CN104017085A - Pamp37-pr39融合抗菌肽及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及PAMP37-PR39融合抗菌肽及其制备方法。本发明将猪抗菌肽PAMP37和PR39串联构建了一种融合抗菌肽，并且利用大肠杆菌密码子的偏爱性，设计了所述融合抗菌肽的DNA序列，并将其构建到表达载体中，随后进行了融合抗菌肽的表达及纯化，抗菌活性结果显示，所得到的融合抗菌肽抗菌活性有了很大提高。本发明提供的抗菌肽可以很好的提高猪群的抗病能力，能有效替代或减少抗生素作为饲料添加剂的使用，从而提高畜产品安全性，具有重要的实际应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术制药工业中基因工程生产药物的技术领域，具体为PAMP37-PR39融合抗菌肽及其制备方法。
背景技术
传统抗生素药物的广泛使用，使得许多病原菌对它们产生了耐药性，抗生素添加剂的使用则严重破坏了动物肠道的微生物平衡且易在动物体内残留，严重影响畜产品质量和人类健康。抗菌肽(antibacterial peptides)是生物体产生的一种具有强抗菌作用的多肽，是生物先天免疫的重要组成成分。具有广谱杀菌作用、相对分子量较小、热稳定、水溶性好等优点，更为重要的是抗菌肽对健康的真核细胞几乎没有作用，仅作用于原核细胞和发生病变的真核细胞。抗菌肽的作用机理与抗生素通过阻断大分子生物合成的作用机理完全不同，且病毒和真菌也受抗菌肽的攻击，由此显示了它具有独特的研究和应用价值。
PR39的抗菌作用主要是针对G-，部分G+菌也有抗菌效果。研究表明，PR39的抗菌机制是通过抑制细胞的DNA和蛋白质的合成达到杀菌目的的。PR39对处于对数生长期细菌的杀伤作用迅速明显。扫描电镜实验观察证明，PR39与细胞作用时并没有在膜上形成孔道。对于PR39依靠精氨酸残基的正电荷与细菌细胞磷脂双分子层之间靠静电力作用后吸附在细胞膜上，如何透过脂质双层进人胞内，以及抑制DNA和蛋白质合成的确切机制尚不清楚。另外，PR39对中性粒细胞的趋化作用，引起中性粒细胞在感染部位聚集，促进对病原体的吞噬，可能也是PR39抗菌作用的一个方面。
PMAPs属于猪髓源性抗菌肽，根据其结构差异分为PMAP-23、PMAP-36和PMAP-37，分别含有23、36和37个氨基酸。对其结构预测和色谱分析表明PMAP-36和PMAP-37具有两亲性α螺旋。猪的PAMP37是含有37个氨基酸残基的抗菌多肽，不含半胱氨酸，其N端区域具有强碱性，可形成α螺旋结构，利用该结构可以在细菌细胞膜上形成穿孔，因此对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都有杀伤作用。
然而，现有的研究表明，许多天然的抗菌肽活性并不高，或者对真核细胞存在较高的细胞毒性，因此在作为新型抗生素替代品研制之前需要通过分子改良进一步提高其活性，或降低其毒性。此外，细菌感染已经成为影响畜牧业生产的一个重要原因，尤其是耐药菌株的出现，更是增加了疾病的治疗难度。在当前不少病原菌对原有抗生素逐步产生耐药性时，根据对猪体内自然产生的抗菌肽功能的了解，设计一种新抗菌肽分子来调节猪体内自然抗菌肽的功能以提高抗菌肽活性、替代抗生素，这将对寻找抗生素替代品起到积极的促进作用。
本发明创造性的将猪的抗菌肽PAMP37和PR39进行了融合，融合后的抗菌肽提高了抗菌活性，同时改良了融合抗菌肽的密码子从而得到适于工业大量生产的新型、环保、高活性的融合抗菌肽。本发明提供的猪抗菌肽作为类饲料添加剂，可以很好的提高猪群的抗病能力，能有效替代或减少抗生素作为饲料添加剂的使用，从而提高畜产品安全性。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有高抗菌活性的融合抗菌肽。所述融合抗菌肽包含两种或两种以上猪抗菌肽。
