CN102459310B - 包含能够增强屏障功能的肽水解产物的化妆品组合物和/或药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及富含生物活性肽的肽水解产物，其能够增强皮肤屏障功能和刺激表皮分化。本发明还涉及化妆品和/或药物组合物，其包含在生理学可接受的介质中的作为活性成分的所述水解产物。本发明还涉及本发明的活性成分在化妆品组合物中的用途，所述化妆品组合物用于活化皮肤细胞中的HMG?CoA还原酶以及用于预防和控制老化和光老化的皮肤迹象。

Description

包含能够增强屏障功能的肽水解产物的化妆品组合物和/或药物组合物
本发明属于化妆品和药学领域，更特别地是皮肤病学领域。本发明涉及富含生物活性肽的肽水解产物，其能够增强皮肤屏障功能和刺激表皮分化。所述生物活性肽的特征在于其包含4-6个氨基酸，所述氨基酸包括至少一个甘氨酸残基、一个亮氨酸残基和一个谷氨酸残基。优选地，所述活性成分来自选自单粒小麦、马铃薯、玉米、豌豆、大豆的植物蛋白或来自酵母菌属的酵母蛋白的水解。本发明还涉及组合物，所述组合物包含富含生物活性肽的作为能够增强表皮的屏障功能的活性成分的肽水解产物，所述肽水解产物在生理学可接受的介质中。本发明还涉及药物组合物，所述药物组合物包含作为药物的该新活性成分。最后，本发明涉及作为活性成分的所述肽水解产物激活HMG-CoA还原酶的用途。本发明还涉及作为活性成分的所述肽水解产物增强皮肤屏障功能和刺激表皮分化的用途。本发明还适于用于预防和/或抵抗外界应激和皮肤老化迹象的化妆品治疗方法。
表皮的首要功能是构建外界环境和内部环境之间的屏障。表皮的最外层即表皮的角质层确保了这一功能。它是由处于分化末期的角质形成细胞即角质层细胞组成的，这些细胞通过弹性的且不可渗透的厚细胞间粘合质相互密封。因此，排列成多层结构的由角质层细胞组成的细胞区室和主要由脂质组成的胞外区室在角质层中非常明显。
人类角质层的脂质含量约为15％胆固醇酯、16％游离长链饱和脂肪酸、32％胆固醇和37％神经酰胺，然而个体间的差异较为显著(NorlenL.等人，J.Invest.Dermatol.1999；112(1)第72-77页)。这些脂质由来自表皮中层的角质形成细胞合成并且分泌在被称作“板层小体”或Odland体的专门的细胞器中。特别地，表皮合成胆固醇非常活跃的部位。该合成的限速步骤并且也是最精细的调控步骤为3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)转化成甲羟戊酸。该步骤是由被称作HMG-CoA还原酶(E.C.1.1.1.34)的膜结合酶催化的。人基因组测序数据表明HMG-CoA还原酶至少存在两种同工酶，它们由位于染色体5上的唯一的基因编码(Luskey等人，JBiolChem.，1985260(18)，p.10271-7)。
在皮肤中，胆固醇在膜的流动性中起作用，特别是它表现出确保脂质双层中烃链的活动性(MartiniM.C.，Pathol.Biol.2003，(51)，267-270)。因此，在生理条件下，以维持内环境稳定必需的水平合成胆固醇。另一方面，在皮肤屏障发生突然改变后，观察到显著且快速的胆固醇合成增加，这与HMG-CoA还原酶的表达和活性的增加相关(MenonG.K.等人，J.Lipid，Res.，1985，(26)，P.418-427)。
HMG-CoA还原酶的关键作用使其成为调节有机体中胆固醇表达的主要靶点。因此，开发了一类用于抑制HMG-CoA还原酶的被称作他汀类的药理学化合物，其目的是降低循环胆固醇。他汀类的这一抑制剂作用还体现于人类皮肤中。事实上，通过局部途径实验性给药他汀类破坏皮肤的屏障功能(ProkschE.等人，BritishJ.Dermatol.，1993，(128)，p.473-482)。这些结果验证了胆固醇在表皮屏障功能中的重要性以及HMG-CoA还原酶在调节胆固醇合成中的重要作用。
当皮肤老化时，皮肤屏障的完整性及其修复能力发生改变。观察到脂质的整体缺乏，这导致角质层胞外区室的脂质多层减少。这些功能性改变与老化皮肤对外界应激的敏感性增加相关(GhadiallyR.等人，JClinInvest.，1995(95(5)，p.2281-90)。
在外界应激过程中可不依赖于内因性老化或光诱导老化而产生皮肤屏障的改变。
在这一背景下，需要尽力防止改变或者重建表皮的屏障功能。在这一具体领域中，已大量记载了脂质组分例如神经酰胺(EP1272148，US2007576937)或一些胆固醇衍生物(FR2789312)的直接提供。另一方面，还记载了使用植物油活化皮肤脂质的合成。(EP1707189)。在化妆品领域中，为了获得抗衰老作用，已开发了HMG-CoA还原酶的分子靶向以抑制该关键酶，例如通过使用已知具有HMGCOA-抑制活性的他汀类(EP0738510)。但是，迄今为止，无任何文件描述或暗示本发明的目的，即，本发明的富含生物活性肽的肽水解产物可以具有增强皮肤屏障功能和刺激表皮分化的令人感兴趣的性质。通过这一作用，还可改善与屏障功能相关的一些病理学功能障碍(过敏性、受刺激的或反应性的皮肤、特应性湿疹)。
本发明的第一个目的是富含生物活性肽的能够增强表皮的屏障功能的肽水解产物，其特征在于所述水解产物包含4-6个氨基酸，所述氨基酸包括至少一个甘氨酸残基、一个亮氨酸残基和一个谷氨酸残基。
事实上，本发明人已证明了包含一些特殊的肽(在下文中被称作生物活性肽)的肽水解产物在化妆品和治疗、特别是皮肤病学方面的活性。
具体而言，本发明人已证明了当将富含生物活性肽的肽水解产物施用至皮肤时，其增强表皮的屏障功能和刺激表皮分化。这些性质以通过更好地防护皮肤组织免受外界应激的侵害和组成表皮角质层的脂质形成增加得到证明。
根据本发明，“生物活性肽”应理解为至少四个氨基酸的连接，所述氨基酸由肽键或修饰的肽键相互连接并且具有以本发明的活性成分的活性为特征的体内或体外活性。
本发明的特征性生物活性在体外被定义为所述肽通过以下方式激活HMG-CoA还原酶的能力：增加HMG-CoA还原酶的蛋白质合成(直接或间接调节HMG-CoA还原酶的基因表达)，或者增加HMG-CoA还原酶的酶活性，或者其它生物过程例如使HMG-CoA还原酶蛋白稳定或使信使RNA转录物稳定。
