CN113698459B - 抗菌肽突变体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗菌肽突变体及其应用，所述突变体的其氨基酸序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2任一项所示。所述抗菌肽具有很好的抗菌抑菌性能，本发明还提供了其在制备微生物抑制剂中的应用以及饲料添加剂中的应用。所述饲料添加剂，包含上述抗菌肽，其中抗菌肽可代替抗生素的促生长作用，且效果迅速稳定，无残留；同时还含γ－氨基丁酸及维生素C可以解除由高温高湿引起的采食量减少，缓解无汗、呼吸急促等中暑症状；抗应激，对多种应激等生理病理变化有较好的调节作用；减轻和中和毒素、增强肝脏解毒能力。

Description

抗菌肽突变体及其应用
技术领域
本发明属于功能基因改造技术领域，具体涉及一种抗菌肽突变体及其应用。
背景技术
饲粮中添加抗生素可缓解仔猪断奶应急，促进仔猪生长，但抗生素残留及病原菌耐药性问题对畜禽及人类健康产生了负面的影响。2020年，我们国家畜禽养殖用饲料全面禁抗，饲用抗生素的禁用会造成仔猪保育前期的发病死淘率增加，生长速度降低。在饲料禁抗的背景下，寻求有效的抗生素替代物，提升猪肠道免疫调节作用，研发新型高效安全的产品来改善生猪肠道健康就显得尤其重要。
抗菌肽是一类具有广谱抑菌活性的多肽类物质，部分抗菌肽还能激活免疫系统，在细胞信号传导过程、细胞增殖调节过程以及抗肿瘤、抗病毒、抗寄生虫等方面具有重要功能。抗菌肽因其独特的杀菌机制和优良的理化性质成为抗生素替代品研发的热点，抗菌肽在医用抗感染治疗药物以及畜牧业生产中具有广阔应用前景。在抗菌肽研发过程中，改造已有抗菌肽和设计新抗菌肽分子是提高其活性的有效途径。对抗菌肽进行分子设计、结构改造和修饰、降低其溶血活性、提高其抑菌活性和酸碱稳定性等成为抗菌肽研发的重要内容之一。
γ－氨基丁酸别名4－氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，简称GABA)，GABA在溶液中常以两性离子(带负电荷的羧基和带正电荷的氨基)形式存在，由于正负电荷基团间的静电相互作用，使得GABA在溶液中能够兼具气态(折叠态)和固态(伸展态)时的分子构象，而GABA在溶液中多分子构象共存的形式，使其能够结合多种受体蛋白并发挥多种重要生理功能。γ-氨基丁酸(GABA)，具有促进动物采食、调节内分泌、改善免疫性能以及提高畜禽抗应激水平的作用，被卫生部批准为新资源食品。在动物养殖领域，γ－氨基丁酸可促进胃液和生长激素的分泌，调节动物的食欲，提高动物采食量，促进畜禽生长，提高饲料报酬；具有解除氨毒的作用，减少畜禽呼吸道疾病发病的概率，减缓动物在热应激时的热性喘息；增强动物的抗应激能力等作用。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种多肽。
本发明的第二个目的在于提供一种核酸分子。
本发明的第三个目的在于提供一种载体。
本发明的第四个目的在于提供一种细胞。
本发明的第五个目的在于提供上述多肽或核酸分子或载体或细胞的应用。
本发明的第六个目的在于提供一种饲料添加剂。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供一种多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示。
本发明的第二个方面，提供一种核酸分子，编码本发明第一份方面所述多肽。
本发明的第三个方面，提供一种载体，包含本发明第二方面所述核酸分子。
本发明的第四个方面，提供一种细胞，包含本发明第三方面所述载体，所述细胞非植物细胞或动物细胞。
本发明的第五个方面，提供本发明第一方面所述多肽或本发明第二方面所述核酸分子或本发明第三方面所述载体或本发明第四方面所述细胞在以下(I)或(II)中的应用：
(I)制备抑菌剂；
(II)制备添加剂。
在本发明的一些实施方式中，所述菌为细菌。
在本发明的一些优选实施方式中，所述细菌为沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌。
在本发明的一些实施方式中，所述添加剂为食品添加剂、饲料添加剂、化妆品添加剂或卫生产品添加剂。
