CN101128213A - 胰腺β细胞再生的促进剂以及在胰腺β细胞中生产胰岛素的促进剂 - Google Patents

胰腺β细胞再生的促进剂以及在胰腺β细胞中生产胰岛素的促进剂 Download PDF

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Abstract

促进产生和分泌胰岛素的胰腺β细胞的新生或再生、以及促进β细胞中胰岛素产生的药物组合物，其中含有ghrelin或其衍生物作为有效成分。

Description

胰腺β细胞再生的促进剂以及在胰腺β细胞中生产胰岛素的促进剂
技术领域
本发明涉及用来促进产胰岛素的胰腺β细胞的新生或再生的药物。本发明还涉及通过促进胰腺β细胞的新生或再生来抑制或治疗高血糖症的方法。
技术背景
糖尿病，也被称为高血糖症，是一种主要与葡萄糖代谢相关的代谢异常，它由例如胰岛素分泌不足或靶细胞对胰岛素的敏感度下降所引起，其特征为血液中糖浓度高。当高血糖持续较长时间时，主要由于血管病，可能会在各种不同器官和神经中引起严重的并发症，例如视网膜病、肾病和神经病。因此，目前在治疗糖尿病中非常重要的是将血糖控制并保持在正常范围内，并且已经研究了多种控制血糖水平的方法。
葡萄糖耐受测试(口服75克葡萄糖)被用于诊断糖尿病(高血糖症)。在该诊断中，在禁食期间抽血测量血液中的胰岛素和血糖的值，然后在摄取其中溶解有75克葡萄糖的水一段时间之后，再次抽血测量血液中的胰岛素和血糖的值。当用“服用葡萄糖30分钟后和服用前血液中胰岛素值的差”(ΔIRI)除以“服用葡萄糖30分钟后和服用前血液中血糖值的差”(ΔBG)获得的值(ΔIRI/ΔBG)不超过0.4时，可以确定存在高血糖症严重恶化的高度风险。
糖尿病主要被分为I型糖尿病和II型糖尿病。I型糖尿病是随着胰腺β细胞的衰弱或死亡而导致的不分泌胰岛素或胰岛素分泌很低所引起的胰岛素分泌的绝对欠缺而发生的。这可能是由病毒感染和源自病毒感染的自身免疫异常所引起的。当胰腺β细胞分泌的胰岛素减少时(胰岛素数量不足)、或胰岛素在吸收葡萄糖的细胞中的作用降低时(胰岛素抗性)会发生II型糖尿病，当胰岛素抗性增加时，胰岛素变得相对数量不足，血糖水平开始增加。在后一种情况下，胰腺β细胞的胰岛素分泌变得过量以补充胰岛素的相对数量不足，当胰岛素的过量分泌达到最高值并维持较长时间时，胰腺β细胞最终会枯竭，细胞分泌的胰岛素减少。
因此，可以假定糖尿病(高血糖症)的基本病因是胰腺β细胞的缺乏和细胞中胰岛素生产的降低或分泌的不足。
尽管目前使用了胰岛素组合物、双胍药剂、磺酰脲类药剂、四氢噻唑二酮类药剂等来改善血糖水平，但由于副作用等因素，目前使用的高血糖症药剂尚不令人满意。此外，因为这些药剂是为降低血糖水平的目的所开发的，它们可以用于症状治疗以控制血糖水平，但从治愈性治疗以改善上述的糖尿病的基本病因、即胰腺β细胞本身的缺乏和细胞中胰岛素生产的降低或分泌的不足的观点来看，尚不能令人满意。
根据上述的观点，开发能够促进胰腺β细胞的新生或再生、抑制胰腺β细胞的枯竭或死亡、以及促进胰腺β细胞中胰岛素的生产的药剂，对于抑制或治疗高血糖症来说是非常需要的。
在另一方面，ghrelin是1999年从大鼠胃中发现的激素，是一种具有相当独特的化学结构的肽，其中N-末端第三个氨基酸被脂肪酸所酰化(Nature，402，pp.656-660，1999)。已经发现ghrelin具有刺激垂体腺分泌生长激素的功能，在最近的研究中还发现它具有例如刺激食物的吸收、或积累脂肪以增加体重、以及改善心脏功能的功能(Nature，409，pp.194-198，2001；Endocr.Rev.，25，pp.656-660，2004；FrontNeuroendocrinol.，25，pp.27-68，2004)。
ghrelin是作为内源性生长激素促分泌素(GHS)从大鼠中分离和纯化的，作用于生长激素促分泌素受体(GHS-R)。在大鼠之外的脊椎动物、例如人、小鼠、猪、鸡、鳗、牛、马、羊、蛙、鳟鱼和犬类动物中，已经发现了具有类似一级结构的ghrelin的氨基酸序列。
人：
GSS(正辛酰基)FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR(序列No.1)
GSS(正辛酰基)FLSPEHQRVQRKESKKPPAKLQPR(序列No.2)
大鼠：
GSS(正辛酰基)FLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR(序列No.3)
GSS(正辛酰基)FLSPEHQKAQRKESKKPPAKLQPR(序列No.4)
小鼠：
GSS(正辛酰基)FLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR(序列No.5)
猪：
GSS(正辛酰基)FLSPEHQKVQQRKESKKPAAKLKPR(序列No.6)
牛：
GSS(正辛酰基)FLSPEHQKLQRKEAKKPSGRLKPR(序列No.7)
羊：
GSS(正辛酰基)FLSPEHQKLQRKEPKKPSGRLKPR(序列No.8)
犬：
GSS(正辛酰基)FLSPEHQKLQQRKESKKPPAKLQPR(序列No.9)
鳗：
GSS(正辛酰基)FLSPSQRPQGKDKKPPRV-NH2(序列No.10)
鳟鱼：
GSS(正辛酰基)FLSPSQKPQVRQGKGKPPRV-NH2(序列No.11)
GSS(正辛酰基)FLSPSQKPQGKGKPPRV-NH2(序列No.12)
鸡：
GSS(正辛酰基)FLSPTYKNIQQQKGTRKPTAR(序列No.13)
GSS(正辛酰基)FLSPTYKNIQQQKDTRKPTAR(序列No.14)
GSS(正辛酰基)FLSPTYKNIQQQKDTRKPTARLH(序列No.15)
牛蛙：
GLT(正辛酰基)FLSPADMQKIAERQSQNKLRHGNM(序列No.16)
GLT(正癸酰基)FLSPADMQKIAERQSQNKLRHGNM(序列No.16)
GLT(正辛酰基)FLSPADMQKIAERQSQNKLRHGNMN(序列No.17)
罗非鱼：
GSS(正辛酰基)FLSPSQKPQNKVKSSRI-NH2(序列No.18)
鲶鱼：
GSS(正辛酰基)FLSPTQKPQNRGDRKPPRV-NH2(序列No.19)
GSS(正辛酰基)FLSPTQKPQNRGDRKPPRVG(序列No.20)
马：
GSS(正丁酰基)FLSPEHHKVQHRKESKKPPAKLKPR(序列No.21)
(在上面的表述中，氨基酸残基用一个字母表示。)
上述的肽具有特定的结构，其中在第三位上的丝氨酸残基(S)或苏氨酸残基(T)的侧链羟基基团被脂肪酸例如辛酸或癸酸所酰化。除了ghrelin之外，还没有从生物体中分离出具有这种疏水修饰结构的生物活性肽的例子。已经知道这种肽具有强的生长激素释放活性，并参与生长激素分泌的调节(国际专利公开WO01/07475)。
因为ghrelin和其受体(GHS-R)也在胰腺中表达(Endocrinology，145，pp.3813-3820，2004；Brain Res.Mol.Brain Res.，48，pp.23-39，1997；J.Clin.Endocrinol.Metab.，87，pp.1300-1308，2002)，因此进行了与葡萄糖代谢或胰岛素分泌相关的研究，这些研究显示出ghrelin调节血液中的胰岛素和葡萄糖，此外已经报道了ghrelin增加血糖和抑制或促进胰岛素分泌的功能(Pancreas，27，pp.161-166，2003；Endocrinology，144，pp.916-921，2003；Eur.J.Endocrinol.，146，pp.241-244，2002；Endocrinology，143，pp.185-190，2002；J.Neuroendcrinol.，14，pp.555-560，2002)。然而，ghrelin作用于胰腺β细胞以促进细胞的新生或再生的功能还没有被提出。
此外，尽管在国际专利申请WO2001/56592(以及美国专利申请2001/0020012A1和2004/0063636A1)中建议了使用GHS-R1A受体配体包括ghrelin作为药物来治疗II型糖尿病，但对于ghrelin是否可以用作II型糖尿病的治疗方法尚没有阐述，并且本领域的专业技术人员尚不了解所提出的使用方法是否实际上存在。此外，尽管国际专利申请WO2002/60472描述了ghrelin对于肥胖症的作用，用于治疗糖尿病的应用还没有被证实。
对于胰腺β细胞和ghrelin之间的关系，已经发现了一种现象，当趋于β细胞的分化被抑制时，增加的产生ghrelin的细胞(ε细胞)代替了胰腺β细胞(Proc.Natl.Acad.Sci.，101，pp.2924-2929，2004)。尽管有可能两种细胞都是从相同的前体细胞衍生的，仍然提出了将来从干细胞等使用产生ghrelin的细胞生产纯的b细胞团用于在细胞水平上治疗糖尿病的的可能性，这些都仅仅是可能性，还没有被证实。此外，该申请没有提出或教导ghrelin具有促进胰腺β细胞的新生或再生、或促进胰腺β细胞中胰岛素产生的功能。
发明公开
通过本发明所解决的问题
本发明的目的是提供能够促进生产和分泌胰岛素的胰腺β细胞的新生或再生的方法，以及在由于胰腺β细胞的衰弱或死亡导致的胰岛素不分泌或分泌很少所引起的高血糖症、或由胰腺β细胞中胰岛素的分泌减少所引起的高血糖症中提供药物，通过促进生产和分泌胰岛素的胰腺β细胞的新生或再生来抑制或治疗高血糖症的药物。
解决问题的方法
作为解决上述问题的一项认真研究的结果，本发明的发明人发现ghrelin具有明显促进胰腺β细胞的新生或再生的功能，并且ghrelin具有促进胰腺β细胞中胰岛素产生的功能。本发明基于上述的发现而完成。
更具体来说，本发明涉及了：
(1)用于抑制或治疗高血糖症的药物组合物，其中作为有效成分包含了从含有下列肽的组中选择的肽：通过与生长激素促分泌素受体(GHS-R)相结合而具有增加细胞内钙离子浓度的活性的肽或非肽类化合物；具有序列No.1中描述的氨基酸序列的肽，其中氨基末端的第三个氨基酸残基是一个修饰的氨基酸残基，在氨基酸残基侧链上引入了脂肪酸；以及具有序列No.1中描述的氨基酸序列的肽，其中在氨基末端的第5个到第28个氨基酸的氨基酸序列中具有一个到几个氨基酸的缺失、取代和/或添加，其中氨基末端的第三个氨基酸残基是一个修饰的氨基酸残基，在氨基酸残基侧链上引入了脂肪酸，该肽通过与GHS-R相结合而具有增加细胞内钙离子浓度的活性，或它们可药用的盐；
(2)上述(1)中的药物组合物，其中的高血糖症是由于胰腺β细胞的衰弱或死亡导致的胰岛素不分泌或分泌很少所引起的，或由胰腺β细胞中胰岛素的分泌减少所引起的；
(3)上述(2)中的药物组合物，其中的高血糖症是由于胰腺β细胞的衰弱或死亡导致的胰岛素不分泌或分泌很少所引起的；
(4)上述(2)中的药物组合物，其中的高血糖症是由胰腺β细胞中胰岛素的分泌减少所引起的；
(5)上述(1)到(4)任何一个中的药物组合物，其中的高血糖症的ΔIRI/ΔBG值不超过0.4；