皮肤应理解为指构成皮肤和粘膜的所有覆盖组织，包括上皮附件(毛发、眼睫毛、体毛、眉毛)。
“肽水解产物”应理解为指主要以肽或寡肽为代表的化合物的混合物。根据本发明，术语“肽水解产物”或“活性成分”等同使用。
“肽性化合物”应理解为指存在于本发明的肽水解产物中的蛋白质片段、肽或游离氨基酸。
“局部施用”应理解为指将本发明的活性成分或包含它的组合物施用至或涂抹至皮肤或粘膜表面的行为。“生理学可接受的”应理解为表示本发明的肽水解产物或包含它的组合物适合与皮肤或粘膜接触而不会引起毒性或不耐受反应。
根据本发明实施方案的特别有利的方法，包含于所述水解产物中的生物活性肽具有通式(I)的序列
X1-[Gly，Glu，Leu]-X2-X3
其中，
X1是丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸，或无氨基酸，
X2是丝氨酸或苏氨酸，
X3是亮氨酸、异亮氨酸，或无氨基酸。
根据本发明实施方案的特别优选的方法，所述生物活性肽具有如下序列：
(SEQIDNo.1)Ala-Glu-Gly-Leu-Ser-Ile
(SEQIDNo.2)Leu-Gly-Glu-Ser-Leu
(SEQIDNo.3)Val-Gly-Glu-Leu-Thr
(SEQIDNo.4)Ile-Gly-Glu-Leu-Ser
(SEQIDNo.5)Ala-Gly-Glu-Leu-Ser
(SEQIDNo.6)Gly-Glu-Leu-Thr-Ile
(SEQIDNo.7)Gly-Glu-Leu-Ser。
根据特别令人感兴趣的实施方案，所述生物活性肽对应SEQIDNo.5序列。
可通过提取植物源或酵母源的蛋白质，然后进行释放其中存在生物活性肽的肽性化合物的受控水解(controlledhydrolysis)来获得本发明的活性成分。
肽水解产物特别是低分子量的肽水解产物的使用在化妆品领域中具有许多优点。除了生成原本不存在于起始蛋白质混合物中的肽性化合物之外，水解和纯化使得能够获得容易标准化且不引起皮肤病学或化妆品过敏反应的更稳定的混合物。
还可能无需纯化对应于本发明的生物活性肽的肽性化合物，但是通过适合的分析方法确保所述肽的存在来使用一些水解的提取物。
非常多的存在于植物和酵母中的蛋白质很可能在它们的结构中包含生物活性肽。受控水解使这些特定的肽性化合物能被释放。有可能但不一定通过以下方式实施本发明：首先提取相关的蛋白质然后将它们水解，或者首先对粗提取物进行水解然后纯化所述肽性化合物。
根据优选的实施方案，所述活性成分来自选自单粒小麦、马铃薯、玉米、豌豆、大豆的植物蛋白或酵母菌属种的酵母蛋白的水解。优选地，所使用的植物不进行预先发酵。
因此，可通过使用小单粒小麦种子(Triticummonococcum)实施本发明，所述单粒小麦为包含特别高的蛋白质水平的非常古老的二倍体小麦(Vallega1992)。
还可通过使用茄属并且更特别的是马铃薯(Solanumtuberosum)种的马铃薯块茎实施本发明。所述块茎不属于植物的根而是属于它的地下茎，从其伸展出被称作根茎的更细的分枝，在其末端形成块茎。
还可通过使用来自玉蜀黍属并且优选玉米(ZeamaysL)种的许多植物之一的种子实施本发明。根据本发明，所使用的植物材料为种子，并且优选通过去壳步骤去除所述种子的壳。
还可通过使用来自豆科(Fabaceae)的许多植物之一实施本发明。根据本发明，使用来自豌豆种豌豆(PisumsativumL)的植物。术语豌豆也指种子，其本身富含蛋白质(25％)。还可通过使用大豆属(大豆)的豆科种子或者豆粕，并且优选大豆种(GlycineMaxL.)的豆科种子实施本发明。根据本发明，所使用的植物材料为种子，并且优选通过去壳步骤去除所述种子的壳。
还可通过使用酵母菌属并且优选酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)种的酵母实施本发明。
可使用本领域技术人员已知的任何提取或纯化方法制备本发明的水解产物。
在第一步中，使用植物碾磨机碾磨种子或植物的特定部分(叶、块茎、根等)。接着可以通过使用常规的有机溶剂(例如乙醇、己烷或丙酮)将由此获得的粉末“脱脂”。
对于酵母而言，在第一步中，在适合它们生长的培养基中，优选在乳糖存在下常规培养所述酵母。通过离心收集所述酵母，然后将其悬浮在缓冲液、优选磷酸盐缓冲液中。在第二步中，使用弗氏细胞压碎器或者使用球磨机使细胞破碎，通过离心或过滤分离大部分的不溶性膜组分。
然后，按照改良的常规方法(Osborne，1924)提取蛋白质；将植物研磨材料或酵母裂解物悬浮于包含不溶性聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)型吸附剂产品(0.01-20％)的碱性溶液中；确实观察到该方法有助于后续的水解和纯化操作。特别是显著降低了与蛋白质相互作用的酚类物质的浓度。
在离心和过滤步骤之后收集包含蛋白质、碳水化合物以及可能存在的脂质的可溶性组分。然后在受控条件下水解该粗溶液以生成可溶性肽。水解被定义为涉及通过水将分子裂解的化学反应，该反应可在中性、酸性或碱性介质中进行。根据本发明，以化学方式和/或有利地通过蛋白质水解酶进行水解。接着可利用植物源的内切蛋白酶(木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶)和微生物(曲霉菌属、根霉菌属、芽孢杆菌属等)。选择水解条件以促进生物活性肽的富集。
由于如上文所述的相同原因，即除去多酚类物质，在该受控水解步骤中向反应介质中加入一定量的聚乙烯聚吡咯烷酮。过滤、除去酶和聚合物后，所得滤液(溶液)构成了本发明活性成分的最初形式。
可再纯化在该阶段获得的水解产物以选择低分子量部分，优选低于6kDa的部分，并且根据它们的性质选择生成的肽。通过孔隙率不断降低的滤器进行连续的超滤步骤，保留每一步骤的滤液，和/或通过色谱型方法，可有利地进行分级分离，从而特异性地使所述水解产物富含生物活性肽。
本发明进行在水中或在任何包含水的混合物中稀释的步骤，然后通过超滤灭菌以获得特征是蛋白质含量为0.5-5.5g/l的肽水解产物。该肽水解产物对应本发明的活性成分的最高纯化形式。
