CN115947815A - 一种重组抗菌肽pmap-37及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组抗菌肽PMAP‑37及其制备方法和应用，所述的抗菌肽PMAP‑37是根据数据库筛选出的抗菌肽基因，并进行毕赤酵母密码子优化后插入pPICZαA中，最后经甲醇诱导表达而得。所得重组抗菌肽活性较好，并且具受温度、pH及酶的影响较小，稳定性较好，能广谱抑菌，在食品保鲜、植物防病害等方面有较好的应用前景。

Description

一种重组抗菌肽PMAP-37及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及到一种重组抗菌肽PMAP-37及其制备方法和应用。

背景技术

抗菌肽具有小分子量，广谱抑菌性及优良的稳定性等优点，具有抗菌、抗病毒、抗癌、促进免疫调节等多种作用，在生物医药、畜牧业、农业、食品等行业都具有潜在的应用前景。PMAP-37抗菌肽来源于猪骨髓细胞，由37个氨基酸组成，对革兰氏阴性及阳性菌均有抑制作用，稳定性较好，在未来拥有良好应用前景。

然而利用生物自身合成抗菌肽的方法合成率太低，传统的天然提取PMAP-37的方法效率低下，会消耗大量财力，无法获得所需用量。

目前，尚无在酵母细胞中高效表达重组PMAP-37抗菌肽的报道。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。

因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种重组抗菌肽PMAP-37。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种重组抗菌肽PMAP-37，所述重组抗菌肽氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

作为本发明所述重组抗菌肽PMAP-37的一种优选方案，其中：所述重组抗菌肽碱基序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明的再一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种重组抗菌肽PMAP-37的制备方法。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种重组抗菌肽PMAP-37的制备方法，包括，通过酵母菌高效表达获得所述重组抗菌肽PMAP-37。

作为本发明所述重组抗菌肽PMAP-37制备方法的一种优选方案，其中：包括，表达载体重组：

将SEQ ID NO:2所示PMAP-37目的基因进行合成，并连接于pPICZα-A载体上构成重组质粒pPICZα-PMAP-37-A；

重组菌株构建：

用SacI内切酶线性化重组后的质粒pPICZα-PMAP-37-A，并将处理后的质粒转入毕赤酵母GS115中，获得带有目的基因的重组菌株；

表达抗菌肽：

筛选出pPICZα-PMAP-37-A的阳性转化子进行诱导表达，收取发酵后的上清液，获得高浓度抗菌肽。

作为本发明所述重组抗菌肽PMAP-37制备方法的一种优选方案，其中：所述PMAP-37目的基因片段是将PMAP-37抗菌肽原始序列根据酵母表达系统偏好性进行密码子优化，在N端依次加入EcoRI，起始密码子ATG，6个组氨酸标签，以及GATGATGATGATAAG15个碱基，C端依次加入终止密码子TAA及XbaI获得。

作为本发明所述重组抗菌肽PMAP-37制备方法的一种优选方案，其中：所述诱导表达，包括，经1.5％的甲醇诱导，最佳表达时间为5d。

本发明的另一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种重组抗菌肽PMAP-37在制备抗菌剂中的应用，所述重组抗菌肽PMAP-37对金黄色葡萄球菌、大肠埃希、大肠O157、沙门氏菌和单增李斯特菌最小抑菌浓度为0.24μg/mL，对枯草芽孢杆菌最小抑菌浓度为0.12μg/mL。

本发明的其中一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种重组抗菌肽PMAP-37在制备红李抗菌剂中的应用。

本发明有益效果：

(1)本发明抗菌肽PMAP-37是根据数据库筛选出的抗菌肽基因，并进行毕赤酵母密码子优化后插入pPICZαA中，最后经甲醇诱导表达而得；所得重组抗菌肽活性较好，并且具受温度、pH及酶的影响较小，稳定性较好，能广谱抑菌，在食品保鲜、植物防病害等方面有较好的应用前景。

