CN104582796A - 治疗阿尔茨海默病的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本文公开了GHRH肽拮抗剂的组合物，和治疗阿尔茨海默病和其他神经退行性病症的方法。这种化合物可用于治疗，用于保护神经元细胞免于细胞死亡，并用于提高神经元细胞的存活力。

Description

治疗阿尔茨海默病的组合物和方法
B.对相关申请的交叉引用：
本申请要求2012年6月27日提交的临时申请No.61/664,860的优先权，通过引用将其全文合并入本文。
C.政府利益：
本工作得到退伍军人事务部医学研究服务部门，迈阿密大学，米勒医学院，病理和医学系，血液学/肿瘤学学科，南佛罗里达州退伍军人事务基金会的支持进行研究和教育，并且得到L.Austin Weeks捐赠基金会的支持进行泌尿科学研究。本工作还部分得到AUA基金会研究学者计划和AUA东南部拨款的支持。
D.合作研究协议各方：不适用
E.通过引用对所提交光盘中材料的并入：不适用
F.背景技术：不适用
G.发明简述
本公开涉及用于治疗阿尔茨海默病和其他神经退行性病症的组合物和方法。在一个实施方案中，治疗患有阿尔茨海默病的受试者的方法可以包括给药于受试者治疗量的具有SEQ ID NO:1(式I)的氨基酸序列的生长激素释放激素(GHRH)肽拮抗剂。在一些实施方案中，SEQ ID NO:1如下所示：
R1-Tyr1-D-Arg2-Asp3-A4-Ile5-A6-Thr7-A8-Har9-A10-A11-A12-Val13-Leu14-A15-Gln16-A17-Ser18-Ala19-A20-A21-Leu22-Leu23-Gln24-Asp25-Ile26-Nle27-D-Arg28-A29-R2-R3-NH2，
其中R1是PhAc、Nac、Oct、N-Me-Aib、Dca、Ac-Ada、Fer、Ac-Amc、Me-NH-Sub、PhAc-Ada、Ac-Ada-D-Phe、Ac-Ada-Phe、Dca-Ada、Nac、Nac-Ada、Ada-Ada或CH3(CH2)10-CO-Ada；
A4是Ala或Me-Ala；
A6是Cpa或Phe(F)5；
A8是Ala、Pal、Dip或Me-Ala；
A10是FPa5、Tyr(Alk)，其中Alk是Me或Et；
A11是His或Arg；
A12是Lys、Lys(0-11)、Lys(Me)2或Orn；
A15是Abu或Orn；
A17是Leu或Glu；
A20是Har或His；
A21是Lys、Lys(Me)2或Orn；
A29是Har、Arg或Agm；
R2是β-Ala、Amc、Apa、Ada、AE2A、AE4P、ε-Lys(α-NH2)、Agm、或不存在；并且
R3是Lys(Oct)、Ahx或不存在。
在一些实施方案中，GHRH肽拮抗剂具有本文进一步所述的SEQ ID NO:2(式II)的氨基酸序列。
在进一步的实施方案中，用于治疗患有淀粉样蛋白斑沉积的受试者的方法可以包括给药于受试者治疗量的具有SEQ ID NO:1(式I)的氨基酸序列的生长激素释放激素(GHRH)肽拮抗剂。在一些实施方案中，GHRH肽拮抗剂具有本文进一步所述的SEQ ID NO:2(式II)的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，治疗患有神经退行性疾病的受试者的方法可以包括给药于受试者治疗量的具有SEQ ID NO:1(式I)的氨基酸序列的生长激素释放激素(GHRH)肽拮抗剂。在一些实施方案中，GHRH肽拮抗剂具有本文进一步所述的SEQ ID NO:2(式II)的氨基酸序列。神经退行性疾病可以是阿尔茨海默病，老年痴呆，路易体痴呆，帕金森氏病，亨廷顿氏病，肌萎缩性脊髓侧索硬化症，及其组合。在一些实施方案中，神经退行性疾病可以是地中海热，穆-韦二氏综合症(Muckle-Wells syndrome)，特发性骨髓瘤，淀粉样多神经病，淀粉样心肌病，系统性神经炎淀粉样变，淀粉样多神经病，遗传性脑出血伴淀粉样变，唐氏综合症，痒病，克雅氏病(Creutzfeldt-Jacob disease)，库鲁病，格-斯二氏综合症(Gerstamnn-Straussler-Scheinker syndrome)，甲状腺髓样癌，孤立性心房淀粉样变性，透析患者β2-微球蛋白淀粉样变，包涵体肌炎，肌肉萎缩病中β2-淀粉样蛋白沉积，II型糖尿病，及其组合。
在另外的实施方案中，保护神经元细胞免受氧化胁迫的方法可以包括使神经元细胞与具有SEQ ID NO:1(式I)的氨基酸序列的生长激素释放激素(GHRH)肽拮抗剂接触。在一些实施方案中，GHRH肽拮抗剂具有本文进一步所述的SEQ ID NO:2(式II)的氨基酸序列。
在进一步的实施方案中，提高神经元细胞存活力的方法可以包括使神经元细胞与具有SEQ ID NO:1(式I)的氨基酸序列的生长激素释放激素(GHRH)肽拮抗剂接触。在一些实施方案中，GHRH肽拮抗剂具有本文进一步所述的SEQ ID NO:2(式II)的氨基酸序列。
H.附图描述：
图1说明在Morris水迷宫(MWM)实验中，GHRH拮抗剂MIA-690对于5XFAD转基因小鼠的行为参数的进行性改变的效果。通过以2、5和10μg的剂量每日皮下注射GHRH拮抗剂MIA-690共6个月来治疗小鼠。各组的合并标准误差(PSE)如下(A)对照:36.0,MIA-690(2μg):41.2,MIA-690(5μg):33.3,MIA-690(10μg):36.9；(B)对照:21.8,MIA-690(2μg):31.4,MIA-690(5μg):20.6,MIA-690(10μg):16.0；(C)对照:53.1,MIA-690(2μg):63.4,MIA-690(5μg):51.9,MIA-690(10μg):38.0；(D)对照:43.6,MIA-690(2μg):74.6,MIA-690(5μg):45.3,MIA-690(10μg):40.0。根据重复测量一般线性模型分析，*＝相对于对照p<0.05。
图2显示在Morris水迷宫(MWM)实验中，MIA-690对于5XFAD转基因小鼠的探索(probe)参数的进行性改变的效果。通过以2、5和10μg的剂量每日皮下注射GHRH拮抗剂MIA-690共6个月来治疗小鼠。数据以平均值±SEM表示。
图3显示在第一和第六个月期间，在MWM实验的空间采集中，MIA-690对于5XFAD转基因小鼠的行为参数的效果。通过以2、5和10μg的剂量每日皮下注射GHRH拮抗剂MIA-690共6个月来治疗小鼠。各组的合并标准误差(PSE)如下(A)对照:28.32,MIA-690(2μg):44.1,MIA-690(5μg):25.5,MIA-690(10μg):37.6；(B)对照:30.8,MIA-690(2μg):47.4,MIA-690(5μg):25.0,MIA-690(10μg):43.2；(C)对照:20.1,MIA-690(2μg):15.9,MIA-690(5μg):17.6,MIA-690(10μg):28.6；(D)对照:22.0,MIA-690(2μg):16.6,MIA-690(5μg):19.8,MIA-690(10μg):23.5。根据重复测量一般线性模型分析，*＝相对于对照p<0.05。
图4证明超过6个月后MIA-690对于5XFAD转基因小鼠的存活的效果。每条线的数字代表每组的估计平均存活时间。通过以2、5和10μg的剂量每日皮下注射GHRH拮抗剂MIA-690共6个月来治疗小鼠。
图5显示MIA-690对于5XFAD转基因小鼠脑中淀粉蛋白样-β1-42和τ-蛋白积聚的效果。通过以2、5和10μg的剂量每日皮下注射GHRH拮抗剂MIA-690共6个月来治疗小鼠。(*＝相对于对照p<0.05。数据以平均值+/-SEM表示)。
图6显示MIA-690对于HCN-2细胞在存活力、自由基形成、体外酶和介质表达方面的效果。细胞用10μM淀粉样蛋白-β1-42处理，并用10μM淀粉样蛋白-β1-42和三种剂量(10nM,100nM和1μM)的MIA-690组合处理。缩写：ROS：活性氧，GPx：谷胱甘肽过氧化物酶，BDNF：脑源性神经因子。*＝相对于对照p<0.05。数据以平均值+/-SEM表示。
图7证明GHRH拮抗剂肽(MIA-602,MIA-606和MIA-640)对于用淀粉样蛋白-β1-42处理的HCN-2细胞的存活力的效果。分化的HCN-2A神经元细胞用单独的10μM淀粉样蛋白-β1-42处理并用10μM淀粉样蛋白-β1-42与10nM,100nM和1μM的MIA-602,MIA-606和MIA 640的组合处理。处理之后，使用普洛麦格(Promega)Cell TiterAqueous非放射性细胞增殖检测按照供应商的说明测定细胞存活力。在490nm测定吸收水平。数据为对照的百分比(n＝3)。
I.详细描述
本发明不被限制于所述的特定的工艺、组合物或方法，因为这些是可以变化的。本说明书中使用的术语仅仅是为描述特定形式或实施方案的目的，并非是要限制本发明的范围。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语与所属领域的普通技术人员的一般理解具有相同的含义。本文提及的所有出版物都通过引用将其全文合并入本文。由于在先发明，本文没有内容应当被解释为承认本发明不享有比这样的公开更早的日期。
如本文和所附的权利要求中所使用的，单数形式的“一(a,an)”和“这(the)”包括复数引用，除非上下文另有明确规定。因此，例如，提及“抗氧化剂”是提及一种或更多种抗氧化剂以及所属领域技术人员已知的它的等同物等等。
如本文所使用的，术语“约”指所使用的数的数值加或减10％。因此约50％意味着在45％-55％的范围内。
当“给药”与治疗剂结合使用时，指给患者给药治疗剂，所述治疗剂对于其所靶向的组织具有积极效果。本文所述的肽/化合物可以单独给药或与其他药物组合给药(同时或顺序)。例如肽/化合物可以与其他抗癌或抗肿瘤剂组合使用，或者与其他除化疗以外的癌症治疗，如，例如外科手术或放疗组合给药。在一些实施方案中，本文所述的肽/化合物还可以与抗生素组合给药(即作为组合制剂或作为独立制剂)。