(6)上述(1)到(5)任何一个中的药物组合物，其中的肽具有序列No.1描述的氨基酸序列，并且氨基末端的第三个位置上的丝氨酸残基是修饰的氨基酸残基，在残基的侧链羟基基团上引入了脂肪酸；
(7)上述(6)中的药物组合物，其中的肽具有序列No.1描述的氨基酸序列，并且氨基末端的第三个位置上的丝氨酸残基的侧链羟基基团被正辛酰基基团所酰化；
(8)用于促进胰腺β细胞的新生或再生的药物组合物，其中作为有效成分包含了从含有下列肽的组中选择的肽：通过与GHS-R相结合而具有增加细胞内钙离子浓度的活性的肽或非肽类化合物；具有序列No.1中描述的氨基酸序列的肽，其中氨基末端的第三个氨基酸残基是一个修饰的氨基酸残基，在氨基酸残基侧链上引入了脂肪酸；以及具有序列No.1中描述的氨基酸序列的肽，其中在氨基末端的第5个到第28个氨基酸的氨基酸序列中具有一个到几个氨基酸的缺失、取代和/或添加，其中氨基末端的第三个氨基酸残基是一个修饰的氨基酸残基，在氨基酸残基侧链上引入了脂肪酸，该肽通过与GHS-R相结合而具有增加细胞内钙离子浓度的活性；或其可药用的盐；
(9)上述(8)中的药物组合物，其中的肽具有序列No.1描述的氨基酸序列，并且氨基末端的第三个位置上的丝氨酸残基是修饰的氨基酸，在残基的侧链羟基基团上引入了脂肪酸；
(10)上述(9)中的药物组合物，其中的肽具有序列No.1描述的氨基酸序列，并且氨基末端的第三个位置上的丝氨酸残基的侧链羟基基团被正辛酰基基团所酰化；
(11)用于促进胰腺β细胞中胰岛素产生的药物组合物，其中作为有效成分包含了从含有下列肽的组中选择的肽：通过与GHS-R相结合而具有增加细胞内钙离子浓度的活性的肽或非肽类化合物；具有序列No.1中描述的氨基酸序列的肽，其中氨基末端的第三个氨基酸残基是一个修饰的氨基酸残基，在氨基酸残基侧链上引入了脂肪酸；以及具有序列No.1中描述的氨基酸序列的肽，其中在氨基末端的第5个到第28个氨基酸的氨基酸序列中具有一个到几个氨基酸的缺失、取代和/或添加，其中氨基末端的第三个氨基酸残基是一个修饰的氨基酸残基，在氨基酸残基侧链上引入了脂肪酸，该肽通过与GHS-R相结合而具有增加细胞内钙离子浓度的活性；或其可药用的盐；
(12)上述(11)中的药物组合物，其中的肽具有序列No.1描述的氨基酸序列，并且氨基末端的第三个位置上的丝氨酸残基是修饰的氨基酸，在残基的侧链羟基基团上引入了脂肪酸；
(13)上述(12)中的药物组合物，其中的肽具有序列No.1描述的氨基酸序列，并且氨基末端的第三个位置上的丝氨酸残基的侧链羟基基团被正辛酰基基团所酰化；
(14)抑制或治疗高血糖症的方法，包括给表现出高血糖症的个体使用从下列的组中选择的肽的步骤：通过与GHS-R相结合而具有增加细胞内钙离子浓度的活性的肽或非肽类化合物；具有序列No.1中描述的氨基酸序列的肽，其中氨基末端的第三个氨基酸残基是一个修饰的氨基酸残基，在氨基酸残基侧链上引入了脂肪酸；以及具有序列No.1中描述的氨基酸序列的肽，其中在氨基末端的第5个到第28个氨基酸的氨基酸序列中具有一个到几个氨基酸的缺失、取代和/或添加，其中氨基末端的第三个氨基酸残基是一个修饰的氨基酸残基，在氨基酸残基侧链上引入了脂肪酸，该肽通过与GHS-R相结合而具有增加细胞内钙离子浓度的活性；或它们可药用的盐；
(15)上述(14)中的方法组合物，其中的高血糖症是由于胰腺β细胞的衰弱或死亡导致的胰岛素不分泌或分泌很少所引起的，或由胰腺β细胞中胰岛素的分泌减少所引起的；
(16)上述(15)中的方法组合物，其中的高血糖症是由于胰腺β细胞的衰弱或死亡导致的胰岛素不分泌或分泌很少所引起的；
(17)上述(15)中的方法组合物，其中的高血糖症是由胰腺β细胞中胰岛素的分泌减少所引起的；
(18)上述(14)到(17)任何一个中的方法组合物，其中的高血糖症的ΔIRI/ΔBG值不超过0.4；
(19)上述(14)到(18)任何一个中的方法组合物，其中的肽具有序列No.1描述的氨基酸序列，并且氨基末端的第三个位置上的丝氨酸残基是修饰的氨基酸残基，在残基的侧链羟基基团上引入了脂肪酸；
(20)上述(19)中的方法组合物，其中的肽具有序列No.1描述的氨基酸序列，并且氨基末端的第三个位置上的丝氨酸残基的侧链羟基基团被正辛酰基基团所酰化；
(21)促进胰腺β细胞的新生或再生的方法，包括给个体使用从下列的组中选择的肽的步骤：通过与GHS-R相结合而具有增加细胞内钙离子浓度的活性的肽或非肽类化合物；具有序列No.1中描述的氨基酸序列的肽，其中氨基末端的第三个氨基酸残基是一个修饰的氨基酸残基，在氨基酸残基侧链上引入了脂肪酸；以及具有序列No.1中描述的氨基酸序列的肽，其中在氨基末端的第5个到第28个氨基酸的氨基酸序列中具有一个到几个氨基酸的缺失、取代和/或添加，其中氨基末端的第三个氨基酸残基是一个修饰的氨基酸残基，在氨基酸残基侧链上引入了脂肪酸，该肽通过与生长激素促分泌素受体相结合而具有增加细胞内钙离子浓度的活性；或其可药用的盐；
(22)上述(21)中的方法，其中的肽具有序列No.1描述的氨基酸序列，并且氨基末端的第三个位置上的丝氨酸残基是修饰的氨基酸，在残基的侧链羟基基团上引入了脂肪酸；
(23)上述(22)中的方法，其中的肽具有序列No.1描述的氨基酸序列，并且氨基末端的第三个位置上的丝氨酸残基的侧链羟基基团被正辛酰基基团所酰化；
(24)促进胰腺β细胞中胰岛素产生的方法，包括给个体使用从下列的组中选择的肽的步骤：通过与GHS-R相结合而具有增加细胞内钙离子浓度的活性的肽或非肽类化合物；具有序列No.1中描述的氨基酸序列的肽，其中氨基末端的第三个氨基酸残基是一个修饰的氨基酸残基，在氨基酸残基侧链上引入了脂肪酸；以及具有序列No.1中描述的氨基酸序列的肽，其中在氨基末端的第5个到第28个氨基酸的氨基酸序列中具有一个到几个氨基酸的缺失、取代和/或添加，其中氨基末端的第三个氨基酸残基是一个修饰的氨基酸残基，在氨基酸残基侧链上引入了脂肪酸，该肽通过与生长激素促分泌素受体相结合而具有增加细胞内钙离子浓度的活性；或它们可药用的盐；
(25)上述(24)中的方法，其中的肽具有序列No.1描述的氨基酸序列，并且氨基末端的第三个位置上的丝氨酸残基是修饰的氨基酸残基，在残基的侧链羟基基团上引入了脂肪酸；
(26)上述(25)中的方法，其中的肽具有序列No.1描述的氨基酸序列，并且氨基末端的第三个位置上的丝氨酸残基的侧链羟基基团被正辛酰基基团所酰化；
(27)应用肽或非肽类化合物生产药物组合物以抑制或治疗高血糖症，其中
肽从下面的组中选择：通过与GHS-R相结合而具有增加细胞内钙离子浓度的活性的肽或非肽类化合物；具有序列No.1中描述的氨基酸序列的肽，其中氨基末端的第三个氨基酸残基是一个修饰的氨基酸残基，在氨基酸残基侧链上引入了脂肪酸；以及具有序列No.1中描述的氨基酸序列的肽，其中在氨基末端的第5个到第28个氨基酸的氨基酸序列中具有一个到几个氨基酸的缺失、取代和/或添加，其中氨基末端的第三个氨基酸残基是一个修饰的氨基酸残基，在氨基酸残基侧链上引入了脂肪酸，该肽通过与GHS-R相结合而具有增加细胞内钙离子浓度的活性；
(28)上述(27)中的应用，其中的高血糖症是由于胰腺β细胞的衰弱或死亡导致的胰岛素不分泌或分泌很少所引起的，或由胰腺β细胞中胰岛素的分泌减少所引起的；
(29)上述(28)中的应用，其中的高血糖症是由于胰腺β细胞的衰弱或死亡导致的胰岛素不分泌或分泌很少所引起的；
(30)上述(28)中的应用，其中的高血糖症是由胰腺β细胞中胰岛素的分泌减少所引起的；
(31)上述(27)到(30)任何一个中的应用，其中的高血糖症的ΔIRI/ΔBG值不超过0.4；
(32)上述(27)到(31)任何一个中的应用，其中的肽具有序列No.1描述的氨基酸序列，并且氨基末端的第三个位置上的丝氨酸残基是修饰的氨基酸残基，在残基的侧链羟基基团上引入了脂肪酸；
(33)上述(32)中的应用，其中的肽具有序列No.1描述的氨基酸序列，并且氨基末端的第三个位置上的丝氨酸残基的侧链羟基基团被正辛酰基基团所酰化；
(34)应用肽或非肽类化合物生产药物组合物以促进胰腺β细胞的新生或再生，其中
肽从下面的组中选择：通过与GHS-R相结合而具有增加细胞内钙离子浓度的活性的肽或非肽类化合物；具有序列No.1中描述的氨基酸序列的肽，其中氨基末端的第三个氨基酸残基是一个修饰的氨基酸残基，在氨基酸残基侧链上引入了脂肪酸；以及具有序列No.1中描述的氨基酸序列的肽，其中在氨基末端的第5个到第28个氨基酸的氨基酸序列中具有一个到几个氨基酸的缺失、取代和/或添加，其中氨基末端的第三个氨基酸残基是一个修饰的氨基酸残基，在氨基酸残基侧链上引入了脂肪酸，该肽通过与GHS-R相结合而具有增加细胞内钙离子浓度的活性；
(35)上述(34)中的应用，其中的肽具有序列No.1描述的氨基酸序列，并且氨基末端的第三个位置上的丝氨酸残基是修饰的氨基酸，在残基的侧链羟基基团上引入了脂肪酸；
(36)上述(35)中的应用，其中的肽具有序列No.1描述的氨基酸序列，并且氨基末端的第三个位置上的丝氨酸残基的侧链羟基基团被正辛酰基基团所酰化；
(37)应用肽或非肽类化合物生产药物组合物以促进胰腺β细胞中胰岛素的生产，其中
肽从下面的组中选择：通过与GHS-R相结合而具有增加细胞内钙离子浓度的活性的肽或非肽类化合物；具有序列No.1中描述的氨基酸序列的肽，其中氨基末端的第三个氨基酸残基是一个修饰的氨基酸残基，在氨基酸残基侧链上引入了脂肪酸；以及具有序列No.1中描述的氨基酸序列的肽，其中在氨基末端的第5个到第28个氨基酸的氨基酸序列中具有一个到几个氨基酸的缺失、取代和/或添加，其中氨基末端的第三个氨基酸残基是一个修饰的氨基酸残基，在氨基酸残基侧链上引入了脂肪酸，该肽通过与GHS-R相结合而具有增加细胞内钙离子浓度的活性；
(38)上述(37)中的应用，其中的肽具有序列No.1描述的氨基酸序列，并且氨基末端的第三个位置上的丝氨酸残基是修饰的氨基酸，在残基的侧链羟基基团上引入了脂肪酸；
(39)上述(38)中的应用，其中的肽具有序列No.1描述的氨基酸序列，并且氨基末端的第三个位置上的丝氨酸残基的侧链羟基基团被正辛酰基基团所酰化；
(40)抑制胰腺β细胞的衰弱、死亡或损耗的方法，包括包括给个体使用从下列的组中选择的肽的步骤：通过与GHS-R相结合而具有增加细胞内钙离子浓度的活性的肽或非肽类化合物；具有序列No.1中描述的氨基酸序列的肽，其中氨基末端的第三个氨基酸残基是一个修饰的氨基酸残基，在氨基酸残基侧链上引入了脂肪酸；以及具有序列No.1中描述的氨基酸序列的肽，其中在氨基末端的第5个到第28个氨基酸的氨基酸序列中具有一个到几个氨基酸的缺失、取代和/或添加，其中氨基末端的第三个氨基酸残基是一个修饰的氨基酸残基，在氨基酸残基侧链上引入了脂肪酸，该肽通过与生长激素促分泌素受体相结合而具有增加细胞内钙离子浓度的活性；或它们可药用的盐；
(41)上述(40)中的方法，其中的肽具有序列No.1描述的氨基酸序列，并且氨基末端的第三个位置上的丝氨酸残基是修饰的氨基酸，在残基的侧链羟基基团上引入了脂肪酸；
(42)上述(41)中的方法，其中的肽具有序列No.1描述的氨基酸序列，并且氨基末端的第三个位置上的丝氨酸残基的侧链羟基基团被正辛酰基基团所酰化；
