CN102439027B - 蛋白酶体激活性肽水解产物和含有其的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及富集生物活性肽的肽水解产物，所述水解产物是蛋白酶体激活剂。另外，本发明涉及化妆或制药组合物，其包含在生理可接受介质中的所述水解产物，及其在预防或治疗皮肤老化或光老化迹象和保护皮肤对抗UV辐射侵袭中的用途。最后，本发明涉及旨在预防和/或减轻皮肤老化和光老化迹象的化妆治疗方法。

Description

蛋白酶体激活性肽水解产物和含有其的组合物
本发明涉及抗老化活性成分及其用途的领域，特别是在化妆品中。更具体地，本发明涉及肽水解产物，其富集有生物活性肽，所述水解产物为蛋白酶激活剂，以及涉及其在化妆和/或制药中的用途，其用于预防和/或纠正老化的影响和皮肤、指甲、毛发的光老化，保护皮肤对抗UV辐射的侵袭。
老化相当于一系列生理和心理过程，其从某一年龄起改变生物体的结构和功能。老化可分为两种类型：一方面是内在性老化，另一方面是外在性老化。内在性老化是由于遗传因素，以及由于在疲乏或有压力时、或在诸如怀孕等激素改变进程期间发生的生化修饰。外在性老化是由于生物体在生命中所暴露于环境因素，诸如污染、阳光、疾病等。其是一个缓慢渐进的过程，在不同程度影响生物体所有细胞，并以不同方式自我显现。作为例子，皮肤的外表被不同种类的内在或外在的侵袭所改变；皱纹和细纹，色素沉着过多或色素沉着过少的瑕疵、干燥甚或皮肤脱水、表皮变薄、弹性组织变性、瑕疵、老年斑等可因此出现。所有这些改变不仅影响皮肤，也影响指甲和毛发，诸如手指甲和头发。这些改变是由于细胞更新功能、细胞粘附、胶原蛋白合成、弹性蛋白合成和其它蛋白的合成的变化，并最终导致皮肤保护屏障质量的衰减和其美感外观的降低。然而，对细胞老化负责的一个主要过程毫无疑问是在那些细胞中积累的受损蛋白。事实上，这些蛋白是各种异常翻译后修饰的靶标，诸如氧化、糖化、与源自脂质过氧化作用物质的偶联，或现象，其发生率随年龄而大大增加。
已知自由基在老化过程中起重要作用，更具体地是在氧化受损蛋白的形成中起重要作用。(Harman et al.“Aging：a theory based on free radical andradiation chemistry”J.Gerontol.，11，298-300)。受损蛋白的积累因此导致负责清除这些蛋白的蛋白水解系统效率的问题，尤其是蛋白酶体系统的效率，其不仅涉及清除改变的蛋白，特别通过氧化，而且也涉及细胞间蛋白的持续更新。
泛素-蛋白酶体途径在许多生物学过程中起基本作用。通过蛋白酶体的蛋白降解机制事实上涉及了主要的细胞机制，诸如DNA修复、基因表达控制、细胞周期调节、新合成蛋白质量的控制、凋亡或免疫应答(Glickman andCiechanover，2002)。
人细胞中存在的蛋白酶体是存在于细胞质和核中的大尺寸的多蛋白复合物。纯化形式的蛋白酶体包含两个主要亚基：被称为20S蛋白酶体的蛋白水解核；和19S调节复合物，其结合于20S蛋白酶体的两端(Coux et al.，1996；Glickman and Coux，2001)。20S蛋白酶体是中空圆柱体形式的颗粒，由28个α和β亚基组成，分布于4个七元环中。肽酶活性存在于圆柱体内表面，具有变构影响。三种蛋白水解活性(胰蛋白酶、糜蛋白酶和半胱天冬蛋白酶样)与20S蛋白酶体相关，并一起作用以将蛋白分解成含有3到20个氨基酸的无活性肽。除20S蛋白酶体外，26S蛋白酶体包含由大约20个亚基构成的0.7MDa的19S复合物。最近的免疫纯化研究显示，其它蛋白可能与20S蛋白酶体和19S蛋白酶体相关(例如11S调节复合物)。
近年进行的研究将老化与蛋白酶体活性相关联。虽然被氧化的蛋白积累随年龄增加，但观察到了蛋白酶体系统效率的衰减(Petropoulos et al.，J.Gerontol.A.Biol.Sci.2000，55A：B220-7)。这一蛋白酶体系统效率的衰减事实上是源于蛋白酶体质量的降低。这些结果由那些通过关于比较百岁老人和年轻个体细胞内蛋白酶体质量和活性的研究所证实(Chondrogianni et al.，Exp.Gerontol.2000；35：721-8)。这些和其它许多研究清楚地显示了老化和蛋白酶体活性间的联系，并可以推断，诱导皮肤或指甲或毛发细胞中蛋白酶体的表达，可能对老化有正面影响或甚至可将其延缓。
