KR101825178B1 - 주름제거 및 미백효과가 강화된 황칠나무 추출물 및 d-아스파라긴산 함유 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 액상의 현미흑초에 분말상의 황칠나무 추출물을 중량기준으로 2:1 내지 3의 비율로 혼합한 흑초황칠 혼합물을 포함하여 주름제거 및 미백효과를 강화한 황칠나무 추출물 함유 화장료 조성물에 관한 것으로, 현미 흑초와 황칠 추출물 분말을 혼합할 경우 혼합물 내에는 D-아스파라긴산, D-알라닌산을 포함한 다양한 종류의 D-아미노산이 생성되고, 이러한 D-아미노산은 콜라겐 생성을 촉진하고 콜라겐 분해 효소 생성을 억제함으로써, 피부 세포간에 콜라겐이 충만하게 하고, 이를 통해 피부 주름을 개선하거나 제거하는 효과를 가질 뿐만 아니라, 멜라닌 생성 효소를 억제하여 피부 미백 효과를 갖는다.

Description

주름제거 및 미백효과가 강화된 황칠나무 추출물 및 D-아스파라긴산 함유 화장료 조성물{COSMETIC COMPOSITION COMPRISING EXTRACT OF DENDROPANAX MORBIFERA AND D-ASPARATIC ACID WITH REINFORCED WRINKLE ELIMANATIN AND WHITENING EFFECT}

본 발명은 주름제거 및 미백효과가 강화된 황칠나무 추출물 함유 화장료 조성물에 관한 것으로, 더 상세하게는 액상의 현미식초에 황칠나무 추출물 분말을 혼합하여 주름제거 및 미백효과를 강화한 화장료 조성물에 관한 것이다.

콜라겐은 피부의 주요 단백질 중 하나로, 피부의 진피층의 선유아 세포에서 생성되고, 상기 선유아 세포를 감싸는 세포 외 매트릭스를 형성한다. 통상의 내적(intrinsic) 노화 및 광노화 중 어느 하나에 있어서도 콜라겐 생성의 저감과 콜라겐 분해효소 활성의 증대를 수반한다. 그래서 콜라겐 생성을 촉진하거나 콜라겐 분해효소 활성의 억제는 통상의 노화 및 광노화에 의한 피부 상태, 예를 들면 주름 형성을 억제 및/또는 개선하는 것으로 연결되는 것으로 여겨져 왔다.

인간 피부의 색소침착은 멜라닌세포로서 알려져 있는 수지상 세포에 의한 멜라닌의 합성으로 인한 것이다. 기미, 주근깨의 원인이 되는 멜라닌 생성 메카니즘은, 우선, 자외선에 의해 피부 안에 프리라디칼이 발생, 그 자극에 의해 멜라노사이트가 활성화되고, 그 결과, 멜라노사이트 내의 티로시나아제의 기능이 활발해져, 티로신이 화학적으로 산화, 중합 등의 여러 단계를 거쳐 멜라닌이 된다. 멜라닌세포는 멜라닌소체로 알려져 있는 세포소기관을 포함하는데, 이는 멜라닌을 각질형성세포의 상부층으로 이송하고, 이는 이후 표피의 분화에 의해 피부의 표면으로 이동된다. 멜라닌형성 효소 중, 티로시나아제는 멜라닌 합성을 촉매하는 핵심 효소이다. 알려져 있는 피부 미백 화합물의 대다수는 페놀 또는 히드로퀴논 유도체이다. 대부분의 미백제의 작용은 효소 티로시나아제 저해작용으로 멜라닌의 생성을 방지하는 데에 있다. 이들 화합물은 티로시나아제를 저해하지만, 이들의 대다수는 멜라닌세포에 대하여 세포독성을 갖는다. 이러한 독성 효과는 피부의 영구한 탈색소화를 일으킬 위험이 있다. 멜라닌형성을 저해할 수 있으면서 동시에 멜라닌세포에 대한 세포 독성이 낮은 천연 물질을 찾을 필요가 있다. 뿐만 아니라, 티로시나아제 저해작용에 이하여 멜라민 생성을 억제할 뿐만 아니라, 이미 생성된 멜라닌 색소의 응집 침착 (기미, 주근깨, 흑자)을 소거할 수 있는 천연 물질을 찾을 필요가 있다.

한국공개특허 10-2011-0078527에 의하여, 황칠나무 추출물이 콜라겐을 분해하는 효소인 콜라겐 분해 효소(기질 금속 단백질 분해 효소) 생성 억제 효과, 자외선 유도에 의한 콜라겐 분해 효소 생성 억제효과, 콜라겐 합성 증진 효과, 자외선 조사에 의한 염증성 사이토카인 발현 억제 효과 등이 알려져 있다. 이러한 효과는 주름 개선 효과로 나타난다.

