KR101046425B1 - 신경교란　진정용 펩타이드 및 이를 포함하는 피부자극 완화용 조성물 - Google Patents

신경교란　진정용 펩타이드 및 이를 포함하는 피부자극 완화용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 하기 화학식 I 또는 화학식 II 로 표현되는 신경교란, 특히 피부신경교란 진정용 펩타이드 또는 이를 포함하는 피부자극 완화용 조성물에 관한 것이다:
[화학식 I]
Tyr-Pro-Phe-Phe-X
(단, X 는 글루탐산, 아스파트산, 히스티딘, 페닐알라닌, 알라닌, 시스테인, 글라이신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌, 루이신, 메티오닌, 이소루이신, 세린, 타이로신, 트레오닌, 라이신, 트립토판, 프롤린, 발린 또는 헥사노익산 중 하나의 아미노산임);
[화학식 II]
[Tyr-Pro-Phe-Phe-Y-Cys]2
(단, Y 는 비치환체, 글루탐산, 아스파트산, 히스티딘, 페닐알라닌, 알라닌, 시스테인, 글라이신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌, 루이신, 메티오닌, 이소루이신, 세린, 타이로신, 트레오닌, 라이신, 트립토판, 프롤린, 발린 또는 헥사노익산 중 하나의 아미노산이고;
[ ]2는 시스테인 잔기인 티올기 (-SH)의 환원체 형태(-S-S-)로 변형한 이중체 (dimer)이다).

Description

신경교란　진정용 펩타이드 및 이를 포함하는 피부자극 완화용 조성물 {The peptides for alleviating the nervous disturbance and the composition for reducing the sensory irritation in skin}
본 발명은 하기 화학식 I 또는 화학식 II 로 표현되는 신경교란, 특히 피부신경교란 진정용 펩타이드 또는 이를 포함하는 피부자극 완화용 조성물에 관한 것이다:
[화학식 I]
Tyr-Pro-Phe-Phe-X
(단, X 는 글루탐산, 아스파트산, 히스티딘, 페닐알라닌, 알라닌, 시스테인, 글라이신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌, 루이신, 메티오닌, 이소루이신, 세린, 타이로신, 트레오닌, 라이신, 트립토판, 프롤린, 발린 또는 헥사노익산 중 하나의 아미노산임);
[화학식 II]
[Tyr-Pro-Phe-Phe-Y-Cys]2
(단, Y 는 비치환체, 글루탐산, 아스파트산, 히스티딘, 페닐알라닌, 알라닌, 시스테인, 글라이신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌, 루이신, 메티오닌, 이소루이신, 세린, 타이로신, 트레오닌, 라이신, 트립토판, 프롤린, 발린 또는 헥사노익산 중 하나의 아미노산이고;
[ ]2는 시스테인 잔기인 티올기 (-SH)의 환원체 형태(-S-S-)로 변형한 이중체 (dimer)이다).
과민성 혹은 민감성 피부에 신체 외부 또는 내부 자극이 주어지면, 자극에 의해 감각신경계의 민감성이 증가되어 유해감각인지가 비정상적으로 유발되는 것으로 알려 있다.
특히나, 피부에 도포하여 사용하는 약물 혹은 화장품에 포함되는 약리학적/화장학적 유효성분 또는 제형화를 위한 여러 부형제들에 대해 신체에서는 감각계의 유해감각인지가 일어나서 극심한 자극감이 유발되는 경우가 많으며, 이러한 자극감을 감소시키기 위해서 감각신경섬유의 과다활성을 억제하거나 중추신경의 흥분상태를 진정시킬 수 있는 약물에 대한 관심이 모아지고 있다.
이러한 약물로서 중추신경계를 포함한 신경계의 흥분상태를 직접적으로 조절할 수 있는 마취제, 최면제, 진통제, 항불안제 등이 사용가능 하지만, 약물의존성이 높아지거나 부작용이 극심하여 사용이 극히 제한된다.
따라서, 말초신경, 특히 구심성 감각신경섬유의 과다활성을 억제하는 약물의 개발을 위한 많은 연구가 진행되고 있으며, 특히 통증의 중추신경계로의 전달에 관련된 신경학적 메커니즘을 억제하여 자극감을 감소시키기 위한 연구가 많이 수행되고 있다.
대표적으로, 통증수용체로 알려진 TRPV1 에 대한 연구가 많이 진행되고 있는데, TRPV1은 피부, 뇌, 척수 등 모든 신경계에서 발현되며, 열, pH 및 이온 등의 신체 내외부의 변화를 감지하고, 염증성 신경전달 물질인 substance P를 유발하는 감각뉴런에서 통증자극(nociceptive stimuli)을 통합하는 수용체이다. TRPV-1은 외부자극에 의해 나타나는 열과 pH 변화에 의해서 신경섬유에서 신경전달물질인 substance P, CGRP등의 발현을 통해 신경성(neurogenic) 염증 반응을 유발한다고 알려져 있다.
이에 본 발명자들 또한 신체 내외부 자극에 의해 유발되는 신경교란을 진정시키기 위한 물질들을 개발하기 위해 집중적인 연구를 수행하던 중, 본 발명에 따른 펩타이드들이 매우 우수한 신경 교란을 진정시킬 수 있는 효능이 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
따라서, 본 발명은 신경교란을　진정시킬 수 있는 펩타이드를 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 피부신경의　교란을　진정시킬 수 있는 펩타이드를 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기한 펩타이드를 포함하는 피부자극　완화용 조성물을 제공하는 데 있다.
상기한 목적으로 달성하기 위하여,
본 발명에 따른 신경교란 진정용 펩타이드는 하기 화학식 I 또는 화학식 II 로 표현되는 화합물인 것을 특징으로 한다:
[화학식 I]
Tyr-Pro-Phe-Phe-X
(단, X 는 글루탐산, 아스파트산, 히스티딘, 페닐알라닌, 알라닌, 시스테인, 글라이신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌, 루이신, 메티오닌, 이소루이신, 세린, 타이로신, 트레오닌, 라이신, 트립토판, 프롤린, 발린 또는 헥사노익산 중 하나의 아미노산임);
[화학식 II]
[Tyr-Pro-Phe-Phe-Y-Cys]2
(단, Y 는 비치환체, 글루탐산, 아스파트산, 히스티딘, 페닐알라닌, 알라닌, 시스테인, 글라이신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌, 루이신, 메티오닌, 이소루이신, 세린, 타이로신, 트레오닌, 라이신, 트립토판, 프롤린, 발린 또는 헥사노익산 중 하나의 아미노산이고;
[ ]2는 시스테인 잔기인 티올기 (-SH)의 환원체 형태(-S-S-)로 변형한 이중체 (dimer)이다).