出于预防或延缓老化的目的，提出了基于自然提取物的化妆组合物：一个例子是专利FR 2 822 701，其公开了基于褐指藻属藻类提取物的组合物用于促进蛋白酶体活性。此外，专利申请FR 2 898 808描述了包含微藻类和精氨酸阿魏酸盐提取物的组合物的用途，也是激活蛋白酶体。其它组合物包含化学化合物，其能够调控蛋白酶体的活性以具有抗老化效果。这些组合物在专利申请WO 2006/105811或WO 2005/061530中有描述。然而，所提出的肽类型化合物很大，并难以在化妆领域以其自身来使用。因此有必要，尤其在化妆品产业中，从自然提取物中获得有效的具有小型活性成分的新混合物，用于其作为具有抗老化效果的蛋白酶体激活剂的用途。
因此，本申请人发现了肽水解产物，其富集有生物活性肽，能够激活蛋白酶体，因此可用于预防和/或治疗皮肤老化和光老化迹象以及由于UV辐射的侵袭。
因而，本发明在第一方面提出了蛋白酶体激活剂肽水解产物，其富含生物活性肽，所述生物活性肽有小于6kDa的分子量，含有3到5个氨基酸，每种生物活性肽包含至少一个天冬氨酸残基、一个半胱氨酸残基和一个精氨酸残基。
在第二方面，本发明提出了包含所述富集的肽水解产物作为活性成分的化妆组合物。
另外，在第三方面，本发明提出了包含所述富集的肽水解产物的化妆组合物的用途，其用于预防和/或治疗皮肤老化和光老化迹象，以及用于改善蛋白酶体对受损蛋白的降解。
最后，在第四方面，本发明提出了用于对要治疗的皮肤、指甲或毛发进行化妆治疗的方法，其使用包含所述富集的肽水解产物的组合物。
附图1显示了通过HPLC获得的色谱图的例子，鉴定出相应于玉米水解产物中的生物活性肽的峰。
附图2显示了通过HPLC获得的色谱图的例子，鉴定出相应于豌豆水解产物中的生物活性肽的峰。
附图3显示了通过HPLC获得的色谱图的例子，鉴定出相应于水稻水解产物中的生物活性肽的峰。
附图4显示了通过HPLC获得的色谱图的例子，鉴定出相应于酿酒酵母水解产物中的生物活性肽的峰。
在第一方面，本发明涉及蛋白酶体激活剂肽水解产物，其富集有多种生物活性肽，所述生物活性肽有小于6kDa的分子量，含有3到5个氨基酸，每种生物活性肽包含至少一个天冬氨酸残基、一个半胱氨酸残基和一个精氨酸残基。
术语“肽水解产物”指的是主要由肽或寡肽所代表的化合物的混合物。
术语“生物活性肽”指的是由经修饰或未修饰的肽键互相连接的至少3个氨基酸连接所组成的蛋白片段，且其具有作为蛋白酶体激活剂的活性。它们以非活性形式存在于蛋白中，并在那些蛋白水解后变成有活性。
本发明所述的富集的肽水解产物特征在于，其是蛋白酶体激活剂。
肽水解产物(和/或生物活性肽)，其是“蛋白酶体激活剂”表示任何肽水解产物或生物活性肽或衍生物，其能够提高蛋白酶体的活性，或通过增加蛋白酶体亚基的蛋白合成(通过直接或间接调控基因表达)，或通过其它生物过程，如使构成蛋白酶体的亚基稳定或使RNA信使转录物稳定。
本发明中富集的肽水解产物特征在于，其能激活蛋白酶体对受损蛋白的降解。“损坏的蛋白”理解为是指因活性氧(自由基)而经氧化反应的蛋白、由脂质过氧化作用产生的产物所糖化或偶联的蛋白等。
优选地，肽水解产物富集有生物活性肽，其具有通式(I)：
X1-[Asp，Cys，Arg]-X2
其中：
X1是天冬酰胺、赖氨酸、天冬氨酸、缬氨酸、精氨酸或不存在；
X2是组氨酸、赖氨酸、精氨酸或不存在。
优选地，肽水解产物富含生物活性肽，具有下式：
(SEQ ID no1)Arg-Asp-Cys-Arg-Arg
(SEQ ID no2)Asn-Asp-Cys-Arg-Lys
(SEQ ID no3)Asp-Cys-Arg-His
(SEQ ID no4)Val-Asp-Cys-Arg
(SEQ ID no5)Asp-Cys-Arg
这些肽已被鉴定为特别具有作为蛋白酶体激活剂的活性，并由此作为增亮剂而受到特别关注。
本发明的富集的肽水解产物可从各种蛋白来源获得，不论动物或植物来源。根据第一个实施方案，富集的肽水解产物来自于植物的水解，所述植物选自玉米(Zea mayz L.)、豌豆(Pisum sativum)、或水稻(Oryza sativa L.)。优选所使用的植物此前未经发酵。在第二个实施方案中，富集的肽水解产物来自酵母属(Saccharomyces)酵母的水解，更具体地是来自酿酒酵母种的水解。
因此，本发明可通过使用来自玉蜀黍属的多种植物中的一种的种子来进行，优选玉米。依照本发明，所使用的植物原料是种子，并且优选种子的外壳已经通过去壳步骤而去除。
本发明也可通过使用豌豆科(豆科Fabaceae)的许多植物中的一种来进行。例如，可使用豌豆种的植物豌豆(Pisum sativum L)。术语豌豆也表示种子，其自身富含蛋白(25％)。