本文使用的术语“动物”、“患者”或“受试者”包括，但不限于，人和非人脊椎动物如野生、家养和农场动物。优选地，该术语指人。
对于“药学上可接受的”，它指与制剂中的其他成分相容的并且对于其接受者无毒的载体、稀释剂或赋形剂。
如文本所使用的，术语“治疗剂”指被用于阻止、防治、减轻、预防或改善患者的不希望的状况、疾病和症状的试剂。
组合物的“治疗有效量”或“有效量”是计算以获得所期望效果，即减轻、预防或改善患者的不希望的状况、疾病和症状的预定的量。本方法考虑的活性包括治疗和/或预防性治疗二者，视情况而定。根据本发明被给药以获得治疗和/或预防性治疗效果的肽/化合物或者肽的特定剂量应当，当然，根据病例的相关具体情况，包括，例如，被给药的肽/化合物，给药方式和要被治疗的状况来确定。给药的有销量可以由医生根据相关情况，包括要被治疗的状况，要给药的肽/化合物的选择，和所选择的给药方式确定。本发明的肽/化合物的治疗有效量典型地是这样的量，当其在生理学上耐受的赋形剂组合物中被给药时，其足以在靶向组织中达到有效系统浓度或局部浓度。
一般而言，术语“组织”指相似特化细胞的任何聚集体，它们联合起来行使特定的功能。
如本文所使用的，多肽的“类似物”指由一个或更多个氨基酸残基改变的氨基酸序列。类似物可以具有“保守的”变化，其中取代的氨基酸具有相似的结构或化学性质(例如用异亮氨酸替换亮氨酸)。较少见地，类似物可以具有“非保守的”变化(例如用色氨酸替换甘氨酸)。类似的小变化还可以包括氨基酸缺失或插入，或二者。可以通过使用本领域熟知的计算机程序，例如LASERGENE软件(DNASTAR)来指导确定哪个氨基酸残基可以被取代、插入或缺失，而不破坏生物学活性。
阿尔茨海默病(AD)是一种进行性神经退行性病症，其特征在于认知减退，不可逆的记忆丧失，定向障碍和语言障碍。AD影响10％的65岁以上人群和至少50％的85岁以上人群。已报道在40-50岁的年轻患者中发现AD，但是因为如果不对脑组织进行组织病理学检测的话，很难发现该疾病的存在，因此活体受试者中发病的时间未知。在阿尔茨海默病的发病机理中涉及到几种致病因素。这些因素导致级联过程的激活，其引起神经元的死亡和认知功能的严重减退。这些卧床不起的患者最终死于与呼吸、褥疮和尿潴留相关的并发(inter-current)感染。
AD涉及，在生物化学上，淀粉样前体蛋白(APP)的病理学断裂。APP，在正常情况下，被α-和γ-分泌酶切割并在CNS中参与轴突运输，突触形成和突触修复。由β-位淀粉样前体蛋白-裂解酶(BACE)和γ-分泌酶进行的异常的、顺序的处理导致淀粉样蛋白-β，其具有高度神经毒性。淀粉样蛋白-β的分子，特别是淀粉样蛋白-β1-42类型，易于聚集并在细胞膜积聚，形成被称为“筏(rafts)”的不可溶聚集物。随后，这些聚集物对膜的导电性，Ca2+流通，活性氧(ROS)形成的控制，τ-蛋白装配，轴突运输，和线粒体膜的极性造成损伤。最终，病理性的级联导致Ca2+毒性，凋亡过程的激活，炎症和神经元死亡。这种恶性循环可能由多种引发机制起始，所述引发机制可以追溯到基因或环境因素。单基因形式代表罕见的，早老型或早发型的家族性阿尔茨海默病(FAD)，它的特征通常在于APP或γ-分泌酶早老素亚域基因的常染色体显性突变。基于异常处理或断裂的原因，两种类型的突变促进毒性淀粉样蛋白-β1-42的积聚。
流行病学研究表明阿尔茨海默病和代谢综合症之间的强烈相关性，这证明脂蛋白谱(ApoE4纯合基因型)，高胰岛素血症和II型糖尿病属于最典型的预后因素。衰老会显著改变中枢神经系统(CNS)神经激素、这些内分泌和代谢状况的主要调节子的分泌。与肥胖症，高胰岛素血症和改变的瘦素信号传导相关的促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)，促黄体激素释放激素(LHRH)，和GHRH分泌可能在阿尔茨海默病的发展中起着作用。
帕金森氏病(PD)是一种进行性神经退行性疾病，其特征在于静止性震颤，动作迟缓，肌肉僵硬，和姿势不稳。PD典型地在60岁以后发生，虽然有15％的被诊断患者年龄在50岁以下。PD的家族史是5-10％的被诊断患有该疾病的患者的致病因素，虽然只有1％的病例被显示具有明显的家族性。估计目前有一百五十万美国人患有PD。
路易体痴呆(DLB)是一种进行性脑病，其症状在不同程度的表现之间波动。这些症状包括进行性痴呆，帕金森氏病的活动困难，幻觉，以及增加的对神经松弛药物的敏感性。与AD一样，高龄被视为是DLB的最大的风险因素，其平均发病通常在50-85岁之间。进一步，所有痴呆病例中的20％是由DLB引起的，而且超过50％的PD患者发生“帕金森氏病痴呆”(PDD)，一种类型的DLB。DLB可能单独发生，或者与其他脑部异常一同发生，包括如上所述的AD和PD中涉及的那些脑部异常。
神经退行性变的病因可能还涉及病理学的混合，包括微脉管组分，或脑部灌注、缺损。例如，通常被称做“混合性痴呆”的病症通常包含灌注缺损和淀粉样蛋白斑病理。术语“混合性痴呆”具有多种含义，但该术语通常被用于指AD和血管性痴呆(VaD)的共同存在，特别是在VaD是由脑血管系统中许多微血栓引起的情况下。虽然目前对于混合性痴呆的真正患病率还所知甚少，这种形式的神经退行性变在临床上是重要的，因为AD和VaD的组合对于脑部的影响比对任一种单独的状况的影响更大。症状与AD或VaD或二者组合的症状类似。
脑部淀粉样蛋白斑沉积的发生可能是多种神经退行性疾病或其他状况的特征，包括，但不限于地中海热，穆-韦二氏综合症，特发性骨髓瘤，淀粉样多神经病，淀粉样心肌病，系统性神经炎淀粉样变，淀粉样多神经病，遗传性脑出血伴淀粉样变，唐氏综合症，痒病，克雅氏病，库鲁病，格-斯二氏综合症，甲状腺髓样癌，孤立性心房淀粉样变性，透析患者β2-微球蛋白淀粉样变，包涵体肌炎，肌肉萎缩病中β2-淀粉样蛋白沉积，II型糖尿病，及其组合。
生长激素释放激素(GHRH)是属于神经内分泌和胃肠激素的分泌素/胰高血糖素家族的肽，该家族还包括血管活性肠肽(VIP)，垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)和其他成员。人GHRH(hGHRH)肽由44个氨基酸残基构成。最知名的产生GHRH的部位是下丘脑，但是发现各种外周器官也合成GHRH。hGHRH也由不同来源的人恶性组织(癌)产生，有时是大量地。
GHRH行使多种生理学和病理生理学功能。下丘脑GHRH是内分泌释放激素，其通过垂体上特定的GHRH受体发挥作用，调节垂体生长激素(GH)的分泌。GHRH对于垂体外组织的生理学功能还不太清楚。但是，越来越多的证据表明GHRH在各种癌症中作为自分泌/旁分泌生长因子。GHRH的剪接变体(SV)受体，与垂体中表达的那些不同，已在许多各种不同的人类癌症以及一些正常的外周器官中被描述。在这些受体上可以行使肿瘤自分泌/旁分泌GHRH的作用。GHRH还可以通过与非内分泌组织上的它们可能的GHRH受体结合，独立于GH来发挥作用。此外，剪接变体的受体，该家族的仍未被鉴别的其他受体，都可以作为局部GHRH的靶点。
GHRH拮抗剂已被用于治疗各种病症。GHRH拮抗剂通过间接的内分泌机制以及对肿瘤组织的直接效果来抑制恶性肿瘤的增殖，所述内分泌机制是基于对垂体GH释放的抑制并导致GH和IGF-1的血清水平的下降。GHRH和它的肿瘤剪接变体(SV)受体存在于肺，前列腺，乳腺，卵巢，子宫内膜，胃，肠，胰腺，肾，和骨的人癌上。肿瘤GHRH受体已被证明或怀疑在这些恶性肿瘤中是作为自分泌生长因子。GHRH的拮抗性类似物能够抑制GHRH的刺激活性，并且在体外对癌细胞，以及在体内对肿瘤发挥抗增殖效果。除了对于GHRH的特定肿瘤SV受体之外，VIP受体以及该家族的其他未被鉴别的受体，是GHRH拮抗剂的靶点。
对GHRH肽的各种修饰赋予其拮抗特性。包含残基1-29的GHRH片段，或者GHRH(1-29)，是垂体上生物学活性所必需的最小序列。该片段保留了天然GHRH的50％或更多的效力。许多基于hGH-RH(1-29)NH2肽结构的GHRH的合成类似物已被制备。hGHRH(1-29)NH2(SEQ ID NO:3)具有下述氨基酸序列：
Tyr-Ala-Asp-Ala-lle5-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr10-Arg-Lys-Val-Leu-Gly15-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg20-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp25-Ile-Met-Ser-Arg29-NH2(SEQ ID NO:3)。
GHRH拮抗剂可以包含其中进行了氨基酸缺失、插入和/或取代的GHRH肽序列。GHRH拮抗剂还可以是具有结合GHRH受体能力并抑制生长激素释放的GHRH的片段或修饰的片段。相信这些拮抗特性是由于各种氨基酸的替换以及在GHRH(1-29)NH2的N末端用芳香酸或非极性酸进行的酰化导致的。
本文公开新的一系列hGHRH(1-29)NH2的合成肽类似物。本发明的新的合成肽在动物(包括人)中在阻断垂体生长激素(GH)上显示出高的拮抗活性。它们还显示出对hGHRH受体的极高的结合能力。
在一些实施方案中，GHRH肽拮抗剂具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列，并且可以由式I表示：
R1-Tyr1-D-Arg2-Asp3-A4-Ile5-A6-Thr7-A8-Har9-A10-A11-A12-Val13-Leu14-A15-Gln16-A17-Ser18-Ala19-A20-A21-Leu22-Leu23-Gln24-Asp25-Ile26-Nle27-D-Arg28-A29-R2-R3-NH2，
其中R1是PhAc、Nac、Oct、N-Me-Aib、Dca、Ac-Ada、Fer、Ac-Amc、Me-NH-Sub、PhAc-Ada、Ac-Ada-D-Phe、Ac-Ada-Phe、Dca-Ada、Nac、Nac-Ada、Ada-Ada或CH3(CH2)10-CO-Ada；