在高压液相色谱法(HPLC)中对根据本发明获得的肽水解产物进行定性和定量分析，使得能够分析分子量为0.2-25kDa(根据适合溶剂的梯度)的蛋白质。然后分析可被分离的不同的肽部分的生物学效应。然后通过质谱法分析这些不同的部分以特异性鉴定每一个峰的肽的氨基酸含量。还进行了测序分析以确定所述生物活性肽的肽序列。
所得水解产物由分子量低于6kDa，优选低于6kDa的肽组成，并且富含4-6个氨基酸的生物活性肽，所述氨基酸包括至少一个甘氨酸残基、一个亮氨酸残基和一个谷氨酸残基。
本发明的第二个目的是组合物，所述组合物包含作为能够增强表皮的屏障功能的活性成分的本发明的富含生物活性肽的肽水解产物，所述肽水解产物在生理学可接受的介质中。
根据本发明的有利的实施方案，以最终组合物的总重计，本发明的活性成分以约0.0001％-20％的浓度，优选约0.05％-5％的浓度存在于本发明的组合物中。
根据本发明的有利的实施方案，本发明的活性成分溶解于本领域技术人员常规使用的一种或多种生理学可接受的溶剂中，所述溶剂例如水、甘油、乙醇、丙二醇、丁二醇、双丙二醇、乙氧基化二甘醇或丙氧基化二甘醇、环状多元醇、白凡士林、植物油或这些溶剂的任意混合物。
根据本发明的另一有利的实施方案，预先将本发明的活性成分溶解于化妆品或药物载体例如脂质体中或吸附至粉状有机聚合物、无机载体例如滑石和膨润土，更概括而言，将其溶解于在任何生理学可接受的载体中或固定在任何生理学可接受的载体上。
本发明的可用组合物可具体地由用于毛细血管护理的组合物组成，并且特别地可由香波、护发素、治疗洗液、焗油膏或凝胶、头发修复洗液、面膜等组成。所述组合物还可以染发剂或睫毛膏的形式存在，以通过刷子或梳子施用，特别是施用于睫毛、眉毛或头发上。
可通过任何适合的途径施用本发明的可用组合物，特别是口服、肠胃外或局部途径，并且本领域技术人员会调节所述组合物的制剂，特别是针对化妆品或皮肤病组合物。有利的是，本发明的组合物旨在用于局部给药。因此，这些组合物必须包含生理学可接受的介质(即与皮肤和上皮附件相容的介质)，并且必须包括所有化妆品或皮肤病学形式。
应理解本发明的活性成分可单独使用或与其它活性成分组合使用。
有利的是，本发明的可用组合物还可包含用于提高和补充所述活性成分的作用的各种保护性或抗老化的活性成分。以非限制性方式列举以下成分：结瘢剂、抗老化剂、抗皱剂、润肤剂、抗自由基剂、抗UV剂、刺激皮肤大分子合成或能量代谢的药剂、保湿剂、抗菌剂、抗真菌剂、抗炎剂、麻醉剂、调节皮肤分化的药剂、着色剂或脱色剂、刺激指甲或毛发生长的药剂。优选使用表现出抗皱活性的药剂(例如抗自由基剂或抗氧化剂)，或者刺激皮肤大分子合成的药剂、刺激能量代谢的药剂、金属蛋白酶抑制剂。
例如，可加入选自维生素C、维生素E、辅酶Q10和多酚植物提取物、类视黄醇的具有抗自由基或抗氧化作用的其它活性成分。
本发明组合物还可将刺激皮肤大分子(层粘连蛋白、纤维连接蛋白、胶原蛋白)的合成的其它活性成分，例如Vincience公司出售的名为“Collaxyl”的胶原肽与本发明的活性成分组合。
本发明组合物还可将刺激能量代谢的其它活性成分，例如Vincience公司出售的名为“GP4G”的活性成分与本发明的活性成分组合。
当然，明显的是本发明一般针对哺乳动物，并且更特别的是人类。
这些组合物可特别地以如下形式存在：水溶液、水醇溶液或油溶液；水包油乳剂、油包水乳剂或复合型乳剂；它们还可以适合施用至皮肤、粘膜、唇和/或上皮附件的乳膏、混悬剂或散剂的形式存在。这些组合物可或多或少具有流动性并且具有乳膏、洗剂、乳剂、精华液(sérum)、润发脂、凝胶剂、糊剂或泡沫剂的外观。它们还可以固体形式存在，例如棒剂(stick)，或者可以气雾剂的形式施用至皮肤。可将它们用作护理产品和/或皮肤化妆品。
所有这些组合物还包含常用于所设想的应用领域的任何添加剂以及它们的制剂所必须的辅剂，例如溶剂、增稠剂、稀释剂、抗氧化剂、着色剂、遮光剂、自晒黑剂、色素、填充剂、防腐剂、香精、除臭剂、其它化妆品活性成分、精油、维生素、必需脂肪酸、表面活性剂、成膜聚合物等。
在所有情况中，本领域技术人员会确保选择这些辅剂以及它们的比例从而不会破坏本发明组合物的期望的有利性质。这些辅剂可对应于例如所述组合物总重的0.01-20％的浓度。当本发明所述组合物是乳剂时，以所述组合物的总重计，脂肪相可为5-80重量％并且优选5-50重量％。用于所述组合物中的乳化剂和共乳化剂选自所考虑领域内常规使用的那些。例如，以所述组合物的总重计，它们的使用比例可为0.3-30重量％。
本发明的第三个目的是包含有效量的作为药物的本发明的肽水解产物的药物组合物。例如，所述药物组合物可用于预防或治疗特征是屏障功能改变的疾病，例如过敏性、受刺激的或反应性的皮肤以及特应性湿疹。
根据本发明的这一形式，所述组合物会适于药物用途的口服给药。因此，所述组合物可特别地以片剂、胶囊剂、凝胶胶囊剂、咀嚼糊剂、在使用时或在临使用前与液体混合以施用的散剂、糖浆、凝胶剂或本领域技术人员已知的任何其它形式存在。这些组合物还包含所设想的应用领域常用的任何添加剂以及它们的制剂所必需的辅剂，例如溶剂、增稠剂、稀释剂、抗氧化剂、防腐剂、其它药学活性成分、精油、维生素、必需脂肪酸等。
本发明的第四个目的是有效量的作为激活人HMG-CoA还原酶的活性成份的肽水解产物在化妆品组合物中的用途。
所述活性成分的有效量对应于获得期望的结果，即激活HMG-CoA还原酶以提高表皮的屏障功能和刺激表皮分化所必需的量。
“增强皮肤的屏障功能和刺激表皮分化”应理解为指表皮角质层的保护能力的提高和生物学分化标记例如角蛋白的表达的增加。
因此，由于所述活性成分的特殊性质，可将其用于旨在增强皮肤的屏障功能和刺激表皮分化的化妆品组合物中。
另一方面，可有利地将所述肽水解产物作为活性成分用于旨在预防性和/或治疗性地抵抗皮肤老化更特别的是光诱导皮肤老化(光老化)的迹象的化妆品组合物中。老化或光老化的皮肤迹象应理解为指由老化引起的皮肤和上皮附件的外观的任何改变，例如表皮角质层表面粗糙、皱纹和细纹，但是还指未全身性地表现为改变的外观的任何皮肤内部改变，例如表皮变薄或暴露于紫外线(UV)照射后皮肤的任何其它内部降解。
