CN107405278B - 序列为his-d-trp-ala-trp-d-phe-lys-nh2的肽用于减少或延缓细胞衰老的出现和皮肤老化的迹象的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及在生理学上可接受的介质中包含作为活性剂的0.1至1μM的序列为His‑D‑Trp‑Ala‑Trp‑D‑Phe‑Lys‑NH2的合成肽或其盐之一的组合物用于减少或延缓细胞衰老的出现和皮肤老化的迹象的化妆品用途。本发明还涉及与这些用途相关的化妆品处理方法，其包括经至少2天的时段每天至少一次局部施用组合物的步骤。

Description

序列为HIS-D-TRP-ALA-TRP-D-PHE-LYS-NH2的肽用于减少或 延缓细胞衰老的出现和皮肤老化的迹象的用途
技术领域
本发明涉及化妆品和皮肤-药物活性剂以及涉及其的美容处理方法的领域。
本发明涉及包含序列为His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2的合成肽的组合物用于减少或延缓细胞衰老的出现的新型化妆品用途。
本发明还涉及包含所述肽的组合物用于减少或延缓皮肤老化迹象、更具体地皱纹的出现的新型化妆品用途。
本发明还涉及与这些新型用途相关的美容处理方法，其包括将组合物在至少2天的时段每天至少一次局部施用的步骤。
背景技术
皮肤是由几层(真皮、真皮-表皮连接处、表皮)组成的包膜器官。真皮是皮肤的支撑组织，并且由水、弹性蛋白纤维和胶原蛋白纤维构成。该后者代表大约70％的真皮纤维，并且由成纤维细胞合成。
胶原蛋白的合成、其降解及其再循环是维持其在皮肤细胞外基质中的表达水平的关键步骤。所有这些步骤都被高度调节，特别是再循环。后一步骤通过细胞质酶(氨酰基脯氨酸二肽酶)进行。氨酰基脯氨酸二肽酶是这样的酶，其降解在C-端位置含有脯氨酸或羟脯氨酸且主要衍生自胶原蛋白的亚氨基二肽和三肽(Surazynski等人Amino Acids(2008)35:731–738)。因此，由于氨酰基脯氨酸二肽酶的作用，更新细胞中脯氨酸和羟脯氨酸的储库，以便能够合成新鲜的胶原蛋白。事实上，胶原蛋白是由23％脯氨酸和羟脯氨酸构成的蛋白，并且基本要素(即脯氨酸和羟脯氨酸)的可用性对于胶原蛋白的新合成是至关重要的(Barbul A.,J.Nutr.138:2021S–2024S,2008)。用于合成胶原蛋白的脯氨酸的90％源自氨酰基脯氨酸二肽酶的作用(Son等人, Biol.Pharm.Bull.30(8)1395—1399(2007))。
与所有其它器官相同，皮肤经历老化的复杂生理过程。内在或时间老化是遗传程序性衰老和由于内源性因素引起的生化改变的结果。在皮肤中，这特征在于细胞和细胞外基质的再生的减慢，导致真皮和表皮萎缩、干燥、皮肤的弹性和紧实度的降低以及细纹和皱纹的出现。另一方面，外在老化是由于环境攻击诸如污染、阳光(UV辐射)、疾病、生活方式等。这被叠加在长期暴露于这些攻击的区域处的内在老化；这则被称为光老化。
因此，20和80岁之间，成纤维细胞的数量将减少一半。此外，当成纤维细胞老化时，胶原蛋白合成的水平以及氨酰基脯氨酸二肽酶的活性降低，表明该酶在衰老中的意义和发现分子靶标以抵抗成纤维细胞的衰老的优点 (
Figure GDA0001407798350000021
等人Tokai J Exp Clin Med.,Vol.21,No.4-6,pp.207-213,1996)。
研究已经能够鉴定能够增加胶原蛋白的合成和抵抗皮肤老化的活性剂。然而，已经有必要鉴定能够有效地靶向细胞中胶原蛋白的合成并延缓细胞衰老的新型化合物。
发明内容
序列为His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2的合成肽(其具有六肽-2的国际命名名称INCI)由于其漂白、遮蔽和皮肤增亮活性而已知(Sawyer TK等人Discovery andstructure-activity relationships of novel alpha-melanocyte -stimulatinghormone inhibitors.Pept Res.1989Jan-Feb；2(1):140-6)。
然而，尚未描述其对皮肤老化的作用。相反，专利申请EP 2 666 780 公开了在1μM、10μM和100μM的浓度下，六肽-2对体外培养的成纤维细胞对胶原蛋白的分泌没有影响，而用生物素基团化学取代的相同肽在相同浓度增加胶原蛋白的分泌。
然而，生物素化的六肽-2对氨酰基脯氨酸二肽酶的活化和胶原蛋白的表达没有任何影响。