A4是Ala或Me-Ala；
A6是Cpa或Phe(F)5；
A8是Ala、Pal、Dip或Me-Ala；
A10是FPa5,Tyr(Alk)，其中Alk是Me或Et；
A11是His或Arg；
A12是Lys、Lys(0-11)、Lys(Me)2或Orn；
A15是Abu或Orn；
A17是Leu或Glu；
A20是Har或His；
A21是Lys、Lys(Me)2或Orn；
A29是Har、Arg或Agm；
R2是β-Ala、Amc、Apa、Ada、AE2A、AE4P、ε-Lys(α-NH2)、Agm或不存在；并且
R3是Lys(Oct)、Ahx或不存在。
上述肽的式还可以可替换地表示为下式：
[R1-Tyr1-D-Arg2-A4-A6-A8-Har9-A10-A11-A12-A15-A17-A20-A21-Nle-27-D-Arg28-A29-R2-R3]hGHRH(1-29)NH2,
其中R1是PhAc、Nac、Oct、N-Me-Aib、Dca、Ac-Ada、Fer、Ac-Amc、Me-NH-Sub、PhAc-Ada、Ac-Ada-D-Phe、Ac-Ada-Phe、Dca-Ada、Nac-Ada、Ada-Ada或CH3(CH2)10-CO-Ada；
A4是Ala或Me-Ala；
A6是Cpa或Phe(F)5；
A8是Ala、Pal、Dip或Me-Ala；
A10是FPa5,Tyr(Alk)，其中Alk是Me或Et；
A11是His或Arg；
A12是Lys、Lys(0-11)、Lys(Me)2或Orn；
A15是Abu或Orn；
A17是Leu或Glu；
A20是Har或His；
A21是Lys、Lys(Me)2或Orn；
A29是Har、Arg或Agm；
R2是β-Ala、Amc、Apa、Ada、AE2A、AE4P、ε-Lys(α-NH2)、Agm、或不存在；并且
R3是Lys(Oct)、Ahx或不存在。
在一些实施方案中，所述肽可以没有R2和/或R3C-末端修饰。在一些实施方案中，当R1是PhAc、Nac、或Oct时，存在R2。
在一些实施方案中，R1可以是PhAc、Nac、Oct、N-Me-Aib、Dca、Ac-Ada、Fer、Ac-Amc、Me-NH-Sub或PhAc-Ada。在一些实施方案中，R1可以是PhAc-Ada或PhAc。在一些实施方案中，A8可以是Ala或Me-Ala。在一些实施方案中，A10可以是Tyr(Me)或FPa5。在一些实施方案中，A17可以是Leu或Glu。在一些实施方案中，R2可以是Ada或Agm。
在一些实施方案中，GHRH肽拮抗剂具有SEQ ID NO:2(式II)的氨基酸序列：
R1-Tyr1-D-Arg2-Asp3-Ala4-Ile5-A6-Thr7-A8-Har9-A10-His11-Orn12-Val13-Leu14-Abu15-Gln16-A17-Ser18-Ala19-His20-Orn21-Leu22-Leu23-Gln24-Asp25-Ile26-Nle27-D-Arg28-Har29-R2-NH2,
其中R1是PhAc-Ada或PhAc；
A6是Phe(F)5或Cpa；
A8是Ala或Me-Ala；
A10是Tyr(Me)或FPa5；
A17是Leu或Glu；并且
R2是Ada、Agm，或不存在。
用于定义氨基酸残基和合成肽的术语是根据IUPAC-IUB生物化学术语委员会(Commission on Biochemical Nomenclature)的规定(European J.Biochem.,1984,138,9-37)。在蛋白质中发现的天然存在的氨基酸由以下三字母代码来描述：Gly,Ala,Val,Leu,Ile,Ser,Thr,Lys,Arg,Asp,Asn,Glu,Gln,Cys,Met Phe,Tyr,Pro,Trp和His。
所使用的其他缩写为：
Abu α-氨基丁酸
Ac 乙酰基
AcOH 乙酸
Ac2O 乙酸酐
Ada 12-氨基十二酰基
AE2A 8-氨基-3,6-二氧杂辛酰基
AE4P 15-氨基-4,7,10,13-四氧杂十五酰基
Agm 胍基丁胺
Ahx 6-氨基己酰基
Amc 8-氨基辛酰基
Apa 5-氨基戊酰基
Aib α-氨基异丁酰基
All 烯丙基
Alloc 烯丙基氧羰基
Amp p-脒基-苯丙氨酸
Bpa p-苯甲酰-苯丙氨酸
Boc t-叔丁氧羰基
Bom 苄氧基甲基
2BrZ 2-溴-苄氧羰基
Bzl 苄基
Cha 环己基丙氨酸
Chg 环己基甘氨酸
cHx 环己基
Cit 瓜氨酸(2-氨基-5-脲酰戊酰基
2CIZ 2-氯-苄氧羰基
Cpa p-氯苯丙氨酸
Dat d-氨基-酪氨酸
Dca 二氯乙酰基
DCM 二氯甲烷
DIG N,N'-二异丙基碳化二亚胺
DIEA 二异丙基乙胺
Dip (3,3-二苯基)丙氨酸
DMF 二甲基甲酰胺
Et 乙基
Fer 阿魏酰(ferulyl)
FGF 成纤维细胞生长因子
Fm 芴甲基
Fmoc 芴甲氧羰基
For 甲酰基
GH 生长激素
GHRH GH释放激素
Gup p-胍基-苯丙氨酸
Har 高精氨酸
HBTU 2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯
Hca 氢化肉桂酰基
Hca-OH 氢化肉桂酸
hGHRH 人GH-RH
HOBt 1-羟基苯并三唑
HPLC 高效液相色谱
Ibu 异丁酰基
IndAc 吲哚-3-乙酰基
Ipa 吲哚-3-丙酰基
Lys(0-11) Lys(A0-A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9–A10-A11-)
ε-Lys(α-NH2) Lys残基，它的ε-氨基被位于N末端的氨基酸的羰基酰化；Lys残基的α-氨基是游离的
MBHA p-甲基二苯甲基胺
Me 甲基
MeOH 甲醇
MeCN 乙腈
Nac 萘基乙酰基
Nal 萘基丙氨酸
Nle 正亮氨酸
NMM N-甲基吗啉
Npr 萘基丙酰基
Oct 辛酰基
Orn 鸟氨酸
Peg 聚乙二醇基
Pal 吡啶基丙氨酸
PAM 苯乙酰胺甲基
Ph 苯基
PhAc 苯乙酰基
PhAc-OH 苯乙酸
Phe(pCI) p-氯-苯丙氨酸
Phe(pNH2) p-氨基-苯丙氨酸
Phe(pNO2) p-硝基-苯丙氨酸
rGHRH 大鼠GHRH
RP-HPLC 反相HPLC
Sub 环庚基(suberyl)
SPA p-磺酰基-苯氧乙酰基
TFA 三氟乙酸
Tos p-甲苯磺酰基
Tpi 1,2,3,4-四氢诺哈明-3-羧酸
Tyr(Me) O-甲基-酪氨酸
Tyr(Et) O-乙基-酪氨酸
Z 苄氧羰基
根据hGHRH(1-29)(SEQ ID NO:3)中的氨基酸残基对合成肽的氨基酸序列进行编号。因此，例如，合成肽中的Ala4和A8在序列中所处的位置与hGH-RH(1-29)中的Ala4和A8残基相同。本文中也遵循这样的惯例：肽的N-末端位于左边，并且C-末端位于右边。在一些实施方案中，肽可以具有N-末端修饰，由R1表示。在一些实施方案中，肽可以具有C-末端修饰，由R2和R3表示。在一些实施方案中，肽可以没有R2和/或R3C-末端修饰。
在一些实施方案中，特定的GHRH肽拮抗剂包括：
Phac-Ada-Tyr1-D-Arg2-Asp3-Ala4-Ile5-Phe(F)5 6-Thr7-Ala8-Har9-Tyr(Me)10-His11-Orn12-Val13-Leu14-Abu15-Gln16-Leu17-Ser18-Ala19-His20-Orn21-Leu22-Leu23-Gln24-Asp25-Ile26-Nle27-D-Arg28-Har29-NH2(MIA-602,SEQ ID NO:4).
Phac-Ada-Tyr1-D-Arg2-Asp3-Ala4-Ile5-Phe(F)5 6-Thr7-Ala8-Har9-Tyr(Me)10-His11-Orn12-Val13-Leu14-Abu15-Gln16-Leu17-Ser18-Ala19-His20-Orn21-Leu22-Leu23-Gln24-Asp25-Ile26-Nle27-D-Arg28-Har29-Agm-NH2(MIA-604,SEQ ID NO:5).
Phac-Ada-Tyr1-D-Arg2-Asp3-Ala4-Ile5-Phe(F)5 6-Thr7-Me-Ala8-Har9-Tyr(Me)10-His11-Orn12-Val13-Leu14-Abu15-Gln16-Leu17-Ser18-Ala19-His20-Orn21-Leu22-Leu23-Gln24-Asp25-Ile26-Nle27-D-Arg28-Har29-Agm-NH2(MIA-606,SEQ ID NO:6).
Phac-Tyr1-D-Arg2-Asp3-Ala4-Ile5-Cpa6-Thr7-Ala8-Har9-Fpa510-His11-Orn12-Val13-Leu14-Abu15-Gln16-Leu17-Ser18-Ala19-His20-Orn21-Leu22-Leu23-Gln24-Asp25-Ile26-Nle27-D-Arg28-Har29-Ada-NH2(MIA-610,SEQ ID NO:7).
Phac-Ada-Tyr1-D-Arg2-Asp3-Ala4-Ile5-Cpa6-Thr7-Ala8-Har9-Fpa510-His11-Orn12-Val13-Leu14-Abu15-Gln16-Glu17-Ser18-Ala19-His20-Orn21-Leu22-Leu23-Gln24-Asp25-Ile26-Nle27-D-Arg28-Har2 9-Ada-NH2(MIA-640,SEQ ID NO:8).
Phac-Ada-Tyr1-D-Arg2-Asp3-Ala4-Ile5-Cpa6-Thr7-Ala8-Har9-Fpa510-His11-Orn12-Val13-Leu14-Abu15-Gln16-Leu17-Ser18-Ala19-His20-Orn21-Leu22-Leu23-Gln24-Asp25-Ile26-Nle27-D-Arg28-Har2 9-NH2(MIA-690,SEQ ID NO:9).