根据本发明的另一方面，可有利地将所述肽水解产物作为活性成分用于旨在保护皮肤免受各种类型的外界应激的侵害的化妆品组合物中。
“外界应激”这一表述应理解为环境可能产生的应激。举例而言，可列举如下应激：污染、UV照射、或其它刺激性产品例如表面活性剂、防腐剂或芳香剂，或者物理应力，例如摩擦、剃须或拔毛。污染应理解为指由内燃机颗粒、臭氧或重金属引起的“外界”污染和特别是由油漆、粘合剂或壁纸溶剂(例如甲苯、苯乙烯、二甲苯或苯甲醛)的释放或者吸烟引起的“内部”污染。空气干燥也是皮肤应激的重要原因。这些外界应激引起屏障功能的改变，其导致皮肤不适、令人不愉快的感觉现象，例如撕裂痛或搔痒以及甚至是过度脆弱和发红。
具体而言，本发明的目的是本发明的水解产物在用于预防或治疗皮肤的外界应激对皮肤造成的损害的化妆品组合物中的用途，所述外界应激选自机械处理例如剔须或拔毛、使用去污剂过度强烈地洗涤、极端气候条件或温度和湿度骤变。
本发明的第五个目的是用于预防和/或抵抗老化和/或光老化的皮肤迹象的化妆品治疗方法，根据该方法将包含有效量的本发明的肽水解产物的组合物施用至待治疗的区域上。
从之前的描述也得到该化妆品治疗方法的具体实施方案。在阅读了出于说明而非限制的目的而提供的实施例后，本发明的其它优点和特征会变得更加清楚。
附图说明
图1：通过HPLC获得的色谱图实例，其中示出了对应于单粒小麦水解产物中的生物活性肽的峰。
图2：通过HPLC获得的色谱图实例，其中示出了对应于马铃薯水解产物中的生物活性肽的峰。
图3：通过HPLC获得的色谱图实例，其中示出了对应于玉米水解产物中的生物活性肽的峰。
图4：通过HPLC获得的色谱图实例，其中示出了对应于豌豆水解产物中的生物活性肽的峰。
图5：通过HPLC获得的色谱图实例，其中示出了对应于大豆水解产物中的生物活性肽的峰。
图6：通过HPLC获得的色谱图实例，其中示出了对应于酿酒酵母水解产物中的生物活性肽的峰。
实施例1：从单粒小麦(Triticummonococcum)制备肽水解产物
在2％POLYCLAR10(聚乙烯吡咯烷酮-PVPP-不溶性)存在下将单粒小麦种子(Triticummonococcum)置于在10倍体积的水中的溶液中。用1M氢氧化钠水溶液将混合物调节至pH6-8。
调节pH后向反应介质中加入淀粉酶(hasidase)和蛋白酶(2％木瓜蛋白酶)。于50℃搅拌2小时后实现水解。然后通过将所述溶液加热至80℃并持续2小时使酶失活。离心后，回收对应于粗单粒小麦水解产物的上清水溶液。选择水解条件使得能够富集具有4-6个氨基酸的生物活性肽，所述氨基酸包括Gly、Leu和谷氨酸残基。
使用孔隙率不断降低(最高0.2μm)的Seitz-Orion滤板通过连续过滤开始粗水解产物的纯化过程以获得澄明溶液，将其描述为水解产物1。
在这一步骤中，单粒小麦水解产物1的特征是具有浅黄色以及干提取物为20-25g/kg、蛋白质水平为10-12g/l以及糖水平为5-8g/l。
在NuPAGEBis-TrisPre-cast(Invitrogen)聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分析后证明了水解产物1的蛋白质性质。在NuPAGELDS样品制备缓冲液中，在还原变性条件下，将单粒小麦蛋白水解产物加热至70℃并持续10分钟。将NuPAGE抗氧化剂溶液加入内槽(阴极)以防止被还原的蛋白质在电泳过程中被重新氧化。在NuPAGEMES迁移缓冲液中进行蛋白质迁移，将标准的SeeBluePlus2用作分子量标记。使用考马斯蓝R-250进行蛋白质染色。在这些条件下，观察到对应于酶的24kDa处的条带和小于6kDa的蛋白质。
然后使用Pellicon2Biomax5kDa超滤膜包通过超滤纯化水解产物1以除去任何微量的酶。在纯化末期，获得黄色-橙色、澄明的肽水解产物。进行稀释步骤以获得特征是蛋白质含量为1.5-3.5g/l的肽水解产物。该肽水解产物对应于本发明的活性成分。
然后使用由ChemStation软件运行的HP1100仪器通过高压液相色谱法(HPLC)分析该肽水解产物。在水解产物的洗脱过程中使用的柱是Nucleosil300-5C4MPN(125x4mn)柱，使得能够在如下条件下对分子量为0.2-25kDa的蛋白质进行色谱分析：
甲醇梯度：
-UptisphereOPB125x3mm柱
-溶剂A：包含0.1％七氟丁酸(HFBA)的HPLC级水
-溶剂B：HPLC级甲醇
-梯度：13min内100％-40％溶剂A，然后在5min内40％-10％。
在这些色谱条件下可分离几种肽部分。图1提供了通过HPLC(高压下在液相中的色谱法)获得的色谱图的实例，其中显示出对应于所述生物活性肽的峰。
然后通过质谱法分析这些不同部分以具体鉴定每一个峰的肽的氨基酸含量。还进行了测序分析以测定所述生物活性肽的肽序列。
还进行了本发明的活性成分的氨基酸组成的测定。这在进行了酸水解和通过使用以PICT(异硫氰酸苯酯)进行预衍生化的高压液相色谱法进行鉴定之后实现。
所述水解产物的氨基酸组成的实例列于下表(％)：
氨基酸 ％
丙氨酸 3.1
天冬氨酸 4.7
精氨酸 3.1
谷氨酸 32.8
甘氨酸 3.1
组氨酸 ＜3.0
异亮氨酸 ＜5.5
亮氨酸 6.2
赖氨酸 ＜2.2
苯丙氨酸 4.5
脯氨酸 10.9
丝氨酸 4.7
苏氨酸 3.1
酪氨酸 ＜3.6
缬氨酸 4.7
色氨酸 ＜1.5
实施例2：从属于马铃薯种的块茎制备肽水解产物
在2％POLYCLAR10(聚乙烯吡咯烷酮-PVPP-不溶性)的存在下将马铃薯块茎(Solanumtuberosum)置于在10倍体积的水中的溶液中。用1M氢氧化钠水溶液将混合物调节至pH6-8。然后在酸性介质中进行沉淀。将沉淀放回溶液中，并且在调节pH之后向反应介质中加入2％木瓜蛋白酶。于55℃搅拌2小时后实现水解。然后通过将所述溶液加热至80℃并持续2小时使酶失活。离心后，回收对应于粗马铃薯水解产物的上清水溶液。选择水解条件使得能够富集具有4-6个氨基酸的生物活性肽，所述氨基酸包括Gly、Leu和Glu残基。
使用孔隙率不断降低(最高0.2μm)的Seitz-Orion滤板通过连续过滤开始粗水解产物的纯化过程以获得澄明的黄色溶液，将其描述为水解产物1。