본 발명에 따르면, N-말단은 아실화(acylation)되거나 되지 않을 수 있다. N-말단을 아실화시키는 경우는 친수성에 가까운 N-말단이 소수성 성질로 변화됨에 따라 생체내 존재하는 다양한 단백질 가수분해 효소(protease) 중 N-말단 부위를 인식하여 단백질 또는 펩타이드를 절단하는 효소에 분해되는 것을 억제하여 생체내 안정성을 유도할 수 있다.
또한, 본 발명에 따르면, C-말단은 카르복실산(CO2H) 또는 아미드(CONH2)일 수 있다. 펩타이드의 C-말단의 카르복실산 부분을 아미드기 형태로 변화시키는 경우, 펩타이드 또는 단백질의 C-말단을 인식하여 절단하는 단백질 가수분해 효소 (protease)에 의한 펩타이드의 절단을 억제할 수 있어 바람직하다. 즉, C-말단을 아미드기 형태로 치환하는 경우 단백질 가수분해 효소는 C-말단을 다른 아미노산과 결합된 형태로 인식하기 때문에 효소 반응이 일어나지 않는다.
본 발명에 따른 신경교란 진정용 펩타이드는 감각신경계의 민감성이 증가되어 유해감각인지가 비정상적인 경우를 효과적으로 진정시킬 뿐만 아니라, 과민성 혹은 민감성 피부에 대해도 신경교란 진정 작용을 통한 자극 완화에도 효과적임이 본 발명자들에 의해서 확인되었다.
따라서, 본 발명에 따른 신경교란 진정용 펩타이드가 피부자극 완화용 조성물에 사용될 경우, 외부 자극 혹은 생리학적 유용성분의 신체 적용에 따른 자극, 예를 들면 작열통, 국소염증성 통증감각, 쑤심, 따끈거림, 소양증, 뜨거움, 염증, 불쾌감, 땡김,　통증 등을 완화시키는데 사용될 수 있음이 본 발명자들에 의해 확인되었다.
도 1은 본 발명에 따른 신경교란 진정용 펩타이드가 신경자극 유발물질인 SLS (sodium lauryl sulfate)에 의한 자극을 억제함을 홀-셀 패치 클램프 (whole-cell patch clamp) 방법으로 감각신경뉴런(내측전정핵뉴런)에서 적출한 세포에서 칼륨 전류를 측정하여 확인한 결과를 보여주는 도면이다.
도 2는 본 발명에 따른 신경교란 진정용 펩타이드가 피부신경을 교란하는 물질로서 캡사이신에 대한 피부의 민감성/자극성/반응성/과민성을 억제하여 피부자극 완화효능을 가짐을 보여주는 도면이다.
본 발명에 따른 펩타이드는 하기 화학식 I 또는 화학식 II 로 표현되는 화합물인 것을 특징으로 한다:
[화학식 I]
Tyr-Pro-Phe-Phe-X
(단, X 는 글루탐산, 아스파트산, 히스티딘, 페닐알라닌, 알라닌, 시스테인, 글라이신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌, 루이신, 메티오닌, 이소루이신, 세린, 타이로신, 트레오닌, 라이신, 트립토판, 프롤린, 발린 또는 헥사노익산 중 하나의 아미노산임);
[화학식 II]
[Tyr-Pro-Phe-Phe-Y-Cys]2
(단, Y 는 비치환체, 글루탐산, 아스파트산, 히스티딘, 페닐알라닌, 알라닌, 시스테인, 글라이신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌, 루이신, 메티오닌, 이소루이신, 세린, 타이로신, 트레오닌, 라이신, 트립토판, 프롤린, 발린 또는 헥사노익산 중 하나의 아미노산이고;
[ ]2는 시스테인 잔기인 티올기 (-SH)의 환원체 형태(-S-S-)로 변형한 이중체 (dimer)이다).
본 발명에 따르면, N-말단은 아실화(acylation)되거나 되지 않을 수 있다. N-말단을 아실화시키는 경우는 친수성에 가까운 N-말단이 소수성 성질로 변화됨에 따라 생체내 존재하는 다양한 단백질 가수분해 효소(protease) 중 N-말단 부위를 인식하여 단백질 또는 펩타이드를 절단하는 효소에 분해되는 것을 억제하여 생체내 안정성을 유도할 수 있다.
또한, 본 발명에 따르면, C-말단은 카르복실산(CO2H) 또는 아미드(CONH2)일 수 있다. 펩타이드의 C-말단의 카르복실산 부분을 아미드기 형태로 변화시키는 경우, 펩타이드 또는 단백질의 C-말단을 인식하여 절단하는 단백질 가수분해 효소 (protease)에 의한 펩타이드의 절단을 억제할 수 있어 바람직하다. 즉, C-말단을 아미드기 형태로 치환하는 경우 단백질 가수분해 효소는 C-말단을 다른 아미노산과 결합된 형태로 인식하기 때문에 효소 반응이 일어나지 않는다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.
본원 명세서에서 사용된 용어 '신경교란'은 신체 내/외부　자극에　의해　신경반응성이　비정상적으로　대응하여　신체에서　불편하고　불유쾌하게　인지하는 상태를 의미한다.
본원 명세서에서 사용된 용어　'피부신경교란'은　피부에　존재하는　말초감각신경이 내/외부　자극에　의해　피부감각신경 반응성이　비정상적으로　흥분되어　피부에서유해한　감각으로　불유쾌하게　인지하는 상태를 의미한다.
본원 명세서에서 사용된 용어 '내부자극'은 호르몬,　비정정상적　신경기능이상　등의　신체　내부에서　기인하여　발생되는 자극을 의미한다.
본원 명세서에서 사용된 용어　'외부자극'은　신체　외부에서　유래하여　영향을　미치는　온도, 접촉,　압력, 진동 및　이물질을　포함하는　물리화학적　자극물질　등의　유/무형　잠재적　자극요인　의해　발생하는 자극을 의미한다.
본원 명세서에서 사용된 용어 '피부자극'은　피부에 전달되는　내부　또는　외부　자극에　의해　유발되는 자극을 의미하며, 쑤심, 따끈거림, 소양증, 뜨거움, 염증, 불쾌감, 땡김,　통증 등을 포함한다.
본 발명에 따른 신규한 신경교란 진정용 펩타이드는 신체 내부자극 또는 외부자극에 의해서 인지 또는 유발되는 다양한 민감성 감각을 완화시키는 진정기능을 갖는 것을 특징으로 한다.
특히, 본 발명에 따른 펩타이드는 피부신경계, 특히 유해감각을 인지하고 중추신경계로 전달하는 말초의 구심성 감각신경에서 신경계의 과민흥분성을 억제하는 진정기능을 갖는다.
따라서, 본 발명에 따른 상기 펩타이드는 신경교란　진정용 펩타이드, 특히 피부 신경교란　진정용 펩타이드로 이용될 수 있다.