(2)本发明对PMAP-37抗菌肽进行了改造，重组后，目的基因经过热击转入酵母细胞中，首次以毕赤酵母作为表达载体，获得所需高效表达重组PMAP-37酵母菌株，并进行抑菌、稳定性及应用的研究，确定其对致病菌沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等有很强的抑菌作用，同时能明显地延缓红李的腐败；经检索本发明相关信息在国内外未见公开报道，在国内外未见公开使用。

(3)本发明获得的重组抗菌肽PMAP-37所用的菌株为巴斯德毕赤酵母，该表达系统具有优点：毕赤酵母载体上含有醇氧化酶启动子，可受甲醇调控；毕赤酵母对于营养的要求低，价格低廉，并且产量高，所产的抗菌肽可分泌到胞外，不似原核载体要细胞破碎，对于操作者来说简便不少，分泌的蛋白也多为目的蛋白，便于纯化；毕赤酵母遗传性状较稳，不易丢失基因，还可对翻译后的基因进行糖基化、蛋白磷酸化等修饰，使得修饰后的肽带有活性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：

图1为本发明实施例中抗菌肽基因PMAP-37的PCR跑胶示意图；其中，a-c为含有目的基因的三株阳性克隆。

图2为本发明实施例中重组抗菌肽PMAP-37Westernblot示意图。

图3为本发明实施例中重组抗菌肽PMAP-37的抑菌实验示意图；其中，a为阳性对照庆大霉素(50μg/mL)；b为重组抗菌肽PMAP-37200mg/mL冻干粉溶液，c为阴性对照SC3。

图4为本发明实施例中重组抗菌肽PMAP-37稳定性实验示意图；其中，A为温度稳定性实验，1-5：PMAP-37经4℃、25℃、37℃、65℃、90℃处理1h；1’-5’：以相同条件下处理的缓冲液(阴性对照)；B为pH稳定性实验，1-5：PMAP-37经pH为2、4、6、8、10的缓冲液溶解至同浓度，于37℃处理4h；1’-5’：以不同pH缓冲液作阴性对照；C为酶稳定性实验，1-4：PMAP-37经胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K和胰蛋白酶条件下，于37℃处理2h；1’-4’：各个蛋白酶对应的缓冲液作阴性对照。

图5为本发明实施例中重组抗菌肽PMAP-37对红李失重对比图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