또한, 한국공개특허 10-2004-0107852에 의하여, 황칠나무 수지 추출물 및 분획물이 멜라민을 생성하는 티로시나아제의 활성을 억제하여 피부 미백 효과를 나타내는 것이 알려져 있다.

그러나, 황칠나무 추출물이나 황칠나무 수지 추출물만을 이용하여서는 주름 개선 효과나 피부 미백 효과가 매우 미약하여 상업적으로나 경제적으로 실용화하기 어렵다.

본 발명은 상술한 황칠나무 추출물이나 황칠나무 수지 추출물을 이용하는 종래의 화장료 조성물의 문제점을 해결하기 위하여 이루어진 것으로, 황칠나무 추출물을 주름 제거 및 피부 미백 용도로 실용화할 수 있게 그 효과를 강화한 화장료 조성물을 제공하는 데 있다.

상술한 본 발명의 과제는, 액상의 현미흑초에 분말상의 황칠나무 추출물을 중량기준으로 2:1 내지 3의 비율로 혼합한 흑초황칠 혼합물을 포함하는 화장료 조성물에 의하여 해결될 수 있다.

상기 흑초 황칭 혼합물은 상기 화장료 조성물의 전체 중량에 대하여 0.001 ~ 30.0 중량% 함유될 수 있다.

상기 화장료 조성물은 유분, 계면활성제, 분말, 색재, 물, 알코류, 증점제, 킬레이트제, 실리콘류, 산화방지제, 자외선 흡수제, 보습제, 향로, 각종 약효성분, 방부제, 중화제, pH 조정제 등을 효과를 방해하지 않는 범위에서 필요에 따라 적당히 더 선택적으로 배합하여, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 클렌징, 오일, 분말파운데이션, 유탁액파운데이션, 왁스파운데이션, 팩, 마사지크림 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 한 제형을 갖게 할 수 있다.

본 발명에 따른 흑초황칠 혼합물을 포함하는 화장료 조성물은, 현미 흑초와 황칠 추출물 분말을 혼합할 경우 혼합물 내에는 D-아스파라긴산, D-알라닌, D-류신, D-프로신, D-글리신, D-발린 등을 포함한 다양한 종류의 D-아미노산이 생성되고, 이러한 D-아미노산은 콜라겐과 엘라스틴의 생성을 촉진하고 콜라겐 분해 효소 생성을 억제함으로써, 피부 결합조직 메트릭스에 콜라겐과 엘라스틴이 충만하게 하고, 이를 통해 에이징(aging) 또는 자외선 조사에 의해 발생한 피부 주름을 개선하거나 제거하는 효과를 갖는다.

또한, 액상의 현미 흑초와 황칠나무 추출물 분말을 혼합할 경우 생성되는 다양한 종류의 D-아미노산은 멜라닌 생성 효소를 억제하여 피부 미백 효과를 갖는다.

본 발명은 액상의 현미식초와 분상의 황칠나무 추출물을 유효성분으로 함유하여 주름제거 및 미백효과를 강화한 황칠나무 추출물 함유 화장료 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 사용되는 황칠나무 추출물 분말은 다음 공정을 통하여 얻을 수 있다.

본 발명에 있어서, 황칠나무 추출물은 황칠나무의 다양한 기관 또는 부분(예: 잎, 꽃, 뿌리, 줄기, 가지, 껍질 및 종자 등)으로부터 추출하여 얻은 것을 의미하고, 바람직하게는 잎, 줄기, 가지, 껍질 또는 뿌리로부터 얻은 추출물이고, 보다 바람직하게는 잎, 가지, 껍질 또는 뿌리로부터 얻은 추출물이며, 가장 바람직하게는 줄기로부터 얻은 추출물을 의미한다.

상기 황칠나무 추출물은 황칠나무를 세척한 후 절단하는 단계(단계 a); 절단된 황칠나무에 정제수를 가한 후, 진공증기가열 방식으로 100~160 ℃에서 7 ~ 9 시간 동안 가열한 다음, 저온 숙성 후 재가열하고 자연 냉각시켜 황칠을 추출하는 단계(단계 b); 및 이후 단계 b에서 추출된 추출물을 여과하고 농축한 후 냉동 건조를 통해 분말화하는 단계(단계 c)에 의하여 얻어질 수 있다. 상기 방식을 이용하는 경우, 양질의 제품을 높은 수율로 수득할 수 있다. 상기 황칠나무 추출물은 단계 a와 단계 b 사이에, 절단한 황칠나무을 건조시키는 단계를 더 포함하여 얻어질 수 있다.