모든 신경 세포는 전기적인 흥분성을 띠며, 신경 세포는 이온 통로, 이온 펌프등을 이용하여 나트륨, 칼륨, 칼슘, 염소이온들을 세포막 안과 밖의 농도차를 만들어 막전위를 형성한다. 외부 자극에 의한 신호가 신경으로 전달되기 전 일상적인 상태의 막전위를 휴지 전위라고 하며, 형성된 휴지 전위가 전달된 신호에 의해 이온 통로들이 열리고 닫히면서 일시적으로 흥분하여 휴지 전위 이상으로 튀어오르는 것을 활동 전위라고 한다. 신경세포는 이 활동 전위를 이용하여 신호를 전달한다. 휴지전위상태는 세포 안쪽이 바깥쪽에 비해서 상대적으로 음(-)전하를 띠는 상태인데, 세포막에 존재하는 나트륨 펌프는 나트륨이온 3개를 세포 밖으로 내보내면서 칼륨이온 2개를 세포 안으로 들여 보내어 세포 내부를 음(-) 전하로 만든다.
일반적으로 휴지 전위 상태에서는 세포 바깥쪽의 나트륨이온 농도는 세포 안에 비해 10배 정도가 높다. 신경세포가 흥분상태가 되면, 세포막에 있는 이온 통로가 열리면서 농도 차에 의해 세포 밖의 나트륨이온이 세포 안으로 빠르게 들어와서 세포 안쪽이 양전하를 띠게 되는 활동전위 상태가 유발되면서 신경자극이 시작된다. 흥분이 끝나면 나트륨이온이 통과할 수 있는 통로가 닫히고, 나트륨 펌프가 작동하여 나트륨 이온을 세포 밖으로 운반하여 다시 휴지전위 상태를 유지한다.
홀-셀 패치 클램프 (whole-cell patch clamp) 방법으로 외부자극이 존재하는 상황에서 막전위를 테스트하였을 때, 본 발명에 따른 신경교란 진정용 펩타이드가 칼륨 전류의 억제 또는 나트륨 전류의 증가 현상이 감소되어 신경 교란을 진정시킴을 확인하였다.
또한, 본 발명자들은 본 발명에 따른 신경교란 진정용 펩타이드가 피부자극을 완화하는데 우수한 성능을 가지고 있음을 확인하였다.
한편, 상기 화학식 I로 표현되는 신경교란 진정용 펩타이드는 예를 들면 하기의 구조를 갖는 화합물로부터 선택된 것일 수 있다:
Ac-YPFFC-NH2, Ac-YPFFA-NH2, Ac-YPFFD-NH2, Ac-YPFFE-NH2, Ac-YPFFF-NH2, Ac-YPFFG-NH2, Ac-YPFFH-NH2, Ac-YPFFI-NH2, Ac-YPFFK-NH2, Ac-YPFFL-NH2, Ac-YPFFM-NH2, Ac-YPFFN-NH2, Ac-YPFFP-NH2, Ac-YPFFQ-NH2, Ac-YPFFR-NH2, Ac-YPFFS-NH2, Ac-YPFFT-NH2, Ac-YPFFV-NH2, Ac-YPFFW-NH2, Ac-YPFFY-NH2, Ac-YPFF-Hex-NH2, Ac-YPFFGC-NH2
또한, 상기 화학식 II로 표현되는 신경교란 진정용 펩타이드는 예를 들면 하기의 구조를 갖는 화합물로부터 선택된 것일 수 있다:
[Ac-YPFFC-NH2]2, [Ac-YPFFDC-NH2]2, [Ac-YPFFEC-NH2]2, [Ac-YPFFFC-NH2]2, [Ac-YPFFHC-NH2]2, [Ac-YPFFIC-NH2]2, [Ac-YPFFKC-NH2]2, [Ac-YPFFGC-NH2]2, [Ac-YPFFLC-NH2]2, [Ac-YPFFMC-NH2]2, [Ac-YPFFNC-NH2]2, [Ac-YPFFPC-NH2]2, [Ac-YPFFQC-NH2]2, [Ac-YPFFRC-NH2]2, [Ac-YPFFSC-NH2]2, [Ac-YPFFTC-NH2]2, [Ac-YPFFVC-NH2]2, [Ac-YPFFWC-NH2]2, [Ac-YPFFYC-NH2]2, [Ac-YPFF-Hex-C-NH2]2
상기 펩타이드의 아미노산 서열에서, N-말단의 Ac- 는 아실 치환된 N-말단을 의미하며, C-말단의 -NH2 는 C-말단이 아미드로 치환된 CONH2 인 것을 의미한다.
본 발명에 따르면, N-말단의 아실 치환체 또는 C-말단의 아미드 치환체는 생체내에서 단백질 가수분해 효소에 의한 절단을 억제하여 생체내 안정성을 확보하기 위한 것일 뿐, 실제 펩타이드의 효능을 변화시키지 않는다는 것을 자명하다.
상기 펩타이드는 유사한 신경교란 진정 성능 및 펩타이드의 안정성을 크게 저하시키지 않는 범위에서 아미노산의 삽입, 치환, 삭제가 가능하며, 이 또한 본 발명의 범주 내이다.
또한, 본 발명에 따른 신경교란 진정용 펩타이드는 펩타이드의 세포내 이동을 촉진하는 세포 투과성 펩타이드(cell permeable peptide)를 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 세포 투과성 펩타이드에는 TAT 펩타이드 (RKKRRYRRR) 및 Tat-PTD 펩타이드(GRKKRRQRRR: Tat PTD)일 수 있으나, 본 발명이 이에 국한되는 것은 아니며, 당업계에 공지된 세포 투과성 펩타이드가 본 발명에 따른 펩타이드의 신경교란 진정 활성을 저해하지 않는 범위내의 것이라면, 본 발명의 범위 내이다.
한편, 본 발명의 펩타이드는 염의 형태로 존재할 수도 있다. 본 발명에 사용 가능한 염의 형태는 화합물의 최종 분리 및 정제 동안 또는 아미노기를 적절한 산과 반응시키는 것에 의해 만들어지는 것일 수 있다. 예를 들면, 산 부가염으로 아세테이트, 아디페이트, 알기네이트, 시트레이트, 아스파테이트, 벤조에이트, 벤젠설포네이트, 바이설페이트, 부티레이트, 캄포레이트, 캄포설포네이트, 디글루코네이트, 글리세로포스페이트, 헤미설페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 포르메이트, 푸마레이트, 하이드로 클로라이드, 하이드로브로마이드, 하이드로요오다이드, 2-하이드록시에탄설포네이트, 락테이트, 말레에이트, 메시틸렌설포네이트, 메탄설포네이트, 나프틸렌설포네이트, 니코티네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 옥살레이트, 파모에이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 3-페닐프로피오네이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 숙시네이트, 타르트레이트, 트리클로로아테이트, 트리플루오로아세테이트, 포스페이트, 글루타메이트, 바이카보네이트, 파라-톨루엔설포네이트 및 운데카노에이트일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 산 부가염을 형성하기 위해 사용될 수 있는 산의 예로는 염산, 브롬화수소산, 황산 및 인산과 같은 무기산 및 옥살산, 말레산, 숙신산 및 시트르산과 같은 유기산일 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.
