CN115960197B

CN115960197B - 猪源抗菌肽pamp-37-bt3及其应用

Info

Publication number: CN115960197B
Application number: CN202211423749.8A
Authority: CN
Inventors: 王丽英; 王丹玉; 李廷耀; 李曼; 马洪龙; 贠桂玲
Original assignee: Chenzhou Dabei Agricultural Feed Technology Co ltd; Harbin Dabei Farming And Animal Husbandry Technology Co ltd; Beijing Dabeinong Technology Group Co Ltd
Current assignee: Chenzhou Dabei Agricultural Feed Technology Co ltd; Harbin Dabei Farming And Animal Husbandry Technology Co ltd; Beijing Dabeinong Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2022-11-14
Filing date: 2022-11-14
Publication date: 2023-06-30
Anticipated expiration: 2042-11-14
Also published as: CN115960197A

Abstract

本发明选取抗菌肽PAMP‑37的主要螺旋结构部分的氨基酸序列，在此基础上，通过对其疏水性、正电荷和螺旋结构的优化得到了抗菌活性和稳定性改善的PAMP‑37‑BT3，其相比原始抗菌肽具有提高的抗菌抑菌活性以及热稳定性。其次，本发明将所述抗菌肽PAMP‑37‑BT3用于制备饲料添加剂，并将所述添加剂用于断奶仔猪饲料的生产，研究表明，本发明的抗菌肽PAMP‑37‑BT3具有较高的抑菌和杀菌活性，将其用于制备饲料添加剂或饲料，可以改善仔猪的健康状况，提高日均增重值，降低料肉比和腹泻率，提高养殖的经济效益。

Description

猪源抗菌肽PAMP-37-BT3及其应用

技术领域：

本发明属于生物技术领域，具体涉及猪源抗菌肽PAMP-37-BT3及其应用。

背景技术：

抗生素是人类历史上的一项伟大发明，在疾病治疗和畜牧业发展中发挥了不可磨灭的作用，在上个世纪60-70年代，抗生素开始被应用于动物的生产，随着人们发现抗生素的使用能够较大程度上提高养殖的经济效益，到上个世纪末抗生素被大规模的应用于畜牧业生产中，部分抗生素甚至作为饲料添加剂被长期使用。然而，抗生素的使用虽然带来了养殖效益的改善，但是很多问题接踵而至，例如滥用抗生素导致了超级细菌的出现，抗生素的大量使用甚至滥用导致抗生素在畜禽肉品和蛋品等农产品中残留，最终对人体造成毒性和过敏反应等，未被动物吸收的抗生素随着动物的排泄而进入环境中造成了环境中抗生素污染等，抗生素在畜牧业中大量使用带来的弊端逐渐被人们所认识，解决细菌耐药性和抗生素残留为已经成为畜牧业发展的重要课题。2019年7月，农业农村部第194号公告颁布，明确指出2020年元旦起，抗生素在饲料中被全面禁用，以维护动物源食品安全和公告卫生安全。因此，寻找绿色、安全、高效的抗生素替抗产品是畜牧业发展的必然趋势，也是目前亟需解决的技术问题，对于畜牧业的可持续健康发展具有重要的意义。而抗菌肽可在动物机体发挥先天性免疫作用，是目前抗生素替代品的首选。

抗菌肽是一类具有抗菌活性的阳离子短肽的总称，是生物先天免疫的重要组成部分，通常具有广谱杀菌作用，大多数对G⁺细菌具有较强的杀灭作用，有些对G^-细菌和G⁺细菌都有杀灭作用。由于抗菌肽的作用机制不同于目前被广泛应用的抗生素，且一般不会导致细菌对其产生耐药性，因而可以用于杀灭很多耐药性细菌。抗菌肽来源十分广泛，在植物、昆虫、哺乳动物和两栖动物中均可分离得到，猪源抗菌肽是第一批分离得到的哺乳动物抗菌肽，目前在猪体内已经发现了几十种不同的抗菌肽，大致可以分为Cathelicidin家族、防御素家族以及皂苷家族，其中猪源Cathelicidin家族的抗菌肽主要从猪白细胞中分离或从骨髓组织的cDNA序列推断而来，包括PR-39、PF-1、PF-2、PMAP-23、PMAP-36、PMAP-37、PG-1、PG-2、PG-3、PG-4、PG-5等11种，其中PMAP-23和PMAP-36的研究较多，但是对于PMAP-37的研究较少。PMAP-37是最强的膜活性因子,在0.2～1.0μmol/L时引起细菌细胞内膜的渗透作用,而PMAP-23和PMAP-36杀菌活性分别在1～10和10～50μmol/L。目前国内仅有明双喜、王燕、卢刚等人对PMAP-37进行了研究，分别采用RT-PCR的方法对PMAP-37进行了扩增和表达，研究其抑菌活性。对抗菌肽新型优化设计从而得到新的抗菌肽或者提高原抗菌肽的抑菌活性、降低毒性或溶血性等是抗菌肽类药物研究的热点，对于猪源抗菌肽的结构优化也成为当前开发新型抗菌药物的研究热点。例如曹荣田等对猪源抗菌肽PMAP-23进行了优化和改造设计，得到了活性更高的抗菌肽，具有更高的安全性。然而，目前对于PMAP-37的研究极少，因而，对PMAP-37进行深入的研究，对其进行优化设计以得到具有高活性、高安全性的抗菌肽具有积极的意义。