来自水稻科(禾本科Poaceae)、特别是来自稻属(Oryza)、更优选的是水稻(Oryza sativa L)种的植物可被使用来实现本发明的水解产物。所使用的植物原料是种子，并且优选种子的外壳已经通过去壳步骤而去除。
最后，本发明也可通过使用酵母属的酵母来进行，并优选地是酿酒酵母种的酵母。
任何本领域技术人员已知的用于提取或纯化的方法，均可被使用以制备本发明的水解产物。
在第一个步骤中，使用植物研磨机将种子或植物的特定部分(叶、块茎、根等)研磨。由此获得的粉末可随后使用常规的有机溶剂(例如酒精、己烷或丙酮)而进行去脂化。
对酵母，在第一个步骤中，将酵母在适合于其发育的培养基中以常规方式培养，优选是有乳糖存在。酵母通过离心收获，并接着悬浮于缓冲液中，优选磷酸盐缓冲液。在第二个步骤中，用弗氏细胞压碎器(French press)或球型研磨器来使细胞破裂，大部分不可溶的膜组分通过离心或过滤而除去。
然后，依照修改过的常规方法(Osborne，1924)来提取蛋白；将植物研磨过的原料或酵母溶解产物悬浮于含有不溶性聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)类型(0.01-20％)吸附产物的碱性溶液中；事实上，发现此方法可以促进随后的水解和纯化操作。特别是与蛋白相互作用的苯酚型物质的浓度显著降低。
在离心和过滤步骤之后，收集含有蛋白、碳水化合物和可能的脂类的可溶性部分。随后将此粗溶液在受控条件下水解以产生可溶性肽。水解被定义为涉及通过水切割分子的化学反应，此反应可在中性、酸性或碱性介质中完成。依照本发明，水解是通过化学方式和/或有利地使用蛋白水解酶来进行。可引用的有使用植物来源的内切蛋白酶(木瓜蛋白酶、波罗蛋白酶、无花果蛋白酶)和微生物(曲霉Aspergillus、根霉Rhizopus、杆菌bacillus等)。选择水解条件，以促进生物活性肽的富集。
基于上述同样的原因，即消除多酚类物质，将一定量的聚乙烯聚吡咯烷酮在此受控的水解步骤中加入到反应介质中。过滤后，将酶和多聚物除去，获得首份滤液。
此阶段获得的水解产物可再次纯化以选择低分子量的部分，优选小于6kDa的部分，且肽依其性质而产生。为了特异地富集水解产物中的生物活性肽，可以通过在孔隙率递减的过滤器中经连续的超滤步骤而有利地进行纯化，这是通过保留每一步的滤液和/或通过色谱类型的方法。
然后本发明在水中或任何含有水的混合物中的进行稀释阶段，并随后通过超滤灭菌以获得富集的肽水解产物，其特征在于蛋白含量为0.5至5.5g/l。此富集的肽水解产物相应于本发明活性成分最纯化的形式。
依照本发明获得的肽水解产物在高效液相色谱(HPLC)中进行定量和定性分析，使得能够分析分子量为0.2至25kDa的蛋白(依照合适的溶剂梯度)。随后分析能被分离的不同肽部分的生物效能。接着通过质谱分析这些不同的部分，以特异地从每个峰鉴定肽的氨基酸含量。也进行了序列分析，以确定生物活性肽的肽序列。
最后，所获得的富集的肽水解产物由分子量小于6kDa的肽组成，并富含具有3到5个氨基酸的生物活性肽，包含至少一个天冬氨酸残基、一个半胱氨酸残基和一个精氨酸残基。
本发明的此肽水解产物，富集有生物活性肽，也可被用作药物。
在第二方面，本发明涉及化妆组合物，其包含如前所述的富含生物活性肽的肽水解产物作为活性成分。
优选地，本发明的组合物以包含化妆可接受介质的适于局部使用的形式存在。“化妆可接受”理解为是指介质适用于与皮肤或人的上皮附属物接触，没有毒性、不相容性、不稳定性、过敏反应或其它副作用的风险。优选所述肽水解产物在组合物中以占组合物总重量0.0001％到20％的量存在，优选以占组合物总重量0.05％到5％的量存在。
在本发明的组合物中，将富含生物活性肽的肽水解产物溶解于一种或多种溶剂中，如水、甘油、乙醇、丙二醇、丁二醇、一缩二丙二醇、乙氧基化或丙氧基化的二甘醇、环多元醇、凡士林、植物油、或这些溶剂的任意混合物。
按照另一有利的实施方案，将本发明的肽水解产物溶解在化妆或药物载体如脂质体中，或将其吸附至粉末状有机多聚物、矿物质支持物如华视和皂粘土上，而更常见的是溶解于或固定至任何生理可接受的载体。
要应用于皮肤的组合物可以如下形式存在，水或水醇溶液、油包水乳剂或水包油乳剂、微乳剂、含水或无水凝胶、浆液、囊泡分散物、贴片、乳霜、喷雾、软膏、润发油、洗剂、胶体、溶液、悬浮液或其它形式。组合物也可以洗发剂、染发剂或要用刷子或梳子应用的睫毛膏的形式而应用于上皮附属物，尤其是睫毛、眉毛或毛发上，或指甲的处理如指甲油。
