CN101312745A

CN101312745A - 包含生长素释放肽或其衍生物或作用于GHS-R1a的物质作为活性成分的皮肤修复促进治疗剂

Info

Publication number: CN101312745A
Application number: CNA2006800434502A
Authority: CN
Inventors: 村上昇; 中原桂子; 寒川贤治; 林友二郎
Original assignee: JAPAN GOVERNMENT; NIVERSITY OF MIYAZAKI; Asubio Pharma Co Ltd
Current assignee: JAPAN GOVERNMENT; NIVERSITY OF MIYAZAKI; Sankyo Co Ltd
Priority date: 2005-11-21
Filing date: 2006-11-21
Publication date: 2008-11-26
Also published as: WO2007058359A1; AU2006316100B2; RU2008125169A; CA2630006A1; EP1967208A4; AU2006316100A1; RU2420306C2; JPWO2007058359A1; BRPI0618824A2; US20090181888A1; EP1967208A1; KR20080075530A

Abstract

本发明提供新颖的皮肤损伤治疗剂和皮肤再生促进剂。所述皮肤损伤治疗剂和皮肤再生促进剂包含作用于生长激素促泌素受体的物质或其可药用盐作为活性成分。

Description

包含生长素释放肽或其衍生物或作用于GHS-R1a的物质作为活性成分的皮肤修复促进治疗剂

技术领域

本发明涉及作用于生长激素促泌素受体(GHS-R)的物质的皮肤细胞增殖活性。更具体地，本发明涉及其中将该物质用作活性成分的用于皮肤损伤治疗的皮肤损伤治疗剂或组合物、皮肤再生促进剂和培养皮肤细胞的方法。

背景技术

无须回顾皮肤移植术的悠久历史，很明显，皮肤是最早尝试移植治疗的组织。此外，展望对移植和再生的将来的研究，通过皮肤形成研究、使用毛发的再生研究等，认为皮肤是允许最容易接近的组织，并且其形成/再生过程已经得到充分验证。另外，皮肤移植和再生是可以直接应用于各种皮肤病如热损伤、遗传性大疱性表皮松解和男性型秃发的研究领域，并且预期在皮肤损伤或皮肤损害中起到重要作用(参见，Kyoto University 21st Century Center of Excellence Program“Establishment of International COE for Integration ofTransplantation Therapy and Regenerative Medicine”的网址-Study on Skin Transplantation and Regeneration，http://www.kuhp.kyoto-u.ac.jp/～coe/member15.html)。

皮肤移植所需的培养的皮肤取决于疾病、伤害程度和移植面积而不同。尽管在中等或轻度烧伤的情况中单独移植培养表皮是适合的，但是对于全层皮肤破坏的患者，需要包含真皮层的培养皮肤。期望形成的培养皮肤作为伤口敷料起作用并且可能释放生理活性物质用于治疗患有包括糖尿病的疾病的患者的难治性皮肤溃疡(参见，Takamura：Bio Venture，1：58(2001))。

目前，有两类培养皮肤片用于皮肤移植：一种是根据Green等人开发的方法的正常表皮角质形成细胞(参见，Rheinwald和Green：Cell，6：331(1975))；另一种是由Bell等人开发的皮肤等价组织(参见，Bell等人：Science，211：1052(1981))。Green等人使用3T3细胞作为支持细胞，以抑制表皮角质形成细胞的分化，并且成功地获得了充分的增殖。根据该方法，表皮角质形成细胞在培养过程中多层化，以形成片状结构，并且已经证明与活体结构相似的培养细胞结构临床上可用作皮肤组织代替物。使用材料例如胶原，Bell等人预先制备了相当于真皮的部分，并且在其上面培养表皮角质形成细胞。在这种方法中，必须使用促进用于人造组织形成的细胞三维掺入的材料，胶原凝胶是用于该目的的适合材料(参见，Hata：Jikken Igaku Extra Number，19：2121(2001))。

一旦制备了细胞的支架，下一个必需品是促进细胞增殖和分化的物质(参见，Ueda：Bio Venture，1：32(2001))。人们对于IGF、TGF-β、FGF等的临床应用保持谨慎，强调其可能引起人体其它部分中细胞分化和形成的异常。因此期望发现/开发非常安全的具有这种活性的物质。

在用于受损皮肤的移植治疗或再生药物中，未来的培养的胎儿皮肤细胞的应用也是期望的，因为移植到受损区域的培养的胎儿皮肤细胞分化和增殖为正常皮肤，也就是说，具有皮肤修复能力(参见，Hohfeld等人：Lancet，366：788-790(2005))。然而，因为胎儿皮肤细胞的增殖速度缓慢，期望开发促进增殖的技术。

生长素释放肽(ghrelin)是在1999年在胃中发现的激素。它是这样的肽，即，具有由28个残基组成的氨基酸序列并且具有其中序列中N末端的第三个氨基酸被脂肪酸酰化的非常罕见的化学结构(参见，Kojima等人：Nature，402，656-660(1999)；和参见WO01/07475)。生长素释放肽作用于生长激素促泌素-受体1a(GHS-R1a，参见Haward等人：Science 273：974-977(1996))并且被描述为促进垂体分泌生长激素(GH)的内源性的脑-胃肠道激素(参见，Kojima等人：Nature，402，656-660(1999))。近来的研究显示，生长素释放肽增进食欲，生长素释放肽的皮下给药增加体重和体脂肪，并且生长素释放肽具有例如改善心脏功能的活性(参见，Wren等人：Endocrinology 141：4325-4328(2000)；Nakazato等人：Nature 409：194-198(2001)；Shintani等人：D iabetes 50：227-232(2001)；Lely等人：Endocr.Rev.25：426-457(2004)；和Korbonits等人：Front Neuroendocrino.25：27-68(2004))。

因为生长素释放肽具有GH分泌促进活性和食欲刺激活性，由此预期生长素释放肽另外有效地发挥用于将脂肪转化为能量的脂肪燃烧活性，和通过GH表现出的合成代谢活性强化肌肉的作用(参见，Akamizu和Kangawa：Saishin Igaku，60：1569-1573(2005))。

生长素释放肽最初从大鼠分离，并且作为作用于GHS-R1a的内源性GHS纯化。从那以后，已经从除大鼠以外的多种脊椎动物发现了具有类似一级结构的生长素释放肽的氨基酸序列，例如人、小鼠、猪、鸡、鳗鱼、牛、马、绵羊、牛蛙、鳟鱼和狗。

人

：GSS(正辛酰基)FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR (SEQ ID NO：1)

：GSS(正辛酰基)FLSPEHQRVQRKE SKKPPAKLQPR (SEQ ID NO：2)

大鼠

：GSS(正辛酰基)FLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR (SEQ ID NO：3)

：GSS(正辛酰基)FLSPEHQKAQRKESKKPPAKLQPR (SEQ ID NO：4)

小鼠

：GSS(正辛酰基)FLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR (SEQ ID NO：5)

猪

：GSS(正辛酰基)FLSPEHQKVQQRKESKKPAAKLKPR (SEQ ID NO：6)

牛

：GSS(正辛酰基)FLSPEHQKLQRKEAKKPSGRLKPR (SEQ ID NO：7)

羊

：GSS(正辛酰基)FLSPEHQKLQRKEPKKPSGRLKPR (SEQ ID NO：8)

