KR102249252B1 - 미세조류 유래 펩타이드를 포함하는 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 화장료 조성물에 관한 것으로, 미세조류 유래 펩타이드를 포함함으로써 피부 미백 및 피부 재생 활성이 우수하고 세포 안전성 또한 우수한 화장료 조성물을 제공한다.

Description

미세조류 유래 펩타이드를 포함하는 화장료 조성물{A COSMETIC COMPOSITION COMPRISING MICROALGAE-DERIVED PEPTIDE}

본 발명은 미세조류 유래 펩타이드를 포함함으로써 피부 미백 및 피부 재생 활성을 증대시킨 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부는 외부환경과 접촉하여 외부 자극에 대한 신체를 보호하는 가장 기초적인 방어기관이며, 외적인 아름다움을 표현하는 중요한 기관이다. 피부는 외적인 아름다움이 젊음과 건강을 상징하는 판단의 기준일 뿐 아니라 자신감을 표출하여 업무능력에 영향을 주는 경쟁력으로 자리잡고 있다.

그러나 사람들의 외부 활동량이 증가함에 따라 피부가 태양광선에 장기간 노출되면서 자외선에 의해 피부가 손상된다. 피부가 자외선에 장기간 노출되면 피부노화가 진행되고, 자외선으로부터 피부 내층을 보호하기 위해 생성된 멜라닌 색소로 인해 피부가 검게 변색된다.

따라서 현대사회에서 피부를 관리하는 방법으로 기능성 화장품의 소비가 증가하고 있으며, 백옥같이 하얗고 깨끗하면서 젊고 탄력이 있는 피부를 선호하기 때문에 화장품 산업에서는 미백효과와 노화방지에 대한 개발이 활발히 이루어지고 있다.

화장품의 미백 효과는 사용자의 피부를 하얗게 하는 것을 말하며, 대부분의 미백 화장품은 멜라닌의 생성을 억제하는 기능을 한다. 멜라닌은 표피 내 기저층에 존재하는 멜라노사이트(melanocyte)에 의해 생성되며, 멜라노사이트의 활동성과 분포가 사람의 피부색을 결정한다.

멜라노사이트 내부에 함유되어 있는 타이로시나제(tyrosinase)라는 효소에 의해 아미노산의 일종인 타이로신(tyrocine)이 도파(DOPA, dihydroxy phenylalanine)로 전환되고, 도파퀴논(dopaquinone)과 도파크롬(dopachrome) 등을 거치는 일련의 산화과정을 통해 최종적으로 중합체인 멜라닌이 생성된다. 따라서 대부분 미백 화장품은 멜라닌 생성의 주요 효소인 타이로시나제의 활성을 저해함으로써 멜라닌의 생성을 억제시키는 원리로 미백 효과가 발휘된다.

화장품의 노화방지는 피부노화를 촉진하는 원인들을 차단하거나 제거하는 것이다. 상기 피부노화는 나이가 들면서 자연스럽게 나타나거나 태양광에 의한 광노화 등에 의해 발생할 수 있다.

상기 광노화는 자외선에 의해 과잉의 활성산소종이 생성되고, 체내의 항산화효소와 비타민 E, C, 글루타티온 및 유비퀴놀 등의 항산화제가 감소함으로 인해 산화와 항산화의 불균형으로 인해 야기된다.

광노화가 진행됨에 따라 멜라닌 생성반응이 촉진될 뿐 아니라 지질 과산화, 단백질 산화, 단백질 분해효소의 활성화, 콜라겐과 엘라스틴의 사슬절단 및 비정상적인 교차결합, 히알루론산 사슬절단, DNA 산화 등에 의해 생체 구성성분들의 손상을 가져오고 결국에는 피부탄력감소, 주름 및 기미, 주근깨 생성 등의 피부노화가 일어나게 된다. 따라서 타이로시나제의 활성을 저해함과 동시에 항산화 효과를 가지는 화장료 조성물이 피부의 미백 효과를 효과적으로 유도하면서 피부노화를 방지할 수 있다.

한국공개특허 제10-2018-0097101호

본 발명의 목적은 미세조류 유래 펩타이드를 포함하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 측면은 미세조류 유래 펩타이드를 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

상기 미세조류는 탈지미세조류일 수 있다.