(a) 황칠나무를 세척한 후 절단하는 단계

세척은 불순물을 제거하여 이후 단계에서 황칠 고유의 성분을 추출하기 위한 기본 단계로서, 정제수를 이용할 수 있다. 절단은 황칠 나무의 표면적을 넓게 하기 위한 것으로, 이후 황칠 추출 단계에서 용이하게 추출이 이루어질 수 있도록 하기 위하여 수행된다. 세척된 황칠 나무는 2 ~ 3cm 크기로 절단하는 것이 바람직하다. 상기 제조 방법은 세척 후 절단 단계 이전에 정선 단계를 더 포함할 수 있다. 정선은 이물질을 제거하여 순수한 제품을 얻게 위해서 실시한다. 다만 황칠나무는 농약을 사용하지 않으므로 제거하여야 이물질이 많지는 않다.

(b) 절단한 황칠나무를 건조시키는 단계

절단한 황칠나무를 건조시키는 단계는 절단한 황칠나무의 수분 함량이 10%(w/w) 이하가 되도록 건조시키는 방법으로 수행할 수 있다. 고품질의 황칠 추출물을 생산하고, 황칠의 안전한 보관 및 유통을 위해 상기 범위로 수분 함량을 유지하는 것이 바람직하다. 건조 과정은 황칠나무를 대량 보관시 곰팡이가 생기거나 유효 성분이 변질되는 것을 막기 위하여 수행한다. 기존에는 일반적으로 자연 건조 방법을 이용하였으나 자연 건조 시에는 나무껍질과 목재 사이의 황칠나무 유효성분이 목재에 스며들어 추출이 곤란해지는 문제가 있었다. 본 발명에서는 이러한 문제를 해결하기 위하여 급속 건조 방법을 이용하였다. 급속 건조는 건조기를 이용하여 70 ~ 80 ℃에서 7 ~ 9시간, 더욱 바람직하게는 8 시간 동안 건조시키는 방법으로 수행할 수 있다. 이러한 급속 건조 방법을 이용하는 경우, 건조 과정에서 황칠나무 유효성분이 목재로 스며들지 않아 추출 효율을 높일 수 있는 장점이 있다.

(c) 황칠나무 추출물을 제조하는 단계

황칠나무 추출물을 제조하는 단계는 절단된 황칠나무에 정제수를 가한 후, 진공증기가열 방식으로 가열한 다음, 저온 숙성 후 재가열하고 자연 냉각시키는 방법으로 수행된다. 황칠나무에 가해지는 정제수의 양은, 황칠나무 중량의 3 ~ 5 배가 바람직하다. 진공증기가열 방식의 가열은 내압성능을 높인 진공증기가열(가열증기를 주입하여 가열) 방식의 추출기를 이용하여 100~160 ℃에서 7 ~ 9 시간, 더욱 바람직하게는 8 시간동안 가열하는 방법으로 수행할 수 있다. 기존에는 가열 용기를 불 위에 올려 가열하는 직화 방식을 이용하였기 때문에 고온의 추출기 내벽에 접촉한 황칠나무가 타거나 변성되는 문제가 있었다. 저온 숙성은 50 ~ 70 ℃에서 22 ~ 26 시간 동안, 더욱 바람직하게는 60 ℃에서 24 시간 동안 숙성(방치)시키는 방법으로 수행할 수 있다. 상기 숙성 과정을 통해 황칠나무의 부피가 팽창되어 추출이 용이해질 수 있다. 재가열은 90 ~ 110 ℃에서 3 ~ 5 시간, 더욱 바람직하게는 98 ℃에서 4시간 동안 가열하는 방법으로 수행할 수 있고 자연 냉각은 3 ~ 5시간 더욱 바람직하게는 4시간 동안 실온에서 냉각시키는 방법으로 수행할 수 있다.