合适的合成GHRH肽拮抗剂在表1中公开。本文公开的肽是由SEQ ID NO:1代表的核心GHRH肽拮抗剂的各种修饰形式。例如，P-1109具有N-末端修饰PhAc；位于氨基酸位置1的Tyr；位于位置2的D-Arg；位于位置4的Ala，位于位置6的Cpa等等，并且位置3,4,5,7,12,13,14,16,18,19,和21-26的中间氨基酸(即表中没有明确指出的那些)与SEQ ID NO:1的氨基酸相同。
肽通过适当的方法被合成，例如通过完全固相技术，通过部分固相技术，通过片段缩合或者通过经典的液相合成。例如，完全固相合成技术记载在教科书“Solid Phase PeptideSynthesis(固相肽合成)”,J.M.Stewart and J.D.Young,Pierce Chem.Company,Rockford,Illinois,1984(2nd.ed.)和M.Bodanszky,“Principles of Peptide Synthesis(肽合成的原理)”,Springer Verlag,1984中。优选使用固相合成制备hGHRH拮抗剂肽，例如通常由Merrifield,J.Am.Chem.Soc,85p.2149(1963)所描述的，虽然也可以使用之前所提及的本领域已知的其他等同的化学合成法。
使用在其alpha氨基基团处被保护的氨基酸进行合成。优选使用尿烷类保护基团(Boc或Fmoc)保护alpha氨基基团。在特定的情况下，在合成过程中也使用被保护的omega-氨基酸。Boc或Fmoc保护基团也适合于保护omega-氨基基团。
在固相合成中，N-alpha-被保护的或N-omega-被保护的氨基酸分子形成位于最终肽的C-末端的氨酰基基团，其与聚合树脂支持物通过化学键相连。完成偶联反应之后，alpha(或omega)氨基保护基团被选择性除去以允许在氨基末端发生后续偶联反应，优选当N-alpha-(N-omega-)保护基团是Boc的时候使用DCM中的50％TFA除去，当N-alpha-(N-omega-)保护基团是Fmoc的时候用DMF中的20％哌啶除去。类似地具有Boc或Fmoc-保护的alpha(或omega)氨基基团的其余氨基酸被逐步偶联到树脂上的先前的氨基酸的游离氨基基团上，以获得所期望的肽序列。由于氨基酸残基被偶联到C-末端残基的alpha(或omega)氨基基团上，合成的hGHRH类似物肽的生长从C末端开始向N-末端前进。当已获得所期望的序列时，肽被酰化，或者N-末端的氨基基团保持游离，并从支持物聚合物上除去肽。
每种被保护的氨基酸被过量使用(2.5或3倍当量)，且偶联反应通常在DCM、DMF或其混合物中进行。每个阶段偶联反应完成的程度通过茚三酮反应监测。在测定到不完全偶联的情况下，在下一个氨基酸偶联之前除去alpha(或omega)氨基保护基团之前，重复偶联步骤，或者通过乙酰化作用使未反应的氨基基团封闭。其他的合成和纯化程序已在美国专利申请No.12/890,626中公开，通过引用将其全文合并入本文。
本文公开的肽可被用于治疗阿尔茨海默病和其他的神经退行性病症。在一些实施方案中，治疗患有阿尔茨海默病的受试者的方法包括给药于受试者治疗量的生长激素释放激素(GHRH)肽拮抗剂。在一些实施方案中，GHRH拮抗剂肽可以是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。在一些实施方案中，GHRH拮抗剂肽可以是SEQ ID NOs:4-9的一个或更多个。
在一些实施方案中，治疗患有淀粉样蛋白斑沉积的受试者的方法可以包括给药于受试者治疗量的生长激素释放激素(GHRH)肽拮抗剂。在一些实施方案中，GHRH拮抗剂肽可以是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。在一些实施方案中，GHRH拮抗剂肽可以是SEQ IDNOs:4-9的一个或更多个。
在一些实施方案中，治疗患有神经退行性疾病的受试者的方法可以包括给药于受试者治疗量的生长激素释放激素(GHRH)肽拮抗剂。神经退行性疾病可以是阿尔茨海默病，老年痴呆，路易体痴呆，帕金森氏病，亨廷顿氏病，肌萎缩性脊髓侧索硬化症，及其组合。在一些实施方案中，神经退行性疾病还可以是地中海热，穆-韦二氏综合症，特发性骨髓瘤，淀粉样多神经病，淀粉样心肌病，系统性神经炎淀粉样变，淀粉样多神经病，遗传性脑出血伴淀粉样变，唐氏综合症，痒病，克雅氏病，库鲁病，格-斯二氏综合症，甲状腺髓样癌，孤立性心房淀粉样变性，透析患者β2-微球蛋白淀粉样变，包涵体肌炎，肌肉萎缩病中β2-淀粉样蛋白沉积，II型糖尿病，及其组合。
在一些实施方案中，GHRH拮抗剂肽可以是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。在一些实施方案中，GHRH拮抗剂肽可以是SEQ ID NOs:4-9的一个或更多个。
在一些实施方案中，保护神经元细胞免受氧化胁迫的方法可以包括使神经元细胞与生长激素释放激素(GHRH)肽拮抗剂接触。在一些实施方案中，提高神经元细胞存活力的方法可以包括使神经元细胞与生长激素释放激素(GHRH)肽拮抗剂接触。在一些实施方案中，GHRH拮抗剂肽可以是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。在一些实施方案中，GHRH拮抗剂肽可以是SEQ ID NOs:4-9的一个或更多个。在本文所述的上述方法中，所述方法可以是体外或体内的。在一些实施方案中，所使用的GHRH肽拮抗剂的局部浓度可以是约1nM至约100mM，约1nM至约10mM，约1nM至约1mM，约1nM至约0.1mM，或约1nM至约10nM。
在一些实施方案中，GHRH肽拮抗剂可以与其他治疗剂一同组合给药，以治疗阿尔茨海默病和其他的神经退行性病症。这样的治疗剂的非限制性实例包括NMDA受体拮抗剂，淀粉样蛋白AB肽的抑制剂，磷酸二酯酶(PDE5)抑制剂，PDE4抑制剂，单胺氧化酶抑制剂，VEGF蛋白，营养生长因子，HIF活化剂，HIF脯氨酰A-羟化酶抑制剂，抗凋亡化合物，活性依赖性神经营养蛋白(ADNP)激动剂，活性依赖性神经营养因子(ADNF)激动剂、AMPA-型谷氨酸受体活化剂，血清素5-HT1A受体激动剂，血清素IA受体拮抗剂，烟碱α-7受体激动剂，神经元L-型钙通道调节剂，5-HT4受体激动剂，抗炎剂，及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，GHRH肽拮抗剂可以与至少一种治疗剂联合给药、同时给药或顺序给药。
本发明的肽可以以药学上可接受的、无毒盐，如酸加成盐的形式给药。这种酸加成盐的例子是盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、磷酸盐、延胡索酸盐、葡糖酸盐、单宁酸盐、马来酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐、苯甲酸盐、琥珀酸盐、藻酸盐、双羟萘酸盐、苹果酸盐、抗坏血酸盐、酒石酸盐等。特别优选的拮抗剂是低溶解性的盐，例如双羟萘酸盐等。这些酸加成盐显示出长时间的活性。
含有本发明肽和合适的载体的制剂可以是固体剂型，其包括，但不限于，软胶囊，片剂，胶囊剂，扁囊剂，微丸，丸剂，粉剂和颗粒剂；局部剂型，其包括，但不限于，溶液，粉剂，液体乳剂，液体混悬剂，半固体，软膏剂，糊剂，乳膏，凝胶剂(gels)和冻胶剂(jellies)，和泡沫剂；和肠胃外剂型，其包括，但不限于，溶液，混悬剂，乳剂，和干粉；其包含有效量的本发明的聚合物或共聚物。在一些实施方案中，单次剂量可以包含一个或更多个软胶囊，片剂，胶囊剂，扁囊剂，微丸，丸剂等等。特定的实例包括，例如，包含1、2、3或4个软胶囊，片剂，胶囊剂，扁囊剂，微丸，丸剂等等的剂量。
在一些实施方案中，可以服用一个或更多个软胶囊，片剂，胶囊剂，扁囊剂，微丸，丸剂等等以获得所期望的剂量。在一些实施方案中，可以同时服用一个或更多个软胶囊，片剂，胶囊剂，扁囊剂，微丸，丸剂等等以获得所期望的剂量。在再另一个实施方案中，可以在特定的时间段如，例如，24小时的时间段的过程中单独服用一个或更多个软胶囊，片剂，胶囊剂，扁囊剂，微丸，丸剂等等。例如，可以在24小时的时间段内服用一个或更多个软胶囊，片剂，胶囊剂，扁囊剂，微丸，丸剂等等两次，以获得所期望的剂量。在一些实施方案中，一个或更多种个软胶囊，片剂，胶囊剂，扁囊剂，微丸，丸剂等等可以随餐服用。例如，可以在24小时的时间段内随每一餐服用一个或更多个软胶囊，片剂，胶囊剂，扁囊剂，微丸，丸剂等等，以获得所期望的剂量。
本领域还已知活性成分可以与药学上可接受的稀释剂、填充剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、表面活性剂、疏水载体、水溶性载体、乳化剂、缓冲剂、湿润剂(humectants)、保湿剂(moisturizers)、增溶剂、防腐剂等等一同被包含在这样的制剂中。给药的方式和方法是本领域已知的，并且技术人员可以参考多种药物学参考资料以获得指导。例如可以查阅Modern Pharmaceutics(现代药剂学),Banker&Rhodes,Marcel Dekker,Inc.(1979)；以及Goodman&Gilman's The Pharmaceutical Basis of Therapeutics(治疗学的药理学基础),6thEdition,MacMillan Publishing Co.,New York(1980)。
在一些实施方案中，药学上可接受的赋形剂可以包括，但不限于，粘合剂、包衣、崩解剂、填充剂、稀释剂、调味剂、着色剂、润滑剂、助流剂、防腐剂、吸着剂、甜味剂、共轭亚油酸(CLA)、明胶、蜂蜡、纯水、甘油、任何类型的油(包括，但不限于，鱼油或大豆油等等)。肽/化合物的药物组合物还可以包含合适的固相或凝胶相载体或赋形剂。这种载体或赋形剂的实例包括但不限于碳酸钙，磷酸钙，各种糖，淀粉，纤维素衍生物，明胶和聚合物例如聚乙二醇。