相反，在其研究期间，本发明人已经证明，当以0.1μM至1μM范围内的较低浓度使用时，序列为His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2的合成肽：
-增加氨酰基脯氨酸二肽酶的表达和活性，
-增加I型和III型胶原蛋白的表达，
-增加已经变得衰老的成纤维细胞中的胶原蛋白I的表达，
-减少或延缓成纤维细胞中的衰老标记物的表达，
-减少皱纹的出现。
因此，他们已经证明，该肽适用于旨在减少或延缓细胞衰老的出现和皮肤老化的迹象、更具体地皱纹的出现的化妆品用途。
在本说明书的过程期间，序列为His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2的合成肽将不加选择地被称为“合成肽”或“根据本发明的肽”或“六肽-2”。
因此，本发明的主要目的是在生理学上可接受的介质中包含作为活性剂的0.1至1μM的序列为His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2(SEQ ID NO:1) 的合成肽或其盐之一的组合物用于减少或延缓细胞衰老的出现和皮肤老化的迹象的化妆品用途，所述组合物在至少2天的时段每天至少一次局部施用。
术语“皮肤”意指构成皮肤的包膜组织、黏膜以及毛发和指甲的组装物。
表述“减少或延缓细胞衰老的出现”意味着根据本发明的肽减少人成纤维细胞(其衰老已经被基因FOXO3a的灭活所诱导或其重复衰老已经通过大量的培养传代所诱导)中的衰老标记物的表达，或者实际上延缓这些现象的出现。
术语“生理上可接受的”意指适合于与皮肤或人毛发和指甲接触、而不会产生毒性、不耐受性、不稳定性、过敏反应和其它继发效应的风险的溶剂或介质。
然后根据本发明的稀释的肽通过无菌过滤来灭菌。
术语“皮肤老化的迹象”意指由于老化引起的出现和毛发以及指甲的任何改变，诸如例如皮肤变薄、下垂、水分损失、皮肤张力缺失、深层皱纹和细纹、硬度和色调的丧失、真皮萎缩或皮肤的任何其它内部降解，除了老年斑或雀斑型的皮肤的色素异常或肤色中的任何其它不规则性。
优选地，表述“减少皮肤老化的迹象”意味着根据本发明的肽减少皱纹的数量、总表面积、总长度和总深度。
有利地，根据本发明的组合物是适合于局部施用的形式。
术语“局部施用”意味着将包含根据本发明的肽的组合物施用或散布至皮肤或黏膜的表面上。
有利地，包含作为活性剂的根据本发明的肽的组合物将以每天至少一次的频率局部施用。
在另一个实施方案中，所述组合物将以每天两次的频率施用。
有利地，包含作为活性剂的根据本发明的肽的组合物将在至少2天的时段局部施用。
在另一个实施方案中，所述组合物将施用至少6周的时段。
在另一个实施方案中，所述组合物将施用至少3个月的时段。
根据本发明的肽是序列为His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2的合成六肽。优选地，所述肽是三氟乙酸盐的形式。
根据本发明的肽有利地溶解在一种或多种生理学上可接受的溶剂中，所述生理学上可接受的溶剂诸如水、甘油、乙醇、丙二醇、丁二醇、二丙二醇、乙氧基化二甘醇或丙氧基化二甘醇、环状多元醇或这些溶剂的任何混合物。
有利地，根据本发明的肽在水溶液中。
在该稀释步骤之后，根据本发明的肽可以被包封或包括在化妆品载体诸如脂质体或化妆品领域中使用的任何其它微胶囊中或吸附至粉末状有机聚合物、矿物支持物诸如滑石和膨润土上，以及更通常溶解于任何生理上可接受的载体中或固定在任何生理上可接受的载体上。
可以根据本发明使用的组合物可以使用任何适当的方式、特别是口服或局部(外部)施用，并且所述组合物的制剂将由本领域技术人员调整。
优选地，根据本发明的组合物是适合于局部施用的形式。因此，这些组合物必须含有生理上可接受的介质，即与皮肤和毛发以及指甲相容、而在施用期间没有任何不适风险的介质，并且涵盖所有化妆品形式。
这些组合物可特别为以下形式：水、水醇或油溶液；水包油型、油包水型乳剂或复合乳剂；水或非水凝胶；胶体。这些组合物也可为适用于施用至皮肤、黏膜、唇和/或皮肤和指甲的乳膏、悬浮液或事实上粉末的形式。这些组合物可在或多或少的程度上为流体并且具有乳膏、洗液、乳、精华液、蜡、乳膏、浆料或泡沫的出现。它们还可为固体形式诸如条，或可以以气溶胶形式将它们施用至皮肤。它们还可用作护理产品和/或用于皮肤的化妆产品。