(43)通过允许肽作用于从个体中分离出的胰腺β细胞或胰腺β细胞的前体细胞而使得胰腺β细胞新生或再生的方法，其中的肽从下列的组中选择：通过与GHS-R相结合而具有增加细胞内钙离子浓度的活性的肽或非肽类化合物；具有序列No.1中描述的氨基酸序列的肽，其中氨基末端的第三个氨基酸残基是一个修饰的氨基酸残基，在氨基酸残基侧链上引入了脂肪酸；以及具有序列No.1中描述的氨基酸序列的肽，其中在氨基末端的第5个到第28个氨基酸的氨基酸序列中具有一个到几个氨基酸的缺失、取代和/或添加，其中氨基末端的第三个氨基酸残基是一个修饰的氨基酸残基，在氨基酸残基侧链上引入了脂肪酸，该肽通过与生长激素促分泌素受体相结合而具有增加细胞内钙离子浓度的活性；
(44)上述(43)中的方法，其中的肽具有序列No.1描述的氨基酸序列，并且氨基末端的第三个位置上的丝氨酸残基是修饰的氨基酸，在残基的侧链羟基基团上引入了脂肪酸；以及
(45)上述(44)中的方法，其中的肽具有序列No.1描述的氨基酸序列，并且氨基末端的第三个位置上的丝氨酸残基的侧链羟基基团被正辛酰基基团所酰化；
附图简述
图1显示了出生后第21天时胰腺中胰岛素分析的结果。在该图中，A是表明胰岛素基因表达的图，B-D显示了胰岛素的免疫组织学染色的结果(分别为B显示了对照组，C显示了n0-STZ组，D显示了n0-STZ/ghrelin组，各自放大倍数×100)，E显示了胰岛素染色阳性细胞面积的定量结果。在每个A和E中，“Cont”表示对照组，“STZ”表示n0-STZ组，“STZ+G”表示n0-STZ/ghrelin组，每个组的值是三次观测的平均值±SE。此外，*表示P＜0.001，**表示P＜0.01，***表示P＜0.005。
图2显示了出生后第21天时胰腺中的pdx-1分析结果。在该图中，A显示了mRNA表达水平，而B-D显示了免疫组织学染色的结果(分别为B显示了对照组，C显示了n0-STZ组，D显示了n0-STZ/ghrelin组，各自放大倍数×500)。在A中，“Cont”表示对照组，“STZ”表示n0-STZ组，“STZ+G”表示n0-STZ/ghrelin组，每个组的值是三次观测的平均值±SE。此外，*表示P＜0.0005，**表示P＜0.0001。
图3显示了出生后第70天时胰岛素分析的结果。在该图中，A显示了血液葡萄糖和胰岛素浓度之间的关系，B是表明胰腺中胰岛素基因表达水平的图，C-E显示了胰腺中胰岛素的免疫组织学染色的结果(分别为C显示了对照组，D显示了n0-STZ组，E显示了n0-STZ/ghrelin组，放大倍数×100)，F显示了胰岛素染色阳性细胞面积的定量结果。在每个B和F中，“Cont”表示对照组，“STZ”表示n0-STZ组，“STZ+G”表示n0-STZ/ghrelin组，每个组的值是三次观测的平均值±SE。此外，*表示P＜0.001，**表示P＜0.05，***表示P＜0.01。
图4显示了出生后第70天时胰腺中的pdx-1分析结果。在该图中，A显示了mRNA表达水平，而B-D显示了免疫组织学染色的结果(分别为B显示了对照组，C显示了n0-STZ组，D显示了n0-STZ/ghrelin组，各自放大倍数×500)。在A中，“Cont”表示对照组，“STZ”表示n0-STZ组，“STZ+G”表示n0-STZ/ghrelin组，每个组的值是三次观测的平均值±SE。此外，*表示P＜0.01，**表示P＜0.05。
图5显示了在21日龄大鼠中检查β细胞复制的磷酸化组蛋白H3染色的结果。在该图中，A显示了用磷酸化组蛋白H3(绿色)和胰岛素(红色)对n0-STZ/ghrelin大鼠进行免疫组织学染色的结果，B显示了β细胞(1000个细胞中)的磷酸化组蛋白H3标记的指数(％)。“Cont”表示对照组，“STZ”表示n0-STZ组，“STZ+G”表示n0-STZ/ghrelin组，*表示P＜0.01。
图6显示了70日龄大鼠中β细胞的磷酸化组蛋白H3标记的指数(％)。“Cont”表示对照组，“STZ”表示n0-STZ组，“STZ+G”表示n0-STZ/ghrelin组。
图7显示了出生后第9周时的体重(A)和胰腺重量(B)。对照：正常的对照组，8只大鼠；STZ-媒介物：用STZ-处理的媒介物(5％甘露醇溶液)给药的组，9只大鼠；STZ-人ghrelin：用STZ-处理的人ghrelin给药的组，8只大鼠。每个值是平均值±SE。*表示与对照组相比P＜0.05，#表示与STZ-媒介物组相比P＜0.05(Dunnett’s多次对比检验)。
图8显示了出生后第9周时的体重(A)和胰腺重量(B)。对照：正常的对照组，8只大鼠；STZ-媒介物：用STZ-处理的媒介物(5％甘露醇溶液)给药的组，12只大鼠；STZ-GHRP-2：用STZ-处理的GHRP-2给药的组，12只大鼠。每个值是平均值±SE。*表示与对照组相比P＜0.05(Dunnett’s多次对比检验)，#表示与STZ-媒介物组相比P＜0.05(Student’s t-检验)。
图9显示了用正常饮食或高脂肪酸饮食饲养的小鼠的体重(A)和血糖值(B)。A表示在用高脂肪酸饮食饲养和服用试验物质的第42天的大约上午9时测量的体重，B表示在用高脂肪酸饮食饲养和服用试验物质的第43天的大约上午9时测量的血糖值。ND：正常饮食饲养组；HFD-媒介物：使用含有高脂肪酸饮食的媒介物(5％甘露醇溶液)的组；HFD-ghrelin：使用高脂肪酸饮食和300μg/kg人ghrelin的组。试验物质在平日每天皮下给药两次，在假日每天给药一次。每个值是8只小鼠的平均值±标准误差。*表示与ND组相比P＜0.05(Dunnett’s多次对比检验)。
图10显示了在用正常饮食或高脂肪酸饮食饲养并腹膜内给药亚油酸的小鼠中的血浆胰岛素浓度(A)和血浆葡萄糖浓度(B)。在用高脂肪酸饮食饲养和给药试验物质50天后，小鼠被禁食过夜，然后通过腹膜内给药1mL亚油酸/kg体重。1小时后，抽血测量血浆胰岛素和葡萄糖浓度。ND：正常饮食饲养组；HFD-媒介物：使用含有高脂肪酸饮食的媒介物(5％甘露醇溶液)的组；HFD-ghrelin：使用高脂肪酸饮食和300μg/kg人ghrelin的组。每个值是8只小鼠的平均值±SE。*表示与ND组相比P＜0.05(Dunnett’s多次对比检验)。
实施本发明的最佳方式
本发明的药物可以用作给动物(个体)包括人使用的药物。可以在本发明中使用的物质包括生长激素促分泌素(GHS)、生长激素促分泌素受体(GHS-R)的配体。尽管现有的肽类化合物或低分子量化合物可以用作GHS，但肽类化合物ghrelin是特别适合的。
如上所述，来自人的ghrelin以及来自其它动物例如大鼠、小鼠、猪和牛的ghrelin及其衍生物可以用作ghrelin。
对于每个个体来说，适合于使用来自于该个体的ghrelin。例如，来自人的ghrelin适合用于人。来自人的ghrelin是由28个氨基酸构成的肽，其中氨基末端第三个位置上的丝氨酸残基的侧链羟基基团被脂肪酸(正辛酰基团)所酰化(序列No.1)。可以使用的ghrelin衍生物的例子是具有序列No.1中描述的氨基酸序列的肽，其中在氨基末端的第5个到第28个位置上的氨基酸残基中具有一个到几个氨基酸的取代、插入或缺失，并且该肽通过与生长激素促分泌素受体(GHS-R)相结合而具有增加细胞内钙离子浓度的活性。适合的衍生物的氨基酸序列与天然形式的氨基酸序列相比具有70％、优选80％、更优选90％、特别优选95％、最优选97％的同源性。这也适用于来自其它动物的ghrelin(序列Nos.2-22)。
用在本发明的药物中的ghrelin及其衍生物可以通过常规的方法获得。例如，从天然原料中分离或通过重组DNA技术和/或化学合成来生产都是可能的。当需要对氨基酸残基进行进一步修饰(酰化)时，可以按照已知的方法进行修饰反应。例如在使用重组DNA技术的生产方法中，可以将用具有为本发明的肽编码的DNA的表达载体转化的宿主细胞进行培养，然后可以从培养液中收集靶肽，从而获得本发明的ghrelin或其衍生物。筛选宿主细胞可以获得含有在细胞中修饰的(酰化的)靶肽的化合物。当肽没有被修饰(酰化)时，如果需要可以按照的方法进行修饰反应例如酰化。
尽管用于在其中引入基因的载体的例子包括大肠杆菌的载体(pBR322、pUC18、pUC19等)、枯草芽孢杆菌的载体(pUB110、pTP5、pC194等)、酵母的载体(YEp型、YRp型、Yip型)和动物细胞的载体(逆转录病毒、痘苗病毒等)，任何其它的载体只要其能够将靶基因稳定地保持在宿主细胞中也可以使用。载体被导入到适合的宿主细胞中。
例如，在《分子克隆实验指南》(Sambrook等，1989)中描述的方法可以用作将靶基因引入质粒或导入宿主细胞的方法。
为了使得在上述的质粒中的靶肽基因能够表达，可以将启动子连接在基因上游发挥作用。任何启动子，只要适合于用来表达靶基因的宿主细胞，都可以使用。例如，当被转化的宿主细胞是大肠杆菌属时可以使用lac启动子、trp启动子、lpp启动子、λPL启动子、recA启动子等；在芽孢杆菌属的情况下可以使用SPO1启动子、SPO2启动子等；在酵母的情况下可以使用GAP启动子、PHO5启动子、ADH启动子等；在动物细胞的情况下可以使用SV40衍生的启动子、逆转录病毒衍生的启动子等。
可以使用如上述获得的含有目的基因的载体转化宿主细胞。就宿主细胞来说，可以使用细菌(例如埃希氏大肠杆菌属或芽孢杆菌属)、酵母(糖酵母菌属、毕赤氏酵母属、假丝酵母属等)、动物细胞(CHO细胞、COS细胞等)等。液体培养基适合用作培养基，含有被培养的转化细胞生长所需的碳源、氮源等的培养基是特别优选的。如果需要，可以加入维生素、生长促进因子、血清等。
为了直接生产脂肪酸修饰(酰化)的肽，理想的细胞具有加工蛋白酶活性，能够在适当的位置切开肽的前体多肽，并具有能够酰化肽中的丝氨酸残基的活性。这种具有加工蛋白酶活性和丝氨酸酰化活性的宿主细胞的筛选可以通过用含有为前体多肽编码的cDNA的表达载体转化宿主细胞，然后证实转化的宿主细胞产生了具有增加钙或释放生长激素活性的脂肪酸修饰的肽来进行。
培养后，可以通过常规的方法从培养基中分离和纯化ghrelin。例如，为了从培养的细胞体或细胞中提取靶物质，可以在培养后收集细胞体或细胞，悬浮在含有蛋白变性剂(例如盐酸胍)的缓冲溶液中，然后可以通过超声等将细胞体或细胞匀质化，然后进行离心。为了从上清液中纯化靶物质，可以参考靶物质的分子量、溶解度、电荷(等电点)、亲和性等，将例如凝胶过滤、超滤、透析、SDS-PAGE以及各种层析方法等分离和纯化的方法进行适当组合并使用。
ghrelin及其衍生物可以通过常规的方法化学合成。例如，ghrelin及其衍生物可以通过用液相方法和/或固相方法将具有保护基团的氨基酸进行缩合以延伸肽链、用酸除去所有的保护基团、然后用上述的纯化方法纯化产生的粗产物来获得。靶位置上的氨基酸侧链可以通过酰化酶或酰基转移酶进行选择性酰化。
已经知道了多种生产肽的方法，ghrelin也可以按照已知的方法容易地生产。例如，ghrelin可以按照常规的肽合成方法或固相方法容易地生产。
此外，使用重组DNA技术与化学合成相结合的生产方法也可以使用。ghrelin可以通过下面的方法来生产：含有修饰氨基酸残基的片段通过化学合成产生，其它不含修饰氨基酸残基的片段用重组DNA技术来生产，然后将片段彼此融合(参见国际专利申请WO01/07475)。