상기 “미세조류(microalgae)”는 물, 이산화탄소 및 햇빛을 이용하여 광합성으로 성장하는 단세포성 생물로서, 식물 플랑크톤이라고도 불린다. 상기 미세조류는 배양하거나 수확한 것일 수 있다. 상기 배양된 미세조류는 배양액을 포함할 수 있고, 수확된 미세조류는 미세조류의 서식지에 따라 해수 또는 담수를 함께 포함할 수 있다. 상기 미세조류는 육상식물을 제외한 모든 광합성 생물의 통칭으로 분류학적 용어는 아니며, 매우 다양한 분류군을 지칭하는 일반 용어라 할 수 있다. 이들 중 현미경으로 관찰할 수 있는 단세포성 조류를 미세조류라 하며 대부분의 식물성 플랑크톤이 이에 속한다.

일반적으로, 상기 미세조류는 지상 식물보다 훨씬 빨리 성장하고 생균체 생산성이 높은 점, 담수나 해수는 물론이고 빛 에너지를 확보할 수 있는 자연환경에서는 쉽게 생육된다는 점, 다양한 조류에서 단백질, 지질, 당질 및 색소와 같은 산업적으로 흥미가 있는 생물 고분자 물질은 물론이고 특정의 생리 기능을 갖는 물질을 고농도로 생산할 수 있다는 점에서 중요한 생물 산업 소재로서 활용가능성이 우수하다.

상기 "탈지미세조류(lipid-extracted microalgae)"는 미세조류 배양 후 지질을 추출하고 잔류한 고체 부산물이며 미세조류 건조 중량의 30 내지 50 %를 차지하고 있다. 미세조류의 대량배양으로서 1960년대 아시아를 중심으로 건강보조식품으로서 클로렐라의 상업적 생산을 시작하였으며, 프랑스에서는 스피룰리나(Spirulina)를 단백질원으로 개 발하고자 대량배양을 시작하였다. 스피룰리나는 단백질 함량이 건량의 46 내지 71 %로 매우 높고 γacid(GLA), phycocyanin, oxanthophyll, zeaxanthin 등 생리활성물질이 다량 함유되어 있어 식품보조제뿐만 아니라 동물사료로서 단백질이나 vitamin을 제공하는 우수한 소재로 선호되고 있다.

상기 미세조류에는 단백질 이외에 탄수화물과 리그닌이 일부 함유되어 있는데, 다양한 페놀성 물질의 결합체인 리그닌(lignin)이 외부를 감싸 보호하고 있는 형태를 지니고 있다. 탈지미세조류는 페놀성 화합물을 포함한 천연 항산화제를 함유하고 있어 지질 추출시 사용된 용매에 용출되지 않은 다당체, 항산화물질 등 기능성 소재가 다량 함유되어 있어 고부가가치 식품, 사료, 화장품 및 의약품 소재로서 높은 가치가 있다.

상기 “펩타이드”는 2개 이상의 아미노산이 α-카르복시기와 α-아미노기로 사슬모양 또는 고리모양으로 결합하여 형성된 화합물이다. 상기 펩타이드는 아미노산의 결합수에 따라서 디펩타이드, 트리펩타이드, 테트라펩타이드 혹은 올리고펩타이드나 폴리펩타이드로 분류된다. 상기 올리고펩타이드(결합 아미노산수 2 내지 10개)나 폴리펩타이드(10 내지 50개인 아미노산)의 수는 반드시 결정되어 있지는 않다.

상기 펩타이드의 크기는 1.4 kDa 이하일 수 있고, 상기 펩타이드의 아미노산 개수가 13개 이하일 수 있다.

상기 펩타이드의 크기가 1.4 kDa 이하거나, 아미노산의 개수가 13개 이하인 경우, 분자의 크기가 작기 때문에 피부 흡수율이 증대될 수 있으며 화장품 제품으로 적용하였을 때 기능성이 개선될 수 있다.

상기 미세조류에서 유래한 펩타이드는 미세조류를 분쇄하고, 동결건조하는 전처리 단계; 분말화된 미세조류와 단백질 분해효소를 포함하는 효소액을 혼합하는 펩타이드화 단계; 및 혼합물을 여과하고 원심분리로 펩타이드를 수득하는 펩타이드 분리 단계;로 구성된 펩타이드 제조 방법으로 수득할 수 있다.