(d) 여과, 농축 및 분말화 단계

본 단계는 단계 b에서 추출된 추출물을 여과하고 농축한 후 냉동 건조를 통해 분말화하는 방법으로 수행될 수 있다. 상기 여과를 통해, 단계 b의 추출물에서 고분자 물질인 전분, 팩틴 등을 제거하여 순수 황칠 성분을 정제할 수 있다. 상기 농축은 일반 농축기를 사용하여 25 ~ 35 브릭스(brix), 더욱 바람직하게는 30 브릭스로 농축하는 방법으로 수행될 수 있다. 상기 농축 과정은 60~70℃에서 5~6시간 수행될 수 있다. 상기 농도 범위로 농축하는 경우, 적당한 고형분을 유지하여 이후 분말화 단계에서 양질의 분말을 얻을 수 있다. 또한 상기 시간 내에서 농축함으로써 유효성분 파괴를 최소화할 수 있다. 상기 냉동 건조는 -80 ~ -90 ℃에서 48 ~ 50 시간 냉동시켜 승화에 의해 수분을 제거하여 분말체를 수득하는 방법으로 수행할 수 있다. 상기 방법으로 분말화하는 경우 적당한 크기의 입자로 분말화되어 용해도 측면에서 유리할 수 있고, 또한 매우 청결한 상태로 분말화가 이루어지므로 양질의 제품을 수득할 수 있다. 아울러 열풍 건조에 의해 유효 성분이 파괴되는 문제를 해결할 수 있다.

본 발명에 사용되는 액상의 현미 흑초는 다음 과정을 통하여 얻을 수 있다.

현미를 100메시 이하의 사이즈로 분쇄하는 현미 분쇄 단계과, 상기 분쇄된 현미 20 중량%, 정제수 79.6중량% 및 액화효소제(Termamyl) 0.3-0.7 중량%을 혼합하고 80~98℃에서 50-10분간 교반하는 현미액화단계와, 상기 현미액화물에 전체 중량에 대해 3중량%-6중량% 비율로 효모(주모)를 접종하고 25~38℃에서 80~120시간 정도 알콜발효를 하는 알콜발효단계와, 상기 알콜액에 아세토박터를 투입하여 28~35℃에서 100-130시간 발효시켜 최종산도 3~6%의 초산발효를 하는 초산발효단계와, 상기 초산발효가 종료된 발효액은 최소 1회 이상 살균 및 여과하는 살균여과단계를 거쳐 본 발명에 사용하는 액상의 현미 흑초를 얻는다. 이렇게 얻어지는 현미 흑초에는 D-아스파라긴산이 생성되어 있다.

본 발명에 사용되는 액상의 현미 흑초와 분말상의 황칠나무 추출물의 혼합물은 다음 과정을 통하여 얻을 수 있다.

믹서에 액상의 현미흑초에 분말상의 황칠나무 추출물을 중량기준으로 2:1 내지 3의 비율로 투입하여 혼합한 후 실온에서 1시간 내지 100시간 방치한다. 액상의 현미흑초에 분말상의 황칠나무 추출물의 가장 바람직한 비합비율은 1:1이다.

이렇게 얻어지는 흑초황칠 혼합물에는 D-아스파라긴산, D-알라닌, D-류신, D-프로신, D-글리신, D-발린 등 다양한 종류의 D-아미노산이 생성되어 있다.

본 발명에 따르면, 상기 현미식초와 황칠나무 추출물의 혼합물은 화장료 조성물 전체 중량에 대해서 0.1 ~ 30.0 중량% 함유되며, 1 ~ 5 중량% 함유되는 것이 가장 바람직하다. 상기 추출물의 함량이 0.1 중량% 미만인 경우에는 콜라겐 생성 효과 및 멜라민 생성 억제 효과가 미미하게 나타나며, 30.0 중량%를 초과하는 경우에는 제형상의 안전 및 안정성에 문제가 있으며 비용이 과다하게 소요된다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서 상기 유효 성분 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화 될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 계면활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물이 비누, 계면활성제 함유 클렌징 제형 또는 계면활성제 비함유 클렌징 제형일 경우, 피부에 도포한 후 닦아내거나 떼거나 물로 씻어낼 수도 있다. 구체적인 예로서, 상기 비누는 액상비누, 가루비누, 고형비누 및 오일비누이며, 상기 계면활성제 함유 클렌징 제형은 클렌징 폼, 클렌징 워터, 클렌징 수건 및 클렌징 팩이며, 상기 계면활성제 비 함유 클렌징 제형은 클렌징크림, 클렌징 로션, 클렌징 워터 및 클렌징 겔이며, 이에 한정되는 것은 아니다.

이하에서는 본 발명에 따른 름제거 및 미백효과가 강화된 황칠나무 추출물 함유 화장료 조성물의 구체적인 실시예와 그 효과를 살펴 본다.

<실시예>

위의 공정으로 생산한 현미 흑초 100g과 황칠 나무 추출물 100g을 믹서에 의하여 혼합한 후 3시간 실온에서 방치하여 시험용 시료를 제작하였다. 양성 대조를 위하여 황칠 나무 추출물을 100g을 현미 흑초와 혼합하지 않고 별도로 준비하였다.