发明内容：

为了弥补饲料无抗化后的生产需求，本发明旨在提供一种猪源抗菌肽PAMP-37-BT3及其应用，具体将其用于饲料添加剂或饲料的生产，以填补原包含抗生素的饲料的市场空白。

为了解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：

本发明请求保护一种猪源抗菌肽PAMP-37-BT3，其特征在于，所述抗菌肽PAMP-37-BT3的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，所述变体相比猪源抗菌肽PMAP-37具有增强的抑菌活性。

本发明还请求保护猪源抗菌肽PAMP-37-BT3在制备饲料添加剂或饲料中的应用。

本发明还涉及一种饲料添加剂，其特征在于，按质量百分含量计，包括权利要求1所述的猪源抗菌肽PAMP-37-BT3 1.5％，维生素C 5％，维生素E 5％，低聚木糖10％，余量为米糠粉；所述饲料添加剂的制备方法为：按质量百分含量称取猪源抗菌肽PAMP-37-BT3、维生素C、维生素E、低聚木糖、米糠粉，将其在搅拌机中搅拌均匀即得。

本发明还涉及一种饲料添加剂，其特征在于，按质量百分含量计，包括权利要求1所述的猪源抗菌肽PAMP-37-BT3 1％，维生素C 6％，维生素E 6％，低聚木糖12％，余量为米糠粉；所述饲料添加剂的制备方法为：按质量百分含量称取猪源抗菌肽PAMP-37-BT3、维生素C、维生素E、低聚木糖、米糠粉，将其在搅拌机中搅拌均匀即得。

优选地，所述饲料为猪饲料。

进一步优选地，所述猪为断奶仔猪。所述饲料添加剂在饲料中的添加量为0.3％。

基于以上技术方案，本发明具有如下优点和有益效果:

首先，本发明选取抗菌肽PAMP-37的主要螺旋结构部分的氨基酸序列，在此基础上，通过对其疏水性、正电荷和螺旋结构的优化得到了抗菌活性和稳定性改善的PAMP-37-BT3，其相比原始抗菌肽具有提高的抗菌抑菌活性以及热稳定性。

其次，本发明将所述抗菌肽PAMP-37-BT3用于制备饲料添加剂，并将所述添加剂用于断奶仔猪饲料的生产，研究表明，本发明的抗菌肽PAMP-37-BT3具有较高的抑菌和杀菌活性，将其用于制备饲料添加剂或饲料，可以改善仔猪的健康状况，提高日均增重值，降低料肉比和腹泻率，提高养殖的经济效益。

附图说明：

图1.抗菌肽PAMP-37及其变体的溶血活性测定结果图。

图2.抗菌肽PAMP-37及其变体的热稳定性测定结果图。

具体实施方式：

实施例1：

据报道，抗菌肽PAMP-37的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示，具体为：GLLSRLRDFLSDRGRRLGEKIERIGQKIKDLSEFFQS，通过对抗菌肽PMAP-37的分子结构进行分析，选取合适的位点进行替换和/或截断等优化，并将优化后的序列输入生物信息学软件，对二级结构、平均亲疏水值、电荷分布等进行预测和分析，最终筛选出3条理化参数较好的抗菌肽(序列如SEQID No：2-4所示)送至吉尔生化公司(中国上海)进行合成。