상기 제조 방법의 전처리 단계에서 미세조류를 분쇄하고, 용매(산/염기/유기용매)에 침전하여 단백질을 선택적으로 추출하는 단백질 고함량화 단계가 더 추가될 수 있다. 상기 단백질 고함량화 단계로 인해 미세조류에서 단백질만 선택적으로 효소 분해할 수 있기 때문에, 펩타이드 제조 효율이 향상될 수 있다.

상기 제조 방법의 전처리 단계에서 동결건조는 water wapor의 부분압을 낮춤으로써, 얼음을 직접 증기로 만드는 승화에 의해 실시된다. 상기 동결건조를 통해 잔여 수분이 2 w/w% 이하로 유지되면, 유용물질의 손실 없이 안정적으로 분쇄물을 저장 및 수송할 수 있다.

상기 제조 방법의 펩타이드화 단계에서 상기 단백질 분해효소는 단백질을 가수분해하는 효소이고, 파쇄된 미세조류와 일정시간 혼합하여 효소분해를 진행한다.

상기 단백질 분해효소는 식품 유래 균주일 수 있으며, 상기 식품은 청국장, 된장, 나또, 간장 및 김치일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 균주는 바실러스(Bacillus), 락토바실러스(Lactobacillus), 페니실리움(Penicillium), 프사리움(Fusarium), 피키아(Pichia), 캔디다(Candida), 싸가로마이세스(Saccharomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 씨테로마세스(Citeromyces), 및 아스퍼질러스(Aspergullus)와 같은 미생물에서 유래한 효소를 사용할 수 있으며, 그 외에 Fusarium illudens, F. lateritium, F. solani, Paecilomyces sp., Penicillium aurantiogriseum Dierckx, P. brevicompactum, P. citrinum, P. chrysogenum, P. corylophilum, P. crustosum, P. expansum, P. fellutanum, P. implicatum, P. roqueforti, P. solitum 및 P. Waksman에서 유래할 수도 있으나, 구체적으로는 바실러스 서브틸리스 나또(Bacillus subtilis natto)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 균주에서 단백질 분해효소를 생산하기 위해, 액상 또는 고상의 효소 생산용 배지를 사용한다. 상기 효소생산용 배지에, 상기 균주를 10 v/v%로 접종하고, 30 내지 40 ℃에서 24 시간 배양한 다음, 20 분간 13,000 xg 속도로 원심분리한 후 상등액을 회수하여 조효소액으로 사용할 수 있다.

상기 화장료 조성물은 피부 미백 또는 피부 재생용일 수 있다.

상기 “미백”은 피부색에 영향을 미치는 멜라닌, 산화-환원 헤모글로빈, 카로틴, 멜라노이드 등 다양한 생체 분자의 생성을 억제함으로써 잡티, 주근깨, 기미 등의 피부 색소 침착 현상을 완화시키고, 피부 누런기, 붉은기를 완화시켜 피부 밝기 및 균일도를 향상시키는 효과를 의미한다. 특히, 멜라닌 색소 생성 효소인 타이로시네이즈의 활성을 억제함으로써 피부 톤을 개선할 수 있다.

상기 “피부 재생”은 피부 노화를 방지하는 것으로, 피부 주름 방지 및 개선과 같은 효과를 의미한다. 피부 주름은 콜라겐의 분해에 의해 발생되며, 콜라겐 분해효소인 콜라게네이즈를 억제함으로써 피부 주름을 개선할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 식품 유래 균주를 미세조류와 혼합하여 수득한 기능성 펩타이드(실시예 1)의 피부 안전성이 상업효소를 활용하는 경우보다 우수함을 확인하였고(표 2), 타이로시네이즈 저해 활성(표 3) 및 콜라게네이즈 저해 활성(표 4) 역시 우수함을 확인함으로써, 본 발명의 미세조류 유래 펩타이드가 피부 미백 및 피부 재생용 화장료 조성물로 유용하게 활용될 수 있음을 확인하였다.

상기 화장료 조성물은 유연화장수, 영양화장수, 수분크림, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 앰플, 젤, 아이크림, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 스프레이 및 파우더로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상으로 제형화될 수 있다.

