FR2944795A1 - Hydrolysats peptidiques activateurs du proteasome et compositions les contenant - Google Patents
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Abstract
La présente invention se rapporte à un hydrolysat peptidique enrichi en peptides bioactifs, ledit hydrolysat étant activateur du proteasome. En outre, la présente invention concerne, d'une part, une composition cosmétique ou pharmaceutique, comprenant ledit hydrolysat dans un milieu physiologiquement acceptable et, d'autre part, son utilisation pour prévenir ou traiter les signes cutanés du vieillissement, du photo-vieillissement et protéger la peau contre les agressions dues aux rayonnements UV. L'invention porte enfin sur un procédé de traitement cosmétique destiné à prévenir et/ou à lutter contre les signes cutanés du vieillissement et du photo-vieillissement.
Description
La présente invention se rapporte au domaine des actifs anti-âge et de leurs utilisations en cosmétique notamment. Plus particulièrement la présente invention se rapporte à un hydrolysat peptidique enrichi en peptides bioactifs, ledit hydrolysat étant activateur du proteasome, ainsi que son utilisation en cosmétique et/ou pharmaceutique afin de prévenir et/ou corriger les effets du vieillissement et du photo-vieillissement de la peau et des phanères, et protéger la peau contre les agressions dues aux rayonnements UV.
Le vieillissement correspond à l'ensemble des processus physiologiques et psychologiques qui modifient la structure et les fonctions de l'organisme à partir d'un certain âge. On distingue deux types de vieillissement, d'une part, le vieillissement intrinsèque et, d'autre part, le vieillissement extrinsèque. Le vieillissement intrinsèque est dû à des facteurs génétiques, à des modifications biochimiques qui ont lieu lors d'états de fatigue, de stress, de changements hormonaux comme lors de la grossesse... Le vieillissement extrinsèque, quant à lui, est dû à des facteurs environnementaux auxquels est soumis l'organisme tout au long de sa vie, tels que la pollution, le soleil, les maladies etc. Il s'agit d'un processus lent et progressif qui atteint toutes les cellules de l'organisme par différents moyens et se manifeste de différentes manières. Par exemple, au niveau de la peau, l'aspect de celle-ci est modifié par les divers types d'agressions internes ou externes et l'on voit apparaître alors des rides et ridules, des taches d'hyper ou d'hypopigmentation, une sècheresse voire une déshydratation de la peau, un amincissement de l'épiderme, une élastose, des imperfections, des taches de vieillesse.... Tous ces changements affectent non seulement la peau, mais également les phanères tels que les ongles et les cheveux. Ces modifications sont dues entre autres à l'altération des fonctions de renouvellement cellulaire, de cohésion cellulaire, de synthèse de collagène, d'élastine et d'autres protéines, et conduisent finalement à une diminution des qualités de barrière protectrice de la peau et à un aspect peu esthétique de celle-ci. Mais l'un des processus principaux responsables du vieillissement des cellules est sans conteste l'accumulation de protéines endommagées dans ces dernières. En effet, les protéines sont la cible de diverses modifications post-traductionnelles anormales telles que l'oxydation, la glycation, la conjugaison avec des produits issus de la peroxydation lipidique, phénomènes dont l'incidence augmente fortement avec l'âge. Il est connu que les radicaux libres jouent un rôle clé dans le processus de vieillissement et plus particulièrement dans la formation de protéines oxydées, endommagées (Harman et al. Aging: a theory based on free radical and radiation chemistry J. Gerontol., 11, 298-300). L'accumulation de protéines endommagées pose donc le problème de l'efficacité des systèmes protéolytiques en charge de l'élimination de ces protéines, et particulièrement celle du système protéosomal impliqué non seulement dans l'élimination des protéines altérées, notamment par oxydation, mais aussi dans le renouvellement continu des protéines intracellulaires. La voie ubiquitine-protéasome joue un rôle fondamental dans un très grand nombre de processus biologiques. En effet, les mécanismes de dégradation des protéines par le protéasome sont impliqués dans des mécanismes cellulaires importants tels que la réparation de l'ADN, le contrôle de l'expression des gènes, la régulation de la progression du cycle cellulaire, le contrôle de la qualité des protéines néo-synthétisées, l'apoptose ou la réponse immunitaire (Glickman and Ciechanover, 2002). Le protéasome présent dans les cellules humaines est un complexe multi protéique de très grande taille présent dans le cytoplasme et le noyau. Les formes purifiées du protéasome comprennent 2 grandes sous-unités ; d'une part, un coeur protéolytique appelé protéasome 2OS et, d'autre part, un complexe régulateur 19S qui se lie à chacune des deux extrémités du protéasome 2OS (Coux et al., 1996 ; Glickman et Coux, 2001). Le protéasome 2OS est une particule en forme de cylindre creux, composée de 28 sous-unités alpha et béta, distribuées en 4 anneaux heptamériques. Les activités peptidases sont présentes à la surface interne du cylindre et s'influencent de manière allostérique. Trois activités protéolytiques ( trypsine, chymotrypsine et caspase-like ) ont été associées au protéasome 2OS et concourent à la destruction des protéines en peptides inactifs de 3 à 20 acides aminés. Outre le protéasome 2OS, le protéasome 26S comprend le complexe régulateur 19S de 0,7 NlDa constitué de 20 sous-unités environ. Des études récentes d'immunopurification ont montré que d'autres protéines pouvaient être associées au protéasome 20S et 19S (par exemple le complexe régulateur 11S).
3 Des travaux menés ces dernières années ont permis de corréler le vieillissement avec l'activité du protéasome. En effet, alors qu'avec l'âge il y a une augmentation de l'accumulation des protéines oxydées, on a constaté une baisse de l'efficacité du système protéosomal (Petropoulos et al., J. Gerontol. A. Biol. Sci. 2000, 55A :B220-7). Cette baisse de l'efficacité du système protéosomal était due en fait à une baisse de la quantité de protéasome. Ces résultats ont été confirmés par ceux d'une étude portant sur la quantité et l'activité du protéasome dans des cellules d'individus centenaires versus individus jeunes (Chondrogianni et al., Exp. Gerontol. 2000 ;35 :721-8). Ces études, ainsi que bien d'autres, démontrent bien le lien entre vieillissement et activité du protéasome et l'on peut penser que l'induction de l'expression du protéasome dans des cellules de la peau ou des phanères pourrait avoir une influence positive sur le vieillissement, voire retarder celui-ci. Dans l'optique de prévenir ou retarder le vieillissement, des compositions cosmétiques à base d'extraits naturels ont été proposées : par exemple le brevet FR 2822701 divulgue une composition à base d'un extrait d'algue phaeodactylum pour favoriser l'activité du protéasome. Ou encore, la demande de brevet FR 2898808 décrit l'utilisation d'une composition comprenant un extrait de micro-algue et de ferrulate d'arginine, toujours pour activer le protéasome. D'autres compositions quant à elle comprennent des composés chimiques, capables de moduler l'activité du protéasome pour avoir un effet antivieillissement. Ces compositions sont décrites dans les demandes de brevets WO 2006/105811 ou encore WO 2005/061530. Cependant les composés de type peptidique proposés présentent une taille importante et il est difficile dans le domaine de la cosmétique de les utiliser tels quels. Il existe alors un besoin, notamment dans l'industrie cosmétique, de nouvelles compositions provenant d'extraits naturels avec des principes actifs de taille réduite, et efficaces quant à leur utilisation en tant qu'activateur du protéasome ayant un effet anti-âge.