其中选用合成的抗菌肽的序列如下表1所示：

其中PAMP-37-BT1相对PMAP-37而言进行了截断，截取了其中9F-35F之间的27个氨基酸残基；PAMP-37-BT2在PAMP-37-BT1而言，对其中的第1位的苯丙氨酸(F)替换为带正电荷的精氨酸(R)，将第5位的精氨酸(R)替换为疏水性的色氨酸(W)；PAMP-37-BT3在PAMP-37-BT2的基础上，进一步将第8位的精氨酸(R)替换为疏水性的异亮氨酸(I)，将第27位的苯丙氨酸(F)替换为赖氨酸(K)，并增加了第28位的异亮氨酸(I)和第29位的色氨酸(W)。

实施例2：

2.1试验用菌株及抗菌肽溶液的配制：

为了检测抗菌肽对于畜禽养殖中常见致病菌的抑菌活性，本发明选取大肠杆菌(ATCC29522)、鸡白痢沙门氏菌(CVCC535)、肠炎沙门氏菌(ATCC 13076)、金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)、粪链球菌(ATCC29212)均由北京大北农科技集团股份有限公司购买、保存和提供。

抗菌肽由吉尔生化公司(中国上海)合成，采用反相高效液相色谱和基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱鉴定。多肽纯度均高于95％。抗菌肽以1000μg/mL的浓度溶解于去离子水中，并储存在-80℃。

2.2抑菌活性的测定

利用纸片浸润液扩散法进行抑菌活性的测定。具体方法是：将抗菌肽分别配成1mg/mL的溶液，将活化后的菌液分别均匀涂布在LB固体培养基平板上，待菌液风干后将滤纸片均匀贴于培养基上并按实，取10μL抗菌肽溶液依次滴加到滤纸纸片上，37℃保温箱中过夜培养，测定抑菌圈的大小，试验重复3次，取平均值。具体结果如下表2所示：

表2抗菌肽抑菌试验结果

基于以上抑菌试验结果可知，本发明所制备得到的PAMP-37-BT1～PAMP-37-BT3相对于原始的PAMP-37而言，其抑菌活性均得到了提高，特别是PAMP-37-BT3，其相比原抗菌肽序列对于大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的抑菌效果提升明显，而对于粪链球菌的抑菌效果与原始的PAMP-37效果接近，且与BT-1以及BT-2相比，通过氨基酸位点的替换，其相对而言取得了更好的抑菌效果。

2.3最小抑菌浓度(MIC)的测定

采用最小抑菌浓度测定法(MIC)对抗菌肽的抑菌活性进行测定。具体方法如下：将培养至对数生长期的待测菌液用LB培养液重悬至10⁸cfu/mL，吸取100μL加入96孔细胞培养板，而后各孔加入100μL经倍比稀释后的肽溶液，使孔内抗菌肽的终浓度分别0.0039、0.0078、0.0156、0.0313、0.0625、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0、64.0、128.0μg/mL。阳性对照为100μL的0.4％多聚甲醛溶液，阴性对照为100μL无菌超纯水。细菌置于37℃恒温摇床上培养6h后，使用全自动酶标仪在λ＝630nm处测各孔吸光值，试验重复3次，取其平均值。与未培养前初始吸光值相比，未有显著变化的抗菌肽浓度定义为对该菌的最小抑菌浓度(MIC)。具体测定结果如下表3所示：

表3抗菌肽MIC测定结果

基于以上表3展示的结果可知，PAMP-37及其BT1-3对于金黄色葡萄球菌均具有较强的抑制作用，尤其是PAMP-37-BT3，其MIC仅为0.0039μg/mL；PAMP-37-BT1相比PAMP-37具有增强的大肠杆菌抑菌活性；PAMP-37-BT2相对PAMP-37在大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌、肠炎沙门氏菌和金黄色葡萄球菌上具有增强的抑菌活性，但是对于粪链球菌的抑菌活性没有改善；PAMP-37-BT3相比PAMP-37以及PAMP-37-BT1、PAMP-37-BT2而言，对于以上五种菌均具有增强抑菌活性，是以上四种抗菌肽中活性最强的。

2.4抗菌肽溶血性测定

兔红细胞溶血试验用来评估抗菌肽对哺乳动物正常细胞的溶血活性，溶血率＜5％则认为没有溶血活性。用PBS缓冲液将新鲜兔血红细胞轻轻洗涤3遍，4℃下1000×g，离心10min后取沉淀，生理盐水洗涤3次后按照10％(v/v)重悬于PBS缓冲液中。使用PBS对抗菌肽进行二倍梯度稀释后加入等体积兔血红细胞重悬液，各抗菌肽终浓度为1000、500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.81、3.91μg/mL，每孔溶液终体积为200μL。在37℃、含5％ CO₂的细胞培养箱孵育1h后，4℃下1000×g，离心10min，取上清测定波长为590nm时各实验孔A值。以100μL的0.1％的Triton X-100溶液作为阳性对照，85μL生理盐水与15μL超纯水混合液作为阴性对照，试验重复3次，取其平均值。根据公式计算溶血率，溶血率(％)＝(试验组A值-阴性对照A值)/(阳性对照A值－阴性对照A值)×100％。具体结果见图1所示。