상기 화장료 조성물은 통상의 방법에 의해 제형화될 수 있다. 피부 외용제의 제형화에 있어서 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 내용을 참조할 수 있고, 화장료 조성물의 제형화에 있어서 International cosmetic ingredient dictionary, 6th ed(The cosmetic, Toiletry and Fragrance Association, Inc., Washington, 1995)에 개시되어 있는 내용을 참조할 수 있다.

구체적으로, 상기 화장료 조성물은 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형으로 제조할 수 있다. 예컨대, 유연 화장수 또는 영양 화장수 등의 화장수; 훼이셜 로션, 바디로션 등의 유액; 영양 크림, 수분 크림, 아이 크림 등의 크림; 에센스; 화장연고; 스프레이; 젤; 팩; 선 스크린; 메이크업 베이스; 액체 타입, 고체 타입 또는 스프레이 타입 등의 파운데이션으로 제형화될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 상기 피부 외용제는, 연고, 패치, 겔, 크림 또는 분무제로 제형화될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 화장료 조성물은 각각의 제형에 있어서 상기 필수성분 외에 제형의 종류 또는 사용 목적 등에 따라 본 발명에 따른 목적을 저해하지 않는 범위 내에서 다른 성분들이 적절히 배합될 수 있다.

상기 화장료 조성물은 통상적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있으며, 예컨대 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급 알코올, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 허용 가능한 담체는 제형에 따라 달리할 수 있다. 예컨대, 연고, 페이스트, 크림 또는 젤로 제형화될 때 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 또는 이들의 혼합물이 사용될 수 있다.

상기 화장료 조성물은 파우더 또는 스프레이로 제형화될 때, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더 또는 이들의 혼합물이 사용될 수 있고, 스프레이의 경우 클로로플루오로히드로카본, 프로판, 부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 더 포함할 수 있다.

상기 화장료 조성물은 용액 또는 유탁액으로 제형화될 때, 담체 성분으로서 용매, 용해화제, 또는 유탁화제가 사용될 수 있고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-브틸글리콜 오일이 사용될 수 있고, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브 오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 사용될 수 있다.

상기 화장료 조성물은 현탁액으로 제형화될 때, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리 옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 사용될 수 있다.

상기 화장료 조성물은 최종 제품의 품질이나 기능에 따라 업계에서 통상적으로 사용되는 지방 물질, 유기용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉 쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 추가적으로 함유할 수 있다. 상기 보조제 및 그 혼합 비율은 본 발명에 따른 화장료 조성물의 바람직한 성질에 영향을 미치지 않도록 적절히 선택할 수 있다.

본 발명의 일 측면에 따른 화장료 조성물은 천연 원료인 미세조류 유래 펩타이드를 함유함으로써 인체 안정성이 우수할 뿐만 아니라 피부 건강에 유익하며, 미백 및 피부 재생 효과가 우수하다.

본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

도 1은 본 발명의 일 형태에 따른 실시예 및 비교예의 펩타이드 분자량을 SDS-PAGE로 측정한 것으로, 구체적으로, 도 1a 및 도 1b는 비교예 1 내지 3을, 도 1c 및 도1d는 실시예 1 및 비교예 4 내지 8의 펩타이드 분자량을 측정하였다.
도2는 본 발명의 일 형태에 따른 실시예 1의 펩타이드의 MALDI-TOF MS(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry) 분석 결과를 도시한 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실험예 1 : 미세조류 선정 및 성분분석

1-1. 미세조류 성분분석

AOAC 표준분석 방법에 따라 미세조류의 일반성분을 측정하였다.

그 결과, 건조 미세조류를 기준으로 10 내지 40 %의 조단백질, 20 내지 40 %의 조지방, 10 내지 40 %의 조회분, 10 내지 25 %의 탄수화물로 구성되어 있었으며, 탈지 공정을 마친 탈지미세조류의 경우, 단백질을 70 %이상 함유하고 있다.

상기 결과는 미세조류에는 기능성 펩타이드를 생산하기에 충분한 단백질을 함유하고 있으며, 특히, 상기 미세조류에 대하여 탈지 공정을 통해 단백질 함량을 극대화시켜 기능성 펩타이드 생산에 더욱 유용하게 활용될 수 있음을 시사한다.