한편, 본 발명에 따른 상기 펩타이드는 피부자극의　완화효과를 가지고 있어, 피부　내부　또는　외부에서 유도되는 피부　자극에　의해　유발되는 쑤심, 따끈거림, 소양증, 뜨거움, 염증, 불쾌감, 땡김,　통증 등의　피부자극을　완화시키는데 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 상기한 본 발명에 따른 신경교란 진정용 펩타이드, 특히 피부신경 교란 진정용 펩타이드를 포함하는 피부자극 완화용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 피부자극 완화용 조성물은 본 발명에 따른 신경교란 진정용 펩타이드, 특히 피부신경 교란 진정용 펩타이드를 조성물 총 중량에 대하여 0.000001-10중량% 포함하는 것을 특징으로 한다.
특히, 본 발명에 따른 피부자극 완화용 조성물은 피부 자극이 강한 약리학적 또는 화장학적 기능성 성분들과 함께 사용할 경우, 상기 기능성 성분들에 의해 유발되는 자극을 감소시킬 수 있다.
본 발명에 따른 피부자극 완화용 조성물은 피부 민감성/반응성/과민성/자극성 피부를 가진 사람에게 처방될 경우, 매우 유용할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 신규 신경교란 진정용 펩타이드 화합물의 안정화, 제제화 또는 생체내 전달을 위하여 당업계에 알려진 통상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있으며, 예를 들면, 당 사슬 화합물, 지질 화합물, 핵산 화합물, 펩타이드 또는 단백질 등을 포함할 수 있다.　예를 들어, 지질 화합물에는 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 팔미토일 올레일포스파티딜글리세롤(POPG), 포스파티딜글리세롤(PG), C18 포화 지방산, C16 불포화 지방산, C18 불포화 지방산 등이 있다.
본 발명의 조성물은 투여 방식에 따라 허용 가능한 담체를 포함하여 적절한 제제로 제조될 수 있다.　이때, 투여 방식에 적합한 제제는 당업계에 공지되어 있으며, 바람직하게는 생체로의 전달에 용이한 제제일 수 있다.
본 발명의 신경교란 진정용 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 본 발명에 따른 조성물은 일반적인 의약품 제제의 형태일 수 있다.　비경구용 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제, 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있고; 경구 투여 제제에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 포함할 수 있고; 주사제에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 포함할 수 있고; 국소 투여 제제에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 포함할 수 있다.　
본 발명에 따른 조성물의 약제학적 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있으며,　예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릴시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수 회 투약 형태로 제조할 수 있다.
적절한 투여 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입되는 일반적인 경로를 통하여 투여된다.　복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.　그러나 경구 투여시, 펩티드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화하는 것이 바람직하다.　또한, 본 발명에 따른 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.　바람직한 투여방식 및 제제는 정맥 주사제, 피하 주사제, 피내 주사제, 근육 주사제, 점적 주사제 등이다. 주사제는 생리식염액, 링겔액 등의 수성 용제, 식물유, 고급 지방산 에스텔(예, 올레인산에칠 등), 알코올류(예, 에탄올, 벤질알코올, 프로필렌글리콜, 글리세린 등) 등의 비수성 용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 변질 방지를 위한 안정화제(예, 아스코르빈산, 아황산수소나트륨, 피로아황산나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA 등), 유화제, pH 조절을 위한 완충제, 미생물 증식을 억제하기 위한 보존제(예, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레솔, 벤질알코올 등) 등의 약제학적 담체를 포함할 수 있다.
본 발명의 펩타이드 또는 이를 포함하는 조성물은 약학적으로 유효량으로 투여한다. 질환의 종류, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 경로, 투여 방법, 투여횟수, 치료 기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물 등 의학분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
예를 들면 본 발명에 따른 신경과민 진정용 펩타이드의 생체 투여 또는 도포 용량은 신경교란 진정 성능을 나타내기 위한 정도이면 제한되지 않으며, 당업자라면 목적하는 효과를 나타내기 위한 투여분량을 적의선정할 수 있다.
한편, 본 발명에 따르면, 본 발명의 신경교란 진정용 펩타이드는 인간뿐만 아니라 유사한 생체면역반응을 보일 수 있는 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개, 고양이 등의 가축에게도 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 신경교란 진정용 펩타이드는 당업계에 공지된 펩타이드 합성 기술, 예를 들어 고체상 및 용액상 합성 기술 등에 의해 합성될 수 있다. 고체상 펩타이드 합성을 위한 기술은 문헌 [J.M. Stewart and J.D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, (1963) W.H. Freeman Co. (San Francisco); J. Meienhofer, Hormonal Proteins and Peptides, (1973) vol. 2, p. 46, Academic Press (New York)] 등을 참조할 수 있다. 또한, 통상적인 용액 합성에 대한 기술은 문헌 [G. Schroder and K. Lupke, The Peptides, (1965) vol. 1, Academic Press (New York)]을 참조할 수 있다.
일반적으로, 본 발명에서는 펩타이드의 합성 방법으로 고체상에 일정하게 결합된 아미노산 골격에 하나 이상의 아미노산 또는 적합하게 보호된 아미노산을 연속적으로 아미드 결합을 형성하는 방식으로 제조하였으나, 본 발명이 이에 한정되지 않는다는 것은 자명하다.
일반적으로, 제1 아미노산의 아미노기 또는 카복실기는 적합한 보호기에 의해 보호될 수 있다. 보호된 아미노산은 고체 지지체에 부착되거나 아미드 결합을 형성하기에 적합한 조건하에서 다음의 아미노산을 첨가함으로써 용액중에서 반응이 이루어질 수 있다. 또한, 보호기는 적합한 보호기로 보호된 아미노산을 첨가하기 이전에 완전히 제거된다. 모든 아미노산이 목적하는 바에 따라 연결된 후, 유리된 잔류 보호기 및 유리된 고형 지지체로부터 연속적으로 또는 동시에 분리하여 최종 목적하는 펩타이드를 얻는다.
본 발명에서는 일반적으로 키랄 센터가 라세미화되지 않는 조건하에서 적합하게 보호된 테트라펩타이드를 적절하게 보호된 또 다른 디펩타이드와 축합시켜 아미드결합을 형성시킨 후 탈보호하여 목적하는 헥사펩타이드를 합성하여 얻는 절편 축합반응 기술을 또한 이용할 수 있다.