<콜라겐 생성 효과 확인 실험>

세포는 시판된 인간 신생아 진피 선유아 세포가 사용되었다. 상기 세포는 시판된 24웰 플레이트에 1웰당 2×105개가 되도록 파종하고, 시판된 세포 배양용 배지에 소태아 혈청을 10% 첨가한 통상 배지를 사용해서 37℃, 5% CO₂ 및 포화 수증기 분위기 하에서 4시간 배양하였다. 그 후 상기 세포를 배양하는 배지를 시판된 세포 배양용 배지에 소태아 혈청을 0.5% 첨가한 저혈청 배지로 바뀌어 37℃, 5% CO₂ 및 포화 수증기 분위기 하에서 약 1일간 추가 배양하였다.

상기 저혈청 배지에 흑초황칠 혼합물을 10㎍/㎖, 50㎍/㎖, 100㎍/㎖, 200㎍/㎖, 400㎍/㎖의 농도로 첨가하였다. 농도 조절에는 정제수를 사용하였다.

또한, 양성대조로서 상기 저혈청 배지에 콜라겐 생성 효과가 있는 것으로 알려진 황칠 추출물 분말을 5㎍/㎖, 25㎍/㎖, 50㎍/㎖, 100㎍/㎖l, 200㎍/㎖의 농도로 첨가하였다. 농도 조절에는 정제수를 사용하였다.

실시예 1의 배지와 양성대조 배지에 첨가되는 황칠 추출물 분말의 양을 동일하게 하기 위해서, 흑초황칠 혼합물의 농도를 황칠 추출물 분말의 농도보다 2배 크게 조절한 것이다. 이를 통해서 황칠 추추물만 사용하는 경우와 현미 흑초가 더 첨가되었을 때의 효과를 확인할 수 있기 때문이다.

시료가 첨가된 상태로 2일간의 배양 종료 후 배양액을 채취해서 인간 신생아 진피 선유아 세포가 생성하는 I형 프로콜라겐의 C말단 펩티드(PIP) 농도를 Procollagen type I C-peptide EIA kit에 의해 측정하였다. 측정결과, 흑초황칠 혼합물을 첨가한 경우, 첨가량 10㎍/㎖, 50㎍/㎖, 100㎍/㎖, 200㎍/㎖, 400㎍/㎖에 대하여 각각 63.54ng/㎖, 92.24ng/㎖, 98.90ng/㎖, 99.88ng/㎖, 101.03ng/㎖의 PIP 농도를 얻었다. 또, 이에 반해, 황칠 추출물 분말만 첨가한 경우, 5㎍/㎖, 25㎍/㎖, 50㎍/㎖, 100㎍/㎖, 200㎍/㎖에 대하여 각각 45.51ng/㎖, 73.22ng/㎖, 76.34ng/㎖, 78.91ng/㎖, 83.21ng/㎖의 PIP 농도를 얻었다. 이를 통해, 흑초황칠 혼합물을 사용할 경우, 황칠 추출물 분말을 단독으로 사용할 경우보다 모든 농도에서 콜라겐 생성 효과가 농도에 따라 20% - 40% 크고, 농도가 높아짐에 따라 그 콜라겐 생성량도 어느 단계까지 점증하는 것을 확인되었다.

<콜라겐 분해 효소 생성 억제 효과 확인 실험>

세포는 시판된 인간 신생아 진피 선유아 세포가 사용되었다. 상기 세포는 시판된 24웰 플레이트에 1웰당 2×105개가 되도록 파종하고, 시판된 세포 배양용 배지에 소태아 혈청을 10% 첨가한 통상 배지를 사용해서 37℃, 5% CO₂ 및 포화 수증기 분위기 하에서 4시간 배양하였다. 그 후 상기 세포를 배양하는 배지를 시판된 세포 배양용 배지에 소태아 혈청을 0.5% 첨가한 저혈청 배지로 바뀌어 37℃, 5% CO₂ 및 포화 수증기 분위기 하에서 약 1일간 추가 배양하였다.

상기 저혈청 배지에 흑초황칠 혼합물을 10㎍/㎖, 50㎍/㎖, 100㎍/㎖, 200㎍/㎖, 400㎍/㎖의 농도로 첨가하였다. 농도 조절에는 정제수를 사용하였다.

또한, 양성대조로서 상기 저혈청 배지에 콜라겐 생성 효과가 있는 것으로 알려진 황칠 추출물 분말을 5㎍/㎖, 25㎍/㎖, 50㎍/㎖, 100㎍/㎖l, 200㎍/㎖의 농도로 첨가하였다. 농도 조절에는 정제수를 사용하였다.