此外，所有的这些组合物包括使用领域中设想的通常使用的任何添加剂以及对于它们的配制必要的佐剂，诸如助溶剂(乙醇、甘油、苯甲醇、湿润剂等)、增稠剂、稀释剂、乳化剂、抗氧化剂、着色剂、遮光剂、颜料、填料、防腐剂、香水、气味吸收剂、香精油、痕量元素、必需脂肪酸、表面活性剂、成膜聚合物、化学或矿物滤光剂、水合剂或热水等。可以引用的实例是天然聚合物型的水溶性聚合物诸如多糖、或多肽、甲基纤维素或羟丙基纤维素型的纤维素衍生物、或事实上合成的聚合物、泊洛沙姆、卡波姆、硅氧烷、PVA或PVP和特别是由Ashland公司销售的聚合物。
在任何情况中，本领域技术人员将注意确保：选择佐剂以及它们的比例，其方式使得它们不具有对本发明的组合物所期望的有利性质的有害影响。这些佐剂可以例如以组合物总重量的0.01％-20％的浓度存在。当根据本发明的组合物为乳剂时，相对于组合物的总重量，脂肪相可以代表5重量％-80重量％并且优选5重量％-50重量％。将从所考虑的领域中常规使用的那些乳化剂和辅助乳化剂中选择组合物中使用的乳化剂和辅助乳化剂。作为实例，可以基于相对于总组合物重量的0.3重量％-30重量％的比例使用它们。
显然，根据本发明的用作活化剂的肽可单独使用或事实上与其它活性剂结合使用。
有利地，根据本发明使用的组合物还将含有旨在防止和改善皮肤老化迹象的领域中增强根据本发明的活性剂作用的至少一种其它活性剂，或者事实上用于扩展所考虑的组合物的性质范围的另一种活性剂。
可以以非限制性的方式引用以下类别的成分：再生剂、抗老化剂、抗皱剂、舒缓剂、自由基清除剂、抗糖化剂、水合剂、抗细菌剂、抗真菌剂、角质软化剂、肌肉松弛剂、脱落剂、固化剂、刺激真皮大分子的合成或能量代谢或微循环或指甲生长或毛发生长的试剂、调节表皮的分化或色素沉着的试剂、抑制金属蛋白酶的试剂或事实上遮光剂或滤光剂。
在本发明的一个更特别的实施方案中，除了根据本发明的肽以外，根据本发明的组合物还将包含：
-至少一种活化细胞色素c的化合物，和/或
-至少一种水合化合物，诸如活化水通道蛋白的化合物，和/或
-至少一种活化sirtuins的化合物，和/或
-至少一种增加细胞粘连的化合物，和/或
-至少一种增加基质蛋白诸如胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、糖胺聚糖的产生的化合物，和/或
-至少一种调节蛋白酶体活性的化合物，和/或
-至少一种调节昼夜节律的化合物，和/或
-至少一种调节HSP蛋白的化合物，和/或
-至少一种提高细胞能量的化合物，和/或
-至少一种调节皮肤色素沉着的化合物，和/或
-至少一种活化辅酶Q10的化合物，和/或
-至少一种改善屏障功能的化合物，诸如活化谷氨酰胺转移酶或 HMG-CoA还原酶的化合物，和/或
-至少一种保护线粒体的化合物。
所述上述化合物可为天然来源的，诸如植物肽水合剂，或事实上为合成来源的，诸如肽。
不依赖于它们的功能，所述组合物中与根据本发明的活性剂关联的其它活性剂可具有非常广泛的各种化学结构。可以引用的非限制的实例为肽类、维生素C及其衍生物、来自B族的维生素类、DHEA(二氢表雄甾酮)、植物甾醇类、水杨酸及其衍生物、类视黄醇类、类黄酮类、氨基糖类、唑类、金属盐类、植物来源的肽提取物或实际上聚合物。
有利地，根据本发明的肽以范围0.1至1μM的浓度、优选范围0.5至1μM 的浓度、还更优选严格低于1μM的浓度存在于所述组合物中。
不希望受任何科学理论所束缚，该浓度范围代表作为活性剂的根据本发明的肽以获得所需分子效应(其被定义为氨酰基脯氨酸二肽酶的活性和胶原蛋白的合成的优化增加)所需的量。
有利地，该浓度范围可用于获得I型和III型胶原蛋白的合成的最大增加。
本发明还涉及用于减少或延缓细胞衰老的出现和皮肤老化的迹象的美容处理方法，其包括在持续至少2天的时段每天至少一次局部施用在生理上合适的介质中包含作为活性剂的0.1至1μM序列为 His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2的合成肽的组合物。
附图说明
从参照附图作出的以下非限制性实施方案将更好地理解本发明及其所得优点，在所述附图中：
-图1代表来自不同年龄的供体的人成纤维细胞中的miRNA-29a 3p的表达的研究；
-图2代表六肽-2对通过用siRNA FOXO3a转染使得衰老的人成纤维细胞中的胶原蛋白I的表达的影响的评估；
-图3代表六肽-2对通过重复衰老(长期处理)使得衰老的人成纤维细胞中的β-半乳糖苷酶的活性的影响的评估；
-图4代表六肽-2对通过在六肽-2存在的情况下重复衰老(短期处理) 而衰老的人成纤维细胞中的β-半乳糖苷酶的活性的影响的评估；
-图5代表六肽-2对通过重复衰老(长期处理)使得衰老的人成纤维细胞中的氨酰基脯氨酸二肽酶的活性的影响的评估；