本发明的肽/化合物可以通过任何使其有活性的路线以常规方式给药。给药可以是系统性、肠胃外、局部或口服。例如，给药可以是，但不限于，肠胃外，例如皮下、肌内、腹膜内、腔内、，鞘内、透皮和静脉内。口服、经颊或经眼方式，阴道内，吸入，储药注射或植入物也可被用于递送肽。因此，本发明的肽/化合物(单独或与其他药物组合)的给药方式可以是，但不限于舌下含服，注射(包括皮下或肌内注射的短效、储药、植入和微丸形式)，或者通过使用阴道内乳膏，栓剂，阴道栓，阴道环，直肠栓，宫内节育器和透皮形式如贴剂和乳膏。
可替换地，肽可以与合适的载体以鼻内喷雾的形式或通过肺吸入给药。一种合适的给药路线是用生物可降解的合适的聚合物配制的储药形式，例如以聚-D,L-丙交酯-聚乙交酯作为含有分散的拮抗剂化合物的微胶囊、微颗粒或圆柱形植入物。
特定给药模式取决于适应症。特定给药路线和剂量方案将由临床医生根据临床医生已知的方法进行调整或滴定，以获得最佳的临床反应。被给药的肽/化合物的量是治疗有效的量。被给药的剂量将取决于接受治疗的受试者的特点，例如接受治疗的特定的动物或人，年龄，重量，健康，同时进行的治疗的类型(如果有的话)以及治疗的频率，并且可以容易地由本领域技术人员(例如由临床医生)来确定。
所需要的肽的量取决于药物组合物的类型并取决于给药模式。在一些实施方案中，GHRH肽拮抗剂给药的剂量可以是约0.005mg/kg/剂至约100mg/kg/剂，约0.005mg/kg/剂至约10mg/kg/剂，约0.005mg/kg/剂至约1mg/kg/剂，约0.005mg/kg/剂至约0.5mg/kg/剂，约0.005mg/kg/剂至约0.1mg/kg/剂，或约0.005mg/kg/剂至约0.05mg/kg/剂。在人受试者接受GHRH拮抗剂方案(solutions)，通过肌内或皮下注射，或者以鼻内喷雾或肺吸入的形式给药的情况下，典型的剂量是在2-20mg/天/患者之间，每天一次或每天分为2-4次给药。当GHRH拮抗剂以静脉注射的方式被给药给人患者时，典型的剂量是在8-80μg/kg体重/天的范围内，每天分为1-4次快速浓注或者连续输注给药。当使用GHRH拮抗剂的储药制备物时，例如通过肌内注射双羟萘酸盐或其他低溶解性的盐，或者通过肌内10或皮下进行含有分散在生物可降解聚合物中的拮抗化合物的微胶囊、微颗粒或植入物的给药时，典型的剂量是在1-10mg拮抗剂/天/患者之间。
本发明的肽/化合物可以配制成通过注射，例如通过快速浓注或连续输注用于肠胃外给药。肽/化合物可以在约15分钟至约24小时的时间段中通过皮下连续输注给药。注射用制剂可以以单位剂量形式呈现，例如以安瓶的形式或以多剂量容器的形式，并加入防腐剂。组合物可以采用这样的形式：混悬液，溶液或在油性或水性载体中的乳液，并可以含有配方试剂如助悬剂，稳定剂和/或分散剂。
对于口服给药，肽/化合物可以容易地通过将这些肽/化合物与本领域熟知的药学上可接受的载体混合来配制。这样的载体使得本发明的肽/化合物能够被配制成片剂，丸剂，糖衣丸，胶囊剂，液体剂，凝胶剂，糖浆剂，淤浆，混悬剂等等，以用于被治疗的患者口服。口服使用的药物制剂可以通过在加入合适的助剂(如果需要的话)之后，加入固体赋形剂，可选地研磨所得到的混合物，并加工颗粒混合物，以获得片剂或糖衣丸的芯部。合适的赋形剂包括，但不限于，填充剂如糖，包括，但不限于乳糖、蔗糖、甘露糖醇和山梨糖醇；纤维素制备物如，但不限于，玉米淀粉、小麦淀粉、稻米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基-纤维素、羧甲基纤维素钠和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要的话，可以加入崩解剂，如，但不限于，交联聚乙烯吡咯烷酮，琼脂，或海藻酸或其盐(如海藻酸钠)。
可以为糖衣丸的芯部提供合适的包衣。为此目的，可以使用浓缩糖溶液，其可以可选地含有阿拉伯胶，滑石，聚乙烯吡咯烷酮，卡波姆胶，聚乙二醇和/或二氧化钛，漆溶液，和合适的有机溶剂或溶剂混合物。染料或色素可以被加入到片剂或糖衣丸的包衣中以识别或特征化活性肽/化合物剂量的不同组合。
可以口服使用的药物制备物包括，但不限于由明胶制成的推入配合式(push-fit)胶囊，以及由明胶和增塑剂(如甘油和山梨醇)制成的软的密封胶囊。推入配合式胶囊可以含有以与填充物(如，例如乳糖)，粘合剂(如，例如淀粉)，和/或润滑剂(如，例如滑石或硬脂酸镁)以及可选地稳定剂的混合物的形式的活性成分。在软胶囊中，活性肽/化合物可以被溶解或悬浮于合适的液体，如脂肪油，液体石蜡，或液体聚乙二醇中。此外，可以加入稳定剂。所有用于口服给药的制剂的剂量应当是适合这种给药的剂量。
对于经颊给药，组合物可以采用例如以常规方式配制的片剂或锭剂的形式。
对于吸入给药，根据本发明使用的组合物以加压包或喷雾器呈现的气溶胶喷雾的形式方便地递送，并使用合适的推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体。在加压气溶胶的情况中，剂量单位可以通过提供阀门以递送经计量的量来确定。用于吸入器或吹入器的例如明胶的胶囊和筒可以被配制成含有肽/化合物和合适的粉末基质(如乳糖或蔗糖)的粉末混合物。
本发明的组合物还可以被配制成直肠组合物如栓剂或保留灌肠，例如含有传统的栓剂基质如可可油或其他甘油酯。
除了前述制剂外，本发明的组合物还可以被配制成储药制备物。这种长效制剂可以通过植入(例如皮下或肌内)或通过肌内注射给药。
储药注射可以以约1至约6个月或更长的间隔给药。因此，例如，肽/化合物可以用合适的聚合材料或疏水材料配制(例如配制成在可接受的油中的乳剂)或用离子交换树脂配制，或配制成微溶衍生物，例如配制成微溶盐。
在透皮给药中，本发明的组合物，例如，可以被施加于膏药，或可以通过透皮的治疗系统施加，从而所述组合物被提供给生物体。
本发明的组合物还可以与其他活性成分，如，例如佐剂，蛋白酶抑制剂，或其他相容的药物或化合物组合给药，其中这样的组合在获得本文所述方法的期望效果上被认为是合乎期望的或是有利的。
在一些实施方案中，崩解剂组分包含交联羧甲基纤维素钠，羧甲基纤维素钙，交联聚维酮，海藻酸，海藻酸钠，海藻酸钾，海藻酸钙，离子交换树脂，基于食品酸和碱性碳酸盐组分的泡腾系统，粘土，滑石，淀粉，预胶凝淀粉，羧基乙酸淀粉钠，纤维素絮凝物，羧甲基纤维素，羟丙基纤维素，硅酸钙，金属碳酸盐，碳酸氢钠，柠檬酸钙或磷酸钙的一种或更多种。
在一些实施方案中，稀释剂组分包含甘露糖醇，乳糖，蔗糖，麦芽糖糊精，山梨糖醇，木糖醇，粉状纤维素，微晶纤维素，羧甲基纤维素，羧乙基纤维素，甲基纤维素，乙基纤维素，羟乙基纤维素，甲基羟乙基纤维素，淀粉，羧基乙酸淀粉钠，预胶凝淀粉，磷酸钙，金属碳酸盐，金属氧化物或金属铝硅酸盐的一种或更多种。
在一些实施方案中，可选的润滑剂组分，当存在时，包含硬脂酸，金属硬脂酸盐，硬质酰富马酸钠，脂肪酸，脂肪醇，脂肪酸酯，甘油山嵛酸酯，矿物油，植物油，石蜡，亮氨酸，硅石，硅酸，滑石，丙二醇脂肪酸酯，聚乙氧基蓖麻油，聚乙二醇，聚丙二醇，聚二醇，聚氧乙烯-甘油脂肪酸酯，聚氧乙烯脂肪醇醚，聚乙氧基甾醇，聚乙氧基蓖麻油，聚乙氧基植物油，或氯化钠的一种或更多种。
本发明和说明所使用的方法和材料的实施方案可以通过参考下述非限制性的实施例而被进一步理解。结合下述实施例对本发明进行描述，下述实施例的描述仅仅是为了举例说明的目的。在实施例中，使用L-构型的光学活性的被保护氨基酸，除非特别指出。
实施例
实施例1：用于肌内注射的含水溶液
Phac-Ada-Tyr1-D-Arg2-Asp3-Ala4-Ile5-Phe(F)5 6-Thr7-Ala8-Har9-Tyr(Me)10-His11-Orn12-Val13-Leu14-Abu15-Gln16-Leu17-Ser18-Ala19-His20-Orn21-Leu22-Leu23-Gln24-Asp25-Ile26-Nle27-D-Arg28-Har29-NH2(MIA-602,SEQ ID NO:2)500.0mg
明胶，无抗原性5.0mg
注射用水适量加至100.0mL
明胶和GH-RH拮抗剂肽MIA-602被溶解于注射用水中，然后溶液被无菌过滤。
实施例2：长效肌内可注射注射制剂(芝麻油凝胶)
Phac-Ada-Tyr1-D-Arg2-Asp3-Ala4-Ile5-Phe(F)5 6-Thr7-Ala8-Har9-Tyr(Me)10-His11-Orn12-Val13-Leu14-Abu15-Gln16-Leu17-Ser18-Ala19-His20-Orn21-Leu22-Leu23-Gln24-Asp25-Ile26-Nle27-D-Arg28-Har29-Agm-NH2(MIA-604,SEQ ID NO:3).
单硬脂酸铝，USP 20.0mg
芝麻油适量1.0mL
单硬脂酸铝与芝麻油混合并搅拌加热至125℃，直至形成清澈黄色溶液。该混合物然后进行高压蒸汽灭菌并使其冷却。然后研碎并无菌研磨加入GHRH拮抗剂肽MIA-604。特别优选的拮抗剂是低溶解性的盐，例如双羟萘酸盐等等。这些表现出长时间的活性。
实施例3：长效肌内(IM)可注射-生物可降解的聚合物微胶囊
微胶囊由下述材料制备：
25/75乙交酯/丙交酯共聚物(0.5特性粘度)  99％
Phac-Ada-Tyr1-D-Arg2-Asp3-Ala4-Ile5-Phe(F)5 6-Thr7-Me-Ala8-Har9-Tyr(Me)10-His11-Orn12-Val13-Leu14-Abu15-Gln16-Leu17-Ser18-Ala19-His20-Orn21-Leu22-Leu23-Gln24-Asp25-Ile26-Nle27-D-Arg28-Har29-Agm-NH2(MIA-606,SEQ ID NO:4)  1％.