在这一步骤中，马铃薯水解产物1的特征是干提取物为40-60g/kg、蛋白质水平为20-25g/l以及糖水平为1-3g/l。
在NuPAGEBis-TrisPre-cast(Invitrogen)聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分析后证明了水解产物1的蛋白质性质。在NuPAGELDS样品制备缓冲液中，在还原变性条件下，将马铃薯蛋白水解产物加热至70℃并持续10分钟。将NuPAGE抗氧化剂溶液加入内槽(阴极)以防止被还原的蛋白质在电泳过程中被重新氧化。在NuPAGEMES迁移缓冲液中进行蛋白质迁移，将标准的SeeBluePlus2用作分子量标记。使用考马斯蓝R-250进行蛋白质染色。在这些条件下，观察到所获得的蛋白质具有低于6kDa的分子量。
然后使用正切流动过滤纯化水解产物1以仅仅保留分子量小于5kDa的肽。为实现这一目的，在压力下将水解产物1泵过安装了Pellicon2Biomax5kDa超滤膜包的Pellicon支架。在纯化末期，获得澄明的肽水解产物。进行稀释步骤以获得特征是蛋白质浓度为3.5-5.5g/l的肽水解产物。该肽水解产物对应于本发明的活性成分。
然后使用由ChemStation软件运行的HP1100仪器通过高压液相色谱法(HPLC)分析该肽水解产物。在水解产物的洗脱过程中使用的柱是Nucleosil300-5C4MPN(125x4mn)，使得能够对分子量为0.2-25kDa的蛋白质进行色谱分析(按照与实施例1相同的条件)。在这些色谱条件下可分离几种肽部分。
然后通过质谱法分析这些不同部分以具体鉴定每一个峰的肽的氨基酸含量。还进行了测序分析以测定所述生物活性肽的肽序列。
图2提供了通过HPLC(高压液相色谱法)获得的色谱图实例，其中显示出对应于所述生物活性肽的峰。
还进行了本发明的活性成分的氨基酸组成的测定。这在进行了酸水解和通过使用以PICT(异硫氰酸苯酯)进行预衍生化的高压液相色谱法进行鉴定之后实现。
所述水解产物的氨基酸组成的实例列于下表(％)：
氨基酸 ％
丙氨酸 7.8
天冬氨酸 20.1
精氨酸 7.3
谷氨酸 17.4
甘氨酸 7.3
组氨酸 3.2
异亮氨酸 9.1
亮氨酸 15.1
赖氨酸 11.4
苯丙氨酸 8.7
脯氨酸 7.7
丝氨酸 8.7
苏氨酸 9.19 -->
酪氨酸 8.2
缬氨酸 10.5
色氨酸 1.4
实施例3：从玉米胚芽粕(ZeamaysL.)制备肽水解产物
在2％POLYCLAR10(聚乙烯吡咯烷酮-PVPP-不溶性)存在下将玉米胚芽粕(ZeamaysL.)置于在10倍体积的水中的溶液中。用1M氢氧化钠水溶液将混合物调节至pH6-8。
调节pH后，向反应介质中加入2％的木瓜蛋白酶。于55℃搅拌2小时后实现水解。然后通过将所述溶液加热至80℃并持续2小时使酶失活。离心后，回收对应于粗玉米水解产物的上清水溶液。选择水解条件使得能够富集具有4-6个氨基酸的生物活性肽，所述氨基酸包括Gly、Leu和Glu残基。
使用孔隙率不断降低(最高0.2μm)的Seitz-Orion滤板通过连续过滤开始粗水解产物的纯化过程以获得澄明的黄色溶液，将其描述为水解产物1。
在这一步骤中，玉米水解产物1的特征是干提取物为20-30g/kg、蛋白质水平为20-25g/l以及糖水平为2-5g/l。
在NuPAGEBis-TrisPre-cast(Invitrogen)聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分析后证明了水解产物1的蛋白质性质。在NuPAGELDS样品制备缓冲液中，在还原变性条件下，将玉米蛋白水解产物加热至70℃并持续10分钟。将NuPAGE抗氧化剂溶液加入内槽(阴极)以防止被还原的蛋白质在电泳过程中被重新氧化。在NuPAGEMES迁移缓冲液中进行蛋白质迁移，将标准的SeeBluePlus2用作分子量标记。使用考马斯蓝R-250进行蛋白质染色。在这些条件下，观察到分子量小于6kDa的蛋白质。
然后使用Pellicon2Biomax5kDa超滤膜包进行超滤，除去高分量蛋白质来纯化水解产物1，以仅仅保留小于5kDa的肽性化合物。
在该最终纯化之后进行稀释步骤以获得特征是蛋白质水平为3.5-5.5g/l的肽水解产物。该肽水解产物对应于本发明的活性成分。
然后使用由ChemStation软件运行的HP1100仪器通过高压液相色谱法(HPLC)分析该肽水解产物。在水解产物的洗脱过程中使用的柱是Nucleosil300-5C4MPN(125x4mn)柱，使得能够对分子量为0.2-25kDa的蛋白质进行色谱分析(按照与实施例1相同的适合的溶剂梯度)。在这些色谱条件下可分离几种肽部分。
图3提供了通过HPLC(高压液相色谱法)获得的色谱图的实例，其中显示出对应于所述生物活性肽的峰。
然后通过质谱法分析这些不同部分以具体鉴定每一个峰的肽的氨基酸含量。还进行了测序分析以测定所述生物活性肽的肽序列。
还进行了本发明的活性成分的氨基酸组成的测定。这在进行了酸水解和通过使用以PICT(异硫氰酸苯酯)进行预衍生化的高压液相色谱法进行鉴定之后实现。所述水解产物的氨基酸组成的实例列于下表(％)：
氨基酸 ％
丙氨酸 9.4
天冬氨酸 7.210 -->
精氨酸 3.6
谷氨酸 23.7
甘氨酸 3.6
组氨酸 2.2
异亮氨酸 4.5
亮氨酸 16.1
赖氨酸 2.2
苯丙氨酸 6.7
脯氨酸 10.3
丝氨酸 6.3
苏氨酸 4.0
酪氨酸 5.8
缬氨酸 5.4
色氨酸 ＜0.5
实施例4：从豌豆(PisumsativumL.)制备肽水解产物
从豌豆种的植物提取物获得肽水解产物。当然，可从属于豌豆属的许多变种和种中的至少任意一种的植物制备所述提取物。
在第一步中，通过有机溶剂己烷的作用将1kg去壳的豌豆脱脂。
在2％POLYCLAR10(聚乙烯吡咯烷酮-PVPP-不溶性)存在下将由此获得的豌豆粉置于在10倍体积的水中的溶液中。用1M氢氧化钠水溶液将混合物调节至pH6-7。
调节pH后，向反应介质中加入2％的flavourzyme于50℃搅拌2小时后实现水解。然后通过将所述溶液加热至80℃并持续2小时使酶失活。由此获得的反应混合物对应于豌豆提取物。选择水解条件使得能够富集具有4-6个氨基酸的生物活性肽，所述氨基酸包括Gly、Leu和谷氨酸残基。