-图6代表六肽-2对通过重复衰老(长期处理)使得衰老的人成纤维细胞中的miRNA-29a 3p的表达的影响的评估；
-图7代表通过临床研究评估的1％六肽-2对皱纹的总表面积的影响；
-图8通过临床研究评估的1％六肽-2对皱纹的总长度的影响；
-图9通过临床研究评估的1％六肽-2对皱纹的总深度的影响。
具体实施方式
在说明书和实施例中，除非另有说明，应当理解，当给出其范围时，其包括所述范围的上限和下限。
实施例1：在六肽-2存在的情况下人成纤维细胞中的氨酰基脯氨酸二肽酶的表达 的研究
本研究的目的是确定六肽-2对人成纤维细胞中的氨酰基脯氨酸二肽酶的表达的影响。
方案：培养的人成纤维细胞用在培养基中稀释后最终浓度为0.5和1μM 的六肽-2处理24小时(每天2次施用)。然后将细胞洗涤，在4℃下用冷甲醇固定4分钟。将细胞在对氨酰基脯氨酸二肽酶特异性的小鼠单克隆抗体 (LifeSpan BioSciences,参考LS-C115644)存在的情况下孵育，然后在与荧光染料偶联的抗小鼠二抗(Invitrogen,参考A21202)存在的情况下孵育。然后在落射荧光显微镜(Zeiss Axiovert 200M显微镜)下检查细胞。从获得的照片进行荧光的定量。
结果：表1中显示的显微镜观察表现出用六肽-2处理的细胞中的显著更强烈的细胞质荧光(使用Student t-检验)。
Figure GDA0001407798350000081
结论：六肽-2刺激人成纤维细胞中的氨酰基脯氨酸二肽酶的表达。
实施例2：在六肽-2存在的情况下人成纤维细胞中的氨酰基脯氨酸二肽酶的活性 的研究
本研究的目的是确定六肽-2对人成纤维细胞中的氨酰基脯氨酸二肽酶的活性的影响。
方案：培养的人成纤维细胞用在培养基中稀释后浓度为0.5和1μM的六肽-2处理24小时(每天2次施用)。同时，成纤维细胞用氨酰基脯氨酸二肽酶的活化剂和抑制剂(视黄酸(Sigma,参考R2625)和Cpz-Pro(Bachem,参考4001343))处理。接下来，借助于150mM NaCl溶液从培养皿分离细胞。已回收细胞沉淀并在37℃下用含有2mM MnCl2的溶液活化氨酰基脯氨酸二肽酶2小时之后，添加氨酰基脯氨酸二肽酶底物：47mM的甘氨酸-脯氨酸(Sigma,参考G3002)，在37℃下持续1小时。接下来，使用Chinard氏试剂，在515nm的波长下测定每个样品中含有的脯氨酸的量。同时，产生脯氨酸浓度范围以建立校准曲线。使用BCA蛋白测定试剂盒(Thermo Scientific,参考23225)测定蛋白的量，其使得能够记录每个样品中脯氨酸与蛋白的数量的比率。
结果：用六肽-2处理使得氨酰基脯氨酸二肽酶的活性(使用Student t- 检验)显著增加。结果呈现于下表2中。
Figure GDA0001407798350000082
结论：六肽-2刺激人成纤维细胞中的氨酰基脯氨酸二肽酶的活性。
实施例3：在六肽-2存在的情况下人成纤维细胞中的细胞内胶原蛋白I的表达的研 究
本研究的目的是通过流式细胞术确定六肽-2对人成纤维细胞中的细胞内胶原蛋白I的表达的影响。
方案：培养的人成纤维细胞用在培养基中稀释后浓度为0.5和1μM的六肽-2处理48小时(每天2次施用)。同时，成纤维细胞用胶原蛋白I(TGF-β (R&D system,参考240B))的活化剂处理。成纤维细胞用胰蛋白酶处理并回收细胞沉淀。然后将细胞在4℃下用冷甲醇固定15分钟。借助于与荧光染料偶联的对胶原蛋白I特异性的小鼠单克隆抗体(Millipore,参考：抗胶原蛋白I型，克隆：5D8-G9)进行免疫标记。接下来，通过流式细胞仪(GuavaEasyCyte))分析10 000个细胞，以测定其中它们各自中的荧光量。
结果：通过流式细胞仪分析后，在用六肽-2处理的细胞中检测到更强烈的细胞质荧光。结果呈现于下表3中。
表3 未处理的 0.5μM六肽-2 1μM六肽-2 10ng/ml TGF-β
胶原蛋白I的表达(％) 100 120 145 182
结论：六肽-2刺激人成纤维细胞中的胶原蛋白I的表达。
实施例4：在六肽-2存在的情况下离体培养物中的人皮肤中的胶原蛋白I和III的 表达的研究
本研究的目的是确定六肽-2对离体人皮肤中的胶原蛋白I和III的表达的影响。
方案：在空气/液体界面处培养人皮肤的样品。将六肽-2以培养基中稀释后0.5和1μM的浓度局部施用至样品，其量为每天2次施用，然后将样品在37℃下孵育48小时。
随后将这些皮肤样品用甲醛固定，然后包括至石蜡中。然后产生4μm 切片。