在特定实施方案中，本发明的组合物还含有促进所述富集的肽水解产物作用的至少一种其它活性成分。可以非限制性的方式引用的成分的例子有：肽激活剂、其它植物提取物、修复剂、抗老化剂、抗皱纹剂、抚慰剂、自由基清除剂、UV遮蔽剂、促进皮肤大分子合成或能量代谢的物质、增湿剂、抗菌剂、抗真菌剂、抗炎性物质、麻醉剂、调节皮肤分化或色素沉着或皮肤脱色素的物质、和促进指甲或毛发生长的物质等。优选使用具有抗皱纹活性的物质，诸如自由基清除剂或抗氧化剂，或促进皮肤大分子合成的物质、或促进能量代谢的物质。更特别地，活性成分选自维生素、植物甾醇、类黄酮、DHEA和/或其一种前体或化学或生物学衍生物、金属蛋白酶抑制剂、或类视黄醇。此外，添加剂诸如增稠剂、乳化剂、湿润剂、润滑剂、芳香剂、抗氧化剂、成膜剂、螯合剂、多价螯合剂、包装剂等可被添加到组合物中。
在所有情况下，本领域技术人员会挑选这些佐剂以及它们的比例，以确保不会损害本发明组合物所期待的优势特性。例如，这些佐剂可占组合物总重量的0.01％到20％。当本发明的组合物是乳剂时，脂相可占组合物总重量的5％到80％，优选占组合物总重量的5％到50％。组合物中使用的乳化剂和辅-乳化剂可选自本领域中常规使用的那些。例如，它们可以组合物总重量的0.3％到30％来使用。
最后，本发明涉及组合物，其包含所述肽水解产物以增加蛋白酶体活性和改善蛋白酶体对受损蛋白的降解。
在第三方面，本发明涉及涉及包含所述富集的肽水解产物和化妆可接受介质的化妆组合物的用途，其用于预防和/或治疗皮肤老化和光老化迹象。
“皮肤老化迹象”包括但不限于任何由老化导致的在皮肤可见的表现。这特别是指皱纹、深纹和粗纹、细纹、裂纹、皮肤和皮下组织的松弛、皮肤弹性和张力的丧失、致密性和皮肤紧张性的丧失、以及真皮萎缩。另外，术语“皮肤老化迹象”指的是毛孔增大、瑕疵、变色、老年斑、角化病、胶原蛋白的丧失，和其它真皮和表皮的变化，还有因老化而对皮肤、指甲和毛发外观的任何改变，诸如例如角质层表面租糙，还有任何对皮肤的内在改变，其非全身性地导致改变的外观，诸如皮肤变薄。术语“光老化”指的是累积地长时间暴露于太阳所导致的皮肤过早老化。
因此本发明涉及组合物的用途，其用于治疗或预防皱纹、深纹和粗纹、细纹、裂纹、皮肤和皮下组织的松弛、皮肤弹性和张力的丧失、致密性和皮肤紧张性的丧失、和真皮萎缩。
另一方面，本发明涉及本发明的组合物用于保护皮肤对抗UV辐射侵袭的用途。
最后，本发明涉及组合物的用途，其用于增加蛋白酶体的活性，并改善蛋白酶体对受损蛋白的降解。
最后，本发明涉及化妆治疗方法，其由如下所组成：将包含有效量的本发明富集的肽水解产物的组合物局部应用到皮肤，以预防和/或治疗皮肤老化或光老化迹象。此外，此化妆治疗方法可在睡前应用，以在细胞更新循环期间清理皮肤细胞。事实上，在夜间，皮肤优先进行更新功能和代谢合成过程。因而，以尊重皮肤生物学节律的方式应用所要求保护的组合物意味着能获得促进细胞再生的年轻化和再生效果。
以下实施例描述并证明了本发明所述的肽化合物的有效性，但不应被理解为是对本发明的限制。
实施例1：从玉米粉(Zea mays L.)中制备肽水解产物
将玉米粉(Zea mays L.)溶解在10体积的含2％POLYCLAR10(聚乙烯吡咯烷酮-PCPP-不可溶)的水中。混合物使用1M氢氧化钠水溶液调节pH至6-8范围内。
调节pH后，将2％的木瓜蛋白酶加到反应介质中。在55℃搅拌2小时后完成水解。然后，通过加热溶液到80℃，2小时将酶灭活。离心后，回收上清的水溶液，相当于玉米粗水解产物。选择特定的水解条件，以使得含有3到5个氨基酸包含至少一个天冬氨酸残基、一个半胱氨酸残基和一个精氨酸残基的生物活性肽能够富集。
粗水解产物纯化的方法始于使用孔隙率递降(到0.2μm)的Seitz-Orion过滤板的成功过滤，以获得透明澄清的黄色溶液，称为水解产物1。在这一步，玉米水解产物1的特征在于固体残余物含量测定为20-30g/kg，蛋白含量为20-25g/l和糖含量为2-5g/l。
水解产物1的蛋白性质在NuPAGEBis-Tris预置聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen)电泳分析后被鉴定。玉米蛋白水解产物在NuPAGELDS样品制备缓冲液的还原变性条件下被加热到70℃，10分钟。蛋白迁移在NuPAGEMES迁移缓冲液中使用SeeBlue Plus2 standard作为分子量标记来完成。蛋白染色使用Coomassie BlueR-250来完成。在这些条件下，观察到获得的蛋白具有小于6kDa的分子量。
