot图，横坐标表示主成分与代谢物的协相关系数，纵坐标表示主成分与代谢物的相关系数，同时满足p<0.05，VIP>1的条件下，有466个差异代谢产物。为了进一步缩小范围，将P值提高到0.005，同时将VIP阈值提高到2，P值小于0.01，最终得到如表1中所示的10个化合物。
（2）约登指数分析
然后对10个化合物进行youden 约登指数计算，用来反映单个指标对整体的诊断和预测效果，从而确定这些指标是分子标志物，结果如表1。
表1 缺血缺氧性脑病补充神经酸后相关脂质的约登指数分析
序号 化合物名称 AUC值 敏感性 特异性
F1 神经酰胺(d18:1/24:1(15Z)) 0.927 0.8 0.909
F2 磷脂酰乙醇胺(22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/19:1(9Z)) 0.890 0.733 0.909
F3 鞘磷脂(d17:1/24:1) 0.860 0.666 1
F4 磷脂酰胆碱(22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/16:1(9Z)) 0.860 0.733 0.909
F5 磷脂酰胆碱(22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/20:2(11Z,14Z)) 0.848 0.666 0.909
F6 神经酰胺(m18:1(4E)/24:1(15Z)) 0.842 0.8 0.818
F7 磷脂酰丝氨酸(22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/20:0) 0.842 0.733 0.909
F8 磷脂酰乙醇胺-神经酰胺(d16:1(4E)/24:1(15Z)) 0.836 0.8 0.909
F9 磷脂酰胆碱(22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/20:3(8Z,11Z,14Z)) 0.812 0.933 0.636
5. 内部数据十折交叉验证结果
为提高种变量化合物的生物诊断效果，需要根据上述生物标志物找出适合的模型进行下一步的分析。
将内部小鼠随机分为10份，选择1份为验证集，其他为训练集，如此反复十次，考察最佳的变量组合。将十次的结果，包括AUC，敏感度，特异性都取平均值，并进行统计学显著性计算，结果如表2。
表2
组合 逻辑回归AUC 敏感性 特异性
F8+F1 0.971 1 1
F8+F2 0.886 1 1
F8+F3 0.857 1 1
F8+F4 0.943 1 1
F8+F5 0.971 1 1
F8+F6 0.800 1 1
F8+F7 0.943 1 1
F8+F9 0.914 1 1
组合之间，AUC值并没有显著性p<0.05差异。
基于上述构建的回归模型为：
"模型A"变量为F8+F1，根据公式TC= -2033.1+1539.5×F8+680.1×F1计算TC值，公式中F8为磷脂酰乙醇胺-神经酰胺(d16:1(4E)/24:1(15Z))，F1为神经酰胺(d18:1/24:1(15Z))，根据TC值预测高原环境下的缺血缺氧性脑病补充神经酸是否起效果：若TC≥1，则判定为神经酸起效；若TC＜1，则为神经酸未起效果。
"模型B"变量为F8+F2，根据公式TC=-9.088+2.496×F8+8.477×F2计算TC值，公式中F8为磷脂酰乙醇胺-神经酰胺(d16:1(4E)/24:1(15Z))，F2为磷脂酰乙醇胺(22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/19:1(9Z))，根据TC值预测高原环境下的缺血缺氧性脑病补充神经酸是否起效果：若TC≥0.595，则判定为神经酸起效；若TC＜0.534，则为神经酸未起效果。
"模型C"变量为F8+F3，根据公式TC= -81.62+40.98×F8+54.57×F3计算TC值，公式中F8为磷脂酰乙醇胺-神经酰胺(d16:1(4E)/24:1(15Z))，F3为鞘磷脂(d17:1/24:1)，根据TC值预测高原环境下的缺血缺氧性脑病补充神经酸是否起效果：若TC≥0.531，则判定为神经酸起效；若TC＜0.531，则为神经酸未起效果。
"模型D"变量为F8+F4，根据公式TC= -8.708 +4.081×F8+5.662×F4计算TC值，公式中F8为磷脂酰乙醇胺-神经酰胺(d16:1(4E)/24:1(15Z))，F4为磷脂酰胆碱(22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/16:1(9Z))，根据TC值预测高原环境下的缺血缺氧性脑病补充神经酸是否起效果：若TC≥0.304，则判定为神经酸起效；若TC＜0.304，则为神经酸未起效果。
"模型E"变量为F8+F5，根据公式TC= -8.452+3.377×F8+4.823×F5计算TC值，公式中F8为磷脂酰乙醇胺-神经酰胺(d16:1(4E)/24:1(15Z))，F5为磷脂酰胆碱(22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/20:2(11Z,14Z))，根据TC值预测高原环境下的缺血缺氧性脑病补充神经酸是否起效果：若TC≥0.580，则判定为神经酸起效；若TC＜0.580，则为神经酸未起效果。
"模型F"变量为F8+F6，根据公式TC= -27.43+11.78×F8+13.92×F6计算TC值，公式中F8为磷脂酰乙醇胺-神经酰胺(d16:1(4E)/24:1(15Z))，F6为神经酰胺(m18:1(4E)/24:1(15Z))，根据TC值预测高原环境下的缺血缺氧性脑病补充神经酸是否起效果：若TC≥0.123，则判定为神经酸起效；若TC＜0.123，则为神经酸未起效果。