然后通过微波孵育、然后通过用胰蛋白酶处理将特定位点去掩蔽后进行胶原蛋白I和III的标记。借助于对胶原蛋白I特异性的兔多克隆抗体 (Rockland,参考600-401-103-0.5)、对胶原蛋白III特异性的兔多克隆抗体 (Rockland,参考600-401-105-0.5)、然后与荧光染料偶联的抗兔二抗 (Invitrogen,参考A21206)进行免疫标记。然后在落射荧光显微镜(Zeiss Axiovert 200M显微镜)下检查细胞。从获得的照片进行荧光的定量。
结果：显微镜观察表现出用六肽-2处理的活检的真皮中显著更强烈的荧光。结果呈现于下表4中。
表4 未处理的 0.5μM六肽-2 1μM六肽-2
胶原蛋白I的表达(％) 100 119 154
胶原蛋白III的表达(％) 100 155 155
结论：六肽-2刺激离体人皮肤中的胶原蛋白I和III的表达。
实施例5：衍生自不同年龄的供体的人成纤维细胞中的miRNA-29a 3p的表达的研 究
本研究的目的是通过qPCR确定六肽-2对来自不同年龄的供体的人成纤维细胞中的miRNA-29a 3p的表达的影响。miRNA在其靶标的转录后调节中通过抑制它们来发挥基本作用。在文献中已经证明，miRNA-29a的表达随衰老而增加(Mancini M.等人,2014)。通过使用数据库诸如miRanda， miRNA-29a的靶标被鉴定为胶原蛋白I和氨酰基脯氨酸二肽酶。
方案：来自33、45和66岁的3名供体的人成纤维细胞用培养基中浓度为0.5和1μM的六肽-2处理(1次施用)。
借助于提取试剂盒(Ambion,参考AM1561)提取miRNA，然后用特定试剂盒(AppliedBiosystem,参考4374966)逆转录。在热循环仪中使用对 miRNA-29a 3p特异性的TaqMan基因表达测定法(Applied Biosystems,参考 002112)和对用作对照内源物的RNU44特异性的TaqMan基因表达测定法 (Applied Biosystems,参考001094)进行实时PCR。通过比较Ct方法进行 miRNA-29a 3p的表达的相对定量。
结果：比较三个年龄，miRNA-29a 3p的表达随着衰老显著增加+32％ (33和45岁之间)和+48％(45和66岁之间)(Student t检验)。在每个年龄(33、45和66岁)，用六肽-2处理的细胞分别显示miRNA-29a 3p的表达显著降低-13％、-14％和-27％(使用Student t-检验)。结果呈现于图1中。
结论：当用六肽-2处理细胞时，miRNA-29a 3p的表达降低，其意味着其表达对靶标诸如胶原蛋白和氨酰基脯氨酸二肽酶的负面影响可以受到限制。
实施例6：在六肽-2存在的情况下通过用siRNA FOXO3a转染使得衰老的人成纤维 细胞中的β-半乳糖苷酶的活性的研究
本研究的目的是确定六肽-2对衰老的人成纤维细胞的影响。通过使用来自FOXO3a的干扰RNA(siRNA)抑制FOXO3a基因来诱导衰老。FOXO3a 是参与细胞寿命的Forkhead型转录因子。通过抑制FOXO3a的表达，细胞过表达β-半乳糖苷酶，其为衰老细胞的特征。
方案：培养的人成纤维细胞用或不用最终浓度为25nM的FOXO3a的特异性siRNA(Invitrogen,参考HSS177176)使用通过LipofectamineTM RNAiMAX(Invitrogen,参考56531)的转染技术处理，且用或不用培养基中最终浓度为1μM的六肽-2处理48小时(每天2次施用)。
将细胞冲洗并固定在固定缓冲液(0.2％戊二醛，2％甲醛)中。然后将细胞在1mg/mL X-Gal于40mM柠檬酸盐/磷酸盐(pH 6)、5mM K3FeCN6、5 mM K4FeCN6、150mM NaCl和2mMMgCl2中的溶液中在37℃下在无CO2下孵育24小时。然后用显微镜(Nikon Eclipse E600显微镜)在白光下检查细胞。
结果：具有特异性β-半乳糖苷酶活性的衰老细胞染成蓝色。用FOXO3a 的特异性siRNA处理的细胞表现出与衰老相关的β-半乳糖苷酶的增加，导致蓝染色细胞数量的增加。用FOXO3a的特异性siRNA转染且用六肽-2处理的细胞表现出与衰老相关的β-半乳糖苷酶的活性的可见降低，导致蓝染色细胞数量的减少(结果未显示)。
结论：用六肽-2处理允许观察到衰老水平低于未处理的转染细胞的细胞。
实施例7：在六肽-2存在的情况下通过用siRNA FOXO3a转染使得衰老的人成纤维 细胞中的胶原蛋白I的表达的研究
本研究的目的是通过用siRNA FOXO3a转染来确定六肽-2对衰老的人成纤维细胞中的胶原蛋白I的表达的影响。