进一步的，所述融合抗菌肽包含猪抗菌肽PAMP37和PR39。
更进一步的，所述融合抗菌肽是将猪抗菌肽PAMP37和PR39串联一起得到的。
更近一步的，所述融合抗菌肽氨基酸序列为序列表中SEQ ID1。
本发明的目的是提供一种融合抗菌肽的重组DNA，所述的重组DNA是经过密码子优化、适合在大肠杆菌表达融合抗菌肽。
进一步的，所述融合抗菌肽的重组DNA序列为序列表中SEQ ID2。
本发明的目的是提供一种能够表达上述融合抗菌肽的载体。优选使用pET30a载体表达上述融合抗菌肽。
本发明的目的是提供一种能够表达上述融合抗菌肽的细胞系。优选使用大肠杆菌BL21表达上述融合抗菌肽。
本发明的目的是提供一种新型抗菌免疫制剂，所述的抗菌免疫制剂中含有上述的融合抗菌肽。
本发明的目的是提供一种高抗菌活性的融合抗菌肽的制备方法。
进一步的，所述融合抗菌肽的制备方法包括：
5)将两种或两种以上猪抗菌肽串联，得到的融合抗菌肽的氨基酸序；
6)根据密码子的偏爱性，设计融合抗菌肽的重组DNA序列；
7)将重组DNA序列构建到表达载体上；
8)将表达载体导入细胞进行融合抗菌肽的表达。
更进一步的，所述猪抗菌肽选自抗菌肽PAMP37和PR39中的一种。
更进一步的，设计的融合抗菌肽可通过合成或多重PCR等方法获得、人工合成等获得。
更进一步的，将重组DNA通过酶切链接或同源重组等方式连接到表达载体上。
更进一步的，对表达的融合抗菌肽进行纯化。
本发明的目的是提供融合抗菌肽、能够表达融合抗菌肽的载体以及含有融合抗菌肽的抗菌免疫制剂在制备饲料添加剂、抗菌药物制剂、保健品、防腐剂中的应用。
本发明的优点：
1)本发明创造性的将猪抗菌肽PAMP37和PR39进行多肽串联，获得了具有高抗菌活性的融合抗菌肽，所述融合抗菌肽可以很好的提高猪群的抗病能力，能有效替代或减少抗生素作为饲料添加剂的使用，从而提高畜产品安全性。；
2)本发明提供一种高抗菌活性的融合抗菌肽的制备方法，采用该制备方法可以高效获得融合抗菌肽。
附图说明
图1为重组表达载体的构建过程
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
实施例1 抗菌肽的结构设计和预测
为了增强抗菌肽的杀菌活性，将猪抗菌肽(PAMP37和PR39串联一起进行构建，其构建得到的融合多肽的氨基酸序列为SEQ ID1：
GLLSRLRDFLSDRGRRLGEKIERIGQKIKDLSEFFQSRRRPRPPYLPRPRPPPFFPPRLPPRIPPGFPPRFPPRFP。
利用大肠杆菌密码子的偏爱性，设计了该序列的重组DNA序列(SEQ ID2)，经二级结构预测得到该多肽N端为一个α螺旋，C端为线性结构。
实施例2 抗菌肽表达载体的构建
1)优化DNA序列使其适应于大肠杆菌的密码子偏爱性，增加载体构建所用的酶切位点，设计融合多肽DNA序列(SEQ ID3)如下：
GGTACCGGTCTGCTGTCTCGTCTGCGTGACTTCCTGTCTGACCGTGGTCGTCGTCTGGGTGAAAAAATCGAACGTATCGGTCAGAAAATCAAAGACCTGTCTGAATTCTTCCAGTCTCGTCGTCGTCCGCGTCCGCCGTACCTGCCGCGTCCGCGTCCGCCGCCGTTCTTCCCGCCGCGTCTGCCGCCGCGTATACCACCAGGCTTTCCACCAAGGTTCCCACCACGATTCCCATAACTCGAG