水解产物1随后通过Pellicon2Biomax 5kDa盒超离心来进行纯化，以排除高分子量蛋白，仅保留小于5kDa的肽性质的化合物。
在此最终纯化后，完成稀释阶段以获得肽水解产物，其特征在于蛋白含量在3.5到5.5g/l范围内。此肽水解产物相当于本发明的活性成分。
此肽水解产物随后使用ChemStation软件控制辅助有HP 1100部件的高效液相色谱(HPLC)来进行分析。水解产物洗脱期间使用的柱子是Nucleosil300-5 C4 MPN(125x4mm)柱，其允许分子量为0.2到25kDa的蛋白在以下条件下被色谱分析：
-甲醇梯度
-Uptisphere OPB 125x3mm柱
-溶剂A：含有0.1％七氟丁酸(HFBA)的HPLC级水
-溶剂B：含有0.1％七氟丁酸(HFBA)的HPLC级甲醇
-梯度：35分钟内溶剂A从100％到15％。
通过HPLC(高效液相色谱)鉴定相当于生物活性肽峰的色谱例子在附图1中给出。
这些不同的部分随后通过质谱进行分析，以特异地鉴定每个峰的肽的氨基酸含量。也进行了序列分析以确定生物活性肽的肽序列。
实施例2：从豌豆(Pisum sativum L.)中制备富含生物活性肽的肽水解产物
肽水解产物从豌豆种植物的提取物中获得。显然，提取物可以从至少任何一种属于豌豆属的众多变种和种的植物中制备。
第一步中，1kg去壳的豌豆通过有机溶剂己烷的作用去脂。
将如此获得的豌豆粉溶解在10体积的含2％POLYCLAR10(聚乙烯吡咯烷酮-PCPP-不可溶)的水中。混合物使用1M氢氧化钠水溶液调节pH在6-7范围内。
调节pH后，将2％的flavourzym加到反应介质中。在50℃搅拌2小时后完成水解。然后，通过加热溶液到80℃，2小时是酶灭活。从而获得反应混合物相当于豌豆提取物。选择特定的水解条件，以使得含有3到5个氨基酸包含至少一个天冬氨酸残基、一个半胱氨酸残基和一个精氨酸残基的生物活性肽能够富集。
纯化方法始于使用孔隙率递降(到0.2μm)的Seitz-Orion过滤板的成功过滤，以获得透明澄清的溶液。在这一步，豌豆水解产物的特征在于固体残余物含量测定在70-80g/kg，蛋白含量为55-65g/l，糖含量为2-5g/l和多酚含量在1-3g/l。
此水解产物的蛋白性质通过聚丙烯酰胺凝胶电泳来进行鉴定。对于此分析，使用NuPAGEBis-Tris预置聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen)。豌豆蛋白水解产物在NuPAGELDS样品制备缓冲液的还原变性条件下被加热到70℃，10分钟。蛋白迁移在NuPAGEMES迁移缓冲液中使用SeeBlue Plus2standard作为分子量标记完成。蛋白染色使用Coomassie BlueR-250完成。在这些条件下，管产到2个大的蛋白家族：第一个家族相当于分子量在20到25kDa的蛋白，后一家族是分子量小于5kDa的蛋白。
此溶液随后使用正切流动过滤来纯化，以排除分子量大于5kDa的蛋白。为了此目的，将豌豆水解产物在压力下泵入有Pellicon2 Biomax 30kDa盒的Pellicon支持物。此第一滤液被回收用于后继通过另一Pellicon2Biomax 5kDa盒的过滤。在此纯化后，获得透明澄清的米黄色肽水解产物。其特征在于固体残余物含量为50-55g/kg和蛋白含量为5-52g/l。
此溶液随后使用ChemStation软件控制辅助有HP 1100部件的高效液相色谱(HPLC)来进行分析。豌豆提取物洗脱期间使用的柱子是Nucleosil300-5 C4 MPN(125x4mm)柱。此柱能使分子量为0.2到25kDa的蛋白被色谱分析(使用与实施例1中一致的合适溶剂梯度)。在这些层析分析条件下，几个肽部分能得到分离。
这些不同的部分随后通过质谱进行分析，以特异地鉴定每个峰的肽的氨基酸含量。还进行了序列分析以确定生物活性肽的肽序列。通过HPLC(高效液相色谱)鉴定相当于生物活性肽峰的色谱例子在附图2中给出。
本发明的活性成分的氨基酸组成也被确定。它在酸水解后被完成并通过使用PICT(异硫氰酸苯酯)柱前衍生化的高效液相色谱来鉴定。
实施例3：从酿酒酵母中制备富含生物活性肽的肽水解产物
肽水解产物能从酿酒酵母种的酵母提取物中获得。将酵母培养在适合它们生长的培养基中，优选存在乳酸，随后离心以回收生物质。将酵母生物质溶解在10体积的含2％POLYCLAR10(聚乙烯吡咯烷酮-PCPP-不可溶)和0.2％活性炭的水中。混合物使用1M氢氧化钠水溶液调节pH在6-7.5范围内。