C'est ainsi que la Demanderesse a découvert qu'un hydrolysat peptidique enrichi en peptides bioactifs était capable d'activer le protéasome et pouvait ainsi être utile afin de prévenir et/ ou traiter les signes cutanés du vieillissement et au photo-vieillissement, ainsi que les agressions dues aux rayonnements UV.
4 Par conséquent la présente invention a pour premier objet un hydrolysat peptidique activateur du protéasome, enrichi en peptides bioactifs de 3 à 5 acides aminés, chaque peptide bioactif comprenant au moins un résidu arginine, un résidu lysine et un résidu glycine.
La présente invention a pour second objet une composition cosmétique comprenant à titre de principe actif ledit hydrolysat peptidique enrichi. En outre, la présente invention a pour troisième objet l'utilisation d'une composition cosmétique comprenant ledit hydrolysat peptidique enrichi pour prévenir et/ou traiter les signes cutanés du vieillissement et du photo-vieillissement et améliorer la dégradation par le protéasome des protéines endommagées. Enfin, la présente invention a pour quatrième objet un procédé de traitement cosmétique de la peau ou des phanères à traiter à l'aide de la composition comprenant ledit hydrolysat peptidique enrichi. La figure 1 représente un exemple de chromatogramme obtenu par CLHP, avec mise en évidence du pic correspondant au peptide bioactif dans un hydrolysat de maïs. La figure 2 représente un exemple de chromatogramme obtenu par CLHP, avec mise en évidence du pic correspondant au peptide bioactif dans un hydrolysat de pois. La figure 3 représente un exemple de chromatogramme obtenu par CLHP, avec mise en évidence du pic correspondant au peptide bioactif dans un hydrolysat de riz La figure 4 représente un exemple de chromatogramme obtenu par CLHP, avec mise en évidence du pic correspondant au peptide bioactif dans un hydrolysat de soja La figure 5 représente un exemple de chromatogramme obtenu par CLHP, avec mise en évidence du pic correspondant au peptide bioactif dans un hydrolysat de Saccharomyces cerevisiae La présente invention a pour objet premier un hydrolysat peptidique activateur du protéasome, enrichi en peptides bioactifs de 3 à 5 acides aminés, chaque peptide bioactif comprenant au moins un résidu arginine, un résidu lysine et un résidu glycine. On entend par hydrolysat peptidique , un mélange de composés majoritairement représentés par des peptides ou des oligopeptides.
Par peptides bioactifs on entend un fragment de protéine composé par l'enchaînement d'au moins 3 acides aminés liés entre eux par des liaisons peptidiques modifiées ou non et qui présentent une activité en tant qu'activateur du protéasome. Présents sous forme inactive dans les protéines, ils deviennent actifs après hydrolyse de ces dernières. Ledit hydrolysat peptidique enrichi selon l'invention est caractérisé en ce qu'il est activateur du protéasome. On entend par hydrolysat peptidique (et/ou peptides bioactifs) activateur du protéasome , tout hydrolysat peptidique, ou peptide ou dérivé biologiquement actif capable d'augmenter l'activité du protéasome, soit par augmentation de la synthèse protéique des sous-unités du protéasome (par modulation directe ou indirecte de l'expression génique), soit par d'autres processus biologiques tels que la stabilisation des sous-unités constituant le protéasome ou encore la stabilisation des transcrits d'ARN messager.
L' hydrolysat peptidique enrichi selon l'invention est caractérisé en ce qu'il permet d'activer la dégradation par le protéasome des protéines endommagées. Par protéines endommagées on entend des protéines ayant subi des réactions d'oxydation dues aux espèces réactives de l'oxygène (radicaux libres), des protéines glyquées ou conjuguées avec des produits issus de la péroxydation lipidique etc.
Préférentiellement, l'hydrolysat peptidique est enrichi en peptides bioactifs de formule générale (I) : X1 û [Arg û Lys û Gly] û X2 Dans laquelle, X1 est une isoleucine, une leucine, une proline, une valine, une glycine, une alanine, ou est absent X2 est une cystéine, un acide glutamique, une glutamine, une histidine, une méthionine, ou est absent Préférentiellement, l'hydrolysat peptidique est riche en peptides bioactifs de formule suivante : (SEQ ID n°1) Ile ù Arg ù Lys ù Gly ù Glu (SEQ ID n°2) Leu û Arg û Lys û Gly û Met (SEQ ID n°3) Arg û Lys û Gly û His (SEQ ID n°4) Pro û Arg û Lys û Gly ûMet (SEQ ID n°5) Arg û Lys û Gly En effet, ces peptides ont été identifiés comme étant particulièrement actifs en tant qu'activateurs du protéasome et présentent donc un intérêt particulier en tant qu'agent anti-âge. L'hydrolysat peptidique enrichi selon l'invention peut être obtenu à partir de diverses sources de protéines, qu'elles soient d'origine animale ou végétale. Selon une première réalisation, l'hydrolysat peptidique enrichi est issu de l'hydrolyse de plantes choisies parmi le maïs (Zea mayz L.), le pois (Pisum sativum), le riz (Oryza sativa L.), ou le soja (Glycine Max L.). De préférence, les plantes utilisées ne sont pas soumises à une fermentation préalable. Dans un second mode de réalisation, l'hydrolysat peptidique enrichi est issu de l'hydrolyse de levures du genre Saccaromyces, et plus particulièrement de l'espèce Saccharomyces cerevisiae. Ainsi, l'invention peut être réalisée en utilisant les graines d'une des nombreuses plantes du genre Zea et préférentiellement l'espèce Zea mays L. Selon l'invention le matériel végétal utilisé sera le grain et préférentiellement le grain débarrassé de son enveloppe par une étape de décorticage.
L'invention peut également être réalisée en utilisant l'une des nombreuses plantes de la famille des pois (Fabacées). On utilisera, par exemple, les plantes de l'espèce des pois Pisum sativum L. Le terme pois désigne en outre la graine, elle-même riche en protéines (25 %). Les plantes de la famille du riz (Poacées), notamment celles du genre Oryza et plus préférentiellement l'espèce Oryza sativa L peuvent être utilisées pour réaliser l'hydrolysat selon l'invention. Le matériel végétal utilisé sera le grain et préférentiellement le grain débarrassé de son enveloppe par une étape de décorticage. L'invention peut également être réalisée en utilisant les graines de Fabacées, du genre Glycine (le soja) ou encore le tourteau de soja, et préférentiellement l'espèce Glycine Max. L. Selon l'invention, le matériel végétal utilisé sera le grain et plus préférentiellement le grain débarrassé de son enveloppe par une étape de décorticage.
Enfin, l'invention peut également être réalisée en utilisant des levures du genre Saccharomyces ; et de manière préférentielle des levures de l'espèce Saccharomvices cerevisiae.