본 발명의 펩타이드 화합물을 제조하기 위한 가장 바람직한 합성 방법으로는 고체상 폴리머 지지체를 이용하여 합성하는 고체상 펩타이드 합성 방법이며 특히 α-아미노기는 산 또는 염기 민감성 작용기에 의해 보호된다. 보호기는 펩타이드 축합 반응 조건에서 안정한 성질을 가져야만 하고 연장되는 펩타이드 사슬의 파괴 없이 또는 거기에 함유된 임의의 키랄 센터의 라세미체화 없이 용이하게 제거 가능한 성질을 가져야만 한다. 이와 같이 적합한 보호기들로는 9-플루오레닐메틸옥시카보닐(Fmoc), t -부톡시카보닐(Boc), 벤질옥시카보닐(Cbz), 비페닐이소프로필-옥시카보닐, t-아밀옥시카보닐, 이소보르닐옥시카보닐, (α,α)-디메틸-3,5-디메톡시벤질옥시카보닐, O-니트로페닐설페닐, 2-시아노-t-부틸옥시카보닐 등일 수 있으며, 이러한 목적으로 당업계에 알려진 적합한 다른 보호기들 또한 본 발명의 범위 내이다.
본 발명에 따른 펩타이드 합성에서 가장 바람직한 보호기로는 9-플루오레닐메틸옥시카보닐 (Fmoc) 보호기이며, 대부분 Fmoc 보호기로 보호된 아미노산을 합성 원료로 이용하는 것이 바람직하다.
특히, 본 발명의 펩타이드 합성에서 사용되는 아미노산 잔기의 보호기로는 아르기닌의 경우 2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-설포닐(Pmc) 및 2,2,4,6,7-펜타메틸디하이드로벤조푸란-S-설포닐(Pbf)이고; 아스파라긴의 경우, 트리틸(Trt)이고; 아스파트산의 경우, t-부틸(t-Bu)이고; 글루타민의 경우, 트리틸(Trt)이고; N-메틸글루타민산의 경우, t-부틸(t-Bu)이고; 히스티딘의 경우, 트리틸(Trt)이고; 라이신의 경우, t-부톡시카보닐(Boc)이고; 세린의 경우, 7t-부틸(t-Bu)이고; 트레오닌 및 알로트레오닌의 경우, t-부틸(t-Bu)이고; 트립토판의 경우, t -부톡시카보닐(Boc)이고; 티로신의 경우, t-부틸(t-Bu)인 것이 바람직하지만, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
고체상 펩타이드 합성 방법에서, C-말단 아미노산은 적합한 고형 지지체 또는 수지에 부착된다. 상기 합성을 위해 유용한 적합한 고형 지지체로는 단계적 축합-탈보호 반응의 시약 및 반응 조건에 불활성이고 사용되는 매질에 불용성인 물질이 바람직하며, 예를 들면 링크 아미드(rink amid) 또는 링크 아미드 4-메틸벤질히드릴아민(MBHA) 수지(rink amid MBHA resin)일 수 있다. 특히, C-말단 아미드 펩타이드에 대해 바람직한 고형 지지체는 Novabiochem Corporation 로부터 시판되는 링크 아미드 4-메틸벤질히드릴아민(MBHA) 수지일 수 있다.
C-말단 아미드(amide)는 디클로로메탄, N-메틸피리돈(NMP) 또는 DMF과 같은 용매중에서 10℃ 내지 50 ℃의 온도에서, 바람직하게는 30 ℃의 온도조건에서, 약 1 내지 24 시간 동안 4-디메틸아미노피리딘 (DMAP), 1-하이드록시벤조트리아졸 (HOBt), N-메틸모르폴린 (NMM), 벤조트리아졸-1-일옥시-트리스(디메틸아미노)포스포늄-헥사플루오로포스페이트(BOP) 또는 비스(2-옥소-3-옥사졸리디닐)포스핀클로라이드(BOPCI)의 존재 또는 부재하에서 N,N'-디사이클로헥실카보디이미드(DCC), N,N'-디이소프로필카보디이미(DIC), [O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄헥사플루로포스페이트](HATU) 또는 O-벤조트리아졸-1-일-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄헥사플루오로포스페이트(HBTU)에 카르복실 산을 활성화시켜 축합을 통해 수지 또는 고체상 지지체에 커플링된다.
고형 지지체가 rink amide MBHA 수지인 경우, 바람직한 보호기로서 Fmoc 작용기는 C-말단 아미노산으로 커플링하기 전에 2급 아민 용액, 바람직하게는 20%의 피페리딘 DMF 용액을 과량 사용하여 절단한다. 상기 탈보호된 4-(2',4'-디메톡시페닐-Fmoc-아미노메틸)페녹시아세트아미도에틸 수지에 목적하는 제1 아미노산을 축합시키는데 사용되는 바람직한 시약들로는 적합하게 보호된 제1 아미노산 (1당량)에 대하여 DMF 용매중에서 N-메틸모르폴린(NMM, 1당량), 1-하이드록시벤조트리아졸 (HOBt, 1당량) 및 [O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄헥사플루오로포스페이트] (HATU, 1당량), O-벤조트리아졸-1-일-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄헥사플루오로포스페이트(HBTU, 1당량), N,N'-디사이클로헥실카보디이미드(DCC) 또는 N,N'-디이소프로필카보디이미드 (DIC)과 같은 축합 반응 시약들이다.
본 발명에서 수행되는 연속적인 아미노산의 축합은 관련 기술 분야에서 널리 알려져 있는 자동 펩타이드 합성기 또는 수동으로 직접 수행할 수 있다. 바람직한 합성 반응의 조건으로는 Fmoc 작용기로 보호된 α-아미노산을 2급 아민 용액, 바람직하게 피페리딘으로 처리하여 탈보호시킨 후, 과량의 용매로 세척하고 커플링을 원하는 또 다른 각각의 보호된 아미노산을 이어서 약 5배 몰 과량 첨가하여 바람직하게는 DMF 용매 중에서 반응을 수행한다.
본 발명에서 고체상 수지를 이용한 펩타이드의 합성 마지막 단계에서는 펩타이드를 연속적으로 또는 1회 조작으로 수지로부터 얻고자 하는 펩타이드를 제거하고 각각 아미노산의 잔기를 보호하고 있는 보호기들을 탈보호시킨다. 수지로부터 펩타이드의 제거 및 잔기에 존재하는 보호기들의 탈보호 조건으로는 일반적으로 수지-펩타이드 간의 결합을 절단하는 절단 시약 칵테일, 예를 들어, 트리플루오로아세트산(TFA), 트리이소프로필실란(TIS), 티오아니졸, 물 또는 에탄디티올 (EDT)등으로 구성된 디클로로메탄 혼합 칵테일 용액을 처리하여 얻을 수 있다. 이렇게 얻어진 혼합 용액은 냉장 보관된 디에틸에테르 용매를 과량 처리함으로써 침전물을 생성시킨다. 상기 얻어진 침전물을 원심분리시켜 완전히 침전시키고 과량의 트리플루오로아세트산, 트리이소프로필실란, 티오아니졸, 물 및 에탄디티올 등을 일차 제거하고 이상의 절차를 2회 정도 반복하여 고형화시킨 침전물을 얻는다.