狗

：GSS(正辛酰基)FLSPEHQKLQQRKESKKPPAKLQPR (SEQ ID NO：9)

鳗鱼

：GSS(正辛酰基)FLSPSQRPQGKDKKPPRV-NH2 (SEQ ID NO：10)

鳟鱼

：GSS(正辛酰基)FLSPSQKPQVRQGKGKPPRV-NH2 (SEQ ID NO：11)

：GSS(正辛酰基)FLSPSQKPQGKGKPPRV-NH2 (SEQ ID NO：12)

鸡

：GSS(正辛酰基)FLSPTYKNIQQQKGTRKPTAR (SEQ ID NO：13)

：GSS(正辛酰基)FLSPTYKNIQQQKDTRKPTAR (SEQ ID NO：14)

：GSS(正辛酰基)FLSPTYKNIQQQKDTRKPTARLH (SEQ ID NO：15)

牛蛙

：GLT(正辛酰基)FLSPADMQKIAERQSQNKLRHGNM (SEQ ID NO：16)

：GLT(正癸酰基)FLSPADMQKIAERQSQNKLRHGNM (SEQ ID NO：16)

：GLT(正辛酰基)FLSPADMQKIAERQSQNKLRHGNMN (SEQ ID NO：17)

罗非鱼

：GSS(正辛酰基)FLSPSQKPQNKVKSSRI-NH2 (SEQ ID NO：18)

鲶鱼

：GSS(正辛酰基)FLSPTQKPQNRGDRKPPRV-NH2 (SEQ ID NO：19)

：GSS(正辛酰基)FLSPTQKPQNRGDRKPPRVG (SEQ ID NO：20)

马

：GSS(正丁酰基)FLSPEHHKVQHRKESKKPPAKLKPR (SEQ ID NO：21)

(上述表达中，氨基酸残基表示为单字符表示法)

上述的肽具有其中第三位的丝氨酸残基(S)或苏氨酸残基(T)的侧链羟基被脂肪酸例如辛酸、癸酸等酰化的特定结构。除了生长素释放肽之外，一直没有分离具有疏水性修饰结构的生理学活性肽的情况。

除了上述肽化合物之外，本发明的作用于GHS-R1a的物质包括生长激素释放肽2(GHRP-2)(D-Ala-D-βNal-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH₂)和GHRP-6(His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH₂)(Muccioli，G等人：J.Endocrino.，157，pp.99-106(1998))及其衍生物。此外，可使用低分子化合物例如L-692，429(MK-0751)；L-163，191(MK-0677)(Patchett等人：Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，92，pp.7001-7005(1995))；伊帕瑞林(ipamorelin)(NN161)；tabmorelin(NN703)；和CP-724，391(Ankerson M.等人：DrugDiscovery Today，4.pp.497-506)。

就本发明人所知，还没有发现报道涉及GHS-R1a在皮肤细胞中的表达以及通过包括生长素释放肽在内的作用于GHS-R1a的物质对皮肤细胞的活性使皮肤细胞增殖。

发明公开

本发明要解决的问题

本发明涉及利用具有皮肤细胞增殖活性的物质的用于皮肤损伤治疗的皮肤损伤治疗剂、皮肤再生促进剂和培养皮肤细胞的方法。

解决问题的手段

本发明人发现，对妊娠的雌性动物给予作用于GHS-R1a的物质促进胎儿生长，并且给予的物质被递送到胎儿，以及递送到羊水。考虑到作用于GHS-R1a的物质在羊水中起的功能和作用，预期该物质具有胎儿皮肤细胞增殖活性。

本发明人研究了作用于GHS-R1a的物质如何作用于胎儿皮肤细胞，并且发现：在皮肤细胞中存在有GHS-R1a、作用于GHS-R1a的物质对皮肤细胞起作用以增加胞内的钙、并且该物质表现出皮肤细胞增殖活性。

也就是说，本发明涉及包含作用于GHS-R1a的物质作为活性成分的在皮肤损伤治疗中使用的皮肤再生促进剂、用于通过培养皮肤细胞产生的培养皮肤细胞片的形成促进剂、和在培养皮肤移植时使用的皮肤修复促进剂和治疗剂。

本发明还涉及皮肤损伤治疗方法、促进通过培养皮肤细胞生产的培养皮肤细胞片形成的方法、和在移植培养皮肤时促进皮肤修复的方法以及通过促进修复治疗上述疾病的方法，包括给予作用于GHS-R1a的物质。

此外，本发明涉及作用于GHS-R1a的物质用于皮肤损伤治疗中的皮肤再生促进剂、通过培养皮肤细胞生产的培养皮肤细胞片的形成促进剂的应用，和用于生产在移植培养皮肤时使用的皮肤修复促进剂和治疗剂的应用。

基于以上所述，本发明具体地涉及以下事项。

(1)皮肤损伤治疗剂，包含作用于生长激素促泌素受体的物质或其可药用盐作为活性成分。

(2)(1)的治疗剂，其中所述物质为选自以下的肽或其可药用盐：具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的肽，其中从氨基末端的第3个氨基酸残基为修饰的氨基酸残基，其中在该氨基酸残基的侧链中引入了脂肪酸；和具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的肽，其中从氨基末端的第5到第28个氨基酸中的一个或几个缺失、置换和/或添加，并且从氨基末端的第3个氨基酸残基为修饰的氨基酸残基，在该氨基酸残基的侧链中引入了脂肪酸。

(3)(2)的治疗剂，其中该物质为具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的肽，其中氨基末端的第三位的丝氨酸残基为修饰的氨基酸残基，具有引入该氨基酸残基的侧链羟基的脂肪酸。

(4)(3)的治疗剂，其中该物质为具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的肽，其中氨基末端的第三位的丝氨酸残基具有被正辛酰基酰化的侧链羟基。

(5)(1)到(4)中任一项的治疗剂，包含每个单位制剂0.001mg到100mg的量的活性成分。

(6)皮肤再生促进剂，包含作用于生长激素促泌素受体的物质或其可药用盐作为活性成分。

(7)(6)的促进剂，其中所述物质为选自以下的肽或其可药用盐：具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的肽，其中从氨基末端的第3个氨基酸残基为修饰的氨基酸残基，其中在该氨基酸残基的侧链中引入了脂肪酸；和具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的肽，其中从氨基末端的第5到第28个氨基酸中的一个或几个缺失、置换和/或添加，并且从氨基末端的第3个氨基酸残基为修饰的氨基酸残基，在该氨基酸残基的侧链中引入了脂肪酸。

(8)(7)的促进剂，其中该物质为具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的肽，其中氨基末端的第三位的丝氨酸残基为修饰的氨基酸残基，具有引入该氨基酸残基的侧链羟基的脂肪酸。

(9)(8)的促进剂，其中该物质为具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的肽，其中氨基末端的第三位的丝氨酸残基具有被正辛酰基酰化的侧链羟基。

(10)(6)到(10)中任一项的皮肤再生促进剂，包含每个单位制剂0.001mg到100mg的量的活性成分。

(11)促进培养皮肤细胞增殖的方法，使用作用于生长激素促泌素受体的物质或其可药用盐作为活性成分。

(12)(11)的方法，其中所述物质为选自以下的肽或其可药用盐：具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的肽，其中从氨基末端的第3个氨基酸残基为修饰的氨基酸残基，其中在该氨基酸残基的侧链中引入了脂肪酸；和具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的肽，其中从氨基末端的第5到第28个氨基酸中的一个或几个缺失、置换和/或添加，并且从氨基末端的第3个氨基酸残基为修饰的氨基酸残基，在该氨基酸残基的侧链中引入了脂肪酸。