Toute méthode d'extraction ou de purification connue de l'homme du métier peut être utilisée afin de préparer l'hydrolysat selon l'invention. Dans une première étape, les graines, ou une partie spécifique de la plante (feuilles, tubercules, racines, etc.) sont broyées à l'aide d'un broyeur à plantes. La poudre ainsi obtenue peut ultérieurement être "délipidée" à l'aide d'un solvant organique classique (comme par exemple un alcool, l'hexane ou de l'acétone). Lorsqu'il s'agit de levures, dans une première étape, celles-ci sont mises en culture de manière classique dans un milieu adapté à leur développement, de préférence en présence de lactose. Elles sont récoltées par centrifugation puis mises en suspension dans une solution tampon, préférentiellement un tampon phosphate. Dans une seconde étape, ces cellules sont éclatées à l'aide d'une presse de French ou à l'aide d'un broyeur à bille, la majorité des composants membranaires insolubles étant écartés par centrifugation ou par filtration. On réalise ensuite l'extraction des protéines suivant le procédé classique (Osborne, 1924) modifié ; le broyat de plante ou le lysat de levures est mis en suspension dans une solution alcaline contenant un produit adsorbant de type polyvinylpolypyrrolidone (PVPP) insoluble (0,01 -20 %) ; en effet il a été observé que les opérations d'hydrolyses et de purifications ultérieures étaient facilitées par ce moyen. En particulier, la concentration en substances de type phénoliques, interagissant avec les protéines, se trouve nettement réduite.
La fraction soluble, contenant les protéines, les glucides et éventuellement des lipides, est recueillie après des étapes de centrifugation et de filtration. Cette solution brute est ensuite hydrolysée dans des conditions ménagées pour générer des peptides solubles. L'hydrolyse se définit comme étant une réaction chimique impliquant le clivage d'une molécule par de l'eau, cette réaction pouvant se faire en milieu neutre, acide ou basique.
Selon l'invention, l'hydrolyse est réalisée par voie chimique et/ou de façon avantageuse par des enzymes protéolytiques. On peut alors citer l'utilisation des endoprotéases
8 d'origine végétale (papaïne, bromélaïne, ficine) et de micro-organismes (Aspergillus, Rhizopus, Bacillus, etc.). Les conditions d'hydrolyses sont choisies pour favoriser l'enrichissement en peptides bioactifs. Pour les mêmes raisons que précédemment, c'est-à-dire l'élimination des substances polyphénoliques, une quantité de polyvinylpolypyrrolidone est additionnée au milieu réactionnel lors de cette étape d'hydrolyse ménagée. Après filtration, permettant d'éliminer les enzymes et les polymères, un premier filtrat est obtenu. L'hydrolysat obtenu à ce stade peut être encore purifié afin de sélectionner les fractions de bas poids moléculaires, préférentiellement inférieures à 6 kDa, ainsi que les peptides générés selon leur nature. La purification s'effectue avantageusement par des étapes d'ultrafiltrations successives à travers des filtres de porosité décroissante, en conservant les filtrats à chaque étape et/ ou par une méthode de type chromatographique, afin d'enrichir spécifiquement l'hydrolysat en peptides bioactifs. On procède à une phase de dilution dans de l'eau ou dans tout mélange contenant de l'eau, puis stérilisation par ultrafiltration afin d'obtenir un hydrolysat peptidique enrichi caractérisé par une teneur en protéines de 0,5 à 5,5 g/1. Cet hydrolysat peptidique enrichi correspond à la forme la plus purifiée du principe actif selon l'invention. L'hydrolysat peptidique obtenu selon l'invention est analysé qualitativement et quantitativement en chromatographie liquide haute pression (CLHP), qui permet d'analyser les protéines ayant des poids moléculaires de 0,2 à 25 kDa (selon un gradient de solvants approprié). Les différentes fractions peptidiques qui ont pu être isolées sont ensuite analysées pour leur efficacité biologique. Ces diverses fractions sont ensuite analysées par spectrométrie de masse afin d'identifier spécifiquement le contenu en acides aminés des peptides de chaque pic. Il a également été réalisé une analyse par séquençage, pour déterminer la séquence peptidique des peptides bioactifs. Finalement, l'hydrolysat peptidique enrichi obtenu est composé de peptides de poids moléculaire inférieur à 6 kDa, et est enrichi en peptides bioactifs de 3 à 5 acides aminés comprenant au moins un résidu arginine, un résidu lysine et un résidu glycine.
Cet hydrolysat peptidique, selon l'invention, enrichi en peptides bioactifs peut en outre être utilisé à titre de médicament.
Le second objet de la présente invention se rapporte à une composition cosmétique comprenant à titre de principe actif l'hydrolysat peptidique enrichi en peptides bioactifs tels que décrits précédemment. De manière préférée, les compositions selon l'invention se présentent sous une forme adaptée à l'application par voie topique comprenant un milieu cosmétiquement acceptable. Par cosmétiquement acceptable , on entend des rnilieux qui conviennent à une utilisation en contact avec la peau ou les phanères humains, sans risque de toxicité, d'incompatibilité, d'instabilité, de réponse allergique et autres. Préférentiellement, ledit hydrolysat peptidique est présent dans la composition en une quantité représentant de 0,0001 % à 20 % du poids total de la composition, et préférentiellement en une quantité représentant de 0,05 % à 5 % du poids total de la composition. Dans les compositions selon l'invention, l'hydrolysat peptidique enrichi en peptides bioactifs est solubilisé dans un ou plusieurs solvants comme l'eau, le glycérol, l'éthanol, le propylène glycol, le butylène glycol, le dipropylène glycol, les diglycols éthoxylés ou propoxylés, les polyols cycliques, la vaseline, une huile végétale ou tout mélange de ces solvants. Selon encore un autre mode de réalisation avantageux, l'hydrolysat peptidique selon l'invention est solubilisé dans un vecteur cosmétique ou pharmaceutique comme les liposomes ou adsorbé sur des polymères organiques poudreux, des supports minéraux comme les talcs et bentonites, et plus généralement solubilisé dans, ou fixé sur, tout vecteur physiologiquement acceptable. Les compositions destinées à être appliquées sur la peau peuvent se présenter sous forme de solution aqueuse ou hydroalcoolique, d'émulsion eau dans huile ou huile dans eau, de microémulsion, de gel aqueux ou anhydre, de sérum, ou encore de dispersion de vésicules, de patch, de crème, de spray, d'onguent, de pommade, de lotion, de colloïde, de solution, de suspension ou autres. Les compositions peuvent aussi être appliquées sur les phanères sous forme de shampoing, de teinture ou de mascara à appliquer au pinceau ou au peigne, en particulier sur les cils, les sourcils ou les cheveux, ou encore de soins pour les ongles tels que les vernis.30 Dans un mode de réalisation particulier, la composition selon l'invention contient en outre, au moins un autre principe actif favorisant l'action dudit hydrolysat peptidique enrichi. On peut citer, de manière non limitative, les classes d'ingrédients suivantes : des agents actifs peptidiques, d'autres extraits de végétaux, des agents cicatrisants, anti-âge, anti-rides, apaisants, anti-radicalaire, anti-UV, des agents stimulant la synthèse de macromolécules dermiques ou le métabolisme énergétique, des agents hydratants, antibactériens, anti-fongiques, anti-inflammatoires, anesthésiques, des agents modulants la différenciation, la pigmentation ou la dépigmentation cutanée, des agents stimulants la pousse des ongles ou des cheveux.... Préférentiellement, on utilisera un agent présentant une activité dans le domaine des antirides, tel qu'un agent anti-radicalaire ou antioxydant, ou un agent stimulant la synthèse de macromolécules dermiques, ou encore un agent stimulant le métabolisme énergétique. Plus particulièrement, le principe actif est choisi parmi les vitamines, les phytostérols, les flavonoïdes, la DHEA et/ou un de ses précurseurs ou un de ses dérivés chimiques ou biologiques, un inhibiteur de métalloproteinase, ou un rétinoïde. En outre, des additifs tels que des agents épaississants, émulsifiants, humectants, émollients, des parfums, des antioxydants, des agents filmogènes, chélatants, séquestrants, conditionnants....peuvent être ajoutés à la composition. Dans tous les cas, l'homme de métier veillera à ce que ces adjuvants ainsi que leurs proportions soient choisis de telle manière à ne pas nuire aux propriétés avantageuses recherchées de la composition selon l'invention. Ces adjuvants peuvent, par exemple, être compris entre 0,01 et 20 % du poids total de la composition. Lorsque la composition de l'invention est une émulsion, la phase grasse peut représenter de 5 à 80 % en poids et de préférence de 5 à 50 % en poids par rapport au poids total de la composition. Les émulsionnants et co-émulsionnants utilisés dans la composition seront choisis parmi ceux classiquement utilisés dans le domaine considéré. Par exemple, ils peuvent être utilisés dans une proportion allant de 0,3 à 30 % en poids, par rapport au poids total de la composition. Enfin, l'invention se rapporte à une composition comprenant ledit hydrolysat peptidique afin d'augmenter l'activité du protéasome et d'améliorer la dégradation par le protéasome des protéines endommagées.