"模型G"变量为F8+F7，根据公式TC=-5.092+4.140×F8+2.303×F7计算TC值，公式中F8为磷脂酰乙醇胺-神经酰胺(d16:1(4E)/24:1(15Z))，F7为磷脂酰丝氨酸(22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/20:0)，根据TC值预测高原环境下的缺血缺氧性脑病补充神经酸是否起效果：若TC≥0.518，则判定为神经酸起效；若TC＜0.518，则为神经酸未起效果。
"模型H"变量为F8+F9，根据公式TC= -10.236+6.543×F8+ 5.743×F9计算TC值，公式中F8为磷脂酰乙醇胺-神经酰胺(d16:1(4E)/24:1(15Z))，F9为磷脂酰胆碱(22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/20:3(8Z,11Z,14Z))，根据TC值预测高原环境下的缺血缺氧性脑病补充神经酸是否起效果：若TC≥0.566，则判定为神经酸起效；若TC＜0.566，则为神经酸未起效果。
实施例2
模型验证样本群体16只（外部数据，新生7日龄SD大鼠购自辽宁长生生物科技有限公司）对逻辑回归模型进行验证，按实施例1中的方法造模，并随机分为2组，分别喂元宝枫神经酸油组（NA组）和安慰剂组（CK组）各8只，并放入模拟4500m高原环境的氧仓中进行饲养，喂食30天，采集血液，收集血清。
按实施例1中的方法测得F8：磷脂酰乙醇胺-神经酰胺(d16:1(4E)/24:1(15Z))、F1：神经酰胺(d18:1/24:1(15Z))、F2：磷脂酰乙醇胺(22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/19:1(9Z))、F3：鞘磷脂(d17:1/24:1)、F4：磷脂酰胆碱(22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/16:1(9Z))、F5：磷脂酰胆碱(22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/20:2(11Z,14Z))、F6：神经酰胺(m18:1(4E)/24:1(15Z))、F7：磷脂酰丝氨酸(22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/20:0)、F9：磷脂酰胆碱(22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/20:3(8Z,11Z,14Z))的含量，以验证实施例1中模型结果的准确性，并绘制相应的ROC曲线图，结果如下：
"模型A"变量为F8+F1，ROC曲线图结果如图4所示，Sensitivity （敏感性）=1，Specificity （特异性）=1，Accuracy （准确度）=1。
"模型B"变量为F8+F2，ROC曲线图结果如图5所示，Sensitivity （敏感性）=1，Specificity （特异性）=1，Accuracy （准确度）=1。
"模型C"变量为F8+F3，ROC曲线图结果如图6所示，Sensitivity （敏感性）=1，Specificity （特异性）=1，Accuracy （准确度）=1。
"模型D变量为F8+F4，ROC曲线图结果如图7所示，Sensitivity （敏感性）=1，Specificity （特异性）=1，Accuracy （准确度）=1。
"模型E"变量为F8+F5，ROC曲线图结果如图8所示，Sensitivity （敏感性）=1，Specificity （特异性）=1，Accuracy （准确度）=1。
"模型F"变量为F8+F6，ROC曲线图结果如图9所示，Sensitivity （敏感性）=1，Specificity （特异性）=1，Accuracy （准确度）=1。
"模型G"变量为F8+F7，ROC曲线图结果如图10所示，Sensitivity （敏感性）=1，Specificity （特异性）=1，Accuracy （准确度）=1。
"模型H"变量为F8+F9，ROC曲线图结果如图11所示，Sensitivity （敏感性）=1，Specificity （特异性）=1，Accuracy （准确度）=1。
数据显示：磷脂酰乙醇胺-神经酰胺(d16:1(4E)/24:1(15Z))，以及结合其他8种分子标记物：神经酰胺(d18:1/24:1(15Z))、磷脂酰乙醇胺(22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/19:1(9Z))、鞘磷脂(d17:1/24:1)、磷脂酰胆碱(22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/16:1(9Z))、磷脂酰胆碱(22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/20:2(11Z,14Z))、神经酰胺(m18:1(4E)/24:1(15Z))、磷脂酰丝氨酸(22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/20:0)、磷脂酰胆碱(22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/20:3(8Z,11Z,14Z))中的任一种都表现出非常高的诊断能力，未来都能进行临床试剂盒的应用。
通过对样本信息的对比分析可知：以上磷脂酰乙醇胺-神经酰胺(d16:1(4E)/24:1(15Z))生物标记物，与其他组相比，以上标志物在元宝枫神经酸油组均呈上升趋势。