실시예 1의 배지와 양성대조 배지에 첨가되는 황칠 추출물 분말의 양을 동일하게 하기 위해서, 흑초황칠 혼합물의 농도를 황칠 추출물 분말의 농도보다 2배 크게 조절한 것이다. 이를 통해서 황칠 추추물만 사용하는 경우와 현미 흑초가 더 첨가되었을 때의 효과를 확인할 수 있기 때문이다.

시료가 첨가된 상태로 2일간의 배양 종료 후 배양액의 상층액을 모아 콜라겐 분해 효소 분석 킷트를 이용하여 새로 합성된 콜라겐 분해 효소(MMP-1)의 양(ng/㎖)을 측정하였다. 측정 결과, 흑초황칠 혼합물 농도 10, 50, 100, 200, 400 ㎍/㎖에 대해 각각의 측정된 MMP-1은 63.34ng/㎖, 40.12ng/㎖, 25.37ng/㎖, 15.35ng/㎖, 10.54ng/㎖이었고, 황칠 추출물 분말 농도 5, 25, 50, 100, 200 ㎍/㎖에 대해 각각 의 측정된 MMP-1은 83.54ng/㎖, 54.34ng/㎖, 36.23ng/㎖, 23.55ng/㎖, 19.12ng/㎖이었다. 이를 통해, 흑초황칠 혼합물을 배지에 첨가할 경우, 황칠 추출물 분말만 첨가하는 경우에 비하여 현저한 콜라겐 분해 효소 감소 효과 농도에 따라 30-80%에 이른 것으로 나타났고 그 효과가 농도가 커짐에 따라 콜라겐 분해 효소 감소량도 어느 단계까지 점증함을 확인했다.

<엘라스틴 생성효과 확인>

정상 인간 피부 섬유아세포(이하 NFB)를 피부 섬유아세포용 배지(FGM)로 37℃, 5% CO₂ 및 포화 수증기 분위기 하에서 4시간 배양하였다. FGM은 섬유아세포 기초배지에 섬유아세포 증식인자(1 ㎍/㎖), 인슐린(5 ㎎/㎖), 겐타마이신(50 ㎍/㎖), 암포테리신(amphotericin) B(50 ㎍/㎖)를 첨가한 것이다. NFB를 FGM으로 5×104/㎖가 되도록 현탁 조정하고, Ф90 mm 배양접시에 10 ㎖씩 파종하고, 70% 컨플루언트상태가 될 때까지 배양하였다. 흑초황칠 혹합물과 황칠 추출물 분말을 각 농도로 첨가한 FGM을 10 ㎖/dish로 처리하고, 24시간 배양하였다. 배양상청액을 회수하고, 150 G, 5분간 원심하여 부유 세포를 제거한 후, 12,000 G, 30분간 원심하여 세포편을 제거하였다. 80% 포화가 되도록 황산암모늄을 첨가하고 4℃에서 하룻밤 교반하였다. 15,000 G, 30분간 원심하여 단백질을 침강시키고, 상청을 제거 후, 20 mM Tris-HCl(pH 7.5)에 용해하였다. 20 mM Tris-HCl(pH 7.5) 중에서, 4℃에서 하룻밤 투석 후, 20배 농축이 되도록 20 mM Tris-HCl(pH 7.5)을 가하고, 웨스턴 블로팅용 샘플로서 사용하였다. 샘플 중의 단백질을 SDS-PAGE로 분리 후, 니트로셀룰로오스막으로 전사하였다. 전사 후의 니트로셀룰로오스막을 블로킹용액(탈지유를 5%의 농도가 되도록 0.1%의 폴리옥시 에틸렌(20)소르비탄 모노라우레이트를 포함하는 PBS로 용해한 용액)에 침지하고, 4℃에서 하루 블로킹하였다. 세정액{0.1%의 폴리옥시 에틸렌(20)소르비탄 모노라우레이트를 포함하는 PBS}으로 세정 후, 1차항체{세정액으로 500 ng/㎖로 조제한 엘라스틴에 대한 단일클론항체(케미콘산)}에 침지하고, 실온에서 1시간 반응시켰다. 세정 후, 2차항체(세정액으로 250 ng/㎖로 조제한 호스래디쉬 퍼옥시다아제 표지화 항마우스 이뮤노글로불린 G)(horseradish peroxidase labeling anti-mouse immunoglobulin G)에 침지하고, 실온에서 1시간 반응시켰다. 세정 후, ECL 플러스 웨스턴 블로팅 검출시약을 사용해서 검출하였다. 또한, 검출 된 밴드를 이미지 스캐너를 사용해서 스캔 후, 이미지 마스터 소프트웨어에 의해 해석해서 수치화하였더니, 흑초황칠 혼합물 10, 50, 100, 200, 400 ㎍/㎖ 처리한 경우, 무처리 대조에 비하여 각각 1.1배, 1. 5배, 2.0배, 3.3배, 4.8배의 엘라스틴 생성이 촉진됨을 확인하였다.