11 Un troisième objet de l'invention se rapporte à l'utilisation d'une composition cosmétique comprenant ledit hydrolysat peptidique enrichi et un milieu cosmétiquement acceptable pour prévenir et/ou traiter les signes cutanés du vieillissement et du photo-vieillissement.
Les signes cutanés du vieillissement incluent, mais ne se limitent pas à, toutes les manifestations visibles sur la peau causées par le vieillissement. On entend en particulier les rides, les rides profondes et grossières, les ridules, les crevasses, le relâchement des tissus cutanés et sous-cutanés, la perte de l'élasticité cutanée et l'atonie, la perte de fermeté et de tonicité, et l'atrophie dermique. En outre, on entend aussi par signes cutanés du vieillissement , les pores élargis, les imperfections, la décoloration, les taches de vieillesse, les kératoses, la perte de collagène, et autres changements du derme et de l'épiderme, mais également toutes modifications de l'aspect extérieur de la peau et des phanères dues au vieillissement comme, par exemple, les rugosités superficielles de la couche cornée, mais également toute modification interne de la peau qui ne se traduit pas systématiquement par un aspect extérieur modifié comme, par exemple, l'amincissement du derme. Par photo-vieillissement on entend le vieillissement prématuré de la peau causé par l'exposition prolongée et cumulative au soleil.
La présente invention se rapporte donc à l'utilisation d'une composition pour traiter ou prévenir les rides, les rides profondes et grossières, les ridules, les crevasses, le relâchement des tissus cutanés et sous-cutanés, la perte de l'élasticité cutanée et l'atonie, la perte de fermeté et de tonicité, et l'atrophie dermique. Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'une composition selon l'invention pour protéger la peau contre les agressions dues aux rayonnements UV.
Enfin, l'invention se rapporte à l'utilisation d'une composition comprenant l'hydrolysat peptidique pour augmenter l'activité du protéasome et améliorer la dégradation par le protéasome des protéines endommagées.
Un dernier objet de la présente invention se rapporte à un procédé de traitement cosmétique consistant à appliquer topiquement sur la peau ou les phanères à traiter, une composition comprenant une quantité efficace d'hydrolysat peptidique enrichi selon l'invention, pour prévenir et/ou traiter les signes cutanés du vieillissement et du photo-vieillissement. En outre, ce procédé de traitement cosmétique peut être appliqué avant le coucher de façon à nettoyer les cellules et la peau pendant le cycle de renouvellement cellulaire. En effet, durant la nuit, la peau privilégie les fonctions de renouvellement ainsi que les processus métaboliques de synthèse. Par conséquent, l'application de la composition telle que revendiquée, en respectant le rythme biologique de la peau permet d'obtenir un effet rajeunissant, stimulant le renouvellement cellulaire, et régénérant.
Les exemples suivants décrivent et démontrent l'efficacité de composés peptidiques tels que décrits selon l'invention mais ne doivent pas être interprétés comme une limitation de la présente invention.
Exemple 1 : Préparation d'un hvdrolysat peptidiuue à partir de tourteaux de maïs (Zea mavs L) Le tourteau de maïs (Zea mays L.) est mis en solution dans 10 volumes d'eau en présence de 2 % de POLYCLAR 10 (polyvinylpolypyrrolidone ù PVPP - insoluble). Le mélange est ajusté à un pH compris entre 6 et 8 avec une solution aqueuse de soude 1 M. Après ajustement du pH, de la papaïne à 2 % est ajoutée dans le milieu réactionnel. L'hydrolyse est obtenue après 2 heures d'agitation à 55°C. On procède ensuite à l'inactivation de l'enzyme par chauffage de la solution à 80°C pendant 2 heures. Après centrifugation, la solution aqueuse surnageante correspondant à un hydrolysat brut de maïs est récupérée. Des conditions spécifiques d'hydrolyse sont choisies de façon à permettre un enrichissement en peptides bioactifs de 3 à 5 acides aminés comprenant au moins un résidu arginine, un résidu lysine et un résidu glycine. Le procédé de purification de l'hydrolysat brut commence par des filtrations successives à l'aide de filtres-plaques Seitz-Orion de porosité décroissante (jusqu'à 0.2 !am) afin d'obtenir une solution jaune, brillante et limpide, qualifiée d'hydrolysat 1. A cette étape, l'hydrolysat 1 de maïs est caractérisé par un extrait sec titrant de 20 à 30 g/kg, un taux de protéines de 20 à 25 g/1 et un taux de sucres de 2 à 5 g/1. La nature protéique de l'hydrolysat 1 est mise en évidence après analyse par électrophorèse sur gel de polyacrylamide NuPAGE Bis-Tris Pre-cast (Invitrogen).
13 L'hydrolysat protéique de maïs est chauffé à 70°C pendant 10 minutes dans des conditions réductrices dénaturantes dans un tampon de préparation d'échantillon NuPAGE LDS. La migration des protéines est réalisée dans du tampon de migration NuPAGE MES avec le standard SeeBlue Plus2 comme marqueur de poids moléculaire.
La coloration des protéines est effectuée à l'aide de Bleu de C'oomassie R-250. Dans ces conditions, on observe des protéines de poids moléculaire inférieur à 6 kDa. L'hydrolysat 1 est ensuite purifié en éliminant les protéines de haut poids moléculaire par ultrafiltration à l'aide de la cassette Pellicon 2 Biomax 5 kDa afin de ne conserver que les composés de nature peptidique inférieurs à 5 kDa.
Après cette purification finale, on procède à une phase de dilution afin d'obtenir un hydrolysat peptidique caractérisé par un taux de protéines compris entre 3,5 et 5,5 g/1. Cet hydrolysat peptidique enrichi en peptides bioactifs correspond au principe actif selon l'invention. Cet hydrolysat peptidique est alors analysé en chromatographie liquide haute pression (CLHP) à l'aide d'un appareil HP1100 piloté par le logiciel ChemStation. La colonne utilisée lors de l'élution de l'hydrolysat est une Nucleosil 300-5 C4 MPN (125 x 4 mn), permettant de chromatographier des protéines ayant des poids moléculaires de 0.2 à 25 kDa dans les conditions suivantes : - Gradient Méthanol - Colonne Uptisphere OPB 125 x 3 mm - Solvant A: eau grade HPLC contenant 0.1% d'acide heptafluorobutyrique (HFBA) - Solvant B: méthanol grade HPLC contenant 0.1% d'acide heptafluorobutyrique (HFBA) - Gradient: 100% à 15% solvant A en 35 min Un exemple de chromatogramme obtenu par CLHP (chromatographie en phase liquide à haute pression), avec mise en évidence du pic correspondant aux peptides bioactifs est donné à la figure 1. Ces diverses fractions sont ensuite analysées par spectrométrie de masse afin d'identifier spécifiquement le contenu en acides aminés des peptides de chaque pic. Il a également été réalisé une analyse par séquençage, pour déterminer la séquence peptidique du peptide bioactif.