완전히 탈보호된 펩타이드 염은 물과 아세트나이트릴 용매로 구성된 혼합 용매를 흘리고 역상 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 분리 정제한다. 분리 정제된 펩타이드 용액은 동결건조 시켜 완전히 농축 건조 시킴으로써 고형의 펩타이드를 얻는다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하지만, 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
하기 실시예 및 명세서 전반에서 약어 및 표기어는 다음과 같은 의미를 가진다.
명세서 전반에 걸쳐 기재된 펩타이드내 아미노산 및 아미노아실 잔기의 α-탄소의 입체화학은 'L' 혹은 'D' 형상일 수 있다. 카흔-인골드-프레로그 'R' 및 'S' 명명을 사용하여 본 발명의 펩타이드의 N-말단에서 특정 아실 치환체내 키랄 센터의 입체화학을 표기할 수 있다.
'R, S'의 명명은 2개의 에난티오머 형태의 라세믹 혼합물을 지칭한다. 당해 명명법은 문헌 [R.S. Cahn, et al., Angew.Chem. Int. Ed. Engl., (1966) 5, 385-415 ]에 기재된 명명에 따른다.
모든 펩타이드 서열은 α-N-말단 아미노산 잔기를 좌측에 α-C-말단을 우측상에 기재하는 일반적으로 허용되는 협약에 따라 기재되었다.
본원에 사용된 바와 같이, 'α-N-말단'은 펩타이드내 아미노산의 유리 α-아미노기를 언급하고, 용어 'α-C-말단'은 펩타이드내 아미노산의 유리 α-카복실산 말단을 언급한다. 대부분, 본원에 사용되는 천연적으로 존재하고 비천연적으로 존재하는 아미노아실 잔기에 대한 명명은 유기화학의 명명에 대한 IUPAC 위원회 및 문헌 ['Nomenclature of α-Amino Acids (Recommendations, 1974)' Biochemistry, (1975) 14(2)]에 제시된 바와 같은 생화학 명명에 관한 IUPAC-IUB 위원회에 의해 제안된 명명법 협약에 따른다. 본 명세서 및 첨부된 청구항에 사용되는 천연적으로 존재하거나 비천연적으로 존재하는 아미노산의 명명 및 약어는 아래와 같이 표기한다.
Ala, A: 알라닌; Arg, R: 아르기닌; Asn, N: 아스파라긴; Asp, D: 아스파틱산; Cys, C: 시스테인; Glu, E: 글루타믹산; Gln, Q: 글루타민; Gly, G: 글리신; His, H: 히스티딘; Ile, I: 이소루이신; Leu, L: 루이신; Lys, K: 라이신; Met, M: 메티오닌; Nle: 노오루이신; Phe, F: 페닐알라닌; Pro, P: 프롤린; Ser, S: 세린; Thr, T: 트레오닌; Trp, W: 트립토판; Tyr, Y: 티로신; Val, V: 발린, Hex: 헥사노익산
DMF: N,N-디메틸포름아미드; DCC: N,N'-디사이클로헥실카보디이미드; DIC: N,N'-디이소프로필카보디이미드; DIEA: 디이소프로필에틸아민; EDT: 에틸 디티올; HOBt: 1-하이드록시벤조 트리아졸; HBTU: O-벤조트리아졸-1-일-N,N,N',N',-테트라메틸우로늄헥사플루오로포스페이트; MC: 디클로로메탄; NMM: N-메틸모르폴린 NMP: N-메틸피리돈; TIS: 트리이소프로필실란 및 TFA: 트리플루오로아세트산.
위에서 약어로서 표기되지 않은 경우, 명명법 및 약어는 문헌[Calbiochem-Novabiochem Corp. 1999 Catalog and Peptide Synthesis Handbook or the Chem-Impex International, Inc. Tools for Peptide amp; Solid Phase Synthesis 1998-1999 Catalogue]을 참조하여 추가할 수 있다.
[실시예]
실시예 1 : 화합물 01 내지 22 의 합성
화합물 01: Ac-YPFFC-NH2의 합성:
Novabiochem corporation으로부터 구입한 rink amide MBHA resin (g당 0.6 mmol이 로딩된 수지)을 50 mg(0.03 mmol) 측량하여 반응용기에 넣었다. 수지를 3 ml의 DMF로 용매화시키고 5분간 충분히 스웰링(swelling)시킨 다음, 20% 피페리딘 DMF 용액을 3 ml 첨가하고 10분간 진동배양 시키고 피페리딘 용액을 제거한 후, 10 ml의 DMF 용매를 이용하여 5회 이상 세척하였다.
Fmoc-Cys(Trt) (87.8 mg, 0.15 mmol), HOBt(20 mg, 0.15 mmol) 및 DIC(0.02 ml, 0.15 mmol)를 2 ml의 DMF 용매에 완전히 녹인 후, 수지에 첨가하였다. 반응액를 실온에서 8 시간 정도 진동배양 시킨 후, 10 ml의 DMF 용매로 5회 이상 세척하였다. 20% 피페리딘 DMF 용액을 3 ml 첨가하고 10분간 진동배양시키고 피페리딘 용액을 제거한 후 다시 20% 피페리딘 DMF용액을 첨가하여 10분간 반응시켜 수지에 보호되어 있는 Fmoc 보호기를 완전히 제거하고 10 ml의 DMF 용매를 이용하여 5회 이상 세척하였다. 이 단계에서 Fmoc 보호기의 탈보호 반응 여부를 Kaiser test[E. Kaiser et al. Anal. Biochem.(1970) 34, 595]를 실시하여 확인하였다.
그런 다음, 아래와 동일한 합성 주기에 따라 연속적으로 커플링시켰다:
(1) DMF 용매(10 ml)로 5회 이상 세척; (2) 20% 피페리딘 DMF 용액(3 ml)을 사용하여 10분간 2회 탈보호; (3) DMF 용매(10 ml)로 5회 이상 세척; (4) Fmoc-아미노산의 첨가; (5) 커플링 시약을 첨가하여 아미노산 활성화 및 2 시간 커플링; (6) DMF 용매(10 ml)로 5회 이상 세척.
Fmoc으로 보호된 아미노산(3당량 이상)은 다음에 기술된 순서로 수지 반응용기에 첨가하여 커플링시켰다: (2) Fmoc-Phe , 2 시간 커플링; (3) Fmoc-Pro , 2 시간 커플링; (4) Fmoc-Tyr(tBu) , 2 시간 커플링; 20% 피페리딘 DMF 용액 처리.
