CN116041475B - 一种猪源抗菌肽pmap-37的变体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及猪源抗菌肽PMAP‑37的变体，在PMAP‑37的基础上，通过结构、理化性质进行预测和分析，并经合成和抗菌活性验证，最终筛选到合适的抗菌肽PMAP‑37的变体，所述变体相对PMAP‑37具有提高的抑菌活性和热稳定性，具有更高的安全性，且经试验表明，所述抗菌肽变体对于大肠杆菌和肠炎沙门氏菌混合感染导致的肠炎、腹泻等症状具有治疗作用，其能够替代抗生素，用于治疗细菌感染导致的腹泻，可以减少抗生素的使用，对于养殖业而言具有十分积极的意义。

Description

一种猪源抗菌肽PMAP-37的变体

技术领域：

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种猪源抗菌肽PMAP-37的变体。

背景技术：

抗菌肽是一类具有抗菌活性的阳离子短肽的总称，是生物先天免疫的重要组成部分，通常具有广谱杀菌作用，大多数对G⁺细菌具有较强的杀灭作用，有些对G^-细菌和G⁺细菌都有杀灭作用。由于抗菌肽的作用机制不同于目前被广泛应用的抗生素，且一般不会导致细菌对其产生耐药性，因而可以用于杀灭很多耐药性细菌。抗菌肽来源十分广泛，在植物、昆虫、哺乳动物和两栖动物中均可分离得到，猪源抗菌肽是第一批分离得到的哺乳动物抗菌肽，目前在猪体内已经发现了几十种不同的抗菌肽，大致可以分为Cathelicidin家族、防御素家族以及皂苷家族，其中猪源Cathelicidin家族的抗菌肽主要从猪白细胞中分离或从骨髓组织的cDNA序列推断而来，包括PR-39、PF-1、PF-2、PMAP-23、PMAP-36、PMAP-37、PG-1、PG-2、PG-3、PG-4、PG-5等11种，其中PMAP-23和PMAP-36的研究较多，但是对于PMAP-37的研究较少。PMAP-37是最强的膜活性因子,在0.2～1.0μmol/L时引起细菌细胞内膜的渗透作用,而PMAP-23和PMAP-36杀菌活性分别在1～10和10～50μmol/L。目前国内仅有明双喜、王燕、卢刚等人对PMAP-37进行了研究，分别采用RT-PCR的方法对PMAP-37进行了扩增和表达，研究其抑菌活性。对抗菌肽新型优化设计从而得到新的抗菌肽或者提高原抗菌肽的抑菌活性、降低毒性或溶血性等是抗菌肽类药物研究的热点，对于猪源抗菌肽的结构优化也成为当前开发新型抗菌药物的研究热点。例如曹荣田等对猪源抗菌肽PMAP-23进行了优化和改造设计，得到了活性更高的抗菌肽，具有更高的安全性。然而，目前对于PMAP-37的研究极少，因而，对PMAP-37进行深入的研究，对其进行优化设计以得到具有高活性、高安全性的抗菌肽具有积极的意义。

发明内容：

本发明旨在通过对PMAP-37进行改造获得新的抗菌肽，以丰富抗菌肽的种类，获得抗菌抑菌效果更好、加工适应性更强的抗菌肽产品。

本发明涉及一种猪源抗菌肽PMAP-37的变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ IDNo.4所示，所述变体相比猪源抗菌肽PMAP-37具有增强的抑菌活性。

本发明还涉及一种猪源抗菌肽PMAP-37的变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID No.3所示，所述变体相比猪源抗菌肽PMAP-37具有增强的抑菌活性。

本发明还请求保护所述猪源抗菌肽PMAP-37的变体在制备细菌抑制剂中的应用。

本发明还请求保护所述猪源抗菌肽PMAP-37的变体在制备治疗细菌感染导致的腹泻的药物中的应用。

优选地，所述细菌为大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和粪链球菌中的一种或多种。

进一步优选地，所述细菌为金黄色葡萄球菌。

进一步优选地，所述细菌为大肠杆菌和肠炎沙门氏菌。

基于以上技术方案，本发明具有如下优点和有益效果：

本发明选取抗菌肽PAMP-37的主要螺旋结构部分的氨基酸序列，并在此基础上，通过对其疏水性、正电荷和螺旋结构的优化得到了抗菌活性和稳定性改善的两条抗菌肽变体序列，其中PAMP-37-BT2和PAMP-37-BT3相比原始抗菌肽具有提高的抗菌抑菌活性以及热稳定性，能够用于多种细菌导致的感染的治疗，且所述抗菌肽的热稳定性也得到了较大的提高，其具有更好的加工特性，对于畜牧产业的发展具有积极的意义。