可以用于本发明的ghrelin及其衍生物的盐优选为可药用的盐，例如与无机碱的盐、与有机碱的盐、与有无机酸的盐、与有机酸的盐、或与碱性或酸性氨基酸的盐。
适合的与无机碱的盐的例子包括碱金属盐例如钠盐和钾盐、碱土金属盐例如钙盐和镁盐、以及铝盐和铵盐。
适合的与有机碱的盐的例子包括与三甲基胺、三乙基胺、吡啶、甲基吡啶、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、二环己胺、N，N’-联苄基亚乙基二胺等的盐。
适合的与无机酸的盐的例子包括与盐酸、氢溴酸、硝酸、硫酸、磷酸等的盐。
适合的与有机酸的盐的例子包括与甲酸、乙酸、三氟乙酸、延胡索酸、草酸、酒石酸、顺丁烯二酸、柠檬酸、琥珀酸、苹果酸、甲基磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸等的盐。
适合的与碱性氨基酸的盐的例子包括与精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸等的盐，适合的与酸性氨基酸的盐的例子包括与天冬氨酸、谷氨酸等的盐。
在上述的盐中，钠盐和钾盐是最优选的。
至于ghrelin的生物学作用，可以使用对GHS-R1A受体(这是一种GHS-R，作为指示剂)的结合活性或上述文献中描述的生理学作用来筛选衍生物。现有的方法可以用作测量细胞内钙离子浓度的方法，例如，可以使用利用由于钙离子浓度的变化而引起的Fluo-4 AM(Molecular Probe)的荧光强度的变化的FLIPR(Fluorometric ImagingPlate Reader，Molecular Devices)。此外，现有方法可以用于检查具有钙增加活性的肽是否在体外和体内具有生长激素释放活性。例如在体内情况下，肽可以被加入到分泌生长激素并显示出表达GHS-R的垂体腺细胞中，然后可以通过放射免疫分析使用抗生长激素抗体测量分泌到细胞培养基中的生长激素。为了检测体内生长激素释放活性，可以将具有钙增加活性的肽注射到动物的外周静脉中，然后测量血清生长激素浓度。此外，关于ghrelin衍生物及其制备方法可以参考例如J.Med.Chem.，43，pp.4370-4376，2000。
正如在本说明书的实施例中具体显示的那样，ghrelin及其衍生物当给个体使用时具有促进胰腺β细胞新生或再生的功能，可以在胰腺β细胞中显著增加胰岛素阳性细胞的数量。ghrelin及其衍生物也具有促进胰腺β细胞中胰岛素生产的功能，并增加胰岛素在胰腺β细胞中的积累。
尽管已经报道了ghrelin减少胰岛素从胰腺β细胞的分泌，胰岛素生产和积累的机制可能与胰岛素分泌的机制不同，本发明的药物的功能可能在于胰腺β细胞的新生或再生，以及促进胰岛素在胰腺β细胞中的生产，从而增加胰岛素储存的量并增加胰岛素分泌的潜力。
因此，通过给个体使用本发明的药物，可以增加胰腺中能够分泌胰岛素的β细胞的数量，使具有胰岛素分泌功能的胰腺β细胞的新生或再生成为可能。
因此，本发明的具有允许胰腺β细胞新生或再生功能的药物可以被用来抑制个体中胰腺β细胞的衰弱、死亡或损坏，以及保护胰腺β细胞。此外，可以在糖尿病发生之前给处于高血糖状态的个体使用本发明的药物来阻止糖尿病的发生。此外，当糖尿病症状还不严重时，可以通过给个体使用本发明的药物来抑制糖尿病发病的进程。在严重糖尿病的情况下(ΔIRI/ΔBG值不超过0.4)，可以通过给个体使用本发明的药物用胰腺β细胞的新生或再生来进行糖尿病的治愈性治疗。胰腺β细胞的新生或再生的发生可以通过例如证实pdx-1的表达来证明，其是胰腺分化的一种主要转录因子。
此外，对于胰腺β细胞来说，再生疗法可以如下进行：将本发明的药物与从个体分离的胰腺β细胞在试管中相作用以促进胰腺β细胞的再生和细胞的增殖，然后将细胞移植到发生胰腺β细胞衰弱或死亡的个体的位点上，或预计将会发生胰腺β细胞的衰弱或死亡的位点上。鉴定和分离胰腺β细胞的前体细胞的方法目前在全世界的许多研究组中正在进行大力的研究，并且已经开发出多种方法(参见例如Lancet，364，pp.203-205，2004)。可以通过将ghrelin及其衍生物作用于分离的胰腺β细胞的前体细胞来使得胰腺β细胞新生或再生，然后可以将这样获得的细胞群移植到个体的活体中以进行胰腺β细胞的再生疗法。
本发明的药物、包括ghrelin、其衍生物或可药用的盐作为有效成分，可以与可药用的载体、赋形剂、增充剂等混合并用于个体(例如人、小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、马、猪、猿等)。对于剂量没有特别的限制，可以根据例如本发明的药物的使用对象、或个体的年龄、体重或种类等进行适当的选择。对于成年人来说，例如每天可以服用大约1次到2次剂量为50-200μg重的ghrelin或其衍生物，或者该剂量可以连续服用大约几天或几周。
ghrelin、其衍生物或其可药用的盐可以与可药用的载体混合，并作为固体制备物例如片剂、胶囊、颗粒或粉末或液体制备物例如糖浆或注射液以口服或肠胃外的方式给药。
多种常用作制备物材料的有机或无机载体物质被用作可药用的载体，在固体制备物中作为例如赋形剂、润滑剂、粘合剂或崩解剂进行混合，或在液体制备物中作为溶剂、溶解助剂、悬浮剂、等渗剂、缓冲液、或舒缓剂进行混合。
此外，如果需要，也可以使用制备物添加剂例如防腐剂、抗氧化剂、添色剂或甜味剂。
适合的赋形剂的例子包括乳糖、蔗糖、D-甘露醇、淀粉、结晶纤维素、轻硅酸酐等。适合的润滑剂的例子包括硬脂酸镁、硬脂酸钙、滑石、硅胶等。
适合的粘合剂的例子包括结晶纤维素、蔗糖、D-甘露醇、糊精、羟基丙基纤维素、羟基丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。
适合的崩解剂的例子包括淀粉、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钙、交联羧甲纤维素钠(croscarmellose)、羧甲基淀粉钠等。
适合的溶剂的例子包括注射用水、乙醇、丙二醇、聚乙二醇、芝麻油、玉米油等。
适合的溶解助剂的例子包括聚乙二醇、丙二醇、D-甘露醇、苯甲酸苄酯、乙醇、三氨基甲烷、胆固醇、三乙醇胺、碳酸钠、柠檬酸钠等。
适合的悬浮剂的例子包括表面活性剂例如硬脂基三乙醇胺、十二烷基硫酸钠、十二烷基氨基丙酸、磷脂酰胆碱、苯扎氯铵、苯索氯铵、和单硬脂酸甘油酯、以及亲水性聚合物例如聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素和羟丙基纤维素。
适合的等渗剂的例子包括氯化钠、甘油、D-甘露醇等。
适合的缓冲剂的例子包括磷酸、乙酸、碳酸、柠檬酸等的缓冲溶液。
适合的舒缓剂的例子包括例如苯甲醇。
适合的防腐剂的例子包括对氧苯甲酸盐、氯代丁醇、苯甲醇、苯乙醇、脱氢乙酸、山梨酸等。
适合的抗氧化剂的例子包括亚硫酸盐、抗坏血酸等。
适合用于肠胃外给药的制备物形式的例子包括用于静脉内给药、真皮内给药、皮下给药、肌肉内给药等的注射液，滴注液，栓剂，透过皮肤吸收的药剂，透过粘膜吸收的药剂和吸入剂，而适合于口服给药的制备物形式的例子包括胶囊、片剂、糖浆等。但是，作为本发明的药物的制备物形式，适合于肠胃外给药的制备物形式例如注射液、滴注液或吸入剂是优选的。这样的多种制备物形式对于本领域的专业技术人员来说是已知的，如果需要，使用本技术领域中可用于制备物的一种或多种添加剂，本领域的专业技术人员可以选择适合于所需给药途径的制备物形式，适合地生产药物组合物形式的制备物。
例如，注射液或滴注液形式的药物可以通过将作为有效成分的ghrelin或其衍生物与一种或多种制备物添加剂例如等渗剂、pH调节试剂、舒缓剂或防腐剂一起溶解在用于注射的蒸馏水中，然后灭菌来制备。此外，注射液或滴注液形式的药物也可以提供成冻干粉形式的药物。这样的药物可以在使用前通过加入注射用蒸馏水、生理盐水等立即溶解，然后可以用作注射液或滴注液。此外，例如对于透过粘膜吸收的给药方式来说，鼻内给药试剂例如洗鼻剂或鼻内喷雾剂、或口腔给药试剂例如舌下试剂也是适合的。
实施例
尽管使用实施例可以将本发明描述得更加具体，但本发明的范围不受下列实施例的限制。
实施例1
1.材料和方法
从Charles River购买的雌性或雄性Sprague Dawley大鼠被允许自由接近自来水和标准的大鼠颗粒饲料(352kcal/100g、CE-2、CLEA)。将雌性与雄性同笼一夜，14天后通过腹部触诊检查怀孕。交配后22天自然生产。我们研究了下面三个实验组：对照组(Sprague Dawley大鼠)，其中新出生的大鼠接受单次的柠檬酸缓冲液腹膜内注射；n0-STZ组，其中大鼠接受单次的链脲菌素(STZ)腹膜内注射；以及n0-STZ/ghrelin组，其中大鼠接受单次的链脲菌素腹膜内注射，然后在出生第二天到第八天的7天内每天两次皮下注射来自大鼠的ghrelin(在本文后面称为大鼠ghrelin，序列No.3，100μg/kg体重)。
将链脲菌素(Sigma，100mg/kg体重)溶解在柠檬酸缓冲液(0.05mmol/L，pH4.5)中，给刚出生的大鼠立即腹膜内注射一次。将幼崽留给母亲。在第二天使用Multistix SG(Bayer Medical)检查每只新生大鼠的尿糖。只有那些出生后第二天就有糖尿的大鼠(用Multistix SG测试为3+)被包含在n0-STZ模型组中。动物在21天或70天时在用腹膜内注射戊巴比妥钠(50mg/kg)麻醉后放血处死。从下腔静脉收集血液样品，立即在4℃下离心，然后保存在-80℃直到进行分析。
切除后取出胰腺并称重。为了测量胰岛素含量，将胰腺(35-50mg)在5ml酸性乙醇(0.15M HCl 75％(v/v)乙醇溶液)中匀浆并离心，将上清液保存在-80℃下。对于免疫组织化学分析来说，将其它的胰腺在4％多聚甲醛固定液中固定24小时，然后包埋在石蜡中。
使用间接的过氧化物酶标记技术通过免疫组织化学方法在3μm厚的组织切片上检测胰岛素和pdx-1。每个切片与第一抗体(豚鼠抗猪胰岛素抗体，DACO；或兔抗小鼠/大鼠IDX-1抗体，CHEMICON)保温1小时。通过与3，3’-二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)试剂盒(DakoCytomation)保温进行染色。总β细胞面积的定量评估通过计算机辅助的成像分析步骤进行，使用了与数字照相机DP 12和MacSCOPE Ver2.6软件(Mitani，Fukui，日本)相连的Olympus BX51显微镜。对于每个染色的切片对β细胞面积和总的胰腺切片面积进行评估。β细胞的相对体积通过体视形态学方法，通过计算免疫反应性细胞占据的面积与总的胰腺细胞占据的面积之间的比率来确定。
象以前报道的那样(Biochem.Biophys.Res.Commun.，214，pp.239-246，1995)从大鼠胰腺中提取总RNA。为了合成第一链cDNA，在含有RT(Invitrogen)和靶3’端引物的反应中使用了提取的产物作为模板。按照以前报道的方法(Biochem.Biophys.Res.Commun.，214，pp.239-246，1995)进行了RT-PCR分析。第一链cDNA被用于后面的PCR分析中。在PCR分析中，对于每个靶cDNA使用了下面的寡聚核苷酸引物。PCR产物的身份通过琼脂糖凝胶电泳证实。