25mg上述微胶囊被悬浮于1.0mL的下述媒介物中：
实施例4：GHRH拮抗剂肽在不同阿尔茨海默病模型中的应用
方法
为了治疗，MIA-690被溶解于0.1％DMSO(Sigma)和10％丙二醇(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)的含水溶液中。
转基因小鼠(5XFAD株)得自杰克逊实验室(Jackson Laboratories)(Bar Harbor,ME)。动物被饲养于温控房间的无菌笼中，按12-h光照/12-h黑暗的时间安排，随意喂食高压蒸汽灭菌的食物(chow)和水。使用两种性别，在不同的治疗组之间平均分布。对于Morris水迷宫实验，使用41只成年小鼠(大约3月龄)并将其分为4个治疗组，每组接受下述的皮下每日治疗，共6个月：第1组：(对照)，媒介物溶液；第2组：MIA-690(2μg)；第3组：MIA-690(5μg)；和第4组：MIA-690(10μg)。
迷宫是圆形白色钢制水池(直径120cm；高40cm)。水池装入室温(22±2℃)的水，至大约30cm。用无毒的白色液体天妇罗涂料(Crayola,Easton,PA)使水变成不透明的。黑色毛皮的动物提供足够的对比以进行视频跟踪。根据文献的指导进行实验。水池被虚拟地分为四个象限，围绕边缘有四个等距的投放点。投放点按照指南针的点来标记：南(S)，西(W)，北(N)，东(E)。目标平台(直径10cm)在水面以下1.5cm的水中，在一个象限的中心处(距水池缘径向距离30cm)。按照记录软件(Water Maze Software,Columbus Instruments,Columbus,OH)的命名法和指南针方向：1、北-西(NW)；2、南-西(SW)；3、南-东(SE)；4、北-东(NE)来标记平台位置。对于每个训练试验，小鼠在半随机分配的投放点被投放并允许其自由游泳。一旦达到平台，小鼠被允许在那儿停留15s。如果60s后平台没有被定位，小鼠被缓慢地带至平台并被允许在那儿停留15s。个体试验间隔约70-80min(一次试验持续差不多2min)，试验之间小鼠被弄干以防止低体温症。当平台可见的时候，在2次初级进程(preliminary sessions)中首次评价游泳速度，积极性和漂浮倾向；“漂浮者”被排除在研究之外。在每天的进程中，每个动物随后接受一组4次训练试验，其中平台被隐藏；一个完整的训练周期由连续5天组成。对于所有获得试验并且对于所有小鼠来说，平台保持在同一个象限中。在训练结束时，在第6天，完成探索测试，其中从水池中除去平台并允许每只小鼠自由寻找60s。视频跟踪系统被用于对行为进行监控和量化(Videomex-Onehardware and Water Maze Software,Columbus Instruments,Columbus,OH)。对于所有试验，在整个测试过程中迷宫周围的外围提示保持不变。训练所观察的和记录的参数是：逃避潜伏期(escape latency)，路程长度，累计距离(CD)和近似平均值(PA)，而对于探索CD、PA，平台穿越(PC)，进入平台象限(EPQ)，平台象限中的路程长度(PPQ)和在平台象限中花费的时间(TPQ)被使用。四个个体试验的输出变量的平均值被用于进行比较和统计学评价。在开始治疗之后，小鼠被每月追踪一次，共6个月(在3月龄和9月龄之间)。除了小鼠的存活之外，每月记录他们的训练和探索值。对于探索值的比较，CD，PC，EPQ，PPQ和TPQ被使用，但第一天和第五天之间逃避潜伏期的变化也被发现是一种灵敏的标记。在每个月的进程中，探索进程促进记忆的消失，而且对于下一个训练进程，平台被半随机地迁移到新的位置。
在实验结束时，通过颈椎脱臼法和断头法处死小鼠，进行尸体剖检，并移除大脑。大脑半球立即在液氮中被迅速冷冻并储存于-80℃以进行PCR和蛋白质组学研究。对于淀粉样蛋白-β1-42和总τ-蛋白水平的测定，使用小鼠特异性ELISA试剂盒，根据制造商的说明(Invitrogen,Carlsbad,CA)进行。
HCN-2细胞(American Type Culture Collection(美国典型培养物保藏中心),Manassas,Virginia,USA)在DMEM培养基(加入10％的胎牛血清(FBS)和0.1％的青霉素/链霉素)中在37℃并在大气和5％CO2的气氛下。在70-80％的融合度(confluency)时，培养物用胰蛋白酶处理并重悬于新鲜的含血清培养基中，并被转移至T-75烧瓶中或被直接接种于48-孔的微孔板上，密度为10,000个细胞/cm2。第二天，加入含有25ng/ml NGF，0.5mM双丁酰cAMP和0.1mM异丁基甲基黄嘌呤(IBMX)(均得自Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)的新鲜培养基诱导HCN-2细胞分化一周。人淀粉样蛋白-β1-42(Abbiotec LLc,San Diego,CA)储液(10mM)被制备于DMSO中，并立即被稀释至在检测培养基中的合适的浓度。用于神经毒性检测的培养基是含有10％FBS的加入N2的DMEM/F12(Gibco BRL,NY)。治疗组是对照，淀粉样蛋白-β1-42，和淀粉样蛋白-β1-42和3种剂量(10nM,100nM和1μM)的MIA-690的组合治疗；对照接受含丙二醇和DMSO的培养基。暴露三天后评价类似物对于蛋白毒性的效果。使用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二丙基溴化四氮唑(MTT)检测(CellTiter非放射性细胞增殖检测,Promega,Madison,WI)确定细胞的存活力，根据制造商的说明进行。APF检测(Invitrogen)被用于检测自由基形成，根据制造商的说明进行。培养基中特定蛋白(IGF-I,IGF-II,GPx1,SOD1,BDNF)的浓度用适当的ELISA试剂盒测定，根据制造商的说明进行。IGF-I,IGF-II和BDNF人ELISA试剂盒得自AbCam Inc.(Cambridge,MA)，而Abfrontier的GPx1和SOD1试剂盒得自Biovendor,LLC,(Candler,NC)。读数按NanoDrop(NanoDrop Technologies Inc.,Wilmington,DE)测定的蛋白浓度进行标准化。
使用NucleoSpin试剂盒从代表性的半球分离总RNA并用DNAse处理，按制造商的说明进行(Macherey-Nagel Inc.,Bethlehem,PA)。对五个样品进行分析，每个样品来自于对照和10μg MIA-690组。RNA样品的产量和质量用分光光度计测定，使用260nm，和260/280和260/230nm比值。如下所述进行cDNA的合成。简短来说，来自每个样品的1μg的RNA通过RT First Strand试剂盒(Qiagen)被反转录为cDNA。在Veriti 96-孔热循环仪(Applied Biosystems)上进行反转录。本研究中使用的小鼠阿尔茨海默病实时定量PCR阵列(PAMM-057Z Qiagen)含有84个与阿尔茨海默病相关的独特基因。所有的PCR阵列使用iQ5Multicolor Real-Time Detections System(Bio-Rad)进行。阵列代表的所有基因在特定产物的熔解曲线特征上显示出单峰。使用制造商(Qiagen)提供的基于Excel的PCR阵列数据分析软件进行基因表达的数据分析：使用ΔΔCt方法计算基因表达的倍数变化，并且五个稳定表达的看家基因(Act b,B2m,GAPDH,Gus b,Hsp 90ab1)被用于结果的标准化。
通过重复测量一般线性模型(GLM)或存活分析(Kaplan-Meier)进行体内实验的统计学评价。GLM之后是图基和费雪事后检验(Tukey's and Fisher's post hoc tests)，而对于存活分析，使用对数秩(Log Rank)(Mantel-Cox)检验进行组间(group-wise)比较。对于独立样品或单变量GLM，使用t-检验评价体外数据；对于后者，接下来进行事后比较。在线条图的情况下，结果或者表示为平均值±SEM或者表示为平均值和合并标准误差(PSE)。与对照相比p<0.05的差异被视为是有统计学意义的。用SigmaPlot 12.0(SystatSoftware,Inc.,Chicago,IL)和IBM SPSS Statistics 20.0(IBM Corporation,Armonk,NY)进行数据简化和统计学分析。
结果
在动物研究中，在6个月的观察期中，根据探索参数，观察到空间学习的明显退化，而且在获得阶段中观察到潜伏期的减少(图1A-D)。一般线性模型(GLM)的重复测量表明10μg MIA-690几乎完全破坏潜伏期曲线幅度的进行性减少(图1A；受试者之间F3,37＝831.73,p<0.01，图基事后检验：相对于对照p<0.05)。类似物还表现出使其他行为参数中的变化减弱的倾向(图1B-D和图2)。6个月后，可以观察到在获得阶段中对照和MIA-690之间有显著差异，特别是当与第一个月的结果进行比较时(图3A-D)。用10μgMIA-690治疗组明显完成的更好，对潜伏期的效果被证明是有统计学意义的(图1C；在受试者之间F3,28＝64.37,p<0.01，图基事后检验：相对于对照p<0.05)。而且，类似物似乎延长了存活(图4)。对尸体剖检的脑样品的分析证明在转基因小鼠中，有效浓度(10μg)的GHRH拮抗剂极大地减少了淀粉样蛋白-β1-42的大脑沉积(MIA-690t(78)＝7.025且相对于对照p<0.05)并且轻微地减少了τ-蛋白的总积聚(MIA-690t(78)＝2.395且相对于对照p<0.01)(图5)。
MIA-690对HCN-2细胞的存活力，氧化代谢和介质释放表现出剂量依赖的效果(图6)。该肽显著减少了与淀粉样蛋白-β1-42联合处理对于神经元存活力的毒性作用(F4,23＝2.8,p<0.05，费雪事后检验：p<0.05，10μM MIA-690+淀粉样蛋白-β1-42相对于淀粉样蛋白-β1-42)而且事实上破坏了淀粉样蛋白-β1-42联合处理诱发的ROS的产生(F4,43＝2.64,p<0.05，费雪事后检验：p<0.05,1μM MIA-690+淀粉样蛋白-β1-42相对于淀粉样蛋白-β1-42)。同时类似物对于SOD1表达没有显著的和线性的影响，它为最高应用浓度时显著增加了谷胱甘肽-过氧化物酶(GPx)(F4,75＝15.2,p<0.01，图基事后检验：p<0.05,1μMMIA-690+淀粉样蛋白-β1-42相对于淀粉样蛋白-β1-42)和脑源性神经营养因子(BDNF)(F4,75＝58.72,p<0.01，费雪事后检验：p<0.01,1μM MIA-690+淀粉样蛋白-β1-42相对于淀粉样蛋白-β1-42)的表达。GHRH类似物还抑制IGF-I的释放(F4,75＝9.22,p<0.01),(图基事后检验：p<0.05,100nM MIA-690+淀粉样蛋白-β1-42相对于淀粉样蛋白-β1-42并且p<0.01，1μM MIA-690+淀粉样蛋白-β1-42相对于淀粉样蛋白-β1-42)，但是它对于IGF-II的分泌的效果是可以忽略的(数据未给出)。PCR阵列研究表明在用10μg MIA-690每天治疗6个月后，5XFAD小鼠的脑样品中，22种阿尔茨海默病相关基因的表达上有统计学上显著的变化(表2)。