附图说明：

图1.抗菌肽PAMP-37及其变体的溶血活性测定结果图。

图2.抗菌肽PAMP-37及其变体的热稳定性测定结果图。

具体实施方式：

实施例1：

据报道，抗菌肽PAMP-37的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示，具体为：GLLSRLRDFLSDRGRRLGEKIERIGQKIKDLSEFFQS，通过对抗菌肽PMAP-37的分子结构进行分析，选取合适的位点进行替换和/或截断等优化，并将优化后的序列输入生物信息学软件，对二级结构、平均亲疏水值、电荷分布等进行预测和分析，最终筛选出3条理化参数较好的抗菌肽(序列如SEQID No：2-4所示)送至吉尔生化公司(中国上海)进行合成。

其中选用合成的抗菌肽的序列如下表1所示：

其中PAMP-37-BT1相对PMAP-37而言进行了截断，截取了其中9F-35F之间的27个氨基酸残基；PAMP-37-BT2在PAMP-37-BT1而言，对其中的第1位的苯丙氨酸(F)替换为带正电荷的精氨酸(R)，将第5位的精氨酸(R)替换为疏水性的色氨酸(W)；PAMP-37-BT3在PAMP-37-BT2的基础上，进一步将第8位的精氨酸(R)替换为疏水性的异亮氨酸(I)，将第27位的苯丙氨酸(F)替换为赖氨酸(K)，并增加了第28位的异亮氨酸(I)和第29位的色氨酸(W)。

实施例2：

2.1试验用菌株及抗菌肽溶液的配制：

为了检测抗菌肽对于畜禽养殖中常见致病菌的抑菌活性，本发明选取大肠杆菌(ATCC29522)、鸡白痢沙门氏菌(CVCC535)、肠炎沙门氏菌(ATCC 13076)、金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)、粪链球菌(ATCC29212)均由北京大北农科技集团股份有限公司购买、保存和提供。

抗菌肽由吉尔生化公司(中国上海)合成，采用反相高效液相色谱和基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱鉴定。多肽纯度均高于95％。抗菌肽以1000μg/mL的浓度溶解于去离子水中，并储存在-80℃。

2.2抑菌活性的测定

利用纸片浸润液扩散法进行抑菌活性的测定。具体方法是：将抗菌肽分别配成1mg/mL的溶液，将活化后的菌液分别均匀涂布在LB固体培养基平板上，待菌液风干后将滤纸片均匀贴于培养基上并按实，取10μL抗菌肽溶液依次滴加到滤纸纸片上，37℃保温箱中过夜培养，测定抑菌圈的大小，试验重复3次，取平均值。具体结果如下表2所示：

表2抗菌肽抑菌试验结果

基于以上抑菌试验结果可知，本发明所制备得到的PAMP-37-BT1～PAMP-37-BT3相对于原始的PAMP-37而言，其抑菌活性均得到了提高，特别是PAMP-37-BT3，其相比原抗菌肽序列对于大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的抑菌效果提升明显，而对于粪链球菌的抑菌效果与原始的PAMP-37效果接近，且与BT-1以及BT-2相比，通过氨基酸位点的替换，其相对而言取得了更好的抑菌效果。

2.3最小抑菌浓度(MIC)的测定

采用最小抑菌浓度测定法(MIC)对抗菌肽的抑菌活性进行测定。具体方法如下：将培养至对数生长期的待测菌液用LB培养液重悬至10⁸cfu/mL，吸取100μL加入96孔细胞培养板，而后各孔加入100μL经倍比稀释后的肽溶液，使孔内抗菌肽的终浓度分别0.0039、0.0078、0.0156、0.0313、0.0625、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0、64.0、128.0μg/mL。阳性对照为100μL的0.4％多聚甲醛溶液，阴性对照为100μL无菌超纯水。细菌置于37℃恒温摇床上培养6h后，使用全自动酶标仪在λ＝630nm处测各孔吸光值，试验重复3次，取其平均值。与未培养前初始吸光值相比，未有显著变化的抗菌肽浓度定义为对该菌的最小抑菌浓度(MIC)。具体测定结果如下表3所示：

表3抗菌肽MIC测定结果

基于以上表3展示的结果可知，PAMP-37及其BT1-3对于金黄色葡萄球菌均具有较强的抑制作用，尤其是PAMP-37-BT3，其MIC仅为0.0039μg/mL；PAMP-37-BT1相比PAMP-37具有增强的大肠杆菌抑菌活性；PAMP-37-BT2相对PAMP-37在大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌、肠炎沙门氏菌和金黄色葡萄球菌上具有增强的抑菌活性，但是对于粪链球菌的抑菌活性没有改善；PAMP-37-BT3相比PAMP-37以及PAMP-37-BT1、PAMP-37-BT2而言，对于以上五种菌均具有增强抑菌活性，是以上四种抗菌肽中活性最强的。