합성 종결 즉시, 펩타이드가 커플링된 수지를 3 시간 동안 TFA/티오아니졸/EDT/TIS/ 물(95:5:2.5:2.5:2.5)의 혼합물을 사용하여 수지로부터 절단하였다. 이렇게 얻어진 혼합 용액은 냉장 보관된 디에틸에테르 용매를 과량 처리함으로써 침전물을 생성시켰다. 얻어진 침전물을 원심분리시켜 완전히 침전시키고 과량의 트리플루오로아세트산, 티아니졸 및 에탄디티올 등을 일차 제거하고 이상의 절차를 2회 정도 반복하여 고형화시킨 침전물을 얻었다.
얻어진 펩타이드를 C-18 칼럼을 사용하고 50분에 걸쳐 0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물 농도구배 용매 시스템을 사용하는 HPLC로 정제하였다. 순수 정제된 분획물을 동결건조시켜 백색 분말형의 트리플루오로아세테이트염으로서 Ac-YPFFC-NH2을 얻었다.
화합물 01: Ac-YPFFC-NH2: MS(ESI)m/e, [M+H]+= 717.
상기 화합물 01과 동일한 제조 과정을 이용하여 아래와 같은 펩타이드를 제조하였다.
화합물 02: Ac-YPFFA-NH2: MS(ESI)m/e, [M+H]+= 686.
화합물 03: Ac-YPFFD-NH2: MS(ESI)m/e, [M+H]+= 730.
화합물 04: Ac-YPFFE-NH2: MS(ESI)m/e, [M+H]+= 744.
화합물 05: Ac-YPFFF-NH2: MS(ESI)m/e, [M+H]+= 762.
화합물 06: Ac-YPFFG-NH2: MS(ESI)m/e, [M+H]+= 672.
화합물 07: Ac-YPFFH-NH2: MS(ESI)m/e, [M+H]+= 752.
화합물 08: Ac-YPFFI-NH2: MS(ESI)m/e, [M+H]+= 728.
화합물 09: Ac-YPFFK-NH2: MS(ESI)m/e, [M+H]+= 743.
화합물 10: Ac-YPFFL-NH2: MS(ESI)m/e, [M+H]+= 728.
화합물 11: Ac-YPFFM-NH2: MS(ESI)m/e, [M+H]+= 746.
화합물 12: Ac-YPFFN-NH2: MS(ESI)m/e, [M+H]+= 729.
화합물 13: Ac-YPFFP-NH2: MS(ESI)m/e, [M+H]+= 712.
화합물 14: Ac-YPFFQ-NH2: MS(ESI)m/e, [M+H]+= 743.
화합물 15: Ac-YPFFR-NH2: MS(ESI)m/e, [M+H]+= 771.
화합물 16: Ac-YPFFS-NH2: MS(ESI)m/e, [M+H]+= 702.
화합물 17: Ac-YPFFT-NH2: MS(ESI)m/e, [M+H]+= 716.
화합물 18: Ac-YPFFV-NH2: MS(ESI)m/e, [M+H]+= 714.
화합물 19: Ac-YPFFW-NH2: MS(ESI)m/e, [M+H]+= 801.
화합물 20: Ac-YPFFY-NH2: MS(ESI)m/e, [M+H]+= 778.
화합물 21: Ac-YPFF-Hex-NH2: MS(ESI)m/e, [M+H]+= 728.
화합물 22: Ac-YPFFGC-NH2: MS(ESI)m/e, [M+H]+= 775.
실시예 2: 화합물 23 내지 42 의 제조
화합물 23: [Ac-YPFFC-NH2]2의 합성:
실시예 1의 합성 방법을 통해 제조된 화합물 01 (Ac-YPFFC-NH2)을 완충 용액 [ACN : 0.1 M NH4HCO3=1:1 (v/v)]에 10 mg / ml 농도로 희석한 후, 실온에서 12 시간 동안 격렬하게 교반시켜, [Ac-YPFFC-NH2]2 의 분자간에 디설파이드 (disulfide) 결합된 펩타이드를 얻었다.
화합물 23: [Ac-YPFFC-NH2]2: MS(ESI)m/e, [M+H]+= 1432.
상기 화합물 23과 동일한 제조 과정을 이용하여 아래와 같은 펩타이드를 제조하였다.
화합물 24: [Ac-YPFFDC-NH2]2: MS(ESI)m/e, [M+H]+= 1665.
화합물 25: [Ac-YPFFEC-NH2] 2: MS(ESI)m/e, [M+H]+= 1693.
화합물 26: [Ac-YPFFFC-NH2]2: MS(ESI)m/e, [M+H]+= 1729.
화합물 27: [Ac-YPFFHC-NH2]2: MS(ESI)m/e, [M+H]+= 1708.
화합물 28: [Ac-YPFFIC-NH2]2: MS(ESI)m/e, [M+H]+= 1661.
화합물 29: [Ac-YPFFKC-NH2]2: MS(ESI)m/e, [M+H]+= 1691.
화합물 30: [Ac-YPFFGC-NH2]2: MS(ESI)m/e, [M+H]+= 1547.
화합물 31: [Ac-YPFFLC-NH2]2: MS(ESI)m/e, [M+H]+= 1661.
화합물 32: [Ac-YPFFMC-NH2]2: MS(ESI)m/e, [M+H]+= 1697.
화합물 33: [Ac-YPFFNC-NH2]2: MS(ESI)m/e, [M+H]+= 1663.
화합물 34: [Ac-YPFFPC-NH2]2: MS(ESI)m/e, [M+H]+= 1629.
화합물 35: [Ac-YPFFQC-NH2]2: MS(ESI)m/e, [M+H]+= 1691.
화합물 36: [Ac-YPFFRC-NH2]2: MS(ESI)m/e, [M+H]+= 1747.
화합물 37: [Ac-YPFFSC-NH2]2: MS(ESI)m/e, [M+H]+= 1609.
화합물 38: [Ac-YPFFTC-NH2]2: MS(ESI)m/e, [M+H]+= 1637.
화합물 39: [Ac-YPFFVC-NH2]2: MS(ESI)m/e, [M+H]+= 1633.
화합물 40: [Ac-YPFFWC-NH2]2: MS(ESI)m/e, [M+H]+= 1807.
화합물 41: [Ac-YPFFYC-NH2]2: MS(ESI)m/e, [M+H]+= 1761.
화합물 42: [Ac-YPFF-Hex-C-NH2]2: MS(ESI)m/e, [M+H]+= 1661.
실시예 3: 펩타이드의 신경세포 흥분성 억제작용
신경계의 세포를 대상으로 직접 전기적 흥분성의 지표를 측정하여 본 발명에 따른 신경교란 진정용 펩타이드의 피부감각 민감성 반응의 완화효과를 확인하였다. 신경세포의 억제와 흥분신호에 관여하는 특정한 이온들의 전위차를 측정하기 위해 홀-셀 패치 클램프 (whole-cell patch clamp) 방법으로 칼륨 전류 및 나트륨 전류를 측정하였다.