使用孔隙率不断降低(最高0.2μm)的Seitz-Orion滤板通过连续过滤开始纯化过程以获得澄明的溶液。在该步骤中，所述豌豆水解产物的特征是干提取物为70-80g/kg、蛋白质水平为55-65g/l、糖水平为2-5g/l以及多酚水平为1-3g/l。
通过在聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳证明该水解产物的蛋白质性质。为此分析，使用了NuPAGEBis-TrisPre-cast(Invitrogen)凝胶。在NuPAGELDS样品制备缓冲液中，在还原变性条件下，将豌豆肽水解产物加热至70℃并持续10分钟。将NuPAGE抗氧化剂溶液加入内槽(阴极)以防止被还原的蛋白质在电泳过程过程中被重新氧化。使用NuPAGEMES迁移缓冲液进行蛋白质迁移，将标准的SeeBluePlus2用作分子量标记。使用考马斯蓝R-250进行蛋白质染色。在这些条件下观察到2大蛋白质家族：第一个家族对应于分子量为25-20kDa的蛋白质，最后一个家族对应于分子量小于5kDa的蛋白质。
然后通过使用正切流动过滤除去分子量大于5kDa的蛋白质来纯化该溶液。
为实现这一目的，在压力下将豌豆水解产物泵过安装了Pellicon2Biomax30kDa超滤膜包的Pellicon支架。回收第一次滤液，然后将其通过另一Pellicon2Biomax5kDa超滤膜包过滤。在纯化末期，获得澄明的、黄色-米黄色的豌豆肽水解产物。其特征是干提取物为50-55g/kg，蛋白质含量为50-52g/l。
然后使用由ChemStation软件运行的HP1100仪器通过高压液相色谱法(HPLC)分析该溶液。在豌豆提取物的洗脱过程中使用的柱是Nucleosil300-5C4MPN(125x4mn)柱。该柱使得能够对分子量为0.2-25kDa的蛋白质进行色谱分析(按照与实施例1相同的适合的溶剂梯度)。在这些色谱条件下可分离几种肽部分。
然后通过质谱法分析这些不同部分以具体鉴定每一个峰的肽的氨基酸含量。还进行了测序分析以测定所述生物活性肽的肽序列。图4提供了通过HPLC(高压液相色谱法)获得的色谱图的实例，其中显示出对应于所述生物活性肽的峰。
还进行了本发明的活性成分的氨基酸组成的测定。这在进行了酸水解和通过使用以PICT(异硫氰酸苯酯)进行预衍生化的高压液相色谱法进行鉴定之后实现。
实施例5：从大豆粕(GlycineMax.L.)制备肽水解产物
从来自大豆种的植物获得所述活性成分。当然，可从属于大豆属的许多变种和种中的至少任意一种的植物制备所述提取物。所述粕是从大豆提取油之后获得的固体残留物。它们占大豆质量的50-75％。
在第一步中，在谷类研磨机中研磨1kg大豆粕。通过有机溶剂己烷的作用将所得粉末脱脂。过滤并真空干燥后，将所获得的粉末悬浮于包含1％聚乙烯聚吡咯烷酮(PolyclarVISP)的pH10的碱性水溶液(1∶10稀释)中。将该混合物在搅拌下保持足够长的时间使可溶性部分溶解。提取温度是可变的(4℃-80℃)；优选在寒冷条件下进行该操作。在该提取步骤之后，通过离心使介质变得澄清，然后在板式滤器上过滤。通过改变中性或酸性介质中的离子强度使包含可溶性大豆部分的滤液进行蛋白质沉淀，这使得能够除去可溶性的糖类组分、脂质和核酸。将介质调节至pH3.5。除去上清，并且用诸如乙醇或甲醇的溶剂洗涤沉淀，然后通过真空干燥蒸发溶剂。
在这一阶段获得了约50克的浅黄色粗蛋白质提取物粉末，其包含：
-蛋白质：75％
-碳水化合物：20％
-脂质：5％
将富含蛋白质的沉淀再次置于在水或另一种溶剂中的溶液中。
然后对粗蛋白质提取物进行一系列的受控的且具有选择性的水解，其由在0.5％PVPP(PolyclarV)和半胱氨酸内肽酶(木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶)存在下的化学水解和酶水解组成。反应后，在板和然后在灭菌柱(0.2μm)上过滤水解产物。
然后获得了干提取物为15-30g/l的浅色水解产物，然后将其稀释使得经Lowry法测定的肽性化合物的浓度为0.1-5g/l，优选0.5-2g/l。对构成所述活性成分的肽水解产物的物理化学分析表明其pH为4-7，并且优选5-6，所述干提取物为1-8g/l并且优选2-5g/l，其肽性化合物含量为0.1-5g/l并且优选0.5-2g/l，且其糖含量为0.5-2.5g/l。选择水解条件使得能够富集具有4-6个氨基酸的生物活性肽，所述氨基酸包括Gly、Leu和谷氨酸残基。
然后在MilliporeHelicon滤柱(截止1kDa)上将该溶液超滤。分离包含在截留液中的高分子量物质，保留滤液。
然后使用由ChemStation软件运行的HP1100仪器通过高压液相色谱法(HPLC)分析该溶液。在大豆水解产物的洗脱过程中使用的柱是Nucleosil300-5C4MPN(125x4mn)柱。该柱使得能够对分子量为0.2-25kDa的蛋白质进行色谱分析(按照与实施例1相同的适合的溶剂梯度)。在这些色谱条件下分离了几种肽部分。
然后通过质谱法分析这些不同部分以具体鉴定每一个峰的肽的氨基酸含量。还进行了测序分析以测定所述生物活性肽的肽序列。图5提供了通过HPLC(高压液相色谱法)获得的色谱图的实例，其中显示出对应于所述生物活性肽的峰。
还进行了本发明的活性成分的氨基酸组成的测定。这在进行了酸水解和通过使用以PICT(异硫氰酸苯酯)进行预衍生化的高压液相色谱法进行鉴定之后实现。
所述方案的变化包括用pH7的磷酸盐缓冲液在TSK凝胶柱(TosoHaas)上通过离子交换色谱法纯化根据前述方案获得的活性成分，以使在所述肽水解产物富含生物活性肽。
实施例6：从酿酒酵母制备肽水解产物
可从来自酿酒酵母种的酵母提取物获得所述肽水解产物。在适合酵母生长的培养基中优选在乳糖存在下培养酵母，然后离心回收生物质。在2％POLYCLAR10(聚乙烯吡咯烷酮-PVPP-不溶性)和2％活性炭存在下将酵母生物质置于在10倍体积的水中的溶液中。用1M氢氧化钠水溶液将混合物调节至pH6-7.5。