1-2. 미세조류 선정

다량의 기능성 펩타이드의 생산을 위해서는 단백질 함량이 높은 미세조류를 선정하는 것이 중요하다.

따라서 상기 1-1의 일반성분 측정을 진행한 후, 단백질 함량이 높은 미세조류로 세네데스무스 오블리쿠스(Scensdesmus obliquus)를 선정하였다.

실험예 2 : 미세조류 유래 펩타이드의 제조

미세조류 또는 탈지미세조류 유래 기능성 펩타이드를 생산하기 위해 상기 1-2에서 선정한 미세조류를 증류수로 열수추출 후 동결건조하여 고형물(대조군)을 수득한 후, 상기 고형물의 단백질을 전통 식품 유래 균주를 이용하여 펩타이드를 수득하거나, 화학적 분해 또는 상업효소를 이용하여 펩타이드를 수득하였다.

2-1. 전통 식품 유래 균주를 이용한 미세조류 유래 기능성 펩타이드의 제조

상기 전통 식품은 청국장, 된장 및 간장을 사용하였으며, 상기 전통 식품 중 단백질 분해능이 우수한 균주(B. subtilis natto)를 선정하여 사용하였다.

상기 균주를 YP broth(yeast extract 1 %, peptone 2 %)에서 37 ℃, 16 시간 동안 배양한 후, 효소 생산용 배지 100 mL에 10 v/v%가 되게 접종하여 37 ℃에서 24 시간 배양한 후, 20 분간 원심분리(13,000 ×g)한 후 상등액을 회수하여 미세조류 단백질 분해를 위한 조효소액으로 사용하였다.

상기 고형물 1 g과 상기 조효소액을 1 : 30 (w/v) 비율로 혼합하고, 진탕배양기(SIB-05RH, Jeongbio, Korea)에 50 ℃ 200 rpm 조건으로 8시간 동안 반응시킨 후, 95 ℃ 물에 10 분간 가열하여 효소를 불활성화 시킨 후, 20 분간 3,000 xg속도로 원심분리하여 상등액을 수득하고, 상기 수득한 상등액은 여과하여 불순물을 제거하고, 동결건조하여 고상의 펩타이드 시료(실시예 1)를 수득하였다.

2-2. 화학적 분해를 통한 미세조류 유래 기능성 펩타이드의 제조

상기 화학적 분해는 염기분해 또는 산분해를 통해 이루어지며, 상기 염기분해는 상기 고형물 1 g과 1mol NaOH를 1 : 30 (w/v) 비율로 혼합하고, 진탕배양기(SIB-05RH, Jeongbio, Korea)에 50 ℃ 200 rpm 조건으로 8시간 동안 반응시킨 후, 95 ℃ 물에 10 분간 가열하여 효소를 불활성화 시킨 후, 20 분간 3,000 xg속도로 원심분리하여 상등액을 수득하고, 상기 수득한 상등액은 여과하여 불순물을 제거하고, 동결건조하여 고상의 펩타이드 시료(비교예 1)를 수득하였다.

상기 산분해는 상기 1mol NaOH 대신 1 mol H₂SO₄(비교예 2) 또는 6 mol HCl(비교예 3)을 사용하여 펩타이드 시료를 수득하였다.

2-3. 상업효소를 이용한 미세조류 유래 기능성 펩타이드의 제조

상기 상업효소를 이용하여 펩타이드를 수득하는 방법은 상기 고형물 1 g에 sodium phosphate buffer(SPB, 비교예 4), 알카레이즈(Alcalase, 비교예 5), 프로타멕스(Protamex, 비교예 6), 뉴트라제(Neutrase, 비교예 7) 또는 플라보르자임(Flavourzyme, 비교예 8)을 혼합하여 수득하였다.

구체적으로, 상기 SPB는 0.2 mol을 혼합하였고, 알카레이즈, 프로타멕스, 뉴트라제 및 플라보르자임은 일반적으로 사용하는 희석배수인 1 : 300 (w/v) 비율로 희석하여 혼합하고, 진탕배양기(SIB-05RH, Jeongbio, Korea)에 50 ℃ 200 rpm 조건으로 8시간 동안 반응시킨 후, 95 ℃ 물에 10 분간 가열하여 효소를 불활성화 시킨 후, 20 분간 3,000 xg속도로 원심분리하여 상등액을 수득하고, 상기 수득한 상등액은 여과하여 불순물을 제거하고, 동결건조하여 고상의 펩타이드 시료를 수득하였다.