Exemple 2 : Préparation d'un hydrolysat peptidique enrichi en peptides bioactifs à partir de pois (Pisum sativum L.) L'hydrolysat peptidique est obtenu à partir d'un extrait de plantes de l'espèce Pisum sativum L. Bien entendu l'extrait peut être préparé à partir de plantes d'au moins l'une quelconque des nombreuses variétés et espèces appartenant au genre Pisum. Dans une première étape, 1 kg de pois décortiqués sont délipidés par l'action d'un solvant organique : l'hexane.
La farine de pois ainsi obtenue est mise en solution dans 10 volumes d'eau en présence de 2 % de POLYCLAR 10 (polyvinylpolypyrrolidone ù PVPP - insoluble). Le mélange est ajusté à un pH compris entre 6 et 7 avec une solution aqueuse de soude 1 M. Après ajustement du pH, il est rajouté 2 % de flavourzym dans le milieu réactionnel. L'hydrolyse est obtenue après 2 heures d'agitation à 50°C. On procède à l'inactivation de l'enzyme en chauffant la solution à 80°C pendant 2 heures. Le mélange réactionnel ainsi obtenu correspond à l'extrait de pois. Des conditions spécifiques d'hydrolyse sont choisies de façon à permettre un enrichissement en peptides bioactifs de 3 à 5 acides aminés comprenant au moins un résidu acide arginine, un résidu lysine et un résidu glycine.
Le procédé de purification commence par des filtrations successives à l'aide de filtres-plaques Seitz-Orion de porosité décroissante (jusqu'à 0,2 m) afin d'obtenir une solution brillante et limpide. A cette étape, l'hydrolysat de pois est caractérisé par un sec titrant de 70-80 g/kg, un taux de protéines de 55-65 g/l, un taux de sucres de 2-5 g/1 et un taux de polyphénol de 1-3 g/l.
La nature protéique de cet hydrolysat est mise en évidence par électrophorèse sur gel de polyacrylamide. Pour cette analyse, on utilise les gels NuPAGE Bis-Tris Pre-cast (Invitrogen). L'hydrolysat peptidique de pois est chauffé à 70°C pendant 10 minutes dans des conditions réductrices dénaturantes dans un tampon de préparation d'échantillon NuPAGE LDS. La migration des protéines est réalisée à l'aide du tampon de migration NuPAGE MES avec le standard SeeBlue Plus2 comme marqueur de poids moléculaire.
15 La coloration des protéines est effectuée à l'aide de Bleu de Coomassie R-250. Dans ces conditions, on observe 2 grandes familles de protéines : la l ère famille correspond à des protéines de poids moléculaire de 20 à 25 kDa et la dernière famille à des protéines de poids moléculaires inférieurs à 5kDa.
Cette solution est alors purifiée en éliminant les protéines de poids moléculaires supérieurs à 5 kDa à l'aide d'une filtration à flux tangentiel. Pour cela, l'hydrolysat de pois est pompé sous pression à travers un support Pellicon équipé de cassette Pellicon 2 Biomax 30 kDa. Ce 1er filtrat est récupéré pour être ensuite filtré à travers une autre cassette Pellicon 2 Biomax 5 kDa. En fin de purification, on obtient un hydrolysat peptidique de pois jaune-beige, brillant et limpide. Il est caractérisé par un sec de 50 à 55 g/kg, une teneur en protéines de 50 à 52 g/1. Cette solution est alors analysée en chromatographie liquide haute pression à l'aide d'un appareil HP1100 piloté par le logiciel ChemStation. La colonne utilisée lors de l'élution de l'extrait de pois est une Nucleosil 300-5 C4 MPN (125 x 4 mn). Cette colonne permet de chromatographier des protéines ayant des poids moléculaires de 0,2 à 25 kDa (selon un gradient de solvants approprié, identique à l'exemple 1). Dans ces conditions chromatographiques, plusieurs fractions peptidiques ont pu être isolées. Ces diverses fractions sont ensuite analysées par spectrométrie de masse afin d'identifier spécifiquement le contenu en acides aminés des peptides de chaque pic. Il a également été réalisé une analyse par séquençage, pour déterminer la séquence peptidique des peptides bioactifs. Un exemple de chromatogramme obtenu par CLHP (chromatographie en phase liquide à haute pression), avec mise en évidence du pic correspondant aux peptides bioactifs est donné à la figure 2. La détermination de la composition en acides aminés du principe actif selon l'invention a également été réalisée. Celle-ci est réalisée après hydrolyse acide et identification par chromatographie liquide haute pression à l'aide d'une pré-dérivation au PICT (phenylisothiocyanate). Exemple 3 : Préparation d'un hydrolysat peptidique enrichi en peptides bioactifs à partir de riz (Oryza sativa)30 Exemple 4 : Préparation d'un hvdrolysat peptidiuue enrichi en peptides bioactifs à partir de tourteau de soja (Glycine Max. L.) Le principe actif est obtenu à partir de plantes de l'espèce Glycine niai L. Bien entendu l'extrait peut être préparé à partir de plantes d'au moins l'une quelconque des nombreuses variétés et espèces appartenant au genre Glycine. Les tourteaux sont les résidus solides obtenus après extraction de l'huile des graines de soja. Ils représentent de 50 à 75 % de la masse des graines. Dans une première étape, 1 kg de tourteau de soja est broyé dans un broyeur à céréales. La farine obtenue est délipidée par l'action d'un solvant organique, l'hexane. Après filtration et séchage sous vide, la poudre obtenue est mise en suspension dans une solution aqueuse alcaline (dilution au 1/10) pH 10, contenant 1 % de polyvinylpolypyrrolidone (Polyclar V ISP). Ce mélange est maintenu sous agitation pendant un temps suffisamment long pour permettre la solubilisation des fractions solubles. La température d'extraction est variable (comprise entre 4 et 80°C) ; préférentiellement l'opération sera réalisée à froid. Après cette phase d'extraction, le milieu est clarifié par centrifugation puis filtré sur filtre à plaque. Ce filtrat qui contient les fractions solubles du soja est ensuite soumis à une précipitation des protéines en faisant varier la force ionique en milieu neutre ou acide, ce qui permet d'éliminer les composants glucidiques solubles, les lipides et les acides nucléiques. Le milieu est amené à pH 3,5. Le surnageant est éliminé et le précipité est ensuite lavé à l'aide d'un solvant tel que, par exemple, l'éthanol ou le méthanol, puis le solvant est évaporé par séchage sous vide. A ce stade, on obtient environ 50 grammes de poudre de couleur jaune clair d'extrait protéique brut contenant : - Protéines : 75 % - Glucides : 20 % - Lipides : 5 % Le précipité riche en protéines est remis en solution dans l'eau ou un autre solvant.