黑色下划线的序列为酶切位点(KpnI和XhoI)。序列送到生物公司进行合成。3)抗菌肽表达载体的构建
将pET30a载体和合成的序列分别用KpnI和XhoI酶切，回收酶切产物后，将其连接构建得到pET30a-P37-PR39表达载体，过程如图1所示。将含有表达载体的阳性克隆扩大培养后，进行测序分析，测序结果和设计的序列完全一致，表明载体构建成功。
实施例3 抗菌肽的诱导表达
1)按常规方法转化上述表达载体入大肠杆菌BL21，将转化后的细菌涂布于LB平板，置于37℃孵箱中培养过夜。可观察到明显的阳性克隆生长于平板上。
2)挑取阳性的单菌落在LB液体培养至OD600为0.4-0.6，然后加入0.5mM的IPTG，于37℃250rpm过夜诱导目的蛋白的表达，同时做一个不加IPTG的对照。
3)收集菌体，利用10000g离心15分钟弃掉上清液。在1MTris-HCl溶液中超声破碎菌体，20000g，离心30分钟，对上清液进行SDS-PAGE分析，对聚丙烯酰胺凝胶进行考马斯亮蓝染色后可见明显的目的蛋白可溶表达条带。
实施例4 抗菌肽的纯化
培养工程菌5升，10000g离心收集菌体。采用超声法法破碎菌体，离心破碎后菌体，收集上清液。将上清液调节pH至7.0，加载到阳离子交换树脂上，收集流穿的溶液并浓缩即得到目的蛋白，纯度达到90％以上。
实施例5 抗菌肽的活性检测
采用平板稀释法测定抗菌肽的最小抑菌浓度(MIC)，测定细菌浓度的OD值表明，所设计的抗菌肽浓缩液对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均具有体外抑菌活性。具体见表1。
表1.抗菌肽的抑菌活性
结果显示，本发明设计的融合抗菌肽的抗菌活性较单独的抗菌肽抗菌活性有了很大的提高，为新型抗菌免疫制剂的研制提供了优良的候选肽，这对研发新型抗菌免疫制剂，有效替代或减少抗生素作为饲料添加剂的使用、提高畜产品安全性具有重要意义。
Claims (10)
1.一种融合抗菌肽，包含两种或两种以上猪抗菌肽。
2.根据权利要求1所述的融合抗菌肽，其特征在于，所述猪抗菌肽为PAMP37和PR39。
3.根据权利要求1或2任意一项所述的融合抗菌肽，其特征在于，所述融合抗菌肽通过串联得到。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的融合抗菌肽，其特征在于，所述融合抗菌肽氨基酸序列为序列表中SEQ ID1。
5.一种融合抗菌肽的重组DNA，其特征在于，所述的重组DNA表达后得到权利要求1-4任意一项所述的融合抗菌肽。
6.根据权利要求5所述的重组DNA，其特征在于，所述重组DNA序列为序列表中SEQ ID2。
7.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求5-6任意一项所述的重组DNA或者表达权利要求1-4任意一项所述的融合抗菌肽。
8.一种抗菌免疫制剂，所述的抗菌免疫制剂中含有权利要求1-4任意一项所述的融合抗菌肽。
9.一种融合抗菌肽的制备方法，所述的制备方法包括：
1)将两种或两种以上猪抗菌肽串联，得到的融合抗菌肽的氨基酸序；
2)根据密码子的偏爱性，设计融合抗菌肽的重组DNA序列；
3)将重组DNA序列构建到表达载体上；
4)将表达载体导入细胞进行融合抗菌肽的表达；
所述猪抗菌肽选自权利要求2中的PAMP37和PR39一种或两种。
10.权利要求1-4任意一项所述的融合抗菌肽、权利要求7所述的载体以及权利要求8所述的抗菌免疫制剂在制备饲料添加剂、抗菌药物制剂、保健品、防腐剂中的应用。
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