(13)(12)的方法，其中该物质为具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的肽，其中氨基末端的第三位的丝氨酸残基为修饰的氨基酸残基，具有引入该氨基酸残基的侧链羟基的脂肪酸。

(14)(13)的方法，其中该物质为具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的肽，其中氨基末端的第三位的丝氨酸残基具有被正辛酰基酰化的侧链羟基。

(15)(11)到(14)中任一项的方法，其中培养皮肤细胞的增殖在包含0.0000001mg/mL到0.1mg/mL量的活性成分的培养基中进行。

(16)皮肤损伤的治疗方法，包括对需要皮肤损伤治疗的哺乳动物给予作为活性成分的作用于生长激素促泌素受体的物质或其可药用盐

(17)(16)的方法，其中所述物质为选自以下的肽或其可药用盐：具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的肽，其中从氨基末端的第3个氨基酸残基为修饰的氨基酸残基，其中在该氨基酸残基的侧链中引入了脂肪酸；和具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的肽，其中从氨基末端的第5到第28个氨基酸中的一个或几个缺失、置换和/或添加，并且从氨基末端的第3个氨基酸残基为修饰的氨基酸残基，在该氨基酸残基的侧链中引入了脂肪酸。

(18)(17)的方法，其中该物质为具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的肽，其中氨基末端的第三位的丝氨酸残基为修饰的氨基酸残基，具有引入该氨基酸残基的侧链羟基的脂肪酸。

(19)(18)的方法，其中该物质为具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的肽，其中氨基末端的第三位的丝氨酸残基具有被正辛酰基酰化的侧链羟基。

(20)(16)到(19)中任一项的方法，其中活性成分以每次给药0.001mg到100mg的量给予。

(21)促进皮肤再生的方法，包括对需要促进皮肤再生的哺乳动物给予作为活性成分的作用于生长激素促泌素受体的物质或其可药用盐

(22)(21)的方法，其中所述物质为选自以下的肽或其可药用盐：具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的肽，其中从氨基末端的第3个氨基酸残基为修饰的氨基酸残基，其中在该氨基酸残基的侧链中引入了脂肪酸；和具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的肽，其中从氨基末端的第5到第28个氨基酸中的一个或几个缺失、置换和/或添加，并且从氨基末端的第3个氨基酸残基为修饰的氨基酸残基，在该氨基酸残基的侧链中引入了脂肪酸。

(23)(22)的方法，其中该物质为具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的肽，其中氨基末端的第三位的丝氨酸残基为修饰的氨基酸残基，具有引入该氨基酸残基的侧链羟基的脂肪酸。

(24)(23)的方法，其中该物质为具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的肽，其中氨基末端的第三位的丝氨酸残基具有被正辛酰基酰化的侧链羟基。

(25)(21)到(24)中任一项的方法，其中活性成分以每次给药0.001mg到100mg的量给予。

(26)作用于生长激素促泌素受体的物质或其可药用盐作为活性成分用于生产治疗皮肤损伤的药物组合物的应用。

(27)(26)的应用，其中所述物质为选自以下的肽或其可药用盐：具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的肽，其中从氨基末端的第3个氨基酸残基为修饰的氨基酸残基，其中在该氨基酸残基的侧链中引入了脂肪酸；和具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的肽，其中从氨基末端的第5到第28个氨基酸中的一个或几个缺失、置换和/或添加，并且从氨基末端的第3个氨基酸残基为修饰的氨基酸残基，在该氨基酸残基的侧链中引入了脂肪酸。

(28)(27)的应用，其中该物质为具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的肽，其中氨基末端的第三位的丝氨酸残基为修饰的氨基酸残基，具有引入该氨基酸残基的侧链羟基的脂肪酸。

(29)(28)的应用，其中该物质为具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的肽，其中氨基末端的第三位的丝氨酸残基具有被正辛酰基酰化的侧链羟基。

(30)(26)到(29)中任一项的应用，其中治疗皮肤损伤的药物组合物的每个单位制剂包含0.001mg到100mg的量的活性成分。

(31)作用于生长激素促泌素受体的物质或其可药用盐作为活性成分用于生产促进皮肤再生的药物组合物的应用。

(32)(31)的应用，其中所述物质为选自以下的肽或其可药用盐：具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的肽，其中从氨基末端的第3个氨基酸残基为修饰的氨基酸残基，其中在该氨基酸残基的侧链中引入了脂肪酸；和具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的肽，其中从氨基末端的第5到第28个氨基酸中的一个或几个缺失、置换和/或添加，并且从氨基末端的第3个氨基酸残基为修饰的氨基酸残基，在该氨基酸残基的侧链中引入了脂肪酸。

(33)(32)的应用，其中该物质为具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的肽，其中氨基末端的第三位的丝氨酸残基为修饰的氨基酸残基，具有引入该氨基酸残基的侧链羟基的脂肪酸。

(34)(33)的应用，其中该物质为具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的肽，其中氨基末端的第三位的丝氨酸残基具有被正辛酰基酰化的侧链羟基。

(35)(31)到(34)中任一项的应用，其中促进皮肤再生的药物组合物包含每个单位制剂0.001mg到100mg的量的活性成分。

本发明的有利效果

本发明揭示了作用于生长激素促泌素受体的物质具有皮肤细胞增殖活性。因此，本发明通过加入作用于生长激素促泌素受体的物质以便在培养皮肤细胞时促进细胞增殖，使得能够迅速应用培养皮肤细胞于治疗。也就是说，有可能在其中培养皮肤细胞以制备片状人造皮肤并且用其覆盖受损的皮肤表面的皮肤修复治疗过程中更快地为患者提供由培养皮肤细胞制成的人造皮肤片。此外，通过将皮肤细胞直接移植到裂伤或创伤部位、随后对移植部位给予作用于生长激素促泌素受体的物质，使得促进愈合变得有可能。

附图简述

图1为显示在胎儿皮肤细胞中GHS-R1a mRNA表达的图。

图2为显示生长素释放肽增加单个培养的胎儿皮肤细胞中胞内钙的活性的图。

图3为显示生长素释放肽促进[³H]-胸苷摄入到胎儿皮肤细胞中的活性的图。

图4是显示生长素释放肽和GHRP6促进胎儿皮肤细胞增殖的活性的图。

发明详述

本发明的药物可用作用于哺乳动物(个体生物)的药物，哺乳动物包括人。用于本发明的物质的实例包括生长激素促泌素(GHS)，其为作用于生长激素促泌素受体(GHS-R)的配体。作为GHS，可使用已知的肽化合物和低分子化合物(例如生长素释放肽、GHRP6、MK-0677和伊帕瑞林)，特别优选生长素释放肽-一种肽化合物。