表2
讨论
本实验证明在不同的阿尔茨海默病模型的每一个中，GHRH拮抗剂，MIA-690，具有几种有益效果。对于GHRH-GH-IGF轴，在HCN-2细胞培养物的上清中，MIA-690减少了IGF-I的分泌(图6)。这是很有意义的，因为在阿尔茨海默病中，一个最重要的病理学现象是胰岛素和淀粉样蛋白-β竞争胰岛素降解酶(IDE)。在高胰岛素血症的情况下，胰岛素与IDE有更高的亲和力，其占据着该酶的结合位点，使得IDE不能接近淀粉样蛋白-β，从而导致淀粉样蛋白-β的积聚。除了胰岛素之外，在CNS中，IGF-1是IGF家族中最多的类型，在病理状况中，它影响认知减退。减少的IGF-I信号传导通过增加DNA修复和增加对氧化胁迫的抗性来直接减轻淀粉样蛋白-β的蛋白质毒性。
在体内研究中，在MWM的获得阶段中，GHRH拮抗剂显著地并且剂量依赖地延迟了阿尔茨海默病相关的退化(图1A,3C)。该肽还有助于提高至随访期的第6个月的认知行为的参数，这由空间参考记忆的探索值(特别是累计距离和平台穿越)反映出来(图1B-D，图2，图3D)。PCR阵列研究(表2)显示神经-肽类似物，除了几种可能的，长期活性之外，可能对于学习有着短期的有益效果。
基因组和蛋白质组学研究阐明了MIA-690作用的进一步的可能机制。根据PCR阵列实验，GHRH拮抗剂影响几乎两打的公认的阿尔茨海默病标志的转录(表2)。最值得注意的实例涉及淀粉样蛋白-β的代谢，微管系统，凋亡，神经信号转导，和能量平衡。对于淀粉样蛋白-β的代谢，转录研究表明对APPs和淀粉样蛋白-β前体蛋白结合蛋白(APP-BP)s的显著抑制。进一步，GHRH拮抗剂减少了产生淀粉样蛋白-β的BACE2和γ-分泌酶复合物的几个组分(早老素1，早老素2，前咽缺陷因子1和呆蛋白)的转录。在本文所述的实验中，可以在该家族的“C”和“G”成员中发现有大幅度的减少。所观察到的低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)6的下调提供了证据证明MIA-690可以影响淀粉样蛋白-β的降解，因为LRPs，与α2-巨球蛋白和ApoE配合，是淀粉样蛋白-β分泌/断裂的调节中的主要因子。在微管结合蛋白(MAP)s中观察到类似的变化。MAP2和MAPτ二者被下调。这些基因组变化的标志(淀粉样蛋白-β1-42和总τ水平)通过蛋白质组学测定被证实。由于MIA-690的治疗，淀粉样蛋白-β1-42水平显示出特别显著的减少(图5)。
由于GHRH拮抗剂或IGF-1信号传导减少导致的氧化胁迫的减轻在针对淀粉样蛋白-β的蛋白质毒性的保护中似乎也起着重要的作用。在本文描述的实验中，MIA-690显著减少了HCN-2细胞的自由基形成(图6)。进一步，这种GHRH拮抗剂剂量依赖地增加GPx1的水平，而它对SOD2的分泌没有显著影响(图6)。看来MIA-690直接刺激CNS中的保护性抗氧化酶。因此，本文的发现证明MIA-690治疗动物的抗氧化系统的活性不只是被动地响应自由基负荷，而且主动上调相关的ROS分解代谢酶。由蛋白质毒性引发的氧化胁迫不可避免地导致凋亡。与我们的抗氧化实验的结果完全一致，MIA-690剂量依赖地增加了淀粉样蛋白-β1-42处理的HCN-2细胞的存活力(图6)。GHRH拮抗剂还减少了胱天蛋白酶和凝集素的转录(表2)，这二者在CNS的凋亡过程中都起着重要的作用。进一步，GHRH拮抗剂治疗减少了APP-BPs和神经前体细胞表达和发育下调基因(NEDD)8活化酶E1-亚基1的表达，这二者在类泛素化修饰(neddylation)中配合，类泛素化修饰是一种导致凋亡的翻译后标记过程。
GHRH-GH-IGF轴的不同水平的抑制明显对于阿尔茨海默病的发展具有有益效果。与其对身体的效果相比，有可能GHRH-GH-IGF-I轴的激活对于老年人的认知行为具有修复作用(rejuvenating action)。虽然IGF-II对GHRH-GH轴的依赖远不及IGF-I，重要的是，在本文公开的实验中，强调肽的长期给药也减少脑样品中IGF-II的表达(表2)。因此，虽然MIA-690的短期给药在HCN-2组织培养物中不影响IGF-II的分泌，该肽对于记忆的直接效果可能干扰其对于神经退化的有益作用。
本公开证明肽自由穿过血脑屏障并且明显靶向阿尔茨海默病的不同水平的病理学级联，抑制聚集和蛋白毒性，同时恢复正常神经元代谢和再生。
实施例5：细胞存活力检测
HCN-2细胞(American Type Culture Collection(美国典型培养物保藏中心),Manassas,Virginia,USA)在DMEM培养基(加入10％的胎牛血清(FBS)和0.1％的青霉素/链霉素)中在37℃并在大气和5％CO2的气氛下。细胞被直接接种于96-孔的微孔板上，密度为5,000个细胞/cm2。7天后，允许细胞数目加倍(直至70-80％的融合度)，加入含有25ng/ml NGF，0.5mM双丁酰cAMP和0.5mM异丁基甲基黄嘌呤(IBMX)(均得自Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)的新鲜培养基诱导HCN-2细胞分化一周。然后人淀粉样蛋白-β1-42(Sunnyvale,CA)储液(10mM)被制备于TRIS中，并立即被稀释至在检测培养基中的合适的浓度。用于神经毒性检测的培养基是含有2％FBS的加入N2的DMEM/F12(Gibco BRL,NY)。治疗组是对照，淀粉样蛋白-β1-42，和淀粉样蛋白-β1-42和3种剂量(10nM,100nM和1μM)的类似物(MIA-602,MIA-606和MIA-640)的组合治疗。暴露四天后使用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二丙基溴化四氮唑(MTT)检测(Cell Titer非放射性细胞增殖检测,Promega,Madison,WI)评价类似物对于细胞存活力的效果，根据制造商的说明进行。所有被检测的肽减轻了与淀粉样蛋白-β1-42共同给药治疗对于神经元存活力的毒性影响(图7)。

Claims (31)

1.一种治疗患有阿尔茨海默病的受试者的方法，所述方法包括给药于所述受试者治疗量的具有SEQ ID NO:1(式I)的氨基酸序列的生长激素释放激素(GHRH)肽拮抗剂：
R1-Tyr1-D-Arg2-Asp3-A4-Ile5-A6-Thr7-A8-Har9-A10-A11-A12-Val13-Leu14-A15-Gln16-A17-Ser18-Ala19-A20-A21-Leu22-Leu23-Gln24-Asp25-Ile26-Nle27-D-Arg28-A29-R2-R3-NH2，
其中R1是PhAc、Nac、Oct、N-Me-Aib、Dca、Ac-Ada、Fer、Ac-Amc、Me-NH-Sub、PhAc-Ada、Ac-Ada-D-Phe、Ac-Ada-Phe、Dca-Ada、Nac、Nac-Ada、Ada-Ada或CH3(CH2)10-CO-Ada；
A4是Ala或Me-Ala；
A6是Cpa或Phe(F)5；
A8是Ala、Pal、Dip或Me-Ala；
A10是FPa5,Tyr(Alk)其中Alk是Me或Et；
A11是His或Arg；
A12是Lys、Lys(0-11)、Lys(Me)2或Orn；
A15是Abu或Orn；
A17是Leu或Glu；
A20是Har或His；
A21是Lys、Lys(Me)2或Orn；
A29是Har、Arg或Agm；
R2是β-Ala、Amc、Apa、Ada、AE2A、AE4P、ε-Lys(α-NH2)、Agm或不存在；并且
R3是Lys(Oct)、Ahx或不存在。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述GHRH肽拮抗剂具有SEQ ID NO:2(式II)的氨基酸序列：
R1-Tyr1-D-Arg2-Asp3-Ala4-Ile5-A6-Thr7-A8-Har9-A10-His11-Orn12-Val13-Leu14-Abu15-Gln16-A17-Ser18-Ala19-His20-Orn21-Leu22-Leu23-Gln24-Asp25-Ile26-Nle27-D-Arg28-Har29-R2-NH2,
其中R1是PhAc-Ada或PhAc；
A6是Phe(F)5或Cpa；
A8是Ala或Me-Ala；
A10是Tyr(Me)或FPa5；
A17是Leu或Glu；并且
R2是Ada、Agm或不存在。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述GHRH肽拮抗剂具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
4.如权利要求2所述的方法，其中所述GHRH肽拮抗剂具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
5.如权利要求2所述的方法，其中所述GHRH肽拮抗剂具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
6.如权利要求2所述的方法，其中所述GHRH肽拮抗剂具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
7.如权利要求2所述的方法，其中所述GHRH肽拮抗剂具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
8.如权利要求2所述的方法，其中所述GHRH肽拮抗剂具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述GHRH肽拮抗剂给药的剂量为约0.005mg/kg/剂至约100mg/kg/剂。
10.如权利要求1所述的方法，进一步包括将所述GHRH肽拮抗剂与选自由NMDA受体拮抗剂，淀粉样蛋白AB肽的抑制剂，磷酸二酯酶(PDE5)抑制剂，PDE4抑制剂，单胺氧化酶抑制剂，VEGF蛋白，营养生长因子，HIF活化剂，HIF脯氨酰A-羟化酶抑制剂，抗凋亡化合物，活性依赖性神经营养蛋白(ADNP)激动剂，活性依赖性神经营养因子(ADNF)激动剂，AMPA-型谷氨酸受体活化剂，血清素5-HT1A受体激动剂，血清素IA受体拮抗剂，烟碱α-7受体激动剂，神经元L-型钙通道调节剂，5-HT4受体激动剂，抗炎剂，及其药学上可接受的盐组成的组的至少一种治疗剂一同给药。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述GHRH肽拮抗剂与至少一种所述治疗剂联合给药、同时给药或顺序给药。
12.如权利要求1所述的方法，其中所述GHRH肽拮抗剂的所述给药是肠胃外给药。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述肠胃外给药选自由皮下、肌内、腹膜内、腔内、鞘内、透皮和静脉注射组成的组。
14.一种用于治疗患有淀粉样蛋白斑沉积的受试者的方法，所述方法包括给药于所述受试者治疗量的具有SEQ ID NO:1(式I)的氨基酸序列的生长激素释放激素(GHRH)肽拮抗剂：