17 L'extrait protéique brut est alors soumis à une série d'hydrolyses ménagées et sélectives consistant en des hydrolyses chimiques et enzymatiques en présence de 0,5 % de polyvinylpolypyrrolidone (Polyclar V) et d'endopeptidases à cystéine (papaïne, ficine). Après réaction l'hydrolysat est filtré sur plaque puis sur cartouche stérilisante (0,2 m). On obtient alors un hydrolysat de couleur claire, titrant de 15 à 30 g/1 d'extrait sec, qui est alors dilué de telle sorte que la concentration en composés de nature peptidique déterminée, par la méthode de Lowry, soit comprise entre 0,1 et 5g/1 et préférentiellement entre 0,5 et 2 g/l. L'analyse physico-chimique de cet hydrolysat peptidique, montre que son pH est compris entre 4 et 7, et préférentiellement entre 5 et 6, l'extrait sec titre de 1 à 8 g/1 et de manière préférée de 2 à 5 g/l, sa teneur en composés de nature peptidique est comprise entre 0,1 et 5g/l, et préférentiellement, entre 0,5 et 2 g/1 et sa teneur en sucres entre 0,5 à 2,5 g/1. Des conditions spécifiques d'hydrolyse sont choisies de façon à permettre un enrichissement en peptides bioactifs de 3 à 5 acides aminés comprenant au moins un résidu arginine, un résidu lysine et un résidu glycine. On procède ensuite à une ultrafiltration de la solution sur une cartouche de filtration Millipore Helicon (seuil de coupure 1 kDa). Les hauts poids moléculaires contenus dans le retentât sont écartés, le filtrat est conservé. Cette solution est alors analysée en chromatographie liquide haute pression à l'aide d'un appareil HP1100 piloté par le logiciel ChemStation. La colonne utilisée lors de l'élution de l'hydrolysat de soja est une Nucleosil 300-5 C4 MPN (125 x 4 mn). Cette colonne permet de chromatographier des protéines ayant des poids moléculaires de 0,2 à 25 kDa (selon un gradient de solvants approprié, identique à l'exemple 1). Dans ces conditions chromatographiques, plusieurs fractions peptidiques ont été isolées.
Ces diverses fractions sont ensuite analysées par spectrométrie de masse afin d'identifier spécifiquement le contenu en acides aminés des peptides de chaque pic. Il a également été réalisé une analyse par séquençage, pour déterminer la séquence peptidique des peptides bioactifs. Un exemple de chromatogramme obtenu par CLHP (chromatographie en phase liquide à haute pression), avec mise en évidence du pic correspondant au peptide bioactif, est donné à la figure 4.
18 La détermination de la composition en acides aminés du principe actif selon l'invention a également été réalisée. Celle-ci est réalisée après hydrolyse acide et identification par chromatographie liquide haute pression à l'aide d'une pré-dérivation au PICT (phenylisothiocyanate).
Une variante du protocole consiste à effectuer une purification du principe actif, obtenu selon le protocole précédent, par chromatographie d'échange d'ions, sur une colonne TSK gel (TosoHaas) avec un tampon phosphate pH 7, afin d'enrichir l'hydrolysat peptidique en peptides bioactifs.
Exemple 5 : Préparation d'un hvdrolvsat peptidique enrichi en peptides bioactifs à 10 partir de levures Saccharomyces cerevisiae L'hydrolysat peptidique peut être obtenu à partir d'un extrait de levures de l'espèce Saccharomyces cerevisiae. Les levures sont cultivées dans un milieu adapté à leur développement, de préférence en présence de lactose, puis centrifugées pour récupérer une biomasse. La biomasse de saccharomyces est mise en solution dans 10 volumes 15 d'eau en présence de 2 % de POLYCLAR 10 (polyvinylpyrrolidone - insoluble) et 0,2 % de charbon actif. Le mélange est ajusté à un pH compris entre 6 et 7,5 avec une solution aqueuse de soude 1 M. Après ajustement du pH, il est rajouté 2 % de papaïne dans le milieu réactionnel. L'hydrolyse est obtenue après 2 heures d'agitation à 55°C. On procède à l'inactivation de 20 l'enzyme en chauffant la solution à 80°C pendant 2 heures. Après centrifugation, le mélange réactionnel correspondant à l'extrait de saccharomyces est alors obtenu. Des conditions spécifiques d'hydrolyse sont choisies de façon à permettre un enrichissement en peptides bioactifs de 3 à 5 acides aminés comprenant au moins un résidu arginine, un résidu lysine et un résidu glycine. 25 Le procédé de purification commence par des filtrations successives à l'aide de filtres-plaques Seitz-Orion de porosité décroissante (jusqu'à 0.2 m) afin d'obtenir une solution brillante et limpide. A cette étape, l'extrait de saccharomyces est caractérisé par un sec de 25 à 35 g/kg, un taux de protéines de 10 à 15 g/1 et un taux de sucres de 5-10 g/l.
19 La nature protéique de cet extrait est mise en évidence par électrophorèse sur gel de polyacrylamide. Pour cette analyse, les gels NuPAGE Bis-Tris Pre-cast (Invitrogen) sont utilisés. L'hydrolysat peptidique est chauffé à 70°C pendant 10 minutes dans des conditions réductrices dénaturantes dans un tampon de préparation d'échantillon NuPAGE LDS. Une solution de NuPAGE Antioxydant est ajoutée dans la cuve intérieure (cathode) pour éviter que les protéines réduites se ré-oxydent durant l'électrophorèse. La migration des protéines est réalisée à l'aide du tampon de migration NuPAGE MES avec le standard SeeBlue Plus2 comme marqueur de poids moléculaire. La coloration des protéines est effectuée à l'aide de Bleu de Coomassie R-250. Dans ces conditions, on observe 3 grandes familles de protéines : la lère famille correspond à des protéines de poids moléculaire supérieur à 75 kDa, la 2ème famille à des protéines de 20 à 25 kDa et la dernière famille à des protéines de poids moléculaire inférieur à 5kDa. Cette solution est alors purifiée en éliminant les protéines de poids moléculaire supérieur à 5 kDa à l'aide de filtration à flux tangentiel. Pour cela, l'hydrolysat peptidique de saccharomyces est pompé sous pression à travers un support Pellicon équipé de cassette Pellicon 2 Biomax 50 kDa. Ce ter filtrat est récupéré pour être ensuite filtré à travers une seconde cassette Pellicon 2 Biomax 10 kDa. Il est alors récupéré un second filtrat qui est encore élué à travers une dernière cassette Pellicon 2 Biomax 5 kDa. En fin de purification, on obtient un extrait végétal de saccharomyces beige, brillant et limpide. Il est caractérisé par un sec de 35 à 45 g/kg, une teneur en protéines de 30 à 40 g/l. Cette solution est alors analysée en chromatographie liquide haute pression à l'aide d'un appareil HP1100 piloté par le logiciel ChemStation. La colonne utilisée lors de l'élution de l'hydrolysat de saccharomyces est une Nucleosil 300-5 C4 MPN (125 x 4 mn). Cette colonne permet de chromatographier des protéines ayant des poids moléculaires de 0,2 à 25 kDa (selon un gradient de solvants approprié, identique à l'exemple 1). Dans ces conditions chromatographiques, plusieurs fractions peptidiques ont été isolées. Ces diverses fractions sont ensuite analysées par spectrométrie de masse afin 30 d'identifier spécifiquement le contenu en acides aminés des peptides de chaque pic. Il a également été réalisé une analyse par séquençage, pour déterminer la séquence peptidique
20 des peptides bioactifs. Un exemple de chromatogramme obtenu par CLHP (chromatographie en phase liquide à haute pression), avec mise en évidence du pic correspondant aux peptides bioactifs, est donné à la figure 5. La détermination de la composition en acides aminés du principe actif selon l'invention a également été réalisée. Celle-ci est réalisée après hydrolyse acide et identification par chromatographie liquide haute pression à l'aide d'une pré-dérivation au PICT (phenylisothiocyanate).