<멜라닌 생성 효소 억제 효과 확인 실험>

흑초황칠 혼합물의 티로시나아제 단백질 발현 저해를 평가하기 위하여, Mel-Ab 멜라닌 색소 세포의 티로시나아제 단백질 발현 정도를 분석하기 위하여 다음과 같은 실험을 진행하였다. Mel-Ab 멜라닌 색소세포에 흑초황칠 혼합물을 0, 10, 50, 100, 200, 400 ㎍/㎖의 농도로 72시간 동안 처리하고, 단백질을 추출하여 웨스턴 블럿을 실시하였다. 즉 세포를 단백질 용해 완충용액으로 용해시킨 후, 15000 rpm에서 10분간 원심분리하였다. 상등액을 이용하여 Bradford-Lowry법으로 단백질량을 계산한 후, 각 시료마다 동일한 단백질이 함유되도록 단백질 샘플을 제조하였다. 이들 단백질을 웨스턴 블럿을 실시하여 티로시나아제 단백질의 발현을 ECL방법으로 측정하고 흑초황칠 혼합물을 0 ㎍/㎖ 처리한 경우와 비교한 결과 그 발현량이 10, 50, 100, 200, 400 ㎍/㎖의 농도에 대해 각각 13%, 35%, 48%, 55%, 68% 줄어든 것이 확인되었다. 이를 통해, Mel-Ab 멜라닌 세포에 흑초황칠 혼합물을 처리한 경우, 농도 의존적으로 티로시나아제 단백질의 발현이 저해됨을 관찰할 수 있었다. 상기 흑초황칠 혼합물은 Mel-Ab 멜라닌 색소세포에서 멜라닌 생합성의 가장 중요한 효소인 티로시나아제의 합성을 억제하여 세포수준에서 효소 활성을 저해하여, 멜라닌 생성을 억제하는 것임을 알수 있다.

<제형 예 1> 로션

로션의 제형예는 통상의 방법에 따라 다음 표 1과 같이 제조하였다.

성분	함량(단위:중량%)
본 발명에 따른 흑초황칠 혼합물 세틸에칠헥사노에이트 글리세린 부틸렌 글라이콜 세테아릴알코올 나이아신 아마이드 서양장미꽃 수 쉐어버터 소듐하이알루로네이트 피이지-100스테아레이트 세테아릴 글루코사이드 토코페릴아세테이트 녹차추출물 동백오일 아데노신 방부제, 향료 정제수	2.00 5.00 8.00 6.00 2.40 2.00 2.00 1.00 1.50 0.60 0.30 0.25 0.70 0.40 0.04 미량 잔량
합계	100%

<제형 예 2> 수렴화장수

수렴화장수의 제형예는 통상의 방법에 따라 다음 표 2과 같이 제조하였다.

성 분	함량(단위:중량%)
본 발명에 따른 흑초황칠 혼합물 디프로필렌 글라이콜 부틸렌 글라이콜 나이아신 아마이드 서양장미꽃 수 병출추출물 소듐하이알루로네이트 마치현추출물 알지닌 알란토인 에리스리톨 루이보스잎추출물 셀룰로오스검 아데노신 방부제, 향료 정제수	2.00 9.00 6.00 2.00 5.00 1.50 1.50 1.00 0.80 0.10 0.80 0.05 0.05 0.04 미량 잔량
합 계	100%

<제형예 3> 영양화장수

영양화장수의 제형예는 통상의 방법에 따라 다음 표 3과 같이 제조하였다.

성분	함량(단위:중량%)
본 발명에 따른 흑초황칠 혼합물 스테아릴 알콜 라놀린 폴리솔베이트 60 솔비탄스테아레이트 경화식물유 광물유 스쿠알란 트리옥타노인 디메치콘 초산토코페롤 카르복시비닐폴리머 글리세린 1.3-부틸렌글리콜 소듐 하이아루로네이트 트리 에탄올아민 방부제, 향, 색소 증류수	2.5 1.5 1.5 1.3 0.5 1.0 5.0 3.0 2.0 0.8 0.5 0.12 5.0 3.0 5.0 0.12 미량 잔량
합계	100%

<제형 예 4> 영양크림

영양크림의 제형예는 통상의 방법에 따라 다음 표 4와 같이 제조하였다.