作为生长素释放肽，如上所述，除了来源于人类的生长素释放肽以外，还可使用来源于大鼠、小鼠、猪、牛及其它动物的生长素释放肽及其衍生物。

优选地，对于个体生物，使用来源于相同个体生物的生长素释放肽。例如，优选将来源于人类的生长素释放肽用于人体。来源于人类的生长素释放肽为包含28个氨基酸的肽，并且氨基末端的第三位的丝氨酸残基的侧链羟基被脂肪酸(正辛酰基)酰化(SEQ ID NO：1)。作为生长素释放肽的衍生物，可使用例如具有如下氨基酸序列的肽，其中SEQ ID NO：1所示氨基酸序列从氨基末端第5到第28个氨基酸残基中一个或几个氨基酸发生置换、添加和/或缺失，并且其具有通过结合生长激素促泌素受体(GHS-R)增加胞内钙离子浓度的活性。期望衍生物的氨基酸序列与天然氨基酸序列相比的同源性为70％，优选为80％，更优选为90％，更优选为95％，最优选为97％。这些条件在来源于其它动物的生长素释放肽(SEQ ID NO：2到SEQ ID NO：22)中是一样的。

本发明的生长素释放肽和衍生物可通过常规方法制备。例如，它们可以从天然的原料分离、或通过重组DNA技术和/或化学合成产生。在氨基酸残基中需要修饰(酰化)时，可根据已知的方法进行修饰反应。例如，在使用重组DNA技术的生产方法中，可以通过培养用表达载体转化的宿主细胞、然后从培养物收集目标肽而得到本发明的生长素释放肽及其衍生物，所述表达载体具有编码本发明的肽的DNA。通过选择宿主细胞，可以得到化合物-在细胞中被修饰(酰化)的目标肽。当肽未被修饰(酰化)时，如果期望，可以根据已知的方法进行修饰反应例如酰化。

掺入基因的载体的实例包括大肠杆菌载体(例如，pBR 322，pUC18和pUC19)、枯草杆菌载体(例如pUB110、pTP5和pC194)、酵母载体(例如YEp、YRp和YIp)、和动物细胞载体(例如逆转录病毒和痘苗病毒)。可以使用任何其它载体，只要它们在宿主细胞中稳定地保持目的基因。将载体引入到适合的宿主细胞中。作为将目的基因掺入质粒或将其引入宿主细胞的方法，可使用例如在Molecular Cloning(Sambrook等人，1989)中描述的方法。

为了允许目标肽基因在质粒中表达，以使其起作用的方式将启动子连接于基因的上游。

用于本申请的启动子可为任何启动子，只要它适合于用于表达目的基因的宿主细胞。例如，当被转化的宿主细胞是埃希氏杆菌属时，可使用lac启动子、trp启动子、lpp启动子、λPL启动子、recA启动子等；当宿主细胞是杆菌属时，可使用SPO1启动子、SPO2启动子等；当宿主细胞是酵母菌时，可使用GAP启动子、PHO5启动子、ADH启动子等；和当宿主细胞为动物细胞时，可使用SV40-来源的启动子、逆转录病毒来源的启动子等。

使用包含目的基因的上述得到的载体转化宿主细胞。要使用的宿主细胞可为细菌(例如埃希氏杆菌属和杆菌属)、酵母菌(例如酵母菌属、毕赤氏酵母属和假丝酵母属)、和动物细胞(例如CHO细胞和COS细胞)。液体培养基作为培养基是适合的，并且特别优选培养基包含要培养的转化细胞生长所需的碳源和氮源。如果期望，可加入维生素、生长促泌素、血清等。

为了以直接的方式制备脂肪酸修饰(酰化)的肽，要使用的宿主细胞优选为具有在适当位置裂解该肽的前体多肽的加工蛋白酶活性和具有酰化该肽中的丝氨酸残基的活性的细胞。具有这种加工蛋白酶活性和丝氨酸酰化活性的宿主细胞可如下选择：通过用包含编码前体肽的cDNA的表达载体转化宿主细胞，随后确认转化的细胞是否产生具有钙增加活性或生长激素分泌促进活性的脂肪酸修饰的肽。

在培养之后，从培养物分离本发明的肽并且通过常规方法纯化。例如，从培养的细菌形式或细胞提取目标物质如下进行：通过在培养之后收集细菌形式或细胞、将其悬浮在包含蛋白改性剂(例如盐酸胍)的缓冲溶液中、用超声等将细菌形式或细胞粉碎、和将其离心。为了从上清液纯化目标物质，可以使用几种分离和纯化方法，例如凝胶渗透、超滤、透(渗)析、SDS-PAGE和各种色谱技术，根据目标物质的分子量、溶解度、电荷(等电点)和亲和力，以适当的组合使用上述分离和纯化方法。

本发明的作用于GHS-R1a的物质(例如生长素释放肽)及其衍生物可以通过常规方法化学合成。例如，该物质可以如下制备：通过液相方法和/或固相方法将具有保护基的氨基酸缩合、延伸肽链、用酸除去全部保护基、和通过上述纯化方法纯化所得到的粗产物。使用酰化酶或酰基转移酶，可以对氨基酸目标位置的侧链进行选择性酰化。

对于肽的生产方法，已经已知各种方法。本发明的肽还可以通过已知的方法容易地制备，例如，经典的肽合成方法或固相方法。

可以使用包括重组DNA技术和化学合成两者的生产方法：例如，通过化学合成制备包含修饰的氨基酸残基的片段，通过重组DNA技术制备没有任何修饰的氨基酸残基的其它片段，并且其后将各个片段融合(参见，WO01/07475)。

作为用于本发明的作用于GHS-R1a的物质(例如生长素释放肽)及其衍生物的盐，优选可药用盐。其实例包括无机碱的盐、有机碱的盐、无机酸的盐、有机酸的盐、碱性氨基酸的盐和酸性氨基酸的盐。

优选的无机碱的盐的实例包括碱金属盐，例如钠盐和钾盐；碱土金属盐，例如钙盐和镁盐；铝盐；铵盐；等等。

优选的有机碱的盐的实例包括三甲胺、三乙胺、吡啶、甲基吡啶、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、二环己基胺、N，N’-二苄基乙二胺等的盐。

优选的无机酸的盐的实例包括盐酸、氢溴酸、硝酸、硫酸、磷酸等的盐。

优选的有机酸的盐的实例包括甲酸、醋酸、三氟乙酸、富马酸、草酸、酒石酸、马来酸、柠檬酸、琥珀酸、苹果酸、甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸等的盐。

优选的碱性氨基酸的盐的实例包括精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸等的盐，而优选的酸性氨基酸的盐的实例包括天冬氨酸、谷氨酸等的盐。

在上述盐中，最优选钠盐和钾盐。

关于生长素释放肽的生理活性，有可能使用对GHS-R1a受体(GHS-R)的配体活性和/或上述出版物中所述的生理活性作为指标来选择衍生物。作为测量胞内钙离子浓度的方法，可使用已知的方法。例如，可使用FLIPR(Fluorometric Imaging Plate Reader，MolecularDevices Co.，Ltd.)，其利用由钙离子浓度变动引起的Fluo-4AM(Molecular Probe Co.，Ltd.)的荧光强度波动。此外，为了证实具有钙增加活性的肽在体外或体内是否具有生长激素促泌素活性，可使用已知的方法。例如，体外活性可以如下测量：通过将肽添加到分泌生长激素并且确认GHS-R表达的垂体细胞中，和通过使用抗生长激素抗体的放射免疫测定法测量细胞培养基中分泌的生长激素。为了确认体内生长激素分泌增加活性，将具有钙增加活性的肽注入到动物的外周静脉中，然后测量血清中的生长激素浓度。对于生长素释放肽衍生物及其制备方法，可参考例如J.Med.Chem.，43，pp.4370-4376，2000。