调节pH后，将2％的木瓜蛋白酶加到反应介质中。在55℃搅拌2小时后完成水解。然后，通过加热溶液到80℃，2小时将酶灭活。离心后，获得反应混合物，相当于酵母提取物。选择特定的水解条件，以使得含有3到5个氨基酸包含至少一个天冬氨酸残基、一个半胱氨酸残基和一个精氨酸残基的生物活性肽能够富集。
纯化方法始于使用孔隙率递降(到0.2μm)的Seitz-Orion过滤板的成功过滤，以获得透明澄清的溶液。在这一步，酵母提取物的特征在于固体残余物含量为25-35g/kg，蛋白含量为10-15g/l和糖含量为5-10g/l。
此提取物的蛋白性质通过聚丙烯酰胺凝胶电泳来鉴定。对于此分析，使用NuPAGEBis-Tris预置聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen)。肽水解产物在NuPAGELDS样品制备缓冲液的还原变性条件下被加热到70℃，10分钟。NuPAGE抗氧化剂溶液被加到内室(负极)以防止电泳期间再氧化的还原蛋白。蛋白迁移在NuPAGEMES迁移缓冲液中使用SeeBlue Plus2 standard作为分子量标记来完成。蛋白染色使用Coomassie BlueR-250完成。在这些条件下，观察到3个大的蛋白家族：第个一家族相当于分子量大于75kDa的蛋白，第二个家族相当于分子量在20到25kDa的蛋白，最后一家族是分子量小于5kDa的蛋白。
此溶液随后使用正切流动过滤来纯化，以排除分子量大于5kDa的蛋白。为了此目的，将豌豆肽水解产物在压力下泵入提供有Pellicon2Biomax 50kDa盒的Pellicon支持物。此第一滤液被回收用于后继通过另一Pellicon2Biomax 10kDa盒的过滤。第二滤液随后被回收，其再次通过Pellicon2Biomax 5kDa盒的洗脱。在此纯化后，获得透明澄清的米色酵母植物提取物。其特征在于固体残余物含量为35-45g/kg和蛋白含量为30-40g/l。
此溶液随后使用ChemStation软件控制辅助有HP 1100部件的高效液相色谱(HPLC)来分析。酵母水解产物洗脱期间使用的柱子是Nucleosil300-5C4 MPN(125x4mm)柱。此柱能使分子量为0.2到25kDa的蛋白被色谱分析(使用与实施例1中一致的适宜的溶剂梯度)。在这些层析分析条件下，几个肽部分能被分离。
这些不同的部分随后通过质谱来分析，以特异地鉴定每个峰的肽的氨基酸含量。还进行了序列分析以确定生物活性肽的肽序列。通过HPLC(高效液相色谱)鉴定相当于生物活性肽峰的色谱例子在附图4中给出。
本发明的活性成分的氨基酸组成也被确定。它在酸水解后被完成并通过使用PICT(异硫氰酸苯酯)柱前衍生化的高效液相色谱来鉴定。
实施例4：在培养的老龄角质化细胞中，鉴定实施例1的玉米肽水解产物 对于20S蛋白酶体酶活性的激活剂效应
将培养15天的实验性老龄角质化细胞用实施例1中产生的来自玉米的1％的肽水解产物处理。然后，研究了20S蛋白酶体的酶活性。20S蛋白酶体是负责酶水解的亚单位。可研究三种酶活性：胰蛋白酶样、糜蛋白酶样和肽谷氨酸-肽水解酶(PGPH)的活性。我们通过特异针对每一活性的酶测定进行了这些活性的研究。
方案
老龄的角质化细胞被培养15天。细胞通过直接在培养液中加入我们的肽水解产物的1％溶液来进行处理，其在整个试验中每周更换3次。
测定了每一种活性，使用标记有荧光化合物7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)的特异底物。切割后，在440nm读取AMC的荧光，其有350nm的激发波长。荧光强度与获得的荧光染料的量成比例，因此，其量与水解的底物的量成比例。
合成的肽Boc-Leu-Arg-Arg-AMC特异针对胰蛋白酶活性。
合成的肽Suc-Leu-Leu-Val-Try-AMC特异针对糜蛋白酶活性。
合成的肽Z-Leu-Leu-Glu-AMC特异针对肽谷氨酸-肽水解酶酶活性。
这些肽由SIGMA ALDRICH，Saint-Louis，MI，USA提供并标记。
将细胞在提取缓冲液中从支持物解离。然后，将它们在4℃超声处理1分钟，随后在4℃，15000g离心30分钟。蛋白测定使用BCA试剂盒(Pierce)完成。在将细胞裂解液与用于所研究活性的特异合成底物温育后，使用Synergy分光光度计(BIOTEK，Vermont，USA)在440nm读取荧光值。