胰岛素-1：
5′-tagaccatcagcaagcaggtc(序列No.22)
3′-cacaccaggtacagagcct(序列No.23)
胰岛素-2：
5′-cacttggtggaagctctctacc(序列No.24)
3′-gacagggtagtggtgggcctagt(序列No.25)
Rdx-1：
5′-aggaggtgcatacgcagcag(序列No.26)
3′-gaggccgggagatgtatttgtt(序列No.27)
实时PCR如下述进行。将cDNA(1μl)与2×PCR Master Mix(Applied Biosystems)(25μl)、无菌蒸馏水(23μl)以及胰岛素和pdx-1的正义和反义引物(10pmol/μl，0.5μl)混合。使用热循环仪系统(ABIPRISM7700，Applied Biosystems，日本)进行40个循环的PCR扩增，每个循环95℃15秒，然后60℃60秒。使用表示荧光强度对标准化的PCR产物的量的校正曲线对每种mRNA产物的浓度进行定量。
所有表示数据参照来自同样个体样品的18S核糖体RNA的量进行标准化归一。
血浆和血液葡萄糖水平使用葡萄糖分析仪(Antsense 2，Sankyo)进行测量。按照描述的方法(Endocrinology，140，pp.4861-4873，1999)从胰腺提取胰岛素。胰岛素浓度使用Lebis胰岛素ELISA试剂盒(Shibayagi)进行测量。
测量值被表示为平均值±SEM。对照组与给药STZ组的大鼠之间的差别通过ANOVA方差分析进行评估。
2.结果
21日龄大鼠的特征概述在表1中。在对照组和n0-STZ组之间的体重、禁食血糖(FBG)浓度和胰岛素浓度之间没有显著的区别。n0-STZ组和n0-STZ/ghrelin组在这些参数方面彼此之间也没有明显的区别。但是n0-STZ/ghrelin组中的FBG浓度明显低于对照组的FBG浓度(P＜0.01)。
表1
  对照   n0-STZ   n0-STZ/ghrelin
  体重(g)   37.8±5.0(20)   37.6±4.8(15)   36.3±3.9(9)
  FBG(mg/dl)   114±8.6(17)   106.7±16.6(15)   100.6±7.6(8) *1
  血浆胰岛素(ng/ml)   0.32±0.10(7)   0.32±0.19(6)   0.35±0.17(6)
每个值是平均值±SE(大鼠的数量)
*1：P＜0.01(与对照组相比)
与对照组相比，n0-STZ组中胰腺中胰岛素mRNA的表达水平明显降低。但是这些水平在用大鼠ghrelin治疗(n0-STZ/ghrelin组)后恢复到了与对照组相似的水平(图1A)。n0-STZ组的胰腺胰岛素mRNA表达水平大约为n0-STZ/ghrelin组的三分之一，但是n0-STZ组表现出与对照组和n0-STZ/ghrelin组相当的血浆胰岛素水平。胰腺的胰岛素免疫染色与基因表达的结果一致(图1A-E)。与对照组相比，在n0-STZ组中Langerhans胰岛较小(图1B、C、E)。n0-STZ/ghrelin组中的Langerhans胰岛比n0-STZ组中的大，但是比对照组中的小(图1B-E)。
为了探索控制胰腺中胰岛素表达改变的机制，我们研究了pdx-1的表达，其是胰腺分化的一种主要的转录因子。Pdx-1的mRNA和蛋白水平以与胰岛素相似的方式变化(图2A-D)。尽管在n0-STZ组中pdx-1的基因表达水平不到对照组水平的1/10，在经过大鼠ghrelin治疗的n0-STZ/ghrelin组中的水平恢复到了与对照组中相似的水平(图2A)。胰腺中pdx-1的免疫荧光染色与胰岛素染色的结果一致(图2B-D)。
因此，该n0-STZ模型显示出在第21天时胰岛素生产的减少，尽管血糖的水平没有变化。在mRNA水平和蛋白水平上证实了通过大鼠ghrelin治疗在该模型中抑制胰岛素生产的减少。
因为已经知道n0-STZ模型在8-10周龄后才逐渐发展为高血糖症，因此在该模型中研究了早期ghrelin治疗的长期效应。10周龄的对照组、n0-STZ组和n0-STZ/ghrelin组的特点被显示在表2中。
表2
  对照   n0-STZ   n0-STZ/ghrelin
  体重(g)   317±14(6)   285±19(5) *1   248±40(13) *2
  FBG(mg/dl)   103.3±15.6(6)   213±12.8(5) *3   137±28.7(13)#1
  血浆胰岛素(ng/ml)   1.05±0.25(6)   1.75±0.89(5)   0.93±0.49(8)
  胰腺重量(mg)   414±81(6)   520±95(5)   556±83(13)
  胰腺胰岛素(μg/胰腺)   78.6±19.0(6)   39.6±31.6(5)   92.6±6.9(8)#2
每个值是平均值±SE(大鼠的数量)
*1：P＜0.05，*2：P＜0.01，*3：P＜0.0001；与对照组相比
#1：P＜0.0001，#2：P＜0.01；与n0-STZ组相比
与对照组相比，n0-STZ组显示体重降低和高血糖。尽管该组的血浆胰岛素浓度没有减少，但相对于升高的葡萄糖浓度，每只动物的胰岛素浓度显得相对较低(表2，图3A)。事实上，与对照组相比，胰腺胰岛素水平降低了(表2)。
另一方面，n0-STZ/ghrelin组的FBG水平明显比n0-STZ组的低，而不明显比对照组的高。此外，胰腺胰岛素含量维持在与对照组一样高的水平。n0-STZ/ghrelin组的体重明显低于对照组，但是与n0-STZ组没有差别。
n0-STZ组中成年阶段的胰岛素mRNA表达仍然在低水平，尽管得到了略微的恢复。
另一方面，在出生后第21天，n0-STZ/ghrelin组显示了与对照组相似的水平(图3B)。此外，对于胰岛素免疫组织化学染色来说，n0-STZ/ghrelin组中的Langerhans胰岛比n0-STZ组中的大，但是比对照组的小(图3C-F)。
在三组成年大鼠中pdx-1的mRNA和蛋白表达水平情况与出生后第21天时的水平情况相似(图4)。n0-STZ组中的pdx-1基因表达被减少到对照组的大约1/3，而n0-STZ/ghrelin组中的水平回复到了与对照组接近的水平(图4A)。在对胰腺中pdx-1的免疫荧光染色中，观察到了与胰岛素情况类似的情况(图4B-D)。
如上所述，在n0-STZ模型中，动物在出生后10周时发生了胰腺中胰岛素生产的降低并发展出高血糖。大鼠ghrelin治疗能够通过维持或促进胰岛素的生产抑制这种病情的加重。Pdx-1表达的增加也可能部分参与了这种胰岛素生产的维持。因为在n0-STZ/ghrelin组中观察到了pdx-1这种在胰腺发育和分化中发挥重要作用的转录因子的表达的增加，这表明在出生后立即给药STZ所破坏的胰腺β细胞通过给药ghrelin得到了再生，而胰腺β细胞的再生可能对胰岛素生产的维持有贡献。
实施例2
1.材料和方法
还没有被用于形态学研究的胰腺切片被用来检测β细胞的复制。切片被进行磷酸化组蛋白H3(Ser10)和胰岛素的双重染色。切片在4℃下与稀释50倍的抗磷酸化组蛋白H3(Ser10)抗体(Cell SignalingTechnology)保温过夜。然后，将切片与豚鼠抗胰岛素抗体在室温保温1小时。在用PBS洗6次后，将切片在室温下在含有与荧光素偶联的第二抗体(Alexa Fluor488和546，Molecular Probe)的封闭溶液中保温30分钟。在用PBS洗后，切片用含有DAPI(Vector Laboratories)的固定介质固定，然后用共聚焦激光扫描显微镜(Leica Microsystems)检测。每个切片至少计数1000个β细胞。
2.结果
为了检测在STZ处理的大鼠中用ghrelin增殖的β细胞是否对胰岛素生产和β细胞的数量的影响有贡献，我们进行了磷酸化组蛋白H3免疫组织化学分析。磷酸化组蛋白H3是细胞增殖有丝分裂标记物(J.Clin.Invest.，113，pp.1364-1374，2004；Br.J.Cancer，88，pp.257-262，2003)。结果显示在图5A中。在21日龄的大鼠中，在ghrelin组和n0-STZ/ghrelin组中磷酸化组蛋白H3和胰岛素双阳性细胞通过大鼠ghrelin治疗后与对照和n0-STZ大鼠相比分别增加了大约1.7倍和15倍(图5B)。在10周龄大鼠中，尽管在这四组中没有显著的区别，但在STZ模型中通过大鼠ghrelin治疗后磷酸化组蛋白H3和胰岛素双阳性细胞有增加的趋势，而在对照组中通过ghrelin治疗后双阳性细胞有减少的趋势(图6)。因为与21日龄对照n0-STZ大鼠观察到的水平相比，在n0-STZ/ghrelin大鼠中pdx-1、胰岛素和磷酸化组蛋白H3的表达显著增加，这表明在用STZ处理的新生大鼠中ghrelin刺激了β细胞的再生和复制。
实施例3
因为在实施例1和实施例2中证实了大鼠ghrelin的效应，接下来使用与实施例1中同样的新生大鼠STZ模型研究了来自人的ghrelin(在本文后面称为人ghrelin，序列No.1)的效应。人ghrelin与大鼠ghrelin有两个氨基酸的不同。
1.材料和方法
从Charles River购买的雌性怀孕Sprague Dawley大鼠被允许自由接近自来水和标准的大鼠颗粒饲料(CRF-1，Oriental Yeast Co.，Ltd.)，并允许自然分娩。设置了下面三个实验组：对照组，其中大鼠在出生后立即接受单次的柠檬酸缓冲液腹膜内注射；STZ-媒介组，其中大鼠接受单次的STZ腹膜内注射，然后从出生第2天后每天两次皮下给药载体(5％甘露醇溶液)持续七天；以及STZ-人ghrelin组，其中大鼠接受单次的STZ腹膜内注射，然后从出生第2天后起每天两次皮下注射人ghrelin(序列No.1，100μg/kg体重)持续7天。
STZ的制备和给药如实施例1中的描述。在第二天用Pretest 3aII(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)检测每只雄性新生大鼠的尿糖。只有那些出生后第二天就有糖尿的大鼠(用Pretest3aII测试为3+)被包含在下面的研究中。大鼠在出生后第20天的晚上断奶。在出生后第八周(第57天)在清醒状态下从尾静脉收集血液样品，测量血浆葡萄糖和胰岛素浓度。此外，在出生后第九周(第62天或63天)测量体重后，在通过腹膜内注射戊巴比妥钠(50mg/kg)麻醉后从腹主动脉收集血液样品。取出整个胰腺并称重。然后将胰腺分为两片并保存用于胰岛素含量测定。血液样品立即在4℃下离心以制备血浆样品，并保存在-80℃下直到测量葡萄糖和胰岛素浓度。葡萄糖浓度使用GlucoseCII-test Wako(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)测量，胰岛素浓度使用高灵敏度的胰岛素测量试剂盒(Morinaga Institute of BiologicalScience，Inc.)测量。
2.结果