已经发现本发明的作用于GHS-R1a的物质(例如生长素释放肽)具有皮肤细胞增殖活性，并且特别是显著增加胎儿皮肤细胞的数目。

也就是说，本发明的作用于GHS-R1a的物质(例如生长素释放肽)可用作皮肤损伤治疗(例如创伤、擦伤和灼伤)的皮肤再生促进剂的活性成分、用作通过培养皮肤(例如表皮、真皮、和皮肤)细胞生产培养皮肤细胞片的形成促进剂的活性成分、和用作在灼伤损伤、难治性皮肤溃疡、遗传性大疱性表皮松解、褥疮、肥满性瘢痕、胎记、重症过敏性皮肤病和脱发中移植培养皮肤时的皮肤修复促进剂和治疗剂的活性成分。

此外，本发明的作用于GHS-R1a的物质(例如生长素释放肽)对个体生物的给药用于皮肤损伤治疗(例如创伤、擦伤和灼伤)方法；通过培养皮肤(例如表皮、真皮、和皮肤)细胞生产培养皮肤细胞片的形成促进方法；在灼伤损伤、难治性皮肤溃疡、遗传性大疱性表皮松解、褥疮、肥满性瘢痕、胎记、重症过敏性皮肤病和脱发中移植培养皮肤时促进皮肤修复的方法；和通过促进修复治疗上述疾病的方法。

此外，本发明的作用于GHS-R1a的物质(例如生长素释放肽)可用于生产皮肤损伤治疗(例如创伤、擦伤和灼伤)中的皮肤再生促进剂、用于生产通过培养皮肤(例如表皮、真皮、和皮肤)细胞生产培养皮肤细胞片的形成促进剂、和用于生产在灼伤损伤、难治性皮肤溃疡、遗传性大疱性表皮松解、褥疮、肥满性瘢痕、胎记、重症过敏性皮肤病和脱发中移植培养皮肤时的皮肤修复促进剂和治疗剂。

包含作用于GHS-R1a的物质(例如生长素释放肽)或其药理学可接受的盐的本发明的药物可通过将其与药理学可接受的载体、赋形剂、补充剂等混合而用于个体生物(例如人、小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、马、猪和灵长类动物)。

优选本发明的药物通过非肠道途径例如静脉内、皮下和肌肉注射以预定量的单次剂量或多次剂量给予进行皮肤再生治疗的个体。当个体是成年人，特别是家庭治疗的成年人时，优选经鼻、经肺或栓剂给药。

在本发明中，对于药物的剂量没有具体限制，并且可以取决于预定的用途、和个体的年龄、体重、种类、要给药的个体的症状、营养状况、和并用药物而适当选择。当药物以单次或多次剂量给予成年人时，作为活性成分的作用于GHS-R1a的物质(例如生长素释放肽)的量优选为0.001mg到100mg，更优选为0.01mg到10mg。

优选将上述剂量每天给药一次或几次，持续1到24周、更优选1到12周。

可药用载体的实例包括通常用作药物配制材料的各种有机或无机的载体物质。将这种载体作为用于固体制剂的赋形剂、润滑剂、粘合剂或崩解剂混合；和作为用于液体制剂的溶剂、增溶剂、助悬剂、张力调节剂、缓冲剂和无痛化剂混合。

如果期望，可以使用制剂添加剂例如防腐剂、抗氧化剂、着色剂、和甜味剂。

优选的赋形剂的实例包括乳糖、蔗糖、D-甘露醇、淀粉、结晶纤维素、轻质无水硅酸等。

优选的润滑剂的实例包括硬脂酸镁、硬脂酸钙、滑石粉、胶态氧化硅等。

优选的粘合剂的实例包括结晶纤维素、蔗糖、D-甘露醇、糊精、羟基丙基纤维素、羟基丙基甲基纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮等。

优选的崩解剂的实例包括淀粉、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钙、交联羧甲纤维素钠、羧甲淀粉钠等。

优选的溶剂的实例包括注射溶剂、醇类、丙二醇、聚乙二醇、芝麻油、玉米油等。

优选的增溶剂的实例包括聚乙二醇、丙二醇、D-甘露醇、苯甲酸苄酯、乙醇、三氨基甲烷(trisaminomethane)、胆固醇、三乙醇胺、碳酸钠、柠檬酸钠等。

优选的助悬剂的实例包括表面活性剂，例如硬脂酰三乙醇胺、月桂硫酸酯钠、月桂酰基氨基丙酸、卵磷脂、苯扎氯铵、苄索氯铵、和单硬脂酸甘油酯；亲水聚合物，例如聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、和羟基丙基纤维素；等等。

优选的张力调节剂的实例包括氯化钠、甘油、D-甘露醇等。

优选的缓冲剂的实例包括磷酸盐、乙酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐等。

优选的无痛化剂的实例包括苯甲醇等。

优选的防腐剂的实例包括对羟基苯甲酸酯类、三氯叔丁醇、苯甲醇、苯乙醇、脱氢乙酸、山梨酸等。

优选的抗氧化剂的实例包括亚硫酸盐、抗坏血酸等。

本发明的药物的优选形式是适于非肠道给药的制剂。适合于非肠道给药的制剂形式的实例包括用于静脉内、皮内、皮下或肌肉内给药的可注射溶液；静脉内液体；栓剂；经皮吸收剂；经粘膜吸收剂和吸入剂。在这些剂型中，优选可注射溶液的形式；特别是在个体是家庭治疗的成年人时，优选经粘膜的吸收剂、吸入剂和栓剂的形式。因为这些制剂形式是本领域技术人员公知的，他们有可能选择适合于预定给药途径的制剂形式，并且如果期望，他们有可能使用可用于制药工业的一种或多种添加剂将药物配制为药物组合物的形式。

例如，如下制备和提供可注射溶液或静脉内液体形式的药物：通过将作为活性成分的作用于GHS-R1a的物质(例如生长素释放肽)与用于配制应用的一种或多种添加剂(例如缓冲溶液、糖溶液、张力调节剂、pH调节剂、无痛化剂和防腐剂)一起溶解在注射用蒸馏水中、使溶液经过灭菌过滤并将滤液置于安瓿或小瓶中，或者将得到的滤液冻干以生产冻干剂型。添加剂的实例包括糖类，例如葡萄糖、甘露醇、木糖醇和乳糖；亲水聚合物，例如聚乙二醇；醇类，例如甘油；氨基酸，例如甘氨酸；蛋白质，例如血清白蛋白；盐，例如NaCl和柠檬酸钠；酸类，例如醋酸、酒石酸和抗坏血酸；表面活性剂，例如吐温80；还原剂，例如亚硫酸钠；等等。这些制剂通过在使用时将它们溶解于注射用蒸馏水或盐水溶液中而作为可注射溶液或静脉内液体使用。用于鼻内给药(经鼻给药)的药剂例如滴鼻剂和鼻内喷雾剂对于经粘膜给药来说也是优选的，并且对于经肺给药还优选吸入剂等。