在本发明的一些优选实施方式中，所述添加剂为饲料添加剂。
本发明的第六个方面，提供一种添加剂，其包含本发明第一方面所述多肽。
在本发明的一些实施方式中，所述添加剂为食品添加剂、饲料添加剂、化妆品添加剂或卫生产品添加剂。
在本发明的一些优选实施方式中，所述添加剂为饲料添加剂。
在本发明的一些实施方式中，所述包含饲料添加剂按重量百分计含有以下组分：5％～20％SEQ ID NO：1所示多肽、5％～20％SEQ ID NO：2所示多肽、1％～30％γ-氨基丁酸和1％～30％维生素C。
在本发明的一些实施方式中，所述饲料添加剂按重量百分计含有以下组分：5％～10％SEQ ID NO：1所示多肽、10％～20％SEQ ID NO：2所示多肽、10％～20％γ-氨基丁酸和5％～10％维生素C。
在本发明的一些优选实施方式中，所述SEQ ID NO：1所示多肽、SEQ ID NO：2所示多肽和γ-氨基丁酸的质量比为1:2:2。
在本发明的一些实施方式中，所述饲料添加剂还包含辅料。
在本发明的一些实施方式中，所述饲料添加剂按重量百分计含有以下组分：5％SEQ ID NO：1所示多肽、10％SEQ ID NO：2所示多肽、10％γ-氨基丁酸、10％维生素C、65％辅料。
在本发明的一些实施方式中，所述辅料含有抗氧化剂、复合维生素、矿物元素添加剂、发酵中药、益生菌、酵母培养物和沸石粉中的至少一种。
本发明的有益效果是：
本发明提供了一种抗菌肽，其序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示，编码抗菌肽的核酸分子以及包含核酸分子的载体和细胞，所述抗菌肽具有很好的抗菌抑菌性能，本发明还提供了其在制备抗菌、杀菌、抑菌产品中以及产品添加剂中的应用。而且本发明还提供了一种饲料添加剂，包含上述抗菌肽，其中抗菌肽可代替抗生素的促生长作用，且效果迅速稳定，无残留；同时还含γ－氨基丁酸及维生素C可以解除解除由高温高湿引起的采食量减少，缓解无汗、呼吸急促等中暑症状；抗应激，对多种应激(转群、运输、免疫接种、惊吓、天气变化、换料、断奶、断尾)等生理病理变化有较好的调节作用；减轻和中和毒素、增强肝脏解毒能力。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
实施例1抗菌肽突变体的制备
通过杭州丹港生物科技有限公司采用96孔多肽合成仪合成抗菌肽，纯度为95％。合成抗菌肽OdM1及其突变体OdM1-T，合成抗菌肽Myxinidin及其突变体Myxinidin-T；其中抗菌肽OdM1的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示：ATAWDFGPHGLLPIRPIRIRPLCGKDKS；突变体OdM1-T的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示：ATAWAFGPHGLLPIRPIRIRPACGKDKS。抗菌肽Myxinidin的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示：GIHDILKYGKPS；突变体Myxinidin-T的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示：GIHDILKYGKAR。
实施例2抗菌性能检测
以沙门氏菌CMCC50071、大肠杆菌CICC10899和金黄色葡萄球菌ATCC22023作为指示菌，检测实施例1中抗菌肽OdM1突变前后对上述指示菌的最小抑菌浓度(MIC)。
检测结果如表1所示。
表1抗菌肽抗菌性能对比表
Figure BDA0003196453320000041
从表1可以看出，相对于原抗菌肽OdM1和Myxinidin，抗菌肽突变体OdM1-T和Myxinidin-T的抗菌性能有了显著的提升。
实施例3
本实施例提供一种饲料添加剂，重量百分计含有以下组分：5％抗菌肽OdM1-T、10％抗菌肽Myxinidin-T、10％γ-氨基丁酸、10％维生素C、65％辅料。具体情况见表2。表中百分数均表示质量百分数。
表2实施例3～8及对比例1～5的配方表
Figure BDA0003196453320000042
其中γ-氨基丁酸的有效含量为98％。