研究了在给药STZ后立即给药7天人ghrelin在第八周时(禁食4小时后)对血浆葡萄糖和胰岛素浓度的影响。结果显示在表3中。在媒介组中与对照组相比血浆葡萄糖浓度显著增加，而在STZ-人ghrelin组中葡萄糖浓度轻微增加，与对照组中相比没有显著的不同。另一方面，在这些组间血浆胰岛素浓度没有显著差别。
表3
  对照   STZ-媒介   STZ-人ghrelin
  血浆葡萄糖(mg/dL)   116.0±1.7(8)   330.4±26.5(9) *1   222.1±10.5(8)
  血浆胰岛素(ng/mL)   2.44±0.12(8)   2.07±0.15(9)   2.73±0.15(8)
每个值是平均值±SE(大鼠的数量)
*1：P＜0.05；与对照组相比(Dunnett’s多次对比检验)
然后分析了第九周时的体重、胰腺重量和胰腺中的胰岛素含量。体重和胰腺重量的结果显示在图7中。尽管在STZ-媒介组中体重明显低于对照组，在STZ-人ghrelin组中体重的降低被抑制了，其体重与对照组中的相当。与对照组相比，STZ-媒介组显示出稍微低的胰腺重量值。另一方面，在STZ-人ghrelin组中胰腺重量明显高于STZ-媒介组。
因为在STZ-人ghrelin组中显示胰腺重量增加了，因此比较了胰腺中的胰岛素含量。将胰腺分开获得了两个样品——脾侧样品和肠侧样品，从每个样品的胰岛素含量计算出胰腺中的胰岛素含量并进行分析。结果显示在表4中。在STZ-媒介组中，与对照组相比，从两个位点计算的胰腺中胰岛素含量明显降低。尽管STZ-人ghrelin组中的胰岛素含量也明显低于对照组，其含量仍大约是STZ-媒介组中的两倍。
表4
  对照   STZ-载体   STZ-人ghrelin
  胰岛素含量(脾侧)(μg/胰腺) 454.5±31.6(8) 67.1±8.9(9) *1 120.9±14.1(8) *1
  胰岛素含量(肠侧)(μg/胰腺) 309.9±25.8(7) 29.4±3.2(9) *1 63.0±6.7(8) *1
每个值是平均值±SE(大鼠的数量)
*1：P＜0.05；与对照组相比(Dunnett’s多次对比检验)
从上面的结果可以发现，在新生STZ模型中给药STZ后立即用人ghrelin治疗抑制了成年状态下的高血糖和体重的降低。因为同时也显示出胰腺重量的增加和抑制胰腺中胰岛素含量降低的趋势，这表明，正如实施例1中使用大鼠ghrelin所显示的那样，在出生后立即给药STZ所破坏的胰腺β细胞通过给药人ghrelin而再生和胰岛素的生产得到了部分维持，这可能对抑制高血糖有所贡献。
实施例4
因为ghrelin被认为是通过GHS-R表现出其生理功能，ghrelin(生长激素促分泌素，在本文后面称为GHS化合物)之外的GHS-R刺激化合物可能也象ghrelin一样能够促进β细胞的再生并抑制高血糖症或糖尿病的发展。因此，接下来使用新生STZ模型研究了GHS化合物的功能。尽管已经知道多种肽类和非肽类化合物可以作为GHS化合物，在本实施例中使用了肽类GHS化合物GHRP-2(Ala-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2，Drugs of the Future30，pp124-127，2005，CAS No.158861-67-7)来进行研究。
1.材料和方法
实验材料、实验方法和评估方法与实施例2中相同。作为试验物，100μg/kg的GHRP-2从出生第2天起每天两次通过皮下给药(STZ-GHRP-2组)持续7天。
2.结果
第八周时(在禁食4小时后)研究了出生后早期给药GHRP-2对血浆葡萄糖和胰岛素浓度的影响。结果显示在表6中。在STZ-媒介组中与对照组相比血浆葡萄糖浓度显著增加，而在STZ-GHRP-2组中增加是中等的，其水平明显低于STZ-媒介组。另一方面，在这些组中血浆胰岛素浓度没有显著差异。
表5
  对照   STZ-媒介   STZ-GHRP-2
  血浆葡萄糖(mg/dL)   116.0±1.7(8)   281.6±18.5(12) *1   145.5±4.1(12)#1
  血浆胰岛素(ng/mL)   2.44±0.12(8)   2.16±0.10(12)   1.89±0.07(12)
每个值是平均值±SE(大鼠的数量)
*1：P＜0.05；与对照组相比。#1：P＜0.05；与STZ-媒介组相比。(Dunnett’s多次对比检验)
然后分析了第九周时的体重、胰腺重量和胰腺中的胰岛素含量。体重和胰腺重量的结果显示在图8中。尽管在STZ-媒介组中体重明显低于对照组，在STZ-GHRP-2组中体重的降低被抑制了，其体重与对照组中没有显著区别。与对照组相比，STZ-媒介组显示出胰腺重量降低的趋势。另一方面，在STZ-GHRP-2组中胰腺重量高于STZ-媒介组。
我们比较了胰腺中的胰岛素含量。将胰腺分开获得了两个样品——脾侧样品和肠侧样品，从每个样品的胰岛素含量计算出胰腺中的胰岛素含量，结果显示在表6中。在STZ-媒介组中，与对照组相比，两个位点中的每个的胰腺胰岛素含量明显降低。STZ-GHRP-2组的胰岛素含量也明显低于对照组，但是其含量高于STZ-媒介组，这显示出了维持胰岛素生产能力的趋势。
表6
  对照   STZ-载体   STZ-GHRP-2
  胰岛素含量(脾侧)(μg/胰腺) 454.5±31.6(8) 96.3±7.6(12) *1 146.8±10.9(12) *1
  胰岛素含量(肠侧)(μg/胰腺) 309.9±25.8(7) 62.1±5.6(12) *1 81.7±4.6(12) *1
每个值是平均值±SE(案例的数量)
*1：P＜0.05；与对照组相比(Dunnett’s多次对比检验)
如上所述，除了大鼠ghrelin和人ghrelin之外，具有GHS-R结合和活化能力的GHRP-2通过早期给药到新生STZ模型，也显示出具有增加胰岛素生产能力的趋势，并在成年阶段抑制高血糖的发生。因此，表明ghrelin对β细胞再生和高血糖症抑制的效应是通过GHS-R介导的，具有GHS-R结合和活化能力的化合物(GHS)也有相似的效果。
如上所述，我们证实了在新生STZ模型中大鼠ghrelin、人ghrelin和GHS化合物显示出对成年阶段高血糖症的改善。接下来，使用另一个高血糖症模型研究了人ghrelin的效果。
实施例5
已经知道西方风格的高脂肪饮食是肥胖症或糖尿病发生的一种原因。此外，脂肪酸例如亚油酸是GRP40——一种G蛋白偶联受体——的配体，已经报道GPR40被脂肪酸的活化促进了胰腺β细胞的葡萄糖反应性胰岛素分泌(Itoh Y等Nature422，pp173-176，2003)。另一方面，已经显示出尽管短期的脂肪酸摄取促进了胰岛素的分泌，但长期暴露降低了胰腺的胰岛素分泌能力和胰岛素含量(Steneberg P等CellMetab 1，pp245-258，2005)。因此，对小鼠保持了含有亚油酸的高脂肪酸饮食，以研究人ghrelin对胰岛素分泌和血糖浓度的影响。
1.材料和方法
雄性Crj：CD1(ICR)小鼠(Charles River Japan)被允许自由接近自来水和标准的小鼠颗粒饲料(CRF-1，Oriental Yeast Co.，Ltd.)(光照时间从21点到9点钟)。正常的对照小鼠被保持在这种条件下(正常饮食，ND组)。高脂肪酸饮食组(高脂肪饮食，HFD组)从出生后第四周开始被允许自由取食5g CRF-1(粉末)与1g亚油酸的混合物作为高脂肪酸饮食。作为试验物，从开始摄取高脂肪酸饮食的那天起每天两次(假日每天一次)给药媒介(5％甘露醇溶液)(HFD-媒介组)或300μg/kg人ghrelin(HFD-ghrelin组)，共进行大约7周。检测开始给药试验物之后体重的变化和即时(ad lib)血糖水平。此外，从开始给药试验物的第50天起将小鼠禁食过夜，然后在次日快速摄取亚油酸(1mL/kg，腹膜内给药)，在1小时后测量血浆葡萄糖和血浆胰岛素浓度。血糖值使用Antsense II(Horiba，Ltd.)测量，血浆葡萄糖浓度和胰岛素浓度分别使用Glucose CII-test Wako(Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.)和Lebis胰岛素试剂盒(小鼠用TMB)(Shibayagi Co.Ltd.)测量。
2.结果
研究了在高脂肪酸饮食喂养的小鼠中给药人ghrelin对体重和血糖水平的影响。图9显示了给药后第42天时的体重和给药后第43天时的即时血糖水平。与ND组相比，HFD-媒介组的小鼠体重较高，在HFD-ghrelin组中进一步增加。此外，HFD-媒介组的血糖水平明显高于ND组。另一方面，与HFD-媒介组相比，HFD-ghrelin组的血糖水平趋于降低，与ND组相比没有显著的差别。因此，给药ghrelin显示出降低了高脂肪酸饮食对高血糖的诱导。
接下来，分析了急性摄取亚油酸后高脂肪酸饮食喂养的小鼠的血浆胰岛素浓度和血浆葡萄糖浓度的变化。
图10显示了在用正常饮食或高脂肪酸饮食喂养、并通过腹膜内注射了1mL/kg亚油酸的小鼠中的血浆胰岛素浓度(A)和血浆葡萄糖浓度(B)。与ND组相比，在HFD-媒介组中在摄取亚油酸后血浆胰岛素浓度平均降低到最多三分之一的水平，表明胰岛素分泌能力被长期的高脂肪酸饮食摄入所扰乱。HFD-ghrelin组中的胰岛素浓度比HFD-媒介组中的高，但是与ND组相比没有显著的区别(图10A)。另一方面，尽管3个组在摄入亚油酸之前血糖葡萄糖浓度几乎没有区别(ND组：138±5，HFD-媒介组：146±12，HFD-ghrelin组：141±5mg/dL，每个组为8只小鼠的平均值±标准误差)，但给药亚油酸1小时后在所有组中的血浆葡萄糖浓度与给药前相比都显著增加了(P＜0.05，成对t检验)。给药亚油酸后血浆葡萄糖浓度的增加在HFD-媒介组中比ND组中更明显。
在HFD-ghrelin组中摄取亚油酸后的的血浆葡萄糖浓度与HFD-媒介组相比趋于较低，但是与ND组相比没有显著的差别(图10B)。
如上所述，重复地给药人ghrelin显示出在摄取高脂肪酸饮食的小鼠中抑制了血糖水平的增加。在摄取高脂肪酸饮食的情况下，观察到了亚油酸诱导的胰岛素分泌的减少，这种情况在给药人ghrelin的组中趋于改善。因此，表明人ghrelin改善了β细胞机能障碍、也就是说由于高脂肪酸饮食引起的胰岛素分泌的不足，因此抑制了高血糖症的发展。
工业实用性
本发明的药物具有促进产生和分泌胰岛素的胰腺β细胞的新生或再生的功能，以及促进胰腺β细胞中胰岛素产生的功能，因此能够在由于胰腺β细胞的衰弱或死亡导致的胰岛素不分泌或分泌很低所引起的高血糖症、或由于胰腺β细胞中胰岛素分泌减少所引起的高血糖症中，通过促进产生和分泌胰岛素的胰腺β细胞的新生或再生来抑制或治疗高血糖症。此外，本发明的药物也可以用作用于具有胰岛素产生功能的胰腺β细胞的再生疗法的药物。因为按照本发明，能够实现产生和分泌胰岛素的胰腺β细胞的新生或再生，因此具有一种优点，即高血糖症的一种基本原因、即胰腺β细胞的缺乏和细胞中胰岛素的生产或分泌的不足，可以得到改善。
序列表
<110>国立大学法人京都大学(Kyoto University)
阿斯比奥制药株式会社(Asubio Pharma Co.Ltd.)