优选每个单位制剂的活性成分(例如生长素释放肽)的含量为0.001mg到100mg，优选为0.01mg到10mg，将其每天给药一次或几次。

如下处理分离的皮肤细胞：将分离的皮肤细胞在培养溶液中培养，随后将0.1nM到1μM、优选1nM到100nM的作用于GHS-R1a的物质(例如生长素释放肽)加入到通过灭菌过滤或高压灭菌制备的培养溶液中。也就是说，优选使用的培养溶液包含0.0000001mg/mL到0.1mg/mL的作用于GHS-R1a的物质用于增殖皮肤细胞。如实施例4中所示，这种处理促进了皮肤细胞的增殖，所述皮肤细胞在正常情况下几乎没有增殖进展。

实施例

以下通过实施例具体地描述本发明。

(实施例1)GHS-R1a mRNA在大鼠胎儿中的表达

根据Nakahara等人：Biochem.Biophys.Res.Commun.303：751-755(2003)中所述的方法，使用Total RNA Trizol Reagent(LifeTechnologies，Inc.，Gaithersburug，MD)，从妊娠第14、15、或19天的Wistar大鼠胎儿的皮肤组织提取总RNA。使用Superscript3Preamplification Reagents(Life Technologies，Inc.，Bethesda，MD)，通过随机引物反转录从2μg总RNA合成单链cDNA。使用对GHS-R1a特异性的有义引物和反义引物，通过PCR方法扩增所得到的cDNA(使用BD advantage TM 2 PCR Enzyme System(BD Science，CA))，然后使用2％琼脂糖凝胶进行电泳。将在细胞中稳定表达的GAPDH用作对照mRNA。关于对GHS-R1a特异性的PCR引物，使用5’-GATACCTCTTTTCCAAGTCCTTCGAGCC-3’(SEQ ID NO：22)作为有义引物，而5’-TTGAACACTGCCACCCGGTACTTCT-3’(SEQ ID NO：23)用作反义引物(GenBank登录号AB001982中的核苷酸842-869和1001-1025)。关于对GAPDH特异性的引物，使用5′-CGGCAAGTTCAACGGCACA-3′(SEQID NO：24)作为有义引物，而5′-AGACGCCAGTAGACTCCACGACA-3′(SEQID NO：25)用作反义引物(GenBank登录号AF106860中的核苷酸1002-1020和1125-1147)。

结果如图1中所示。

图1表明，GHS-R1a mRNA在妊娠第14、15和19天的大鼠胎儿的皮肤中表达。GHS-R1a mRNA的表达水平在妊娠第14和15天的胎儿皮肤中特别高。

(实施例2)生长素释放肽在培养的胎儿皮肤细胞中的胞内钙增加活性

将妊娠第17天的Wistar大鼠在麻醉下进行剖腹手术，取出胎儿。从胎儿取得一小片皮肤，用在冷的Hank’s溶液中的胶原酶处理，用木瓜蛋白酶消化，并且通过移液管吸取机械分离。这样得到胎儿皮肤细胞的分散液。从分散液得到单个细胞，向其中加入生长素释放肽，并且进行钙成像。对于钙成像，使用钙成像设备(IMACS，HamamatsuPhotonics)。也就是说，在通过340nm/380nm光进行激发时测量在510nm波长的发射的比例。将Fura-2用作钙显像剂。使用得自大鼠的生长素释放肽(SEQ ID NO：3)(以下实施例中同样)。

结果表示在图2中。在图2中，I、II和III是拍照的点，但是在本说明书中省略了照片。实线曲线显示响应生长素释放肽的细胞，而虚线曲线显示响应去酰基生长素释放肽的另一细胞。分别将生长素释放肽和去酰基生长素释放肽加入到不同的细胞中。

当生长素释放肽(1×10^-6M)作用于大鼠胎儿的皮肤细胞时，在单个胎儿皮肤细胞中观察到钙增加。这表明生长素释放肽对具有GHS-R1a的胎儿皮肤细胞起作用并且增加大鼠胎儿皮肤细胞中的钙。

(实施例3)生长素释放肽在培养的胎儿皮肤细胞中的胸苷摄取促进活性

从妊娠第17天的Wistar大鼠取得大鼠胎儿的皮肤细胞，并以与实施例2中相同的方式得到其分散液。将分散的细胞悬浮在包含2％胎牛血清、青霉素(100U/mL)、链霉素(100μg/mL)和表皮生长因子EGF(5ng/mL)的MCDB153HAA培养基(F-Peptide Co.，Ltd.，Yamagata，Japan)中并且以5×10⁵细胞/孔的量接种在聚乙烯亚胺涂层的48孔多孔板上。向其中添加生长素释放肽(0.5、5和50pmol/mL(nM)))和[³H]-胸苷(2μCi/mL)，然后将其培养24小时或48小时。制备不含生长素释放肽的培养溶液作为对照。在培养结束之后，收集细胞并且测量放射性。

结果显示在图3中(黑色三角形：50pmol/mL，黑色正方形：5pmol/mL，黑色圆圈：0.5pmol/mL，白色圆圈：对照)。

图3表明，当生长素释放肽作用于培养的胎儿皮肤细胞时，细胞的[³H]-胸苷摄入增加，因此生长素释放肽具有允许胎儿皮肤细胞增殖的活性。

(实施例4)生长素释放肽和GHRP6在培养的胎儿皮肤细胞中的细胞增殖促进活性

从妊娠第17天的Wistar大鼠取得胎儿皮肤细胞，并且以与实施例2中相同的方式得到其分散液。将分散的细胞与生长素释放肽(0.05到500pmol/mL(nM))或GHRP6(0.05到50pmol/mL(nM))悬浮在包含2％胎牛血清、青霉素(100U/mL)、链霉素(100μg/mL)和表皮生长因子EGF(5ng/mL)的MCDB153HAA培养基(F-Peptide Co.，Ltd.，Yamagata，Japan)中，并且以3×10⁴细胞/孔的量接种在聚乙烯亚胺涂层的96孔多孔板上。将不包含生长素释放肽或GHRP6的培养基用作对照。向其中添加5-溴-2’-脱氧尿苷(BrdU)(10μM)然后将其培养24小时。在培养结束之后，使用Proliferation ELISA Kit(RocheDiagnostic GmbH.Manheim，Germany)测量摄入到胎儿皮肤细胞中的BrdU的量，以研究皮肤细胞生长活性。

结果如图4中所示。

图4表明，当生长素释放肽或GHRP6作用于培养的胎儿皮肤细胞时，BrdU的摄入显著增加，因此生长素释放肽或GHRP6具有允许胎儿皮肤细胞增殖的活性。

本发明的皮肤损伤治疗剂、皮肤再生促进剂、培养皮肤细胞的生长促进方法、和皮肤再生促进方法可以应用于药学和医学领域。

序列表

<110>University of Miyazaki

National Cardiovascular Center，President

Daiichi Asubio Pharma.Co.，Ltd.