方案：培养的人成纤维细胞用或不用最终浓度为25nM的FOXO3a的特异性siRNA(Invitrogen,参考HSS177176)使用通过LipofectamineTM RNAiMAX(Invitrogen,参考56531)的转染技术处理，且用或不用培养基中浓度为0.5或1μM的六肽-2处理48小时(每天2次施用)。
成纤维细胞用胰蛋白酶处理并回收细胞沉淀。然后将细胞在4℃下用冷甲醇固定15分钟。借助于与荧光染料偶联的对胶原蛋白I特异性的小鼠单克隆抗体(Millipore,参考抗胶原蛋白I型，克隆：5D8-G9)进行免疫标记。接下来，使用流式细胞仪(Guava EasyCyte))分析10 000个细胞，以测定其中它们各自中的荧光水平。
结果：通过用siRNA FOXO3a转染来诱导衰老后，在这些细胞中观察到胶原蛋白I的表达的降低。衰老且用六肽-2治疗的细胞本身表现出胶原蛋白I的表达的较小降低。结果呈现于图2中。
结论：用六肽-2处理可用于限制衰老的作用，诸如胶原蛋白I的表达的降低。
实施例8：在六肽-2存在的情况下通过重复衰老而使得衰老的人成纤维细胞中的 β-半乳糖苷酶的活性的研究(长期处理)
本研究的目的是确定六肽-2对衰老的人成纤维细胞的影响。与通过转染siRNAFOXO3a获得的衰老模型(其衰老被诱导超过48小时)相反，重复衰老是需要大约3个月的长期过程。将成纤维细胞通过胰蛋白酶处理来定期亚培养，以引起它们分裂，并因此使它们衰老。
方案：将人成纤维细胞在特定培养基中培养并在培养下维持(超过27 次传代)，并且用或不用培养基中浓度为1μM的六肽-2的每天施用处理(即每周5次施用)。每次传代中冷冻一部分细胞。接下来，选择关键代数：第 4、12、16、20、24和27代。冷冻后，通过测定β-半乳糖苷酶的活性来评估用或不用1μM六肽-2处理的成纤维细胞的衰老表型。
为此，将细胞冲洗并固定在固定缓冲液(0.2％戊二醛，2％甲醛)中。然后将细胞在1mg/mL X-Gal于40mM柠檬酸盐/磷酸盐(pH 6)、5mM K3FeCN6、5mM K4FeCN6、150mM NaCl和2mM MgCl2中的溶液中在37℃下在无CO2下孵育24小时。然后用显微镜(Nikon Eclipse E600显微镜)在白光下检查细胞。
结果：在细胞传代过程期间，β-半乳糖苷酶的活性增加，表明衰老水平随每次传代而增加。当这些细胞用1μM六肽-2处理时，我们观察到与未处理的细胞相比，β-半乳糖苷酶的活性一般显著降低-22％(使用Student t 检验)。结果显示于图3中。
结论：在长期处理大约3个月后，我们观察到用六肽-2处理的细胞的衰老程度低于未处理的细胞。因此，用六肽-2处理可以减缓细胞衰老。
实施例9：在六肽-2存在的情况下通过重复衰老的衰老的人成纤维细胞中的β-半 乳糖苷酶的活性的研究(短期处理)
本研究的目的是确定六肽-2对通过重复衰老的衰老的人成纤维细胞的影响。
方案：将人成纤维细胞在特定培养基中培养并在长期培养处理下维持 (超过28代，即大约3个月)。每次传代中冷冻一部分细胞。接下来，选择关键代数：第4、12、16、20和28代。在冷冻之后，将成纤维细胞在培养基中用1μM六肽-2处理48小时(每天2次施用)。通过测定β-半乳糖苷酶的活性来评估用或不用1μM六肽-2处理的成纤维细胞的衰老表型。
为此，将细胞冲洗并固定在固定缓冲液(0.2％戊二醛，2％甲醛)中。然后将细胞在1mg/mL X-Gal于40mM柠檬酸盐/磷酸盐(pH 6)、5mM K3FeCN6、5mM K4FeCN6、150mM NaCl和2mM MgCl2中的溶液中在37℃下在无CO2下孵育24小时。然后用显微镜(Nikon Eclipse E600显微镜)在白光下检查细胞。
结果：在细胞传代过程期间，β-半乳糖苷酶的活性增加，表明每次传代的衰老水平。当已经使得衰老的这些细胞用1μM六肽-2处理时，我们观察到与未处理的细胞相比，β-半乳糖苷酶的活性一般显著降低-31％(使用 Student t-检验)。结果呈现于图4中。
结论：在短期处理48小时后，我们观察到用六肽-2处理的细胞具有低于未处理的细胞的衰老水平。因此，用六肽-2处理可用于减缓细胞衰老。
实施例10：在六肽-2存在的情况下通过重复衰老而使得衰老的人成纤维细胞中的 氨酰基脯氨酸二肽酶的活性的研究(长期处理)
本研究的目的是确定六肽-2对衰老的人成纤维细胞中的氨酰基脯氨酸二肽酶的活性的影响。在文献中已经显示，氨酰基脯氨酸二肽酶的活性随细胞衰老而减少，并且这与衰老细胞中观察到的胶原蛋白I的减少相关(
Figure GDA0001407798350000141
等人Tokai J Exp Clin Med 1996)。