Exemple 6 : Mise en évidence de l'effet activateur de l'hydrolysat peptidique de 10 maïs selon l'exemple 1, sur l'activité enzymatique du proteasome 20S sur des kératinocytes vieillis maintenus en culture. Des kératinocytes vieillis expérimentalement maintenus en culture pendant 15 jours, sont traités avec 1% de notre hydrolysat peptidique issu du mais réalisé selon l'exemple 1. On étudie alors les activités enzymatiques du protéasome 20S. En effet le protéasome 15 20S est la sous-unité responsable de l'hydrolyse enzymatique. Trois activités enzymatiques peuvent être étudiées : l'activité trypsine-like, chimotrypsine-like et peptidylglutamyl-peptide hydrolase (PGPH). Nous nous proposons d'étudier ces activités par un dosage enzymatique spécifique de chaque activité. Protocole 20 Les kératinocytes vieillis sont maintenus en culture pendant 15jours. Le traitement des cellules est effectué par ajout d'une solution à 1 % de notre hydrolysat peptidique directement dans le milieu, renouvelé 3 fois par semaine pendant le temps de l'expérience. Le dosage de chaque activité a été mis en place en utilisant des substrats spécifiques marqués par un composé fluorescent : le 7-amido-4-méthylcoumarine 25 (AMC). Après clivage, l'AMC dont la longueur d'onde d'excitation est de 350nm, la lecture de la fluorescence est effectuée à 440nm. L'intensité de la fluorescence est proportionnelle à la quantité de fluorochrome obtenue et en conséquence, cette quantité est proportionnelle à la quantité de substrat hydrolysé. Le peptide synthétique Boc-Leu-Arg-Arg-AMC est spécifique de l'activité 30 trypsique.
21 Le peptide synthétique Suc-Leu-Leu-Val-Try-AMC est spécifique de l'activité chymotrypsique. Le peptide synthétique Z-Leu-Leu-Glu-AMC est spécifique de l'activité peptidylglutamyl-peptide hydrolase.
Ces peptides ont été fournis et marqués par SIGMA ALDRICH, Saint-Louis, MI, USA. Les cellules sont détachées du support dans un tampon d'extraction. Par la suite, elles sont soniquées pendant 1 minute à 4°C, puis centrifugées à 15000 g pendant 30 minutes à 4°C. Le dosage des protéines est réalisé par le kit BCA (Pierce). Après incubation du lysat cellulaire avec le substrat synthétique spécifique de l'activité étudiée, la fluorescence est lue au spectrophotomètre Synergy (BIOTEK, Vermont, USA) à 440 nm. Résultats Nous constatons que pour les 3 activités étudiées, l'hydrolysat peptidique selon l'exemple 1, a permis d'augmenter l'activité enzymatique du protéasome 20S. L'activité trypsine- like est augmentée de 155.3 % lors du traitement par l'actif, l'activité chymotrypsin-like est augmentée de 130 % et on enregistre une augmentation de 144.6 % pour l'activité peptidylglutamyl-peptide hydrolase. Conclusions L'hydrolysat peptidique enrichi en peptides bioactifs selon l'exemple 1, utilisé à 1 % sur 20 des kératinocytes vieillis expérimentalement en culture permet d'augmenter les activités enzymatiques spécifiques du protéasomes 20S. L'expérience a été réalisée plusieurs fois, et un test statistique (test statistique t-Student) a pu être réalisé. L'augmentation des activités est significative pour l'étude de l'activité trypsine-like, chymotrypsin-like (p=0.033 et p=0.0477 respectivement), et hautement 25 significative pour l'activité peptidylglutamyl-peptide hydrolase (p=0.00053). Exemple 7 : Mise en évidence de l'effet activateur de l'actif sur la prolifération des kératinocvtes vieillis en culture
22 Une étude de l'effet activateur d'un hydrolysat peptidique de soja enrichi en peptides bioactifs a été réalisée en évaluant l'expression de la protéine marqueur de la prolifération cellulaire, sur des kératinocytes vieillis expérimentalement en culture. L'analyse s'est effectuée après 20 jours de culture. Immuno-dosage Des études in vitro de kératinocytes vieillis expérimentalement en culture pendant 20 jours, ont permis de mettre en évidence par immunomarquage, l'expression de la protéine Ki67 qui est un marqueur de la prolifération. Les kératinocytes sont mis en 10 culture pendant 20 jours dans un incubateur à CO2 à 37°C sous atmosphère humide. Les cellules sont traitées directement par ajout de 1 % d'hydrolysat: peptidique de soja selon l'exemple 4, directement dans le milieu. Des cellules non traitées mais vieillies de la même manière sont utilisées comme cellules témoins. Pour les besoins de l'expérience les cellules sont ensemencées dans des labteck 8 puits, maintenues en culture et traitées dans 15 ce même support jusqu'au jour du marquage. Le jour de l'immunomarquage, les cellules sont rincées à l'aide de tampon phosphate, puis fixées au méthanol froid avant le marquage. L'immunomarquage s'effectue par un anticorps lapin anti-Ki67 (Abcam) dilué au 1/1001è' et un anticorps secondaire au 1/1000è11'e couplé à un fluorochrome Alexa fluor 20 singe anti-lapin (Molecular probes). Les lames sont alors montées dans un milieu adéquat et observées au microscope à épifluorescence (Nikon Eclipse E600). Résultats / Conclusions : 25 Les résultats obtenus montrent que l'intensité des cellules marquées dans les conditions témoins est moins importante que dans les conditions traitées par l'hydrolysat peptidique de soja. Cet hydrolysat a permis d'augmenter la protéine Ki67 dans les cellules vieillies et traitées comparé aux cellules non traitées. Par l'intermédiaire de ce marqueur de5 23 prolifération Ki67 nous avons mis en évidence une prolifération des kératinocytes vieillis lorsqu'ils sont traités par l'hydrolysat peptidique de soja enrichi en peptides bioactifs. Exemple 8 : Evaluation de la carbonvlation des protéines sur des fibroblastes traités 5 par l'hvdrolvsat peptidique de riz et soumis à des rayonnements ultraviolets (UVB) Protocole : Des fibroblastes humains normaux en culture sont ensemencés dans des boites de diamètres 100. Lorsque les cellules ont atteint 70 % de confluence, les cellules sont traitées 48 heures avec un hydrolysat peptidique de riz enrichi en peptides bioactifs dilué 10 à 1 % dans le milieu. Les cellules sont soumises à l'irradiation UVB à 100mj/cm2, puis remises 48 heures supplémentaires en présence du principe actif. Des boîtes contrôle avec des cellules non traitées par le principe actif mais irradiées servent de témoin. Les cellules sont rincées puis détachées du support à l'aide d'un tampon d'extraction adéquat. Les protéines ainsi extraites, sont centrifugées à 4°C à 10000 rpm pendant 10 minutes avant 15 d'être dosées par le kit de dosage des protéines BCA (Pierce). La carbonylation des protéines est réalisée par un test basé sur l'immunodétection des groupements carbonylés préalablement dérivés par le 2,4-di nitrophénylhydrazine (DNP) (SIGMA). Selon la réaction : Protéine-C=0 + H2N-NH-2.4DNP ù Protéine-C=N-NH2.4-DNP + H2O 20 Brièvement, 15 l de l'échantillon sont mis à réagir avec 45 l de DNP pendant 45 minutes à température ambiante. Ensuite, 50 du mélange est dilué dans 1 ml de phosphate buffer saline et 200 l de cette dilution sont mis dans une plaque 96 puits over night à 4°C en présence de 150 l de BSA (fraction V). Après 3 lavages en tampon phosphate saline (PBS), l'anticorps biotinylé de lapin 25 anti-dinitrophenyl (CALBIOCHEM) est diluée au 1/5000eme dans du tampon 0.1 % sérum albumine en présence de 0.1 % Tween 20 et incubé dans les microplaques 1 heure à 37°C. Après 3 lavages, on incube le complexe streptavidine-péroxydase (DAKO) dilué au 1/3000en dans du tampon 0.1 % sérum albumine en présence de 0.1 % Tween 20 et incubé dans les microplaques pendant 1 heure à température ambiante. Après 3 lavages, 30 la révélation est effectuée grâce à 200 l de tétramethylbenzidine (TMB, SIGMA) 25
24 minutes à température ambiante. Ensuite, l'ajout de 100 pl d'acide sulfurique à 2,5 M permet de stopper la réaction. La lecture de la DO s'effectue à 490 nm. Afin de convertir la DO obtenue en groupements carbonylés présents dans les échantillons, une courbe étalon a été établie en faisant varier des proportions de 0 à 100 % de BSA oxydée.