基于图1展示的结果可知，PAMP-37及其BT1-3的溶血活性都较低，在3.91～1000μg/mL的浓度范围内，其溶血活性均低于5％，而相对而言，PAMP-37-BT3具有相对更低的溶血活性，表明该抗菌肽变体3具有更高的安全性。

2.5热稳定性分析

用超纯水溶解抗菌肽，经过沸水浴处理，分别处理1min、5min、10min、20min、30min，按照实施例1中“(1)抑菌活性试验”的方法，以大肠埃希氏菌作为标志菌，观察不同处理对于抗菌肽抑菌活性的影响，具体结果见图2所示。

基于图2的结果可知，抗菌肽PAMP-37-BT1的热稳定性较原始的PAMP-37差，而PAMP-37-BT3的热稳定性最好，沸水浴处理10min时，其抑菌活性基本没有变化，即使经过沸水浴处理20min，其抑菌圈大小仍大于20mm。由此可见，PAMP-37-BT3具有最佳的热稳定性，加工和应用的适应性相对更好。

实施例3.

将12只健康BALB/c随机分成2组，每组6只(雌雄各半)，试验期间采用同样的饲料和饲喂条件，其中试验组每天额外对试验小鼠灌喂用生理盐水稀释的抗菌肽PAMP-37-BT3，按照200μg抗菌肽/kg体重的剂量进行试验，对照组不做其他处理，持续30天，试验结束后处死小鼠，解剖，通过观察不同组小鼠的脏器及组织。结果表明，试验期间试验组的小鼠和对照组的小鼠的采食情况正常、精神状态正常，健康状况未见明显差异。经解剖，试验组小鼠的脏器的色泽、形态、质地等均正常，与对照组无明显差异。由此说明，本发明的抗菌肽PAMP-37-BT3长期口服无毒性。

选取体重为5kg左右的断奶仔猪2头，分别在其耳廓静脉注射经生理盐水稀释的抗菌肽PAMP-37-BT3(剂量为100μg/kg体重)，每头注射两次，连续注射3天，正常饲喂，观察7天。试验期间，仔猪采食情况正常，精神状态良好，增重情况与其他同栏的仔猪无明显差异，试验期间也未见体温异常等现象，注射位点也未见红肿。以上结果表明，本发明的抗菌肽PAMP-37-BT3用于注射也无毒性反应。

实施例4.

基于以上实施例1-3可知，本发明所设计和制备的PAMP-37-BT3具有优异的抗菌活性和热稳定性，因而，可以用于饲料或饲料添加剂的生产，且抗菌肽相比抗生素而言，无残留亦无耐药性的问题，因而，将所述PAMP-37-BT3用于饲料添加剂或饲料的生产，可以用于改善生猪的养殖效率，同时适应饲料无抗化的要求。

一种饲料添加剂，按质量百分含量计，包括抗菌肽PAMP-37-BT3 1.5％，维生素C5％，维生素E 5％，低聚木糖10％，余量为米糠粉。所述饲料添加剂的制备方法为：按质量百分含量称取抗菌肽PAMP-37-BT3、维生素C、维生素E、低聚木糖、米糠粉，将其在搅拌机中搅拌均匀即得。

实施例5.

一种饲料添加剂，按质量百分含量计，包括抗菌肽PAMP-37-BT3 1％，维生素C6％，维生素E 6％，低聚木糖12％，余量为米糠粉。所述饲料添加剂的制备方法为：按质量百分含量称取抗菌肽PAMP-37-BT3、维生素C、维生素E、低聚木糖、米糠粉，将其在搅拌机中搅拌均匀即得。

作为对照，本发明还设置了以下饲料添加剂作为对照：

对照1：一种饲料添加剂，按质量百分含量计，包括维生素C 6％，维生素E 6％，低聚木糖12％，余量为米糠粉。所述饲料添加剂的制备方法为：按质量百分含量称取抗菌肽PAMP-37-BT3、维生素C、维生素E、低聚木糖、米糠粉，将其在搅拌机中搅拌均匀即得对照1的饲料添加剂。

实施例6.