하기 표 1은 상기 실시예 1에서 사용한 조효소액의 단백질 분해 활성을 비교예 4에서 사용한 알카레이즈 및 증류수와 비교한 결과이다.

구분	프로테아제 활성(unit/mL)
실시예 1	708.5
비교예 4	355.1
증류수	0

상기 결과는 전통 식품 유래 균주에서의 단백질 분해효소 활성이 기존 상업용 효소의 일반 사용 기준과 비교하여 충분한 수준임을 시사한다.

실험예 3. 펩타이드 분자량 측정

상기 대조군, 실시예 및 비교예 시료에 함유된 펩타이드 분자량을 측정하기 위해 SDS-PAGE를 사용하였다.

SDS-PAGE는 12-16.5% separating gel과 5% stacking gel로 구성된 겔을 사용하였다.

staining buffer는 0.1% Coomassie brilliant blue R-250, 45% methanol and 10% acetic acid을 혼합하여 사용하고, de-staining buffer는 10% acetic acid and 45% methanol를 혼합하여 사용하였다.

표준 분자량 marker는 SDS-PAGE molecular weight standards(Biorad, USA), polypeptide SDS-PAGE molecular weight standards을 사용하였다.

전기영동장치를 이용하여 전기영동 후 겔은 staining buffer를 이용하여 2시간 이상 염색된 후, destaining buffer로 탈색하였다.

펩타이드 분자량 측정 결과는 도 1에 나타내었다.

대조군과 화학적 분해에 의한 펩타이드 분자량을 비교한 도 1a 및 도 1b를 참조하면, 대조군의 경우 3.4, 5.5 및 6.5 kDa 부군에서 밴드를 확인하였다. 비교예 1은 염기분해로 인해 끌림 현상이 발생하였고, 모든 펩타이드가 1.4 kDa 이하에 존재하였다.

비교예 2 및 3의 경우, 1.4 내지 200 kDa 사이의 밴드가 확인되지 않았으며, 1.4 kDa 미만의 약 13 개 이하 아미노산으로 분해되었다.

상업효소 또는 식품 유래 균주로 분해된 펩타이드 분자량을 비교한 도 1c 및 도 1d를 참조하면, 16 내지 26.6 kDa에서 비교예 4, 6 및 7에서 밴드가 나타나, 단백질이 분해되지 않았음을 확인하였다.

다만, 실시예 1과 비교예 5 및 8에서는 16 내지 26.6 kDa에서 밴드가 나타나지 않았다. 이는, 미세조류의 단백질을 식품 유래 균주, 알카레이즈 또는 프로타멕스로 분해하는 경우 펩타이드가 1.4 kDa 이하로 분해되며, 식품 유래 균주가 상업효소를 대체하여 활용될 수 있음을 시사한다.

식품 유래 균주를 통해 기능성 펩타이드를 제조한 실시예 1의 보다 정확한 분자량을 확인하기 위해 MALDI-TOF-MSMS(matrix-assisted laser desorption/ionization time off light mass spectrometry)를 사용하였다(도 2).

도 2를 참조하면, 실시예 1의 펩타이드는 1.2 내지 1.4 kDa 사이에 존재하였으며, 이는 식품 유래 균주는 미세조류의 단백질을 13 개 이하의 기능성 펩타이드로 분해할 수 있음을 시사한다.

실험예 4 : 타이로시네이즈 저해 활성 실험

실시예 및 비교예 시료의 타이로시나제 억제 활성(tyrosinase inhibition activity)을 측정하고자 도파산화효소(DOPA Oxidase) 방법을 변형하여 사용하였다.

타이로시나제는 타이로신과 반응하여 멜라닌을 형성하는 효소로, 타이로시나제가 억제되면 멜라닌의 생성이 저해되기 때문에 미백 효과가 나타난다.

Buffer는 67 mmol sodium phosphate buffer(pH 6.8) 0.4 mL와 기질액 10 mmol 3,4-dihydroxy phenylanin(L-dopa)용액 0.2 mL의 혼합액에 125 unit/mL mushroom tyrosinase(Sigma-Aldrich Co, Louis, MO, USA) 0.1 mL와 시료 0.2 mL를 첨가하였다.