本发明提供一种重组抗菌肽PMAP-37的制备方法，步骤为：

(1)表达载体重组：

将SEQ ID NO:2所示PMAP-37目的基因进行合成，并连接于pPICZα-A载体上构成重组质粒pPICZα-PMAP-37-A；

(2)重组菌株构建：

用SacI内切酶线性化重组后的质粒pPICZα-PMAP-37-A，并将处理后的质粒转入毕赤酵母GS115中，获得带有目的基因的重组菌株；

(3)表达抗菌肽：

筛选出pPICZα-PMAP-37-A的阳性转化子进行诱导表达，收取发酵后的上清液，获得高浓度抗菌肽。

实施例1

一、转入酵母及PCR验证

1.抗菌肽基因PMAP-37扩增

将质粒转入XL10大肠杆菌感受态细胞，挑取多个单菌落于30mLLB培养基中，37℃培养12h，使用质粒中提(江苏康为世纪生物科技股份有限公司)提取基因。

(1)质粒线性化

运用内切酶SacI将环形质粒线性化，反应体系及条件如下：

酶切体系(50μL)：

质粒:35μL

10×buffer:5μL

ddH2O:7μL

Sac Ⅰ:3μL

按照上述试剂依次添加并混匀，瞬时离心，将反应体系置于37℃培养箱中过夜酶切，并用1％琼脂糖凝胶跑胶验证。

2.酵母转化

按照普因特生物工程有限公司的方法进行转化：

(1)取一支无菌ep管，依次加入预冷的线性化质粒15μL，酵母促转化剂5μL，100μLGS115感受态细胞，毕赤酵母转化液500μL，轻轻翻转6-8次；

(2)30℃水浴30min，每15min轻轻翻转混匀6-8次；

(3)每支加入20μL的二甲基亚砜；

(4)42℃水浴15min，每7.5min轻轻翻转混匀6-8次；

(5)12000rpm瞬时离心弃上清，每支加1ml的YPG于30℃复苏1h；

(6)12000rpm瞬时离心弃上清，用100μL0.9％NaCl重悬，涂板，30℃培养3-7d。

(7)挑取不同的单菌落于含有博来霉素的抗性板上活化。

3.提取基因组

(1)挑取活化后的酵母菌于YPD培养基中，30℃，220rpm过夜培养；

(2)将2mL酵母培养液于6000rpm中离心2min，无菌水清洗两次弃上清；

(3)500μLSTES溶液重悬酵母细胞，加入200μL玻璃粉后冰上放置5min，于3000rpm震荡十分钟破碎；

(4)13000rpm离心10min，取上清；

(5)加入等体积DNA提取液，13000rpm离心10min，吸取上层；

(6)加入2倍体积冰乙醇，于-20℃中沉淀30min，13000rpm离心10min，弃上清；

(7)室温干燥后加入40μL无菌水做模板。

4.PCR验证

(1)PCR扩增

体系为：

PCR反应参数为：94℃预变性5min；94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。

(2)PCR产物回收

用1％琼脂糖凝胶进行电泳，在紫外下切胶，并用胶回收试剂盒(江苏康为世纪生物科技股份有限公司)进行DNA回收，并继续用上述凝胶检测回收状况。

抗菌肽基因PMAP-37的PCR跑胶示意图见图1；其中，a-c为含有目的基因的三株阳性克隆。

二、重组酵母的诱导表达

挑取多个阳性克隆于25mLBMGY培养基中，30℃220rpm培养至OD600到达8.0-10.0后，于3000rpm离心5min收集菌体，用无菌水洗两次，同等条件离心后再用BMMY培养基重悬菌体，置于30℃220rpm摇床上诱导表达；每24h取次样，并加入滤膜除菌的100％甲醇，使其终浓度为1.5％，连续培养120h。

三、上清液的冻干

8000rpm离心5min收集表达上清液，取30mL用冷冻干燥机制成干粉。

实施例2：

1.Westernblot

将0-6d所取上清经Tricine胶电泳后，电转至PVDF膜上，将PVDF膜用封闭液(5％BSA-PBST)封闭过夜，用PBST洗脱3次，每次5min，将膜与一抗(His-tag小鼠单克隆抗体，碧云天生物技术有限公司)在室温孵育1h后，PBST洗脱3次，再将膜转移到二抗溶液(HRP辣根过氧化物酶，碧云天生物技术有限公司)中，室温孵育2h，PBST洗脱3次，用ECL显色，并曝光拍照。表达量效果如图2所示。

2.PMAP-37抗菌活性实验

待测菌株：金黄色葡萄球菌、大肠埃希、大肠O157、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌和单增李斯特菌。

采用打孔法检测抗菌肽活性，取50μL对数期生长的受试菌于15mL的LB培养基中混匀，然后倒平板。吸取50μL酵母上清液加入孔中，每种受试菌做两组重复，阴性对照为表达无活性的另一种肽SC3，阳性对照为50μg/mL的庆大霉素。平板于37℃培养12h。抑菌效果如图3。

3.PMAP-37稳定性实验

待测菌株：金黄色葡萄球菌

(1)温度稳定性：

将配制好的200mg/mL上清冻干粉溶液分别于4℃、25℃、37℃、65℃、90℃下处理1h，同时做5组阴性对照，溶液为蒸馏水。

(2)pH稳定性：

分别用pH为2、4、6、8、10的缓冲液溶解抗菌肽至相同浓度，于37℃处理4h，同时做5组不同pH阴性对照。

(3)酶稳定性：

分别加入胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K、胰蛋白酶于抗菌肽样品溶液，经37℃处理2h，同时做4组不同酶溶液的阴性对照。结果显示各种酶之间无明显差异。结果见图4。