对于高原环境中的缺血缺氧性脑病患者来说，通过补充宝枫神经酸油或含神经酸的产品，通过检测上述分子标记物，即可得知补充效果。这些标志物可用于诊断高原环境下的缺血缺氧性脑病补充神经酸是否起效。

Claims (9)

1.分子标志物磷脂酰乙醇胺-神经酰胺(d16:1(4E)/24:1(15Z))在制备用于诊断高原环境下的缺血缺氧性脑病补充神经酸起效试剂中的应用；
其特征在于，将分子标志物磷脂酰乙醇胺-神经酰胺(d16:1(4E)/24:1(15Z))结合神经酰胺(d18:1/24:1(15Z))、磷脂酰乙醇胺(22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/19:1(9Z))、鞘磷脂(d17:1/24:1)、磷脂酰胆碱(22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/16:1(9Z))、磷脂酰胆碱(22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/20:2(11Z,14Z))、神经酰胺(m18:1(4E)/24:1(15Z))、磷脂酰丝氨酸(22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/20:0)、磷脂酰胆碱(22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/20:3(8Z,11Z,14Z))中的任一种用于诊断缺血缺氧性脑病补充神经酸后是否起效。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，将磷脂酰乙醇胺-神经酰胺(d16:1(4E)/24:1(15Z))的含量记为F8，神经酰胺(d18:1/24:1(15Z)) 的含量记为F1，根据公式TC= -2033.1+1539.5×F8+680.1×F1计算TC值，若TC≥1，则判定为神经酸起效；若TC＜1，则为神经酸未起效果。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，将磷脂酰乙醇胺-神经酰胺(d16:1(4E)/24:1(15Z))的含量记为F8，磷脂酰乙醇胺(22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/19:1(9Z))的含量记为F2，根据公式TC= TC=-9.088+2.496×F8+8.477×F2计算TC值，若TC≥0.595，则判定为神经酸起效；若TC＜0.534，则为神经酸未起效果。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，将磷脂酰乙醇胺-神经酰胺(d16:1(4E)/24:1(15Z))的含量记为F8，鞘磷脂(d17:1/24:1)的含量记为F3，根据公式TC= -81.62+40.98×F8+54.57×F3计算TC值，若TC≥0.531，则判定为神经酸起效；若TC＜0.531，则为神经酸未起效果。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，将磷脂酰乙醇胺-神经酰胺(d16:1(4E)/24:1(15Z))的含量记为F8，磷脂酰胆碱(22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/16:1(9Z))的含量记为F4，根据公式TC= -8.708 +4.081×F8+ 5.662×F4计算TC值，若TC≥0.304，则判定为神经酸起效；若TC＜0.304，则为神经酸未起效果。
6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，将磷脂酰乙醇胺-神经酰胺(d16:1(4E)/24:1(15Z))的含量记为F8，磷脂酰胆碱(22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/20:2(11Z,14Z))的含量记为F5，根据公式TC= -8.452+3.377×F8+4.823×F5计算TC值，若TC≥0.580，则判定为神经酸起效；若TC＜0.580，则为神经酸未起效果。
7.如权利要求1所述的应用，其特征在于，将磷脂酰乙醇胺-神经酰胺(d16:1(4E)/24:1(15Z))的含量记为F8，神经酰胺(m18:1(4E)/24:1(15Z))的含量记为F6，根据公式TC=-27.43+11.78×F8+13.92×F6计算TC值，若TC≥0.123，则判定为神经酸起效；若TC＜0.123，则为神经酸未起效果。
8.如权利要求1所述的应用，其特征在于，将磷脂酰乙醇胺-神经酰胺(d16:1(4E)/24:1(15Z))的含量记为F8，磷脂酰丝氨酸(22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/20:0)的含量记为F7，根据公式TC= -5.092+ 4.140×F8+2.303×F7计算TC值，若TC≥0.518，则判定为神经酸起效；若TC＜0.518，则为神经酸未起效果。
9.如权利要求1所述的应用，其特征在于，将磷脂酰乙醇胺-神经酰胺(d16:1(4E)/24:1(15Z))的含量记为F8，磷脂酰胆碱(22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/20:3(8Z,11Z,14Z))的含量记为F9，根据公式TC= -10.236+6.543×F8+ 5.743×F9计算TC值，若TC≥0.566，则判定为神经酸起效；若TC＜0.566，则为神经酸未起效果。
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