37 ℃ 에서 20 분간 반응시키고 475 nm 파장에서 반응액 중 생성된 도파크롬(DOPAchrome)의 양을 측정하였다.

대조군으로는 상기 시료 대신 증류수를 혼합하였다.

타이로시네이즈 저해활성은 하기 식 1에 따라 시료 미첨가군과의 비율로 산출하였다(표 3).

[식 1]

타이로시네이즈 저해 활성(%) = 100 x (1 - (각 시료 첨가군의 흡광도 / 시료 미첨가군의 흡광도))

구분	타이로시네이즈 저해 활성(%)
실시예 1	22.1
비교예 1	7.4
비교예 2	10.2
비교예 3	10.5
비교예 4	0.0
비교예 5	20.7
비교예 6	15.1
비교예 7	13.5
비교예 8	12.8
대조군	1.3

표 2를 참조하면, 전통 식품 유래 균주를 사용한 실시예 1(22.1 %)은 비교예보다 타이로시네이즈 저해 활성이 우수하였으며, 특히, 유사한 펩타이드의 분자량을 보이는 비교예 5 및 8(각각 20.7 및 12.8 %)과 비교하더라도 우수한 타이로시네이즈 저해 활성을 보였다.

실험예 5 : 콜라게네이즈 저해 활성 시험

실시예 및 비교예 시료의 콜라게네이즈 저해 활성(collagenase inhibition activity)을 평가하였다.

0.1 M tris-HCl buffer(pH 7.5)에 4 mM CaCl₂를 첨가하여, 0.3 mg/mL의 4-phenylazobenzyl oxycarbonyl-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg(sigma, U.S.A)를 녹인 기질액 125 μL에 시료 50 μL를 혼합하였다.

혼합액에 1 mg/mL collagenase from Clostridium histolyticum(Sigma-Aldrich Co, Louis, MO, USA) 0.075 mL를 첨가하였다.

대조군으로는 상기 시료 대신 증류수를 혼합하였다.

실온에서 20 분간 방치한 후, 6% citric acid 0.5 mL를 넣어 반응을 정지시키고, ethyl acetate 2 mL을 첨가하여 분광광도계(UV-1650PC, Shimadzu, Kyoto, Japan)로 320 nm에서 흡광도를 측정하였다.

콜라게네이즈 저해활성은 하기 식 3에 따라 시료 미첨가군과의 비율로 산출하였다(표 3).

[식 2]

콜라게네이즈 저해 활성(%) = 100 x (1 - (각 시료 첨가군의 흡광도 / 시료 미첨가군의 흡광도))

구분	콜라게네이즈 저해 활성(%)
실시예 1	57.5
비교예 1	10.7
비교예 2	54.0
비교예 3	30.6
비교예 4	22.3
비교예 5	48.0
비교예 6	42.8
비교예 7	41.4
비교예 8	37.7
대조군	4.1

표 3을 참조하면, 전통 식품 유래 균주를 사용한 실시예 1(57.5 %)은 비교예보다 콜라게네이즈 저해 활성이 우수하였으며, 특히, 유사한 펩타이드의 분자량을 보이는 비교예 5 및 8(각각 48.0 및 37.7 %)과 비교하더라도 우수한 콜라게네이즈 저해 활성을 보였다.

상기 결과는 미세조류의 단백질 분해 효소로 상업효소 대신 전통 식품 유래 균주를 사용함으로써 안전성 및 경제성을 보장하면서도 미백 활성이 우수한 기능성 펩타이드를 제공할 수 있음을 시사한다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (8)

1. 탈지 미세조류 유래 펩타이드를 포함하는 피부 미백 및 피부 재생용 화장료 조성물로서,
   상기 펩타이드는 발효 식품에서 분리된 바실러스(Bacillus) 균주를 탈지미세조류에 처리하여 수득한 것인, 화장료 조성물.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서,
   상기 펩타이드의 크기는 1.4 kDa 이하인 화장료 조성물.
4. 제1항에 있어서,
   상기 펩타이드의 아미노산 개수는 13 개 이하인 화장료 조성물.
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제

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