<120>包含生长素释放肽或其衍生物或作用于GHS-R1a的物质作为活性成分的皮肤修复促进治疗剂

<130>D05F2172

<160>25

<210>1

<211>28

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(28)

<223>人生长激素促泌素受体内源性肽的氨基酸序列

<400>1

Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Arg Val Gln Gln Arg Lys

1 5 10 15

Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg

20 25

<210>2

<211>27

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(27)

<223>人生长激素促泌素受体内源性肽(27个氨基酸)的氨基酸序列

<400>2

Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Arg Val Gln Arg Lys Glu

1 5 10 15

Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg

20 25

<210>3

<211>28

<212>PRT

<213>褐鼠(Rattus norvegicus)

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(28)

<223>大鼠生长激素促泌素受体内源性肽的氨基酸序列

<400>3

Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys

1 5 10 15

Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg

20 25

<210>4

<211>27

<212>PRT

<213>褐鼠(Rattus norvegicus)

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(27)

<223>大鼠生长激素促泌素受体内源性肽的氨基酸序列

<400>4

Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Arg Lys Glu

1 5 10 15

Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg

20 25

<210>5

<211>28

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(28)

<223>小鼠生长激素促泌素受体内源性肽的氨基酸序列

<400>5

Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys

1 5 10 15

Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg

20 25

<210>6

<211>28

<212>PRT

<213>野猪(Sus scrofa)

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(28)

<223>猪生长激素促泌素受体内源性肽的氨基酸序列

<400>6

Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Val Gln Gln Arg Lys

1 5 10 15

Glu Ser Lys Lys Pro Ala Ala Lys Leu Lys Pro Arg

20 25

<210>7

<211>27

<212>PRT

<213>牛(Bos taurus)

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(27)

<223>牛生长激素促泌素受体内源性肽(27个氨基酸)的氨基酸序列

<400>7

Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Leu Gln Arg Lys Glu

1 5 10 15

Ala Lys Lys Pro Ser Gly Arg Leu Lys Pro Arg

20 25

<210>8

<211>27

<212>PRT

<213>绵羊(Ovis aries)

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(27)

<223>羊生长激素促泌素受体内源性肽(27个氨基酸)的氨基酸序列

<400>8

Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Leu Gln Arg Lys Glu

1 5 10 15

Pro Lys Lys Pro Ser Gly Arg Leu Lys Pro Arg

20 25

<210>9

<211>28

<212>PRT

<213>狗(Canis familiaris)

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(28)

<223>狗生长激素促泌素受体内源性肽的氨基酸序列

<400>9

Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Leu Gln Gln Arg Lys

1 5 10 15

Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg

20 25

<210>10

<211>21

<212>PRT

<213>Anguilla japonica

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(21)

<223>鳗鱼人生长激素促泌素受体内源性肽的氨基酸序列。该肽在C-末端酰胺化。

<400>10

Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Ser Gln Arg Pro Gln Gly Lys Asp Lys

1 5 10 15

Lys Pro Pro Arg Val

20

<210>11

<211>23

<212>PRT

<213>Oncorhynchus mykiss

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(23)

<223>虹鳟鱼生长激素促泌素受体内源性肽(23个氨基酸)的氨基酸序列。该肽在C-末端酰胺化。

<400>11

Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Ser Gln Lys Pro Gln Val Arg Gln Gly

1 5 10 15

Lys Gly Lys Pro Pro Arg Val

20

<210>12

<211>20

<212>PRT

<213>Oncorhynchus mykiss

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(20)

<223>虹鳟鱼生长激素促泌素受体内源性肽(20个氨基酸)的氨基酸序列。该肽在C-末端酰胺化。

<400>12

Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Ser Gln Lys Pro Gln Gly Lys Gly Lys

1 5 10 15

Pro Pro Arg Val

20

<210>13

<211>24

<212>PRT

<213>Gallus domesticus

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(24)

<223>鸡生长激素促泌素受体内源性肽的氨基酸序列

<400>13

Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Thr Tyr Lys Asn Ile Gln Gln Gln Lys

1 5 10 15

Gly Thr Arg Lys Pro Thr Ala Arg

20

<210>14

<211>24

<212>PRT

<213>Gallus domesticus

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(24)

<223>鸡生长激素促泌素受体内源性肽的氨基酸序列

<400>14

Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Thr Tyr Lys Asn Ile Gln Gln Gln Lys

1 5 10 15

Asp Thr Arg Lys Pro Thr Ala Arg

20

<210>15

<211>26

<212>PRT

<213>Gallus domesticus

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(26)

<223>鸡生长激素促泌素受体内源性肽的氨基酸序列

<400>15

Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Thr Tyr Lys Asn Ile Gln Gln Gln Lys

1 5 10 15

Asp Thr Arg Lys Pro Thr Ala Arg Leu His

20 25

<210>16

<211>27

<212>PRT

<213>Rana catesbeiana

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(27)

<223>蛙生长激素促泌素受体内源性肽的氨基酸序列

<400>16

Gly Leu Thr Phe Leu Ser Pro Ala Asp Met Gln Lys Ile Ala Glu Arg

1 5 10 15

Gln Ser Gln Asn Lys Leu Arg His Gly Asn Met

20 25

<210>17

<211>28

<212>PRT

<213>Rana catesbeiana

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(28)

<223>蛙生长激素促泌素受体内源性肽的氨基酸序列

<400>17

Gly Leu Thr Phe Leu Ser Pro Ala Asp Met Gln Lys Ile Ala Glu Arg

1 5 10 15

Gln Ser Gln Asn Lys Leu Arg His Gly Asn Met Asn

20 25

<210>18

<211>20

<212>PRT

<213>Tilapia nilotica

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(20)

<223>罗非鱼生长激素促泌素受体内源性肽的氨基酸序列。该肽在C-末端酰胺化。

<400>18

Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Ser Gln Lys Pro Gln Asn Lys Val Lys

1 5 10 15

Ser Ser Arg Ile

20

<210>19

<211>22

<212>PRT

<213>Silurus asotus

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(22)

<223>鲶鱼生长激素促泌素受体内源性肽的氨基酸序列。该肽在C-末端酰胺化。

<400>19

Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Thr Gln Lys Pro Gln Asn Arg Gly Asp

1 5 10 15

Arg Lys Pro Pro Arg Val

20

<210>20

<211>23

<212>PRT

<213>Silurus asotus

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(23)

<223>鲶鱼生长激素促泌素受体内源性肽的氨基酸序列

<400>20

Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Thr Gln Lys Pro Gln Asn Arg Gly Asp

1 5 10 15

Arg Lys Pro Pro Arg Val Gly

20

<210>21

<211>28

<212>PRT

<213>Equus caballus

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(28)

<223>马生长激素促泌素受体内源性肽的氨基酸序列

<400>21

Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His His Lys Val Gln His Arg Lys

1 5 10 15

Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Lys Pro Arg

20 25

<210>22

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>22

gatacctctt ttccaagtcc ttcgagcc 28

<210>23

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>23

ttgaacactg ccacccggta cttct 25

<210>24

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>24

cggcaagttc aacggcaca 19

<210>25

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>25

agacgccagt agactccacg aca 23

Claims

1.皮肤损伤治疗剂，包含作用于生长激素促泌素受体的物质或其可药用盐作为活性成分。

2.权利要求1的治疗剂，其中所述物质为选自以下的肽或其可药用盐：(i)具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的肽，其中从氨基末端的第3个氨基酸残基为修饰的氨基酸残基，其中在该氨基酸残基的侧链中引入了脂肪酸；和(ii)具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的肽，其中从氨基末端的第5到第28个氨基酸中的一个或几个缺失、置换和/或添加，并且从氨基末端的第3个氨基酸残基为修饰的氨基酸残基，在该氨基酸残基的侧链中引入了脂肪酸。

3.权利要求2的治疗剂，其中该物质为具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的肽，其中氨基末端的第三位的丝氨酸残基为修饰的氨基酸残基，具有引入该氨基酸残基的侧链羟基的脂肪酸。