<120>胰腺β细胞再生的促进剂以及在胰腺β细胞中生产胰岛素的促进剂(Agent for enhancing
regeneration of pancreatic β cells and
agent for enhancing production of insulin in pancreatic β cells)
<130>SCT073485-47
<160>27
<210>1
<211>28
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<221>PEPTIDE
<222>(1)..(28)
<223>Amino acid sequence for human endogenous peptides of growth hormone secretagogue
<400>1
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Arg Val Gln Gln Arg Lys
1               5                   10                  15
Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg
            20                  25
<210>2
<211>27
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<221>PEPTIDE
<222>(1)..(27)
<223>Amino acid sequence for human endogenous peptides(27amino acids)of growth hormone
secretagogue
<400>2
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Arg Val Gln Arg Lys Glu
1               5                   10                  15
Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg
            20                  25
<210>3
<211>28
<212>PRT
<213>Rattus norvegicus
<220>
<221>PEPTIDE
<222>(1)..(28)
<223>Amino acid sequence for rat endogenous peptides of growth hormone secretagogue
<400>3
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys
1               5                   10                  15
Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg
            20                  25
<210>4
<211>27
<212>PRT
<213>Rattus norvegicus
<220>
<221>PEPTIDE
<222>(1)..(27)
<223>Amiino acid sequence for rat endogenous peptides of growth hormone secretagogue
<400>4
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Arg Lys Glu
1               5                   10                  15
Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg
            20                  25
<210>5
<211>28
<212>PRT
<213>Mus musculus
<220>
<221>PEPTIDE
<222>(1)..(28)
<223>Amino acid sequence for mouse endogenous peptides of growth hormone secretagogue
<400>5
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys
1               5                   10                  15
Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg
            20                  25
<210>6
<211>28
<212>PRT
<213>Sus scrofa
<220>
<221>PEPTIDE
<222>(1)..(28)
<223>Amino acid sequence for porcine endogenous peptides of growth hormone secretagogue
<400>6
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Val Gln Gln Arg Lys
1               5                   10                  15
Glu Ser Lys Lys Pro Ala Ala Lys Leu Lys Pro Arg
            20                  25
<210>7
<211>27
<212>PRT
<213>Bos taurus
<220>
<221>PEPTIDE
<222>(1)..(27)
<223>Amino acid sequence for bovine endogenous peptides(27amino acids)of growth hormone
secretagogue
<400>7
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Leu Gln Arg Lys Glu
1               5                   10                  15
Ala Lys Lys Pro Ser Gly Arg Leu Lys Pro Arg
            20                  25
<210>8
<211>27
<212>PRT
<213>Ovis aries
<220>
<221>PEPTIDE
<222>(1)..(27)
<223>Amino acid sequence for ovine endogenous peptides(27amino acids)of growth hormone
secretagogue
<400>8
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Leu Gln Arg Lys Glu
1               5                   10                  15
Pro Lys Lys Pro Ser Gly Arg Leu Lys Pro Arg
            20                  25
<210>9
<211>28
<212>PRT
<213>Canis familiaris
<220>
<221>PEPTIDE
<222>(1)..(28)
<223>Amino acid sequence for dog endogenous peptides of growth hormone secretagogue
<400>9
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Leu Gln Gln Arg Lys
1               5                   10           15
Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg
            20                  25
<210>10
<211>21
<212>PRT
<213>Anguilla japonica
<220>
<221>PEPTIDE
<222>(1)..(21)
<223>Amino acid sequence for eel endogenous peptides of growth hormone secretagogue.Thispeptide is amidated at
C-terminus.
<400>10
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Ser Gln Arg Pro Gln Gly Lys Asp Lys
1               5                   10                  15
Lys Pro Pro Arg Val
            20
<210>11
<211>23
<212>PRT
<213>Oncorhynchus mykiss
<220>
<221>PEPTIDE
<222>(1)..(23)
<223>Amino acid sequence for rainbow trout endogenous peptides(23amino acids)of growth
hormone secretagogue.This
peptide is amidated at C-terminus.
<400>11
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Ser Gln Lys Pro Gln Val Arg Gln Gly
1               5                   10                  15
Lys Gly Lys Pro Pro Arg Val
            20
<210>12
<211>20
<212>PRT
<213>Oncorhynchus mykiss
<220>
<221>PEPTIDE
<222>(1)..(20)
<223>Amino acid sequence for rainbow trout endogenous peptides(20amino acids)of growth
hormone secretagogue.This
peptide is amidated at C-terminus.
<400>12
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Ser Gln Lys Pro Gln Gly Lys Gly Lys
1               5                   10                  15
Pro Pro Arg Val
            20
<210>13
<211>24
<212>PRT
<213>Gallus domesticus
<220>
<221>PEPTIDE
<222>(1)..(24)
<223>Amino acid sequence for chicken endogenous peptides of growth hormone secretagogue
<400>13
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Thr Tyr Lys Asn Ile Gln Gln Gln Lys
1               5                   10                  15
Gly Thr Arg Lys Pro Thr Ala Arg
            20
<210>14
<211>24
<212>PRT
<213>Gallus domesticus
<220>
<221>PEPTIDE
<222>(1)..(24)
<223>Amino acid sequence for chicken endogenous peptides of growth hormone secretagogue
<400>14
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Thr Tyr Lys Asn Ile Gln Gln Gln Lys
1               5                   10                  15
Asp Thr Arg Lys Pro Thr Ala Arg
            20
<210>15
<211>26
<212>PRT
<213>Gallus domesticus
<220>
<221>PEPTIDE
<222>(1)..(26)
<223>Amino acid sequence for chicken endogenous peptides of growth hormone secretagogue
<400>15
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Thr Tyr Lys Asn Ile Gln Gln Gln Lys
1               5                   10                  15
Asp Thr Arg Lys Pro Thr Ala Arg Leu His
            20                  25
<210>16
<211>27
<212>PRT
<213>Rana catesbeiana
<220>
<221>PEPTIDE
<222>(1)..(27)
<223>Amino acid sequence for frog endogenous peptides of growth hormone secretagogue
<400>16
Gly Leu Thr Phe Leu Ser Pro Ala Asp Met Gln Lys Ile Ala Glu Arg
1               5                   10                  15
Gln Ser Gln Asn Lys Leu Arg His Gly Asn Met
            20                  25
<210>17
<211>28
<212>PRT
<213>Rana catesbeiana
<220>
<221>PEPTIDE
<222>(1)..(28)
<223>Amino acid sequence for frog endogenous peptides of growth hormone secretagogue
<400>17
Gly Leu Thr Phe Leu Ser Pro Ala Asp Met Gln Lys Ile Ala Glu Arg
1               5                   10                  15
Gln Ser Gln Asn Lys Leu Arg His Gly Asn Met Asn
            20                  25
<210>18
<211>20
<212>PRT
<213>Tilapia nilotica
<220>
<221>PEPTIDE
<222>(1)..(20)
<223>Amino acid sequence for tilapia endogenous peptides of growth hormone secretagogue
This peptide is amidated at
C-terminus.
<400>18
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Ser Gln Lys Pro Gln Asn Lys Val Lys
1               5                   10                  15