辅料的配方为：50％酵母培养物、30％发酵中药、10％复合维生素、5％矿物元素添加剂、5％沸石粉，所述百分数均为质量百分数。
上述表中预混合饲料添加剂(以下简称预混料)的制备方法为将所有原料在搅拌机中充分搅拌后即可。
实施例4
本实施例提供一种饲料添加剂，重量百分计含有以下组分：10％抗菌肽OdM1-T、5％抗菌肽Myxinidin-T、10％γ-氨基丁酸、10％维生素C、65％辅料。具体情况见表2。表中百分数均表示质量百分数。
其他同实施例3。
实施例5
本实施例提供一种饲料添加剂，重量百分计含有以下组分：10％抗菌肽OdM1-T、10％抗菌肽Myxinidin-T、5％γ-氨基丁酸、10％维生素C、65％辅料。具体情况见表2。表中百分数均表示质量百分数。
其他同实施例3。
实施例6
本实施例提供一种饲料添加剂，重量百分计含有以下组分：20％抗菌肽OdM1-T、5％抗菌肽Myxinidin-T、5％γ-氨基丁酸、5％维生素C、65％辅料。具体情况见表2。表中百分数均表示质量百分数。
其他同实施例3。
实施例7
本实施例提供一种饲料添加剂，重量百分计含有以下组分：5％抗菌肽OdM1-T、20％抗菌肽Myxinidin-T、5％γ-氨基丁酸、5％维生素C、65％辅料。具体情况见表2。表中百分数均表示质量百分数。
其他同实施例3。
对比例1
本对比例提供一种饲料添加剂，重量百分计含有以下组分：25％抗菌肽OdM1-T、5％γ-氨基丁酸、5％维生素C、65％辅料。具体情况见表2。表中百分数均表示质量百分数。
其他同实施例3。
对比例2
本对比例提供一种饲料添加剂，重量百分计含有以下组分：25％抗菌肽Myxinidin-T、5％γ-氨基丁酸、5％维生素C、65％辅料。具体情况见表2。表中百分数均表示质量百分数。
其他同实施例3。
对比例3
本对比例提供一种饲料添加剂，重量百分计含有以下组分：30％γ-氨基丁酸、5％维生素C、65％辅料。具体情况见表2。表中百分数均表示质量百分数。
其他同实施例3。
对比例4
本对比例提供一种饲料添加剂，重量百分计含有以下组分：30％抗菌肽OdM1、5％维生素C、65％辅料。具体情况见表2。表中百分数均表示质量百分数。
其他同实施例3。
对比例5
本对比例提供一种饲料添加剂，重量百分计含有以下组分：30％抗菌肽Myxinidin、5％维生素C、65％辅料。具体情况见表2。表中百分数均表示质量百分数。
其他同实施例3。
对比例6
本对比例提供一种饲料添加剂，重量百分计含有以下组分：1％抗菌肽OdM1-T、1％γ-抗菌肽Myxinidin、5％维生素C、65％辅料。具体情况见表2。表中百分数均表示质量百分数。
其他同实施例3。
效果例养殖场应用实验
实验方法：试验采用单因子试验设计，选用210头28日龄平均体重为(7.28±1.01)kg的健康“杜×长×大”三元杂交断奶仔猪，按照相近体重、公母各半的原则随机分为7组，每组5个重复，每个重复6头猪。对照组饲喂基础饲粮；试验组基础日粮除预混料不同外，其他组成和营养水平均相同，其中试验组中组别以其添加的预混料组别命名，对照组和试验组各组的日粮结构见表3。其中基础饲粮参照NRC(2012)饲养标准配制，组成及营养水平见表4。
表3日粮结构
Figure BDA0003196453320000061
Figure BDA0003196453320000071
表4基础日粮组成及营养水平(风干基础)
原料 含量(％) 营养成分 含量(％)
玉米 70 消化能/(MJ/kg) 13.95
膨化全脂大豆 5 粗蛋白 17.9
大豆粕 12 粗脂肪 4.33
发酵豆粕 5.5 钙 0.74
鱼粉 4 总磷 0.66
氯化胆碱50％ 0.11 有效磷 0.43
食盐 0.4 赖氨酸 1.29
石粉 0.84 苏氨酸 0.73
碳酸氢钙 0.64 色氨酸 0.2
赖氨酸 0.45
苏氨酸 0.05
色氨酸 0.01
1％预混料① 1
合计 100
注：预混料为每千克日粮提供：维生素A 10000IU；维生素D3 3500IU；维生素E40mg；维生素K3 3.0mg；维生素B1 1.5mg；维生素B2 8.0mg；维生素B6 4.0mg；维生素B120.025mg；叶酸1.2mg；生物素0.15mg；烟酸50mg；泛酸20mg；铜50mg；铁135mg；锌140mg；锰50mg；硒0.36mg。营养成分为计算值。
试验期