4.权利要求3的治疗剂，其中该物质为具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的肽，其中氨基末端的第三位的丝氨酸残基具有被正辛酰基酰化的侧链羟基。

5.权利要求1到4中任一项的治疗剂，包含每个单位制剂0.001mg到100mg的量的活性成分。

6.皮肤再生促进剂剂，包含作用于生长激素促泌素受体的物质或其可药用盐作为活性成分。

7.权利要求6的促进剂，其中所述物质为选自以下的肽或其可药用盐：(i)具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的肽，其中从氨基末端的第3个氨基酸残基为修饰的氨基酸残基，其中在该氨基酸残基的侧链中引入了脂肪酸；和(ii)具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的肽，其中从氨基末端的第5到第28个氨基酸中的一个或几个缺失、置换和/或添加，并且从氨基末端的第3个氨基酸残基为修饰的氨基酸残基，在该氨基酸残基的侧链中引入了脂肪酸。

8.权利要求7的促进剂，其中该物质为具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的肽，其中氨基末端的第三位的丝氨酸残基为修饰的氨基酸残基，具有引入该氨基酸残基的侧链羟基的脂肪酸。

9.权利要求8的促进剂，其中该物质为具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的肽，其中氨基末端的第三位的丝氨酸残基具有被正辛酰基酰化的侧链羟基。

10.权利要求6到9中任一项的促进剂，包含每个单位制剂0.001mg到100mg的量的活性成分。

11.促进培养皮肤细胞增殖的方法，使用作用于生长激素促泌素受体的物质或其可药用盐作为活性成分。

12.权利要求11的方法，其中所述物质为选自以下的肽或其可药用盐：(i)具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的肽，其中从氨基末端的第3个氨基酸残基为修饰的氨基酸残基，其中在该氨基酸残基的侧链中引入了脂肪酸；和(ii)具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的肽，其中从氨基末端的第5到第28个氨基酸中的一个或几个缺失、置换和/或添加，并且从氨基末端的第3个氨基酸残基为修饰的氨基酸残基，在该氨基酸残基的侧链中引入了脂肪酸。

13.权利要求12的方法，其中该物质为具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的肽，其中氨基末端的第三位的丝氨酸残基为修饰的氨基酸残基，具有引入该氨基酸残基的侧链羟基的脂肪酸。

14.权利要求13的方法，其中该物质为具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的肽，其中氨基末端的第三位的丝氨酸残基具有被正辛酰基酰化的侧链羟基。

15.权利要求11到14中任一项的方法，其中培养皮肤细胞的增殖在包含0.0000001mg/mL到0.1mg/mL量的活性成分的培养基中进行。

16.皮肤损伤的治疗方法，包括对需要皮肤损伤治疗的哺乳动物给予作为活性成分的作用于生长激素促泌素受体的物质或其可药用盐。

17.权利要求16的方法，其中所述物质为选自以下的肽或其可药用盐：(i)具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的肽，其中从氨基末端的第3个氨基酸残基为修饰的氨基酸残基，其中在该氨基酸残基的侧链中引入了脂肪酸；和(ii)具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的肽，其中从氨基末端的第5到第28个氨基酸中的一个或几个缺失、置换和/或添加，并且从氨基末端的第3个氨基酸残基为修饰的氨基酸残基，在该氨基酸残基的侧链中引入了脂肪酸。

18.权利要求17的方法，其中该物质为具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的肽，其中氨基末端的第三位的丝氨酸残基为修饰的氨基酸残基，具有引入该氨基酸残基的侧链羟基的脂肪酸。

19.权利要求18的方法，其中该物质为具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的肽，其中氨基末端的第三位的丝氨酸残基具有被正辛酰基酰化的侧链羟基。

20.权利要求16到19中任一项的方法，其中活性成分以每次给药0.001mg到100mg的量给药。

21.促进皮肤再生的方法，包括对需要促进皮肤再生的哺乳动物给予作为活性成分的作用于生长激素促泌素受体的物质或其可药用盐。

22.权利要求21的方法，其中所述物质为选自以下的肽或其可药用盐：(i)具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的肽，其中从氨基末端的第3个氨基酸残基为修饰的氨基酸残基，其中在该氨基酸残基的侧链中引入了脂肪酸；和(ii)具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的肽，其中从氨基末端的第5到第28个氨基酸中的一个或几个缺失、置换和/或添加，并且从氨基末端的第3个氨基酸残基为修饰的氨基酸残基，在该氨基酸残基的侧链中引入了脂肪酸。

23.权利要求22的方法，其中该物质为具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的肽，其中氨基末端的第三位的丝氨酸残基为修饰的氨基酸残基，具有引入该氨基酸残基的侧链羟基的脂肪酸。

24.权利要求23的方法，其中该物质为具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的肽，其中氨基末端的第三位的丝氨酸残基具有被正辛酰基酰化的侧链羟基。

25.权利要求21到24中任一项的方法，其中活性成分以每次给药0.001mg到100mg的量给药。

26.作用于生长激素促泌素受体的物质或其可药用盐作为活性成分用于生产治疗皮肤损伤的药物组合物的应用。

27.权利要求26的应用，其中所述物质为选自以下的肽或其可药用盐：(i)具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的肽，其中从氨基末端的第3个氨基酸残基为修饰的氨基酸残基，其中在该氨基酸残基的侧链中引入了脂肪酸；和(ii)具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的肽，其中从氨基末端的第5到第28个氨基酸中的一个或几个缺失、置换和/或添加，并且从氨基末端的第3个氨基酸残基为修饰的氨基酸残基，在该氨基酸残基的侧链中引入了脂肪酸。

28.权利要求27的应用，其中该物质为具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的肽，其中氨基末端的第三位的丝氨酸残基为修饰的氨基酸残基，具有引入该氨基酸残基的侧链羟基的脂肪酸。

29.权利要求28的应用，其中该物质为具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的肽，其中氨基末端的第三位的丝氨酸残基具有被正辛酰基酰化的侧链羟基。

30.权利要求26到29中任一项的应用，其中治疗皮肤损伤的药物组合物包含每个单位制剂0.001mg到100mg的量的活性成分。

31.作用于生长激素促泌素受体的物质或其可药用盐作为活性成分用于生产促进皮肤再生的药物组合物的应用。

32.权利要求31的应用，其中所述物质为选自以下的肽或其可药用盐：(i)具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的肽，其中从氨基末端的第3个氨基酸残基为修饰的氨基酸残基，其中在该氨基酸残基的侧链中引入了脂肪酸；和(ii)具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的肽，其中从氨基末端的第5到第28个氨基酸中的一个或几个缺失、置换和/或添加，并且从氨基末端的第3个氨基酸残基为修饰的氨基酸残基，在该氨基酸残基的侧链中引入了脂肪酸。

33.权利要求32的应用，其中该物质为具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的肽，其中氨基末端的第三位的丝氨酸残基为修饰的氨基酸残基，具有引入该氨基酸残基的侧链羟基的脂肪酸。

34.权利要求33的应用，其中该物质为具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的肽，其中氨基末端的第三位的丝氨酸残基具有被正辛酰基酰化的侧链羟基。

35.权利要求31到34中任一项的应用，其中促进皮肤再生的药物组合物包含每个单位制剂0.001mg到100mg的量的活性成分。