结果
对3种所研究的活性，我们观察到，实施例1中的肽水解产物能增加20S蛋白酶体的酶活性。胰蛋白酶样活性在使用活性成分处理期间增加了155.3％；糜蛋白酶样活性增加了130％，记录到肽谷氨酸-肽水解酶酶活性增加了144.6％。
结论
将实施例1中富含生物活性肽的肽水解产物，以1％的浓度实验性地使用于培养的老龄角质化细胞中，能增加20S蛋白酶体的特异酶活性。
本实验进行了多次，可进行统计检验(Student t检验)。活性的增加在胰蛋白酶样，糜蛋白酶样活性的研究中有显著性(分别为，p＝0.033和p＝0.0477)，对于肽谷氨酸-肽水解酶酶活性有高显著性(p＝0.00053)。
实施例5：在培养的老龄角质化细胞中，鉴定实施例3中的酵母肽水解产 物的抗老化效应
通过在培养的实验性老龄角质化细胞中评估β-半乳糖苷酶蛋白的表达来对酵母肽水解产物的抗老化效应进行研究。β-半乳糖苷酶活性已知存在于衰老的细胞中，而在衰老前体、休眠和永生化细胞中未发现有β-半乳糖苷酶活性。
方案
在Labec8孔板中培养实验性老龄角质化细胞，并在存在和缺乏1％富含生物活性肽的酵母肽水解产物下维持20天。通过直接加样到培养液中每周进行3次处理。
未经处理的细胞在相同实验期间被培养并作为对照。在标记日，清洗细胞，在2％戊二醛-2％甲醛混合物中固定3分钟。随后清洗细胞，施用300μl 5-溴-4-氯-3吲哚-D-乳糖苷酶，通常被称为X-gal(β-半乳糖苷酶底物)。在CO2培养箱中进行24小时温育，随后清洗细胞，将Labec板快速安置到合适的介质上。使用透射显微镜进行观察。原理是简单的：当细胞衰老并含有β-半乳糖苷酶时，X-gal底物被切割成不溶的蓝色物质。β-半乳糖苷酶活性通过细胞的蓝色染色来显现。细胞的蓝色越深，衰老细胞的数量越大。
结果/结论：
我们发现在活性成分存在时，例如酵母肽水解产物，β-半乳糖苷酶活性在处理过的细胞中对比未处理的细胞大大降低了。
因此，本发明的肽水解产物对培养了20天的实验性老龄角质化细胞有抗老化效应。
实施例6：在使用水稻肽水解产物处理并经受UV辐射(UVB)的成纤维细胞 中，评估蛋白的羰基化
方案
将培养的正常人成纤维细胞接种于直径100mm的平皿。当细胞达到70％密度时，用在培养液中稀释到1％浓度的富含生物活性肽的水稻肽水解产物处理细胞48小时。细胞经100mJ/cm2的UVB照射，随后被进一步置于活性成分存在下48小时。对照平皿的细胞未经活性成分处理，但被照射作为对照。清洗细胞，随后从支持物上使用合适的提取缓冲液解离。提取的蛋白在使用PCA蛋白试剂盒(Pierce)检测前在4℃，10000rpm离心10分钟。蛋白羰基化使用基于与2，4-二硝基苯肼(DNP)(Sigma)衍生的羰基基团的免疫检测的测试完成，依照反应：
蛋白-C＝O+H2N-NH-2·4DNP→蛋白-C＝N-NH2.4-DNP+H2O
简而言之，将15μl样品与45μl DNP在室温反应45分钟。然后，5μl混合物被稀释到1ml磷酸盐缓冲液中，200μl的此稀释液被放置到96孔板中，存在150μl BSA(fraction V)，4℃过夜。
在磷酸盐缓冲液(PBS)中清洗三次后，将兔抗二硝基苯生物素标记的抗体(CALBIOCHEM)在存在0.1％Tween 20的0.1％血清白蛋白缓冲液中稀释到1/5000，在37℃于微板中温育1小时。3次清洗后，将稀释到1/3000的链霉亲和素-过氧化物酶(DAKO)络合物在存在0.1％Tween 20的0.1％血清白蛋白缓冲液中室温温育1小时。三次清洗后，使用200μl四甲基联苯胺(TMB，SIGMA)于室温25分钟使其显色。然后加入100μl 2.5M的硫酸终止反应。在490nm被读取OD值。为将获得的OD值转化成样品中存在的羰基基团的数量，通过从0到100％改变氧化的BSA比例来制定校正曲线。
结果：
在UVB存在下，未处理的细胞被强羰基化，相比未被照射的未处理细胞增加了110％。在富含1％生物活性肽的水稻肽水解产物存在下，羰基化程度降低了34％。实验进行了多次，可进行统计检验(Student t检验)。羰基化的降低是显著的，p＝0.0298。
综上所述，本发明的活性成分能用于保护细胞抵抗UV的有害作用，例如，抵抗其氧化作用。水稻肽水解产物能用于降低大于34％的蛋白氧化。
实施例7：临床测验
临床评估方案
将安慰剂或实施例3的富含生物活性肽的酵母肽水解产物，以24小时内2mg/cm2的剂量应用到12名年龄从29到56岁的志愿者，一天两次，早和晚。结果的临床评估使得能够测量几个皱纹和细纹的参数。