为了验证本发明饲料添加剂的饲喂效果，在大北农集团下属的养殖场选择40头28日龄平均体重接近7kg的健康“杜×长×大”三元杂交断奶仔猪，按照公母各半的原则随机分为4组，分别进行编号。对照组饲喂基础饲粮；试验组1饲喂基础饲粮+0.3％实施例4的饲料添加剂；试验组2饲喂基础饲粮+0.3％实施例5的饲料添加剂；对比试验组饲喂基础饲粮+0.3％的对照1的饲料添加剂。其中基础饲粮由养殖场统一配制的大北农宝宝壮仔猪浓缩饲料。

试验期间，养殖的环境条件保持基本一致，严格遵守养殖场的各项规定，统一供应饮水和驱虫等，每天饲喂3次，每次投料略过量，保证采食后料槽内有少量余料。每头观察仔猪的采食情况、精神状态以及有无腹泻，试验持续21天。

平均日增重的计算，在试验开始和结束时，早饲前空腹称重，从而计算各组仔猪的平均日增重；同时记录各组仔猪每天的饲料采食量(“投料量-剩余量”)，从而计算各组仔猪的平均日采食量；记录各仔猪的腹泻情况，腹泻率＝试验期间腹泻的头次数/(试验头数×试验天数)×100％，如实施例4共10头次，因而其腹泻率为10/210×100％＝4.76％。具体结果见下表4所示。

表4不同饲料添加剂对于断奶仔猪生长性能与腹泻率的影响

组别	日均增重(g/天)	日均采食量(g/天)	料重比	腹泻率
					对照组	272.47	479.32	1.76	17.14％
实施例4	320.56	500.37	1.56	4.76％
					实施例5	313.79	493.32	1.57	6.19％
对照1	293.45	488.45	1.66	11.43％

基于以上结果可知，在基础日粮中添加实施例4和5的饲料添加剂后，其日均增长量得到了较大的提升，其中实施例4组的增重量提升了17.65％，实施例5组提升了15.16％，显著高于对照1组。且在基础日粮中添加包含本发明抗菌肽的饲料添加剂后，料重比也得到了较大的改善，实施例4组的料重比为1.56，实施例6组的料重比为1.57，相比对照组降低了11.2％左右。由此可见，在基础日粮中添加本发明的饲料添加剂，可以提高仔猪的日均增重量，提高饲料的利用率，降低料肉比，从而降低养殖成本，提高养殖效益。

另外，基于以上表4的结果可知，实施例4组和实施例5的腹泻率相对对照组以及对照1组的腹泻率均显著下降，实施例4组的腹泻率仅为4.76％，实施例5组的腹泻率为6.19％，说明本发明中包含抗菌肽PAMP-37-BT3的饲料添加剂的使用可以起到降低腹泻率的作用。

总之，基于以上试验可知，本发明的抗菌肽PAMP-37-BT3具有较高的抑菌和杀菌活性，将其用于制备饲料添加剂或饲料，可以改善仔猪的健康状况，提高日均增重值，降低料肉比和腹泻率，提高养殖的经济效益。

Claims

1.一种猪源抗菌肽PAMP-37-BT3，其特征在于，所述抗菌肽PAMP-37-BT3的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

2.权利要求1所述的猪源抗菌肽PAMP-37-BT3在制备饲料中的应用。

3.权利要求1所述的猪源抗菌肽PAMP-37-BT3在制备饲料添加剂中的应用。

4.一种饲料添加剂，其特征在于，按质量百分含量计，包括权利要求1所述的猪源抗菌肽PAMP-37-BT3 1.5％，维生素C 5％，维生素E 5％，低聚木糖 10％，余量为米糠粉；所述饲料添加剂的制备方法为：按质量百分含量称取猪源抗菌肽PAMP-37-BT3、维生素C、维生素E、低聚木糖、米糠粉，将其在搅拌机中搅拌均匀即得。

5.一种饲料添加剂，其特征在于，按质量百分含量计，包括权利要求1所述的猪源抗菌肽PAMP-37-BT3 1％，维生素C 6％，维生素E 6％，低聚木糖 12％，余量为米糠粉；所述饲料添加剂的制备方法为：按质量百分含量称取猪源抗菌肽PAMP-37-BT3、维生素C、维生素E、低聚木糖、米糠粉，将其在搅拌机中搅拌均匀即得。

6.权利要求4或5任一所述的饲料添加剂在制备饲料中的应用，其特征在于，所述饲料为猪饲料。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述猪为断奶仔猪。

8.根据权利要求6或7任一所述的应用，其特征在于，所述饲料添加剂在饲料中的添加量为0.3％。