方案：将人成纤维细胞在特定培养基中培养并在长期培养处理下维持 (超过20次传代，即大约3个月)，并且用或不用培养基中浓度为1μM的六肽-2的每天施用处理(每周5次施用)。对于每次传代冷冻一部分细胞。接下来，选择两代：第12和20代。冷冻后，对于这些条件观察到氨酰基脯氨酸二肽酶的活性。
为此，用150mM NaCl的溶液将细胞从其支持物分离。在回收细胞沉淀并在37℃下用含有2mM MnCl2的溶液活化氨酰基脯氨酸二肽酶2小时之后，添加氨酰基脯氨酸二肽酶的底物：47mM的甘氨酸-脯氨酸(Sigma,参考G3002)，在37℃下持续1小时。接下来，使用Chinard氏试剂，在515nm 的波长下测定每个样品中含有的脯氨酸含量。同时，产生脯氨酸的浓度范围以建立校准曲线。使用BCA蛋白测定试剂盒(Thermo Scientific,参考 23225)测定蛋白含量，以便将脯氨酸含量与每个样品中的蛋白数量相关联。
结果：第P12代(被认为是年轻的细胞)和第P20代(被认为是衰老的细胞)的比较显示，在重复衰老期间，氨酰基脯氨酸二肽酶的活性降低36％(使用Student t检验的显著值)。有趣的是，尽管六肽-2对年轻细胞(P12)几乎没有影响或没有影响，但六肽-2对衰老细胞(P20)的施用显示与同一代中的未处理的对照细胞相比氨酰基脯氨酸二肽酶的活性恢复20％(使用Student t 检验的显著值)。
结果显示于图5中。
结论：在衰老期间，氨酰基脯氨酸二肽酶的活性随着胶原蛋白的表达而降低。用六肽-2处理可以允许维持氨酰基脯氨酸二肽酶的活性，从而导致维持胶原蛋白再循环。
实施例11：在六肽-2存在的情况下通过重复衰老而使得衰老的人成纤维细胞中的 miRNA-29a 3p的表达的研究(长期处理)
本研究的目的是确定六肽-2对通过重复衰老的衰老的人成纤维细胞中的miRNA-29a 3p的表达的影响。miRNA在其靶标的转录后调节中通过抑制它们来发挥基本作用。在文献中已经显示，miRNA-29a的表达随衰老而增加(Mancini M.等人,2014)。通过数据库诸如miRanda的方式，鉴定miRNA-29a的靶标，包括胶原蛋白I和氨酰基脯氨酸二肽酶。
方案：将人成纤维细胞在特定培养基中培养并在长期培养处理下维持 (超过24次传代，即大约3个月)，并且用或不用培养基中浓度为1μM的六肽-2的每天施用处理(每周5次施用)。对于每次传代，冷冻一部分细胞。接下来，选择三代：第4、12和24代。冷冻后，通过定量PCR对于这些条件观察到miRNA-29a 3p的表达。
借助于提取试剂盒(Ambion,参考AM1561)提取miRNA，然后用特定试剂盒(AppliedBiosystems,参考4374966)逆转录。在热循环仪中借助于对 miRNA-29a 3p特异性的TaqMan基因表达测定法(Applied Biosystems, 002112)和对用作内源对照的RNU44特异性的TaqMan基因表达测定法 (Applied Biosystems,001094)进行实时PCR。使用比较Ct方法进行 miRNA-29a 3p的表达的相对定量。
结果：在比较三代P4、P12和P20后，我们可以观察到miRNA-29a 3p 的表达随衰老显著增加+25％(P4和P12之间)和+52％(P4和P24之间)(Student t检验)。在第4代，没有观察到六肽-2对miRNA-29a 3p的表达的作用。相比之下，在第12和24代，用六肽-2处理的细胞分别表现出 miRNA-29a 3p的表达显著降低-16％和-7％(使用Student t-检验)。结果显示于图6中。
结论：尽管衰老，但用1μM六肽-2处理的细胞似乎维持miRNA-29a 3p 的特定水平的表达，从而允许其表达对靶标诸如胶原蛋白和氨酰基脯氨酸二肽酶的负面影响受到限制。
实施例12：用于面部的抗衰老化妆品组合物的制备。
Figure GDA0001407798350000151
Figure GDA0001407798350000161
在制备该配方的条件下，1％六肽-2对应于1μM的浓度。
被称为“安慰剂”的面部的化妆品组合物以完全相同的方式产生，除了用纯化水代替六肽-2。
实施例13 1％六肽-2对皱纹出现的影响的研究(临床研究)
目的：关于用包含1％六肽-2的化妆品组合物(针对安慰剂)局部处理后的皱纹出现的临床研究。
方案：
参与者的数量：35(35岁至65岁)。
研究：针对安慰剂的双盲研究。
测试的产品：如实施例12所述的化妆品组合物中的六肽-2，1％制剂 (即，1μM的最终浓度)，与安慰剂组合物相比。在以下条件下：