R1-Tyr1-D-Arg2-Asp3-A4-Ile5-A6-Thr7-A8-Har9-A10-A11-A12-Val13-Leu14-A15-Gln16-A17-Ser18-Ala19-A20-A21-Leu22-Leu23-Gln24-Asp25-Ile26-Nle27-D-Arg28-A29-R2-R3-NH2,
其中R1是PhAc、Nac、Oct、N-Me-Aib、Dca、Ac-Ada、Fer、Ac-Amc、Me-NH-Sub、PhAc-Ada、Ac-Ada-D-Phe、Ac-Ada-Phe、Dca-Ada、Nac、Nac-Ada、Ada-Ada或CH3(CH2)10-CO-Ada；
A4是Ala或Me-Ala；
A6是Cpa或Phe(F)5；
A8是Ala、Pal、Dip或Me-Ala；
A10是FPa5、Tyr(Alk)，其中Alk是Me或Et；
A11是His或Arg；
A12是Lys、Lys(0-11)、Lys(Me)2或Orn；
A15是Abu或Orn；
A17是Leu或Glu；
A20是Har或His；
A21是Lys、Lys(Me)2或Orn；
A29是Har、Arg或Agm；
R2是β-Ala、Amc、Apa、Ada、AE2A、AE4P、ε-Lys(α-NH2)、Agm或不存在；并且
R3是Lys(Oct)、Ahx或不存在。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述GHRH肽拮抗剂具有SEQ ID NO:2(式II)的氨基酸序列：
R1-Tyr1-D-Arg2-Asp3-Ala4-Ile5-A6-Thr7-A8-Har9-A10-His11-Orn12-Val13-Leu14-Abu15-Gln16-A17-Ser18-Ala19-His20-Orn21-Leu22-Leu23-Gln24-Asp25-Ile26-Nle27-D-Arg28-Har29-R2-NH2,
其中R1是PhAc-Ada或PhAc；
A6是Phe(F)5或Cpa；
A8是Ala或Me-Ala；
A10是Tyr(Me)或FPa5；
A17是Leu或Glu；并且
R2是Ada、Agm或不存在。
16.如权利要求14所述的方法，其中所述淀粉样蛋白斑沉积与选自由地中海热，穆-韦二氏综合症，特发性骨髓瘤，淀粉样多神经病，淀粉样心肌病，系统性神经炎淀粉样变，淀粉样多神经病，遗传性脑出血伴淀粉样变，唐氏综合症，痒病，克雅氏病，库鲁病，格-斯二氏综合症，甲状腺髓样癌，孤立性心房淀粉样变性，透析患者β2-微球蛋白淀粉样变，包涵体肌炎，肌肉萎缩病中β2-淀粉样蛋白沉积，II型糖尿病，及其组合组成的组的疾病相关。
17.如权利要求14所述的方法，其中所述GHRH肽拮抗剂的所述给药是肠胃外给药。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述肠胃外给药选自由皮下、肌内、腹膜内、腔内、鞘内、透皮和静脉注射组成的组。
19.如权利要求14所述的方法，其中所述GHRH肽拮抗剂给药的剂量为约0.005mg/kg/剂至约100mg/kg/剂。
20.一种治疗患有神经退行性疾病的受试者的方法，所述方法包括给药于所述受试者治疗量的具有SEQ ID NO:1(式I)的氨基酸序列的生长激素释放激素(GHRH)肽拮抗剂：
R1-Tyr1-D-Arg2-Asp3-A4-Ile5-A6-Thr7-A8-Har9-A10-A11-A12-Val13-Leu14-A15-Gln16-A17-Ser18-Ala19-A20-A21-Leu22-Leu23-Gln24-Asp25-Ile26-Nle27-D-Arg28-A29-R2-R3-NH2,
其中R1是PhAc、Nac、Oct、N-Me-Aib、Dca、Ac-Ada、Fer、Ac-Amc、Me-NH-Sub、PhAc-Ada、Ac-Ada-D-Phe、Ac-Ada-Phe、Dca-Ada、Nac、Nac-Ada、Ada-Ada或CH3(CH2)10-CO-Ada；
A4是Ala或Me-Ala；
A6是Cpa或Phe(F)5；
A8是Ala、Pal、Dip或Me-Ala；
A10是FPa5、Tyr(Alk)，其中Alk是Me或Et；
A11是His或Arg；
A12是Lys、Lys(0-11)、Lys(Me)2或Orn；
A15是Abu或Orn；
A17是Leu或Glu；
A20是Har或His；
A21是Lys、Lys(Me)2或Orn；
A29是Har、Arg或Agm；
R2是β-Ala、Amc、Apa、Ada、AE2A、AE4P、ε-Lys(α-NH2)、Agm或不存在；并且
R3是Lys(Oct)、Ahx或不存在。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述神经退行性疾病选自阿尔茨海默病，老年痴呆，路易体痴呆，帕金森氏病，亨廷顿氏病，肌萎缩性脊髓侧索硬化症，及其组合。
22.如权利要求20所述的方法，其中所述GHRH肽拮抗剂具有SEQ ID NO:2(式II)的氨基酸序列：
R1-Tyr1-D-Arg2-Asp3-Ala4-Ile5-A6-Thr7-A8-Har9-A10-His11-Orn12-Val13-Leu14-Abu15-Gln16-A17-Ser18-Ala19-His20-Orn21-Leu22-Leu23-Gln24-Asp25-Ile26-Nle27-D-Arg28-Har29-R2-NH2,
其中R1是PhAc-Ada或PhAc；
A6是Phe(F)5或Cpa；
A8是Ala或Me-Ala；
A10是Tyr(Me)或FPa5；
A17是Leu或Glu；并且
R2是Ada、Agm或不存在。
23.如权利要求20所述的方法，其中所述GHRH肽拮抗剂的所述给药是肠胃外给药。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述肠胃外给药选自由皮下、肌内、腹膜内、腔内、鞘内、透皮和静脉注射组成的组。
25.如权利要求20所述的方法，其中所述GHRH肽拮抗剂给药的剂量为约0.005mg/kg/剂至约100mg/kg/剂。
26.一种保护神经元细胞免受氧化胁迫的方法，所述方法包括使所述神经元细胞与具有SEQ ID NO:1(式I)的氨基酸序列的生长激素释放激素(GHRH)肽拮抗剂接触：R1-Tyr1-D-Arg2-Asp3-A4-Ile5-A6-Thr7-A8-Har9-A10-A11-A12-Val13-Leu14-A15-Gln16-A17-Ser18-Ala19-A20-A21-Leu22-Leu23-Gln24-Asp25-Ile26-Nle27-D-Arg28-A29-R2-R3-NH2,
其中R1是PhAc、Nac、Oct、N-Me-Aib、Dca、Ac-Ada、Fer、Ac-Amc、Me-NH-Sub、PhAc-Ada、Ac-Ada-D-Phe、Ac-Ada-Phe、Dca-Ada、Nac、Nac-Ada、Ada-Ada或CH3(CH2)10-CO-Ada；
A4是Ala或Me-Ala；
A6是Cpa或Phe(F)5；
A8是Ala、Pal、Dip或Me-Ala；
A10是FPa5、Tyr(Alk)，其中Alk是Me或Et；
A11是His或Arg；
A12是Lys、Lys(0-11)、Lys(Me)2或Orn；
A15是Abu或Orn；
A17是Leu或Glu；
A20是Har或His；
A21是Lys、Lys(Me)2或Orn；
A29是Har、Arg或Agm；
R2是β-Ala、Amc、Apa、Ada、AE2A、AE4P、ε-Lys(α-NH2)、Agm或不存在；并且
R3是Lys(Oct)、Ahx或不存在。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述GHRH肽拮抗剂具有SEQ ID NO:2(式II)的氨基酸序列：
R1-Tyr1-D-Arg2-Asp3-Ala4-Ile5-A6-Thr7-A8-Har9-A10-His11-Orn12-Val13-Leu14-Abu15-Gln16-A17-Ser18-Ala19-His20-Orn21-Leu22-Leu23-Gln24-Asp25-Ile26-Nle27-D-Arg28-Har29-R2-NH2,
其中R1是PhAc-Ada或PhAc；
A6是Phe(F)5或Cpa；
A8是Ala或Me-Ala；
A10是Tyr(Me)或FPa5；
A17是Leu或Glu；并且
R2是Ada、Agm或不存在。
28.如权利要求26所述的方法，其中所使用的所述GHRH肽拮抗剂的局部浓度是约1nM至约100mM。
29.一种提高神经元细胞存活力的方法，所述方法包括使所述神经元细胞与具有SEQID NO:1(式I)的氨基酸序列的生长激素释放激素(GHRH)肽拮抗剂接触：
R1-Tyr1-D-Arg2-Asp3-A4-Ile5-A6-Thr7-A8-Har9-A10-A11-A12-Val13-Leu14-A15-Gln16-A17-Ser18-Ala19-A20-A21-Leu22-Leu23-Gln24-Asp25-Ile26-Nle27-D-Arg28-A29-R2-R3-NH2,
其中R1是PhAc、Nac、Oct、N-Me-Aib、Dca、Ac-Ada、Fer、Ac-Amc、Me-NH-Sub、PhAc-Ada、Ac-Ada-D-Phe、Ac-Ada-Phe、Dca-Ada、Nac、Nac-Ada、Ada-Ada、或CH3(CH2)10-CO-Ada；
A4是Ala或Me-Ala；
A6是Cpa或Phe(F)5；
A8是Ala、Pal、Dip或Me-Ala；
A10是FPa5、Tyr(Alk)，其中Alk是Me或Et；
A11是His或Arg；
A12是Lys、Lys(0-11)、Lys(Me)2或Orn；
A15是Abu或Orn；
A17是Leu或Glu；
A20是Har或His；
A21是Lys、Lys(Me)2或Orn；
A29是Har、Arg或Agm；
R2是β-Ala、Amc、Apa、Ada、AE2A、AE4P、ε-Lys(α-NH2)、Agm、或不存在；并且
R3是Lys(Oct)、Ahx、或不存在。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述GHRH肽拮抗剂具有SEQ ID NO:2(式II)的氨基酸序列：
R1-Tyr1-D-Arg2-Asp3-Ala4-Ile5-A6-Thr7-A8-Har9-A10-His11-Orn12-Val13-Leu14-Abu15-Gln16-A17-Ser18-Ala19-His20-Orn21-Leu22-Leu23-Gln24-Asp25-Ile26-Nle27-D-Arg28-Har29-R2-NH2,
其中R1是PhAc-Ada或PhAc；
A6是Phe(F)5或Cpa；
A8是Ala或Me-Ala；
A10是Tyr(Me)或FPa5；
A17是Leu或Glu；并且
R2是Ada、Agm或不存在。
31.如权利要求29所述的方法，其中所使用的所述GHRH肽拮抗剂的局部浓度是约1nM至约100mM。
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