Résultats : En présence d'UVB les cellules non traitées sont fortement carbonylées et augmentent de 110 % par rapport aux cellules non irradiées et non traitées. En présence de l'hydrolysat peptidique de riz enrichi en peptides bioactifs à 1 %, le taux de carbonylation est diminué de 34 %. L'expérience a été réalisée plusieurs fois et un test statistique (test statistique t Student) a pu être réalisé. La diminution de la carbonylation est significative et p= 0.0298. En conclusion, le principe actif selon l'invention permet de protéger les cellules contre les effets néfastes des UV c'est-à-dire contre leurs effets oxydatifs. L'hydrolysat 15 peptidique de riz permet de diminuer de plus de 34 % l'oxydation des protéines.
Claims (18)
- REVENDICATIONS1. Un hydrolysat peptidique activateur du protéasome, caractérisé en ce que l'hydrolysat est enrichi en peptides bioactifs de 3 à 5 acides aminés, chaque peptide bioactif comprenant au moins un résidu arginine, un résidu lysine et un résidu glycine.
- 2. Un hydrolysat peptidique enrichi selon la revendication I, caractérisé en ce que le peptide bioactif est de formule générale (I) : X~ ù [Arg ù Lys ù Gly] ù X2 Dans laquelle, XI est une isoleucine, une leucine, une proline, une valine, une glycine, une alanine, ou est absent X2 est une cystéine, un acide glutamique, une glutamine, une histidine, une méthionine, ou est absent
- 3. Un hydrolysat peptidique enrichi selon la revendication précédente, caractérisé en ce que le peptide bioactif correspond à une des formules suivantes : (SEQ ID n°1) I1e ù Arg ù Lys ù Gly ù Glu (SEQ ID n°2) Leu ù Arg ù Lys ù Gly ù Met (SEQ ID n°3) Arg ù Lys ù Gly ù His (SEQ ID n°4) Pro ù Arg ù Lys ù Gly ùMet (SEQ ID n°5) Arg ù Lys ù Gly
- 4. Hydrolysat peptidique enrichi selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il est issu de l'hydrolyse de plantes choisies parmi le maïs (Zea mayz L.), le pois (Pisum sativum), le riz (Orvza sativa L.), ou le soja (Glycine Max L.).
- 5. Hydrolysat peptidique enrichi selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il est issu de l'hydrolyse de levures du genre Saccaromyces, et plus particulièrement de l'espèce Saccharomyces cerevisiae.
- 6. Hydrolysas peptidique selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit hydrolysat peptidique enrichi contient entre 0,5 et 5,5 g/1 de composés de nature peptidique.
- 7. Hydrolysat peptidique enrichi selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est utilisé à titre de médicament.
- 8. Composition cosmétique comprenant à titre de principe actif ledit hydrolysat peptidique enrichi selon l'une des revendications 1 à 6.
- 9. Composition cosmétique selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'elle se présente sous une forme adaptée à l'application par voie topique comprenant un milieu cosmétiquement acceptable. 15
- 10. Composition selon l'une des revendications 8 ou 9, caractérisée en ce que ledit hydrolysat peptidique enrichi est présent dans la composition en une quantité représentant de 0,0001 % à 20 % du poids total de la composition, et préférentiellement en une quantité représentant de 0,05 % à 5 % du poids total de la composition. 20
- 11. Composition selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, caractérisée en ce que ledit hydrolysat est solubilisé dans un ou plusieurs solvants, comme l'eau, le glycérol, l'éthanol, le propylène glycol, le butylène glycol, le dipropylène glycol, les diglycols éthoxylés ou propoxylés, les polyols cycliques, la vaseline, une huile végétale ou tout mélange de ces solvants. 25
- 12. Composition selon l'une quelconque des revendications 8 à 11, caractérisée en ce qu'elle contient en outre, au moins un autre principe actif favorisant l'action dudit hydrolysat peptidique enrichi. 30
- 13. Composition selon la revendication 12, caractérisée en ce que ledit principe actif est un agent présentant une activité dans le domaine des antirides tel qu'un agent anti-10 27 radicalaire ou antioxydant, ou un agent stimulant la synthèse de macromolécules dermiques, ou encore un agent stimulant le métabolisme énergétique.
- 14. Utilisation d'une composition cosmétique comprenant ledit hydrolysat peptidique enrichi tel que défini dans l'une des revendications 1 à 6 et un milieu cosmétiquement acceptable, pour augmenter l'activité du protéasome et améliorer la dégradation par le protéasome des protéines endommagées.
- 15. Utilisation d'une composition cosmétique comprenant ledit hydrolysat peptidique enrichi tel que défini dans l'une des revendications 1 à 6 et un milieu cosmétiquement acceptable pour prévenir et/ou traiter les signes cutanés du vieillissement et du photo-vieillissement.
- 16. Utilisation d'une composition selon la revendication 15 caractérisée en ce que par signes cutanés du vieillissement on entend les rides, les rides profondes et grossières, les ridules, les crevasses, le relâchement des tissus cutanés et sous-cutanés, la perte de l'élasticité cutanée et l'atonie, la perte de fermeté et de tonicité, et l'atrophie dermique.
- 17. Utilisation selon la revendication 15, caractérisée en ce que ladite composition 20 permet de protéger la peau contre les agressions dues aux rayonnements UV.
- 18. Procédé de traitement cosmétique caractérisé en ce que l'on applique topiquement sur la peau ou les phanères à traiter, une composition comprenant une quantité efficace d'hydrolysat peptidique enrichi tel que défini dans l'une des revendications 1 à 6, pour 25 prévenir et/ou traiter les signes cutanés du vieillissement et du photo-vieillissement.
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