성 분	함량 (단위:중량%)
본 발명에 따른 흑초황칠 혼합물 친유형 모노스테아린산글리세린 세테아릴알콜 스테아린산 밀납 폴리솔베이트 60 솔비탄스테아레이트 경화식물유 스쿠알란 광물유 트리옥타노인 디메치콘 소듐마그네슘실리케이트 글리세린 베타인 트리에타올아민 소듐 하이아루로네이트 방부제, 향, 색소 정제수	3.0 2.0 2.2 1.5 1.0 1.5 0.6 1.0 3.0 5.0 5.0 1.0 0.1 5.0 3.0 1.0 4.0 미량 잔량
합계	100%

<제형 예 5> 마사지 크림

마사지 크림의 제형예는 통상의 방법에 따라 다음 표 5와 같이 제조하였다.

성분	함량(단위:중량%)
본 발명에 따른 흑초황칠 혼합물 글리세린 부틸렌 글라이콜 메도우 폼씨 오일 세테아릴알콜 나이아신아마이드 쉐어버터 글리세릴스테아레이트 병출추출물 소듐하이알루로네이트 마치현추출물 알지닌 효모발효추출물 동백오일 알란토인 루이보스잎추출물 세라마이드3 아데노신 방부제, 향료 정제수	3.00 8.00 6.00 3.50 3.00 2.00 2.00 2.00 2.00 0.50 2.00 0.20 0.20 0.50 0.10 0.05 0.05 0.04 미량 잔량
합 계	100%

<제형 예 6> 에센스

에센스의 제형예는 통상의 방법에 따라 다음 표 6와 같이 제조하였다.

성분	함량(단위:중량%)
본 발명에 따른 흑초황칠 혼합물 글리세린 베타인 피이지-100스테아레이트 DL-판테놀 이.디.티.에이-2Na 벤조페논 - 9 히드록시에칠 셀룰로오스 소듐 하이아루로네이트 카르복시비닐폴리머 트리에탄올아민 옥틸도데칸올 옥틸도데세스 -16 에탄올 방부제, 향, 색소 증류수	3.0 10.0 5.0 2.0 0.1 0.3 0.02 0.04 0.1 8.0 0.2 0.18 0.3 0.4 6.0 미량 잔량
합계	100%

<제형 예 7> 팩

팩의 제형예는 통상의 방법에 따라 다음 표 12와 같이 제조하였다.

성 분	함량(단위:중량%)
본 발명에 따른 흑초황칠 혼합물 글리세린 부틸렌 글라이콜 나이아신 아마이드 베타인 소듐하이알루로네이트 트레할로스 알지닌 에리스리톨 잔탄검 아데노신 하이드롤라이즈드 콜라겐 방부제, 향료 정제수	3.00 11.00 7.00 2.00 1.00 1.00 0.80 0.60 0.50 0.07 0.04 0.01 미량 잔량
합계	100%

<제형 예들의 효과 관찰>

위 각 제형에서, 흑초황칠 혼합물 대신 황칠나무 추출물 분말만을 첨가한 에센스를 제형 예 6에 따라 만들어, 10인에 대하여 먼저 30일간 황칠나무 추출물 분말만을 혼합한 에센스를 1 일 2 회 얼굴에 도포하게 하고, 주름 개선 및 미백 효과를 육안으로 관찰하였을 때 도포에 따른 효과가 식별하기 어려울 정도로 미미하였으나, 다시 동일인에 대하여 본 발명의 흑초황칠 혼합물을 30일간 도포하여 주름 개선 및 미백효과를 관찰한 결과, 미세 주름이 상당량 사라진 것으로 관찰되었을 뿐만 아니라, 피부 흑색은 엷은 적갈색으로 퇴색되거나 또는 각질서 벗겨져 떨어져 만족할 만한 효과를 얻었다.

이하, 상기한 실험예들의 결과를 근거로 하여 본 발명에 따른 흑초황칠 혼합물을 유효성분으로 함유하는 화장료를 조성하여 제시하는 것이나 본 발명의 제형이 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

Claims (2)

1. D-아스파라긴산이 생성된 액상의 현미흑초에, 분말상의 황칠나무 추출물을 중량기준으로 2:1 내지 3의 비율로 혼합한 흑초황칠 혼합물을 포함하여, 주름제거 및 미백효과를 강화한 황칠나무 추출물 및 D-아스파라긴산 함유 화장료 조성물.
   
2. 제 1항에 있어서, 상기 흑초황칠 혼합물은 상기 화장료 조성물의 전체 중량에 대하여 0.001 ~ 30.0 중량% 함유되는 것을 특징으로 하는 주름제거 및 미백효과를 강화한 황칠나무 추출물 및 D-아스파라긴산 함유 화장료 조성물.