调节pH后，向反应介质中加入2％木瓜蛋白酶。于55℃搅拌2小时后实现水解。然后通过将溶液加热至80℃并持续2小时使酶失活。离心后获得对应于酵母提取物的反应混合物。选择水解条件使得能够富集具有4-6个氨基酸的生物活性肽，所述氨基酸包括Gly、Leu和谷氨酸残基。
使用孔隙率不断降低(最高0.2μm)的Seitz-Orion滤板通过连续过滤开始纯化过程以获得澄明溶液。在这一步骤中，所述酵母提取物的特征是干提取物为25-35g/kg、蛋白质水平为10-15g/l以及糖水平为5-10g/l。
通过在聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳证明该提取物的蛋白质性质。为此分析，使用了NuPAGEBis-TrisPre-cast(Invitrogen)凝胶。在NuPAGELDS样品制备缓冲液中，在还原变性条件下，将所述肽水解产物加热至70℃并持续10分钟。将NuPAGE抗氧化剂溶液加入内槽(阴极)以防止被还原的蛋白质在电泳过程中被重新氧化。使用NuPAGEMES迁移缓冲液进行蛋白质迁移，将标准的SeeBluePlus2用作分子量标记。使用考马斯蓝R-250进行蛋白质染色。在这些条件下观察到3大蛋白家质族：第1个家族对应于分子量大于75kDa的蛋白质，第2个家族对应于20-25kDa的蛋白质，最后一个家族对应于分子量小于5kDa的蛋白质。
然后通过使用正切流动过滤除去分子量大于5kDa的蛋白质来纯化该溶液。
为实现这一目的，在压力下将酵母肽水解产物泵过安装了Pellicon2Biomax50kDa超滤膜包的Pellicon支架。回收第一次滤液，然后将其通过第二个Pellicon2Biomax10kDa超滤膜包过滤。然后回收第二次滤液并再次通过最后一个Pellicon2Biomax5kDa超滤膜包洗脱。在纯化末期获得了米黄色、澄明的酵母植物提取物。其特征是干提取物为35-45g/kg，蛋白质含量为30-40g/l。
然后使用由ChemStation软件运行的HP1100仪器通过高压液相色谱法(HPLC)分析该溶液。在酵母水解产物的洗脱过程中使用的柱是Nucleosil300-5C4MPN(125x4mn)柱。该柱使得能够对分子量为0.2-25kDa的蛋白质进行色谱分析(按照与实施例1相同的适合的溶剂梯度)。在这些色谱条件下分离了几种肽部分。
然后通过质谱法分析这些不同部分以具体鉴定每一个峰的肽的氨基酸含量。还进行了测序分析以测定所述生物活性肽的肽序列。还进行了本发明的活性成分的氨基酸组成的测定。这在进行了酸水解和通过使用以PICT(异硫氰酸苯酯)进行预衍生化的高压液相色谱法进行鉴定之后实现。
实施例7：用实施例1的水解产物处理的人角质形成细胞中的板层小体的超微结构 研究
该研究的目的是在透射电子显微术中以超微结构方式研究用1％实施例1的水解产物处理的角质形成细胞。
方案：用1％实施例1的水解产物溶液将培养物中的正常的人角质形成细胞处理48小时(每24小时更换存在活性成分的培养基)。用PBS洗涤细胞，然后在环境温度下用Karnosky高渗固定液(0.08M磷酸盐缓冲液中4％多聚甲醛、5％戊二醛)固定1小时，然后于4℃固定24小时。通过刮擦使细胞与载体分离，1000rpm离心5分钟。除去上清并且在残留物上加1M二甲胂酸钠缓冲液。将细胞与2％琼脂混合，然后用四氧化锇后固定1小时。连续通过一系列的醇(50-100％)使样品脱水。然后将细胞包被到树脂中。于60℃聚合约12小时。用超薄切片机制备0.5μm的半薄切片。将所述切片放置于热粘合的载玻片上，然后用甲苯胺蓝染色。再次将载玻片脱水并且包埋于适合的介质中。选择最佳的研究区域后，将切块再次切割成所需要的大小，然后制备超薄切片，仅将具有银灰色和适合大小的切片固定在用乙酸双氧铀和柠檬酸铅标记的电子显微镜载网上，并且于60或80KV通过透射电子显微镜进行检查。
结果：超微结构研究表明与对照细胞相比高尔基复合体明显更为成熟。该增加与板层小体(或Odland体)过多形成相关，所述板层小体(或Odland体)过多形成是脂质合成增加的标志。
结论：1％实施例1的水解产物能够在正常的人角质形成细胞中诱导脂质合成增加。
实施例8：用实施例2的水解产物处理的人成纤维细胞中“细胞膜穴样凹陷”的超微 结构研究
该研究的目的是在超微结构水平研究人皮肤成纤维细胞的细胞膜穴样凹陷(caveolae)。
方案：用1％实施例2的水解产物将培养物中的正常的人皮肤成纤维细胞处理48小时(每24小时更换存在活性成分的培养基)。
结果：超微结构研究显示与未处理的对照细胞相比，用1％实施例2的水解产物处理的细胞的细胞膜穴样凹陷显著增加。这些结果是活性成分的阳性作用的标志，因为细胞膜穴样凹陷是实现诸如胆固醇的分子的外翻的细胞膜的内陷。
结论：1％实施例2的水解产物引起具有胆固醇外翻的膜结构的增加。
实施例9：用实施例2的水解产物处理的人角质形成细胞的分化研究
该研究的目的是测定实施例的水解产物对表皮分化，更具体地是对作为角质形成细胞分化标记的所有细胞角蛋白(或广谱角蛋白(pankératines))的表达的影响。
方案：用1％实施例2的水解产物将培养物中的正常的人角质形成细胞处理48小时(每24小时更换存在活性成分的培养基)。然后洗涤细胞并且于4℃用冷甲醇固定4分钟。在环境温度下在单克隆抗-细胞角蛋白抗体的存在下以1∶200温育细胞1小时，然后在环境温度下以1∶50用偶联了荧光染料“Alexa488”的二抗显色1小时。包埋在特定的介质中后，用落射荧光显微镜观察载玻片。
结果：实施例2的水解产物增加了经处理的细胞中的广谱角蛋白表达。
结论：1％实施例2的水解产物增加了正常的人角化形成细胞中的角蛋白表达。在实施例2的水解产物的存在下，细胞被刺激并且处于分化途径中。
实施例10：研究实施例2的水解产物对被紫外线照射(UVB)的皮肤细胞的保护作用
该研究的目的是测定实施例2的水解产物对接受UVB照射应激的正常的人角质形成细胞的保护作用。为实现这一目的，通过MTT技术进行了细胞活力测定。