施用的数量：每天2次施用，早上和晚上，剂量为2mg/cm2。
测试的持续时间：6周。
对照随访：第0天(D0)和第42天(D42)。
测量：使用
Figure GDA0001407798350000171
VL650软件分析由乌鸦脚制成的硅胶复制品
统计学分析：根据数据分布的正态性，使用“t”Student检验或Wilcoxon 检验。
结果：在根据实施例12的组合物中施用1％配方中的六肽-2后，硅胶复制品的分析在D42表现出与安慰剂相比在皱纹的数量、总表面积、总长度、总深度和最大深度方面的统计学显著降低。结果显示于图7、8和9以及下表5中。
Figure GDA0001407798350000172
*：显著的；**：非常显著的，使用Student检验或Wilcoxon检验(选择为数据分布的正态性的函数的检验)；平均值n＝35+/-sem。
结论：经42天局部施用1％六肽-2(即，1μM的浓度)引起皱纹出现的统计学显著降低。
序列表
<110> ISP投资有限公司
<120> 序列为HIS-D-TRP-ALA-TRP-D-PHE-LYS-NH2的肽用于减少或延缓细胞衰老的出现和皮肤老化的迹象的新型用途
<130> Bv 15-176 PCT
<150> FR 1553139
<151> 2015-04-10
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic peptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Configuration D
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Configuration D
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> AMIDATION
<400> 1
His Trp Ala Trp Phe Lys
1 5

Claims (10)

1.在生理学上可接受的介质中如序列SEQ ID NO:1所示His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2的合成肽或其盐之一在制备用于增加氨酰基脯氨酸二肽酶活性和胶原蛋白合成的局部施用化妆品组合物中的用途，其中所述合成肽作为活性剂在所述化妆品组合物中为0.1至1μM，且所述化妆品组合物在至少2天的时段每天至少一次局部施用。
2.如权利要求1中请求保护的用途，其中所述化妆品组合物导致减少或延缓细胞衰老的出现和皮肤老化的迹象，所述皮肤老化的迹象选自皮肤变薄、下垂、水分损失、皮肤张力缺失、深层皱纹和细纹、硬度和色调的丧失、真皮萎缩，皮肤的色素异常除外。
3.如权利要求1中请求保护的用途，其中所述化妆品组合物包含0.5至1μM的所述合成肽。
4.如权利要求1至3之一中请求保护的用途，其中施用每天进行2次。
5.如权利要求1至3之一中请求保护的用途，其中施用进行至少6周的时段。
6.如权利要求1至3之一中请求保护的用途，其中施用进行至少3个月的时段。
7.如权利要求1请求保护的用途，其中所述化妆品组合物导致减少或延缓细胞衰老的出现和皮肤老化的迹象，其中所述皮肤老化的迹象是皱纹。
8.如权利要求1至3之一中请求保护的用途，其中所述化妆品组合物还包含至少一种用于增强所述活性剂的作用的其它活性剂，其选自肽类、维生素C及其衍生物、来自B族的维生素类、DHEA、植物甾醇类、水杨酸及其衍生物、类视黄醇类、类黄酮类、氨基糖类、唑类、或金属盐类。
9.如权利要求1至3之一中请求保护的用途，其中所述化妆品组合物还包含植物来源的肽提取物作为用于增强所述活性剂的作用的其它活性剂。
10.用于减少或延缓细胞衰老的出现和皮肤老化的迹象的美容方法，其包括在至少2天的时段每天至少一次局部施用在生理上合适的介质中包含作为活性剂的、用于增加氨酰基脯氨酸二肽酶活性和胶原蛋白合成的0.1至1μM如序列SEQ ID NO:1所示His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2的合成肽的组合物。
CN201680015792.7A 2015-04-10 2016-04-08 序列为his-d-trp-ala-trp-d-phe-lys-nh2的肽用于减少或延缓细胞衰老的出现和皮肤老化的迹象的用途 Active CN107405278B (zh)

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