Ser Ser Arg Ile
            20
<210>19
<211>22
<212>PRT
<213>Silurus asotus
<220>
<221>PEPTIDE
<222>(1)..(22)
<223>Amino acid sequence for catfish endogenous peptides of growth hormone secretagogue.
This peptide is amidated at
C-terminus.
<400>19
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Thr Gln Lys Pro Gln Asn Arg Gly Asp
1               5                   10                  15
Arg Lys Pro Pro Arg Val
            20
<210>20
<211>23
<212>PRT
<213>Silurus asotus
<220>
<221>PEPTIDE
<222>(1)..(23)
<223>Amino acid sequence for catfish endogenous peptides of growth hormone secretagogue
<400>20
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Thr Gln Lys Pro Gln Asn Arg Gly Asp
1               5                   10                  15
Arg Lys Pro Pro Arg Val Gly
            20
<210>21
<211>28
<212>PRT
<213>Equus caballus
<220>
<221>PEPTIDE
<222>(1)..(28)
<223>Amino acid sequence for equine endogenous peptides of growth hormone secretagogue
<400>21
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His His Lys Val Gln His Arg Lys
1               5                   10                  15
Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Lys Pro Arg
            20                  25
<210>22
<211>21
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>1
tagaccatca gcaagcaggt c   21
<210>23
<211>19
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>2
cacaccaggt acagagcct      19
<210>24
<211>22
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>3
cacttggtgg aagctctcta cc     22
<210>25
<211>23
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>4
gacagggtag tggtgggcct agt    23
<210>26
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>5
aggaggtgca tacgcagcag        20
<210>27
<211>22
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>6
gaggccggga gatgtatttg tt     22

Claims (42)

1.用于抑制或治疗高血糖症的药物组合物，其中作为有效成分包含选自以下的肽或其可药用的盐：(1)通过与生长激素促分泌素受体相结合而具有增加细胞内钙离子浓度的活性的肽或非肽类化合物；(2)具有序列No.1所述的氨基酸序列的肽，其中氨基末端的第三个氨基酸残基是一个修饰的氨基酸残基，在该氨基酸残基侧链上引入了脂肪酸；以及(3)具有序列No.1所述的氨基酸序列的肽，其中在氨基末端的第5个到第28个氨基酸的氨基酸序列中具有一个到几个氨基酸的缺失、取代和/或添加，其中氨基末端的第三个氨基酸残基是一个修饰的氨基酸残基，在该氨基酸残基侧链上引入了脂肪酸，以及该肽通过与生长激素促分泌素受体相结合而具有增加细胞内钙离子浓度的活性。
2.权利要求1的药物组合物，其中的高血糖症是由于胰腺β细胞的衰弱或死亡导致的胰岛素不分泌或分泌很少所引起的，或由胰腺β细胞中胰岛素的分泌减少所引起的。
3.权利要求2的药物组合物，其中的高血糖症是由于胰腺β细胞的衰弱或死亡导致的胰岛素不分泌或分泌很少所引起的。
4.权利要求2的药物组合物，其中的高血糖症是由胰腺β细胞中胰岛素的分泌减少所引起的。
5.权利要求1到4任何一个的药物组合物，其中的高血糖症的ΔIRI/ΔBG值不超过0.4。
6.权利要求1到5任何一个的药物组合物，其中的肽具有序列No.1所述的氨基酸序列，并且氨基末端的第三个位置上的丝氨酸残基是修饰的氨基酸残基，在残基的侧链羟基基团上引入了脂肪酸。
7.权利要求6的药物组合物，其中的肽具有序列No.1所述的氨基酸序列，并且氨基末端的第三个位置上的丝氨酸残基的侧链羟基基团被正辛酰基基团所酰化。
8.用于促进胰腺β细胞的新生或再生的药物组合物，其中作为有效成分包含选自以下的肽或其可药用的盐：(1)通过与生长激素促分泌素受体相结合而具有增加细胞内钙离子浓度的活性的肽或非肽类化合物；(2)具有序列No.1所述的氨基酸序列的肽，其中氨基末端的第三个氨基酸残基是一个修饰的氨基酸残基，在该氨基酸残基侧链上引入了脂肪酸；以及(3)具有序列No.1所述的氨基酸序列的肽，其中在氨基末端的第5个到第28个氨基酸的氨基酸序列中具有一个到几个氨基酸的缺失、取代和/或添加，其中氨基末端的第三个氨基酸残基是一个修饰的氨基酸残基，在该氨基酸残基侧链上引入了脂肪酸，以及该肽通过与生长激素促分泌素受体相结合而具有增加细胞内钙离子浓度的活性。
9.权利要求8的药物组合物，其中的肽具有序列No.1所述的氨基酸序列，并且氨基末端的第三个位置上的丝氨酸残基是修饰的氨基酸残基，在残基的侧链羟基基团上引入了脂肪酸。
10.权利要求9的药物组合物，其中的肽具有序列No.1描述的氨基酸序列，并且氨基末端的第三个位置上的丝氨酸残基的侧链羟基基团被正辛酰基基团所酰化。
11.用于促进胰腺β细胞中胰岛素产生的药物组合物，其中作为有效成分包含选自以下的肽，或其可药用的盐：(1)通过与生长激素促分泌素受体相结合而具有增加细胞内钙离子浓度的活性的肽或非肽类化合物；(2)具有序列No.1所述的氨基酸序列的肽，其中氨基末端的第三个氨基酸残基是一个修饰的氨基酸残基，在该氨基酸残基侧链上引入了脂肪酸；以及(3)具有序列No.1所述的氨基酸序列的肽，其中在氨基末端的第5个到第28个氨基酸的氨基酸序列中具有一个到几个氨基酸的缺失、取代和/或添加，其中氨基末端的第三个氨基酸残基是一个修饰的氨基酸残基，在该氨基酸残基侧链上引入了脂肪酸，以及该肽通过与生长激素促分泌素受体相结合而具有增加细胞内钙离子浓度的活性。
12.权利要求11的药物组合物，其中的肽具有序列No.1所述的氨基酸序列，并且氨基末端的第三个位置上的丝氨酸残基是修饰的氨基酸残基，在残基的侧链羟基基团上引入了脂肪酸。
13.权利要求12的药物组合物，其中的肽具有序列No.1所述的氨基酸序列，并且氨基末端的第三个位置上的丝氨酸残基的侧链羟基基团被正辛酰基基团所酰化。
14.抑制或治疗高血糖症的方法，包括给表现出高血糖症的个体给药选自以下的肽或其可药用的盐的步骤：(1)通过与生长激素促分泌素受体相结合而具有增加细胞内钙离子浓度的活性的肽或非肽类化合物；(2)具有序列No.1所述的氨基酸序列的肽，其中氨基末端的第三个氨基酸残基是一个修饰的氨基酸残基，在该氨基酸残基侧链上引入了脂肪酸；以及(3)具有序列No.1所述的氨基酸序列的肽，其中在氨基末端的第5个到第28个氨基酸的氨基酸序列中具有一个到几个氨基酸的缺失、取代和/或添加，其中氨基末端的第三个氨基酸残基是一个修饰的氨基酸残基，在该氨基酸残基侧链上引入了脂肪酸，以及该肽通过与生长激素促分泌素受体相结合而具有增加细胞内钙离子浓度的活性。
15.权利要求14的方法，其中的高血糖症是由于胰腺β细胞的衰弱或死亡导致的胰岛素不分泌或分泌很少所引起的，或由胰腺β细胞中胰岛素的分泌减少所引起的。
16.权利要求15的方法，其中的高血糖症是由于胰腺β细胞的衰弱或死亡导致的胰岛素不分泌或分泌很少所引起的。
17.权利要求15的方法，其中的高血糖症是由胰腺β细胞中胰岛素的分泌减少所引起的。
18.权利要求14到17任何一个的方法，其中的高血糖症的ΔIRI/ΔBG值不超过0.4。
19.权利要求14到18任何一个的方法，其中的肽具有序列No.1所述的氨基酸序列，并且氨基末端的第三个位置上的丝氨酸残基是修饰的氨基酸残基，在残基的侧链羟基基团上引入了脂肪酸。
20.权利要求19的方法，其中的肽具有序列No.1所述的氨基酸序列，并且氨基末端的第三个位置上的丝氨酸残基的侧链羟基基团被正辛酰基基团所酰化。
21.促进胰腺β细胞的新生或再生的方法，包括给个体给药选自下列的肽或其可药用的盐的步骤：(1)通过与生长激素促分泌素受体相结合而具有增加细胞内钙离子浓度的活性的肽或非肽类化合物；(2)具有序列No.1所述的氨基酸序列的肽，其中氨基末端的第三个氨基酸残基是一个修饰的氨基酸残基，在该氨基酸残基侧链上引入了脂肪酸；以及(3)具有序列No.1所述的氨基酸序列的肽，其中在氨基末端的第5个到第28个氨基酸的氨基酸序列中具有一个到几个氨基酸的缺失、取代和/或添加，其中氨基末端的第三个氨基酸残基是一个修饰的氨基酸残基，在该氨基酸残基侧链上引入了脂肪酸，以及该肽通过与生长激素促分泌素受体相结合而具有增加细胞内钙离子浓度的活性。
22.权利要求21的方法，其中的肽具有序列No.1所述的氨基酸序列，并且氨基末端的第三个位置上的丝氨酸残基是修饰的氨基酸，在残基的侧链羟基基团上引入了脂肪酸。
23.权利要求22的方法，其中的肽具有序列No.1所述的氨基酸序列，并且氨基末端的第三个位置上的丝氨酸残基的侧链羟基基团被正辛酰基基团所酰化。
24.促进胰腺β细胞中胰岛素产生的方法，包括给个体给药选自以下的肽或其可药用的盐的步骤：(1)通过与生长激素促分泌素受体相结合而具有增加细胞内钙离子浓度的活性的肽或非肽类化合物；(2)具有序列No.1所述的氨基酸序列的肽，其中氨基末端的第三个氨基酸残基是一个修饰的氨基酸残基，在该氨基酸残基侧链上引入了脂肪酸；以及(3)具有序列No.1所述的氨基酸序列的肽，其中在氨基末端的第5个到第28个氨基酸的氨基酸序列中具有一个到几个氨基酸的缺失、取代和/或添加，其中氨基末端的第三个氨基酸残基是一个修饰的氨基酸残基，在该氨基酸残基侧链上引入了脂肪酸，以及该肽通过与生长激素促分泌素受体相结合而具有增加细胞内钙离子浓度的活性。
25.权利要求24的方法，其中的肽具有序列No.1所述的氨基酸序列，并且氨基末端的第三个位置上的丝氨酸残基是修饰的氨基酸，在残基的侧链羟基基团上引入了脂肪酸。
26.权利要求25的方法，其中的肽具有序列No.1所述的氨基酸序列，并且氨基末端的第三个位置上的丝氨酸残基的侧链羟基基团被正辛酰基基团所酰化。
27.应用肽或非肽类化合物生产药物组合物以抑制或治疗高血糖症，其中
肽选自：(1)通过与生长激素促分泌素受体相结合而具有增加细胞内钙离子浓度的活性的肽或非肽类化合物；(2)具有序列No.1所述的氨基酸序列的肽，其中氨基末端的第三个氨基酸残基是一个修饰的氨基酸残基，在氨基酸残基侧链上引入了脂肪酸；以及(3)具有序列No.1所述的氨基酸序列的肽，其中在氨基末端的第5个到第28个氨基酸的氨基酸序列中具有一个到几个氨基酸的缺失、取代和/或添加，其中氨基末端的第三个氨基酸残基是一个修饰的氨基酸残基，在氨基酸残基侧链上引入了脂肪酸，该肽通过与生长激素促分泌素受体相结合而具有增加细胞内钙离子浓度的活性。
28.权利要求27的应用，其中的高血糖症是由于胰腺β细胞的衰弱或死亡导致的胰岛素不分泌或分泌很少所引起的，或由胰腺β细胞中胰岛素的分泌减少所引起的。
29.权利要求28的应用，其中的高血糖症是由于胰腺β细胞的衰弱或死亡导致的胰岛素不分泌或分泌很少所引起的。
30.权利要求28的应用，其中的高血糖症是由胰腺β细胞中胰岛素的分泌减少所引起的。
31.权利要求27到30任何一个的应用，其中的高血糖症的ΔIRI/ΔBG值不超过0.4。
32.权利要求27到31任何一个的应用，其中的肽具有序列No.1所述的氨基酸序列，并且氨基末端的第三个位置上的丝氨酸残基是修饰的氨基酸残基，在残基的侧链羟基基团上引入了脂肪酸。
33.权利要求32的应用，其中的肽具有序列No.1所述的氨基酸序列，并且氨基末端的第三个位置上的丝氨酸残基的侧链羟基基团被正辛酰基基团所酰化。
34.应用肽或非肽类化合物生产药物组合物以促进胰腺β细胞的新生或再生，其中
肽选自：(1)通过与生长激素促分泌素受体相结合而具有增加细胞内钙离子浓度的活性的肽或非肽类化合物；(2)具有序列No.1所述的氨基酸序列的肽，其中氨基末端的第三个氨基酸残基是一个修饰的氨基酸残基，在该氨基酸残基侧链上引入了脂肪酸；以及(3)具有序列No.1所述的氨基酸序列的肽，其中在氨基末端的第5个到第28个氨基酸的氨基酸序列中具有一个到几个氨基酸的缺失、取代和/或添加，其中氨基末端的第三个氨基酸残基是一个修饰的氨基酸残基，在该氨基酸残基侧链上引入了脂肪酸，以及该肽通过与生长激素促分泌素受体相结合而具有增加细胞内钙离子浓度的活性。
35.权利要求34的应用，其中的肽具有序列No.1所述的氨基酸序列，并且氨基末端的第三个位置上的丝氨酸残基是修饰的氨基酸残基，在残基的侧链羟基基团上引入了脂肪酸。
36.权利要求35的应用，其中的肽具有序列No.1所述的氨基酸序列，并且氨基末端的第三个位置上的丝氨酸残基的侧链羟基基团被正辛酰基基团所酰化。
37.应用肽或非肽类化合物生产药物组合物以促进胰腺β细胞中胰岛素的生产，其中
肽选自：(1)通过与生长激素促分泌素受体相结合而具有增加细胞内钙离子浓度的活性的肽或非肽类化合物；(2)具有序列No.1所述的氨基酸序列的肽，其中氨基末端的第三个氨基酸残基是一个修饰的氨基酸残基，在该氨基酸残基侧链上引入了脂肪酸；以及(3)具有序列No.1所述的氨基酸序列的肽，其中在氨基末端的第5个到第28个氨基酸的氨基酸序列中具有一个到几个氨基酸的缺失、取代和/或添加，其中氨基末端的第三个氨基酸残基是一个修饰的氨基酸残基，在该氨基酸残基侧链上引入了脂肪酸，以及该肽通过与生长激素促分泌素受体相结合而具有增加细胞内钙离子浓度的活性。
38.权利要求37的应用，其中的肽具有序列No.1所述的氨基酸序列，并且氨基末端的第三个位置上的丝氨酸残基是修饰的氨基酸残基，在残基的侧链羟基基团上引入了脂肪酸。
39.权利要求38的应用，其中的肽具有序列No.1所述的氨基酸序列，并且氨基末端的第三个位置上的丝氨酸残基的侧链羟基基团被正辛酰基基团所酰化。
40.抑制胰腺β细胞的衰弱、死亡或损耗的方法，包括包括给个体给药选自以下的肽或其可药用的盐的步骤：通过与生长激素促分泌素受体相结合而具有增加细胞内钙离子浓度的活性的肽或非肽类化合物；具有序列No.1所述的氨基酸序列的肽，其中氨基末端的第三个氨基酸残基是一个修饰的氨基酸残基，在该氨基酸残基侧链上引入了脂肪酸；以及具有序列No.1所述的氨基酸序列的肽，其中在氨基末端的第5个到第28个氨基酸的氨基酸序列中具有一个到几个氨基酸的缺失、取代和/或添加，其中氨基末端的第三个氨基酸残基是一个修饰的氨基酸残基，在该氨基酸残基侧链上引入了脂肪酸，以及该肽通过与生长激素促分泌素受体相结合而具有增加细胞内钙离子浓度的活性。
41.权利要求40的方法，其中的肽具有序列No.1所述的氨基酸序列，并且氨基末端的第三个位置上的丝氨酸残基是修饰的氨基酸，在残基的侧链羟基基团上引入了脂肪酸。
42.权利要求41的方法，其中的肽具有序列No.1所述的氨基酸序列，并且氨基末端的第三个位置上的丝氨酸残基的侧链羟基基团被正辛酰基基团所酰化。
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