方案：用0.5％实施例2的水解产物将正常的人角质形成细胞处理24小时，用UVB(50mJ/cm2)照射，然后在相同浓度的实施例2的水解产物存在下再培养24小时。在相同的条件下进行未处理和未照射对照的实验。在实验末期将细胞温育在包含0.1mg/mlMTT(3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基四唑鎓溴化物)的溶液中。该化合物被活细胞吸收然后被线粒体酶代谢成蓝紫色化合物甲，其可通过分光光度计于540nm进行测定。然后，光密度(O.D.)与线粒体酶活性以及活细胞的数量成正比。
结果：通过MTT技术评价细胞活力显示实施例2的水解产物将UVB照射后的细胞活力提高了16％。
结论：0.5％实施例2的水解产物增加细胞活力并且有效保护皮肤细胞免受UVB照射的细胞毒性作用。
实施例11：研究在皮肤活组织检查中HMG-CoA还原酶在实施例1的水解产物的存在 下的表达
该研究的目的是测定0.5％实施例1的水解产物对HMG-CoA还原酶的表达的影响。
方案：将人皮肤样品置于培养基的气/液界面处。局部施用0.5％实施例1的水解产物，然后将样品温育24小时或48小时。
然后用甲醛固定这些皮肤样品并且包埋在石蜡中。然后制备2-3μm的切片。通过微波处理暴露特定位点后进行免疫标记，然后在胰蛋白酶中温育。用对HMG-CoA还原酶具有特异性的多克隆兔抗体(Millipore，Upstate)，然后用与荧光染料偶联的二抗进行免疫标记。然后通过落射荧光显微镜(NikonEclipseE600显微镜)检查皮肤切片。
结果：显微观察显示相对于未处理对照，在用0.5％实施例1的水解产物处理的皮肤中在表皮的上层中具有更强的荧光。
结论：实施例1的水解产物刺激表皮上层中HMG-CoA还原酶的表达。
实施例12：研究在实施例2的水解产物的存在下正常的人角质形成细胞中HMG-CoA 还原酶的表达
该研究的目的是测定实施例2的水解产物对正常的人角质形成细胞中HMG-CoA还原酶的表达的影响。
方案：用0.5％实施例2的水解产物将培养物中的正常的人角质形成细胞处理24或48小时(每24小时更换包含活性成分的培养基)。然后洗涤细胞并且于4℃在冷甲醇中固定4分钟。在对HMG-CoA还原酶具有特异性的多克隆兔抗体(Millipore，Upstate)的存在下和然后在与荧光染料偶联的二抗的存在下温育细胞。然后通过落射荧光显微镜(NikonEclipseE600显微镜)检查细胞。
结果：显微观察表明用0.5％实施例2的水解产物处理的细胞中具有更强的胞质荧光。
结论：0.5％实施例2的水解产物刺激正常的人角质形成细胞中的HMG-CoA还原酶的表达。
实施例13：制备组合物：
1-防晒霜
分别将A相和B相的组分于70℃-75℃加热。在搅拌下将B相乳化于A相中。通过加快搅拌于45℃加入C相。然后当温度低于40℃时加入D相。在剧烈搅拌下持续冷却至25℃。
2-抗老化霜
制备A相并于65-70℃溶化。将C相加热至65-70℃。将B相加入A相，然后立刻将A乳化入B。在约45℃下通过加入D相中和卡波姆。然后在轻微的搅拌下加入E相并且持续冷却至25℃。然后视需要加入F相。
3-防护性日霜
制备A相并且在搅拌下加热至75℃。通过在搅拌下分散carbopol然后分散黄原胶来制备B相。静置。加热至75℃。
在温度下，在转子定子搅拌下将A乳化入B。在快速搅拌下用C相中和。冷却至40℃后加入D相，然后加入E相。在轻微搅拌下持续冷却并加入F相。

Claims (17)

1.富含生物活性肽的能够增强表皮的屏障功能的肽水解产物，其特征在于所述生物活性肽对应以下序列：
(SEQIDNo.5)Ala-Gly-Glu-Leu-Ser，并且
其中所述肽水解产物来自选自单粒小麦(Triticummonococum)、马铃薯(Solanumtuberosum)、玉米(ZeamayzL.)、豌豆(Pisumsativum)的植物的水解或者来自酵母菌属的酵母的水解，并且被纯化以仅保留分子量小于6kDa的肽。
2.权利要求1的肽水解产物，其特征在于所述肽水解产物来自酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)种的酵母的水解。
3.权利要求1或2的肽水解产物，其特征在于所述肽水解产物具有0.5-5.5g/l的蛋白质含量。
4.化妆品组合物，所述组合物包含作为能够增强表皮的屏障功能的活性成分的如权利要求1-3之一定义的肽水解产物，所述肽水解产物在生理学可接受的介质中，其量占所述组合物总重的0.0001％-20％。
5.权利要求4的组合物，所述组合物包含其量占所述组合物总重的0.05％-5％的所述肽水解产物。
6.权利要求4的组合物，其特征在于所述肽水解产物溶解于一种或多种生理学可接受的溶剂中。
7.权利要求6的组合物，其特征在于所述一种或多种溶剂选自水、甘油、乙醇、丙二醇、丁二醇、双丙二醇、乙氧基化二甘醇或丙氧基化二甘醇、环状多元醇、白凡士林、植物油和这些溶剂的任意混合物。
8.权利要求4-7之一的组合物，其特征在于所述组合物以适合于局部施用的形式存在。
9.权利要求4-7之一的组合物，其特征在于所述组合物还包含至少一种促进所述肽水解产物的作用的其他活性成分。
10.药物组合物，所述组合物包含作为药物的如权利要求1-3中任一项定义的肽水解产物，所述肽水解产物在生理学可接受的介质中。
11.有效量的作为激活HMG-CoA还原酶的活性成分的如权利要求1-3之一定义的肽水解产物在制备化妆品组合物中的用途。
12.权利要求11的用途，其特征在于所述化妆品组合物用于增强表皮的屏障功能和刺激表皮分化。
13.权利要求11的用途，其特征在于所述化妆品组合物用于预防和对抗老化的皮肤迹象。
14.权利要求11的用途，其特征在于所述化妆品组合物用于预防和对抗光老化的皮肤迹象。
15.权利要求11的用途，其特征在于所述化妆品组合物用于保护皮肤免受外界应激的侵害。
16.有效量的如权利要求1-3之一定义的肽水解产物在制备用于预防或治疗老化的皮肤迹象的组合物中的用途，其中所述组合物局部施用至待治疗的皮肤或上皮附件。
17.有效量的如权利要求1-3之一定义的肽水解产物在制备用于预防或治疗光老化的皮肤迹象的组合物中的用途，其中所述组合物局部施用至待治疗的皮肤或上皮附件。
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