2.4抗菌肽溶血性测定

兔红细胞溶血试验用来评估抗菌肽对哺乳动物正常细胞的溶血活性，溶血率＜5％则认为没有溶血活性。用PBS缓冲液将新鲜兔血红细胞轻轻洗涤3遍，4℃下1000×g，离心10min后取沉淀，生理盐水洗涤3次后按照10％(v/v)重悬于PBS缓冲液中。使用PBS对抗菌肽进行二倍梯度稀释后加入等体积兔血红细胞重悬液，各抗菌肽终浓度为1000、500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.81、3.91μg/mL，每孔溶液终体积为200μL。在37℃、含5％ CO₂的细胞培养箱孵育1h后，4℃下1000×g，离心10min，取上清测定波长为590nm时各实验孔A值。以100μL的0.1％的Triton X-100溶液作为阳性对照，85μL生理盐水与15μL超纯水混合液作为阴性对照，试验重复3次，取其平均值。根据公式计算溶血率，溶血率(％)＝(试验组A值-阴性对照A值)/(阳性对照A值－阴性对照A值)×100％。具体结果见图1所示。

基于图1展示的结果可知，PAMP-37及其BT1-3的溶血活性都较低，在3.91～1000μg/mL的浓度范围内，其溶血活性均低于5％，而相对而言，PAMP-37-BT3具有相对更低的溶血活性，表明该抗菌肽变体3具有更高的安全性。

2.5热稳定性分析

用超纯水溶解抗菌肽，经过沸水浴处理，分别处理1min、5min、10min、20min、30min，按照实施例1中“(1)抑菌活性试验”的方法，以大肠埃希氏菌作为标志菌，观察不同处理对于抗菌肽抑菌活性的影响，具体结果见图2所示。

基于图2的结果可知，抗菌肽PAMP-37-BT1的热稳定性较原始的PAMP-37差，而PAMP-37-BT3的热稳定性最好，沸水浴处理10min时，其抑菌活性基本没有变化，即使经过沸水浴处理20min，其抑菌圈大小仍大于20mm。由此可见，PAMP-37-BT3具有最佳的热稳定性，加工和应用的适应性相对更好。

实施例3.

将12只健康BALB/c随机分成2组，每组6只(雌雄各半)，试验期间采用同样的饲料和饲喂条件，其中试验组每天额外对试验小鼠灌喂用生理盐水稀释的抗菌肽PAMP-37-BT3，按照200μg抗菌肽/kg体重的剂量进行试验，对照组不做其他处理，持续30天，试验结束后处死小鼠，解剖，通过观察不同组小鼠的脏器及组织。结果表明，试验期间试验组的小鼠和对照组的小鼠的采食情况正常、精神状态正常，健康状况未见明显差异。经解剖，试验组小鼠的脏器的色泽、形态、质地等均正常，与对照组无明显差异。由此说明，本发明的抗菌肽PAMP-37-BT3长期口服无毒性。

选取体重为5kg左右的断奶仔猪2头，分别在其耳廓静脉注射经生理盐水稀释的抗菌肽PAMP-37-BT3(剂量为100μg/kg体重)，每头注射两次，连续注射3天，正常饲喂，观察7天。试验期间，仔猪采食情况正常，精神状态良好，增重情况与其他同栏的仔猪无明显差异，试验期间也未见体温异常等现象，注射位点也未见红肿。以上结果表明，本发明的抗菌肽PAMP-37-BT3用于注射也无毒性反应。

实施例4.

在大北农的某养殖场选取28日龄左右的断奶仔猪12头，公母各半，按照公母随机分为两组，每组3雄3雌，均采用大北农宝宝壮仔猪浓缩饲料进行饲喂1周后，每头灌喂大肠杆菌ATCC29522(106CFU/mL)和肠炎沙门氏菌ATCC 13076(106CFU/mL)的培养物2mL进行攻毒，攻毒后继续正常饲喂，待各组50％以上的动物出现腹泻症状时开始进行试验，对照组继续采用大北农宝宝壮仔猪浓缩饲料正常饲喂，而试验组的饲料中添加抗菌肽PAMP-37-BT3(添加量为5mg/kg饲料)，直至腹泻等症状消失，试验期持续7天。记录各组的增重情况和腹泻等情况，经计算，其中对照组的6头仔猪死亡2头，存活率为4/6，平均日增重为0.15kg/天，最长腹泻天数为7天，最短腹泻天数为3天；试验组的6头仔猪全部健活，存活率为6/6，平均日增重为0.24kg/天，最长腹泻天数为3天，部分仔猪在饲喂抗菌肽后次日即恢复正常。由此可见，本发明的抗菌肽PAMP-37-BT3对于由大肠杆菌和肠炎沙门氏菌混合感染导致的腹泻、肠炎等具有一定的治疗作用，可以用于预防和治疗仔猪腹泻。

Claims (5)

1.一种猪源抗菌肽PMAP-37的变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.3或SEQID No.4所示，所述变体相比猪源抗菌肽PMAP-37具有增强的抑菌活性。

2.权利要求1所述的猪源抗菌肽PMAP-37的变体在制备细菌抑制剂中的应用，其特征在于，所述细菌为大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和粪链球菌中的一种或多种。

3.权利要求1所述的猪源抗菌肽PMAP-37的变体在制备治疗细菌感染导致的腹泻的药物中的应用，其特征在于，所述细菌为大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和粪链球菌中的一种或多种。

4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述细菌为金黄色葡萄球菌。

5.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述细菌为大肠杆菌和肠炎沙门氏菌。