4.MIC：

(1)将PMAP-37上清液稀释到浓度为0.36、0.24、0.12、0.09μg/mL。分别取20μL加入96孔板中，每个浓度2个重复。

(2)挑受试菌于5mLLB液体培养基中，37℃培养至OD600为1.0左右，稀释1000倍，分别取100μL加入上述孔中。

(3)阴性对照为100μLLB培养基和20μL置换buffer溶液；阳性对照为100μL受试菌和20μL置换buffer溶液。

(4)37℃培养12h后用酶标仪测定OD600值。

表1 PMAP-37MIC

实施例3

红李应用

取40g左右红李进行试验，每组五个，实验组喷施5毫升浓度为0.36μg/mL的PMAP-37上清液，对照组喷施5毫升无菌水，放置于室温下进行感官和失重的观察。

(1)感官：记录红李每天的外观特征；

(2)失重率：测量初始重量W0和最终重量W1。

表2红李感官评价

	无菌水	PMAP-37
			2d	果皮微皱	正常
3d	产生菌丝，有霉斑	果皮微皱
			4d	果实部分软化	产生菌丝，果实部分软化
5d	果实软化严重，腐烂出水	果实软化严重
			6d	果实大量腐烂	果实腐烂出水
7d	果实大量腐烂	果实腐烂出水
			8d	果实严重腐烂	果实大量腐烂

重组抗菌肽PMAP-37对红李失重对比图，见图5.

本发明将重组抗菌肽PMAP-37的基因序列插入pPICZαA载体，转入毕赤酵母GS115宿主细胞中，将验证成功的阳性克隆进行甲醇诱导表达，对最终的上清产物进行鉴定，并进行活性、稳定性及应用的研究。最终获得的高效表达重组PMAP-37酵母菌株，所产重组抗菌肽对多种致病菌具有抗菌作用。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (8)

1.一种重组抗菌肽PMAP-37，其特征在于：所述重组抗菌肽氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.如权利要求1所述重组抗菌肽PMAP-37，其特征在于：所述重组抗菌肽碱基序列如SEQID NO:2所示。

3.权利要求1或2所述重组抗菌肽PMAP-37的制备方法，其特征在于：包括，通过酵母菌高效表达获得所述重组抗菌肽PMAP-37。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于：包括，

表达载体重组：

将SEQ ID NO:2所示PMAP-37目的基因进行合成，并连接于pPICZα-A载体上构成重组质粒pPICZα-PMAP-37-A；

重组菌株构建：

用SacI内切酶线性化重组后的质粒pPICZα-PMAP-37-A，并将处理后的质粒转入毕赤酵母GS115中，获得带有目的基因的重组菌株；

表达抗菌肽：

筛选出pPICZα-PMAP-37-A的阳性转化子进行诱导表达，收取发酵后的上清液，获得高浓度抗菌肽。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述PMAP-37目的基因片段是将PMAP-37抗菌肽原始序列根据酵母表达系统偏好性进行密码子优化，在N端依次加入EcoRI，起始密码子ATG，6个组氨酸标签，以及GAT GAT GAT GATAAG15个碱基，C端依次加入终止密码子TAA及XbaI获得。

6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述诱导表达，包括，经1.5％的甲醇诱导，最佳表达时间为5d。

7.权利要求1或2所述重组抗菌肽PMAP-37在制备抗菌剂中的应用，其特征在于：所述重组抗菌肽PMAP-37对金黄色葡萄球菌、大肠埃希、大肠O157、沙门氏菌和单增李斯特菌最小抑菌浓度为0.24μg/mL，对枯草芽孢杆菌最小抑菌浓度为0.12μg/mL。

8.权利要求1或2所述重组抗菌肽PMAP-37在制备红李抗菌剂中的应用。

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