구심성 감각신경뉴런(내측전정핵뉴런)에서 적출한 세포를 대상으로 피부에서 신경교란, 특히 민감한 자극을 일으키는 것으로 알려진 계면활정제 SLS (sodium lauryl sulfate)를 처리하여 신경계의 과민상태를 유발시켰다. 본 발명에 따른 펩타이드의 신경교란 진정효과를 확인하기 위하여, SLS와 함께 compound 1 (화합물 01, Ac-YPFFC-NH2) 및 compound 2 (화합물 23, [Ac-YPFFC-NH2]2)를 각각 1 uM 의 농도로 처리하였다.
이때 발생되는 칼륨 전류를 측정하여 기록하였다. 기록용 전극은 미세유리전극제조기(Narishige, 일본)와 microforge (Narishige, 일본)를 이용하여 저항이 3-5 메가옴(megaohm)이 되도록 제작하였다. 막전류 및 전압고정과 막전압 및 전류의 측정은 Axopatch 200B patch clamp amplifier(Axon, Foster City, CA, USA)를 이용하였으며, Digidata 1200B(Axon, Foster City, CA, USA) interface를 통하여 컴퓨터와 연결하였다. 막전류 및 전압 조절과 실험결과 얻어진 전류의 기록 및 자료 분석은 pClamp 8 software (Axon, Foster City, CA, 미국)를 사용하였으며, 전류는 10 kHz로 여과하며, series resistance는 Axopatch 200B patch clamp amplifier의 series resistance compensation circuit를 이용하여 보상하였다.
SLS는 내측 전정핵 뉴론의 칼륨 전류를 농도의존적으로 전류값 감소시켰으며, 본 발명의 펩타이드의 측정조건은 voltage clamp mode 하에서 칼륨 전류 측정하기 위해 세포막 유지전압을 -70 mV로 하고 10 mV 간격으로 -60 mV에서 +40 mV까지 단계적으로 탈분극펄스를 매 10초마다 400 msec 동안 자극하였다.
그 결과는 하기 표 1 및 도 1에서 보는 바와 같다. SLS 로 신경교란을 유발시키면서 compound 1 과 compound 2 를 전처리한 경우(도 1의 A 및 B), SLS만을 처리한 경우(도 1의 C 및 D)와 비교하여 칼륨 전류의 감소를 유의하게 억제하였다.
또한, compound 1과 compound 2를 10 ug/ml 세포 외액에 미리 첨가하여 전처리한 다음, 40 μM SLS을 관류시켜도 칼륨 전류는 SLS 농도의존적으로 감소되지 않았다. 따라서, 본 발명에 다른 신경교란 진정용 펩타이드가 신경세포의 흥분성을 진정시키거나 예방하는 효과를 갖고 있음을 알 수 있다.
A. B. C. D.
compound 1 + SLS 40 μM compound 2 + SLS 40 μM SLS 20 μM SLS 40 μM
칼륨 이온 전류 6400± 307 pA 6020± 106 pA 4500± 213 pA, 3200±179 pA,
Student t-test (p<0.05) (p<0.05)
실시예 4: 펩타이드의 피부자극 완화작용
전신상태가 건강하고 이학적 검사상 피부질환이 없으며 신경과민성 등의 증상이 없는 20대 17명의 지원자들을 대상으로 본 발명에 따른 펩타이드의 피부자극 완화 작용, 즉 피부 유해감각인지에 관한 평가시험을 수행하였다. 피부에서 대표적인 유해감각인 따가움, 작열감을 유발하는 캡사이신(capsaicin) 0.025중량% 또는 각각 0.001중량%의 compound 1/compound 2 와 캡사이신의 혼합물을 뺨 중앙부에 바르고 난 후 3, 6, 9, 15, 30, 60분간 시간경과에 따라 느끼는 감각인지의 강도를 척도수치로 정량화하여 기록(Visual analogue scale)하여 평가하였다.
감각인지의 강도는 아래의 표 2와 같이 10점척도로 수행하였다.
0-1 2-3 3-4 5-6 7-8 9-10
무감각 매우약한자극감 약한자극감각 보통의 자극감 약간심한 자극감 매우심한자극감
실험에 사용된 캡사이신은 인체에서 대표적인 유해감각수용체로 알려진 TRPV1수용체를 선택적으로 감작하는 물질로서 온도 43도, 산성 pH에서 느끼는 작열감, 통증, 따가움증을 매개하는 화합물로 알려져 있다.
그 결과는 하기 표 3 및 도 2 에서 보는 바와 같다.
3분 6분 9분 15분 30분 60분
캡사이신 0.025% 4.6±1.7 4.9±
1.5		 4.8±
1.3		 4.3±
1.4		 3.3±
1.4		 1.8±
1.3
캡사이신 0.025% + compound 1 3.1±
0.7		 2.8±
0.6		 2.2±
0.6		 1.8±
0.7		 1.0±
0.6		 0.8±
0.5
캡사이신 0.025% + compound 2 2.1±
1.0		 2.1±
1.0		 1.8±
0.4		 1.4±
0.7		 0.7±
0.6		 0.5±
0.5
상기 표 3 및 도 2에서 보는 바와 같이, 피부가 따가운 유해감각을 인지하는 시간적인 변화상 느껴지는 최대의 감각시점은 캡사이신만을 바른 후 3 내지 15분 경과할 즈음이고 30분에 감소되어 60분에 이르면 상당히 감소하는 것을 볼 수 있다. 한편, compound 1 및 compound 2를 15분간 밀폐첩포로 전처리한 경우에는 이러한 따가운 유해감각을 느끼는 정도가 캡사이신만 바른 경우에 비해 상대적으로 현저하게 감소되는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명에 따른 신경교란 진정용 펩타이드는 피부신경을 교란하는 물질에 대한 피부의 민감성/자극성/반응성/과민성을 억제하여 피부자극 완화 기능을 가짐을 알 수 있다.

Claims (9)

  1. YPFFC, [YPFFC]2, Ac-YPFFC-NH2 및 [Ac-YPFFC-NH2]2로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고, [ ]2는 시스테인 잔기인 티올기 (-SH)의 환원체 형태(-S-S-)로 변형한 이중체(dimer)이고, 상기 Ac 는 아세틸, 9-플루오레닐메틸옥시카보닐, t-부톡시카보닐, 벤질옥시카보닐, 비페닐이소프로필-옥시카보닐, t-아밀옥시카보닐, 이소보르닐옥시카보닐, (a,a)-디메틸-3,5-디메톡시벤질옥시카보닐, O-니트로페닐설페닐, 3-시아노-t-부톡시옥시카보닐로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 신경교란 진정용 펩타이드.
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  8. 제1항에 따른 신경교란 진정용 펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 피부자극　완화용 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 피부자극은 신체　내부　또는　외부　자극에　의해　유발되는 쑤심, 따끈거림, 소양증, 뜨거움, 염증, 불쾌감, 땡김,　통증인 것을 특징으로 하는　피부자극　완화용 조성물.
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