皱纹和细纹的测量使用QUANTIRIDE完成，其是一种评估方法，能通过产生治疗前后皮肤的复制物，使用硅酮聚合物，测量皱纹的数量，长度和深度。
结果总结于下表
皱纹定量结果
皱纹长度 时间 测量(mm) Wilcoxon检验 有改善的志愿者％
水解产物 J23-J0 -0.104 0.017 83.3％
安慰剂 J23-J0 0.0029 N/A N/A
皱纹数量 时间 测量(mm) Wilcoxon检验 有改善的志愿者％
水解产物 J23-J0 -9.5833 0.0249* 75％
安慰剂 J23-J0 5.8333 N/A N/A
皱纹深度 时间 测量(mm) Wilcoxon检验 有改善的志愿者％
水解产物 J23-J0 -6.5557 0.0075 75％
安慰剂 J23-J0 3.6284 N/A N/A
结论：
24天治疗后，我们在83.3％的经治疗的受试者中观察到统计上的总皱纹长度的减少，和在75％的经治疗的受试者中皱纹数量的减少。对于皱纹长度，在富含生物活性肽的酵母肽水解产物和安慰剂间观察到显著性差异(p＝0.017)。对于皱纹深度，活性成分和安慰剂间的差异也是显著的(p＝0.0075)并在75％的志愿者中被观察到。

Claims (17)

1.蛋白酶体激活性肽水解产物，特征在于所述水解产物来自植物或酵母的水解，有小于6kDa的分子量并且富含多种生物活性肽，
其中所述植物选自玉米(Zea mayz L.)、豌豆(Pisum sativum)、或水稻(Oryza sativa L.)，所述酵母是酵母属的酵母，
其中所述水解产物富含至少一种下式中的生物活性肽：
(SEQ ID n°1)Arg–Asp–Cys–Arg–Arg
(SEQ ID n°2)Asn–Asp–Cys–Arg–Lys
(SEQ ID n°3)Asp–Cys–Arg–His
(SEQ ID n°4)Val–Asp–Cys–Arg
(SEQ ID n°5)Asp–Cys–Arg。
2.权利要求1的蛋白酶体激活性肽水解产物，其中所述酵母是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)种。
3.权利要求1或2的蛋白酶体激活性肽水解产物，特征在于所述肽水解产物含有0.5至5.5g/l的肽性质的化合物。
4.权利要求1或2的蛋白酶体激活性肽水解产物，特征在于其被用作药物。
5.一种化妆组合物，其包含权利要求1或2所述的蛋白酶体激活性肽水解产物作为活性成分。
6.权利要求5的化妆组合物，特征在于其以包含化妆可接受介质的适于局部应用的形式存在。
7.权利要求5的化妆组合物，特征在于所述蛋白酶体激活性肽水解产物在组合物中以占总组合物重量的0.0001％至20％的量存在。
8.权利要求5的化妆组合物，特征在于所述蛋白酶体激活性肽水解产物在组合物中以占总组合物重量0.05％至5％的量存在。
9.权利要求5的化妆组合物，特征在于所述蛋白酶体激活性肽水解产物被溶解于一种或多种溶剂中。
10.权利要求9的化妆组合物，特征在于所述溶剂选自水、甘油、乙醇、丙二醇、丁二醇、一缩二丙二醇、乙氧基化或丙氧基化的二甘醇、环多元醇、凡士林、植物油或这些溶剂的任意混合物。
11.权利要求5的化妆组合物，特征在于所述化妆组合物还含有促进所述蛋白酶体激活性肽水解产物作用的至少一种活性成分。
12.权利要求11的化妆组合物，其特征在于所述至少一种活性成分是有抗皱纹活性的物质或者刺激皮肤大分子合成的物质或者刺激能量代谢的物质。
13.权利要求12的化妆组合物，其特征在于所述有抗皱纹活性的物质选自自由基清除剂或抗氧化剂。
14.包含权利要求1或2所定义的所述蛋白酶体激活性肽水解产物和化妆可接受介质的化妆组合物的用途，其用于增加蛋白酶体活性和改善蛋白酶体对受损蛋白的降解，其中所述蛋白酶体活性选自胰蛋白酶样酶活性、糜蛋白酶样酶活性和肽谷氨酸-肽水解酶活性。
15.有效量权利要求1或2所定义的蛋白酶体激活性肽水解产物在制备组合物中的用途，其中所述组合物局部应用于皮肤、指甲或毛发来预防和/或治疗皮肤老化和光老化迹象。
16.权利要求15的用途，特征在于术语“皮肤老化迹象”指的是皱纹、深纹和粗纹、细纹、裂纹、皮肤和皮下组织的松弛、皮肤弹性和张力的丧失、致密性和皮肤紧张性的丧失、和真皮萎缩。
17.权利要求15的用途，特征在于所述组合物能保护皮肤抵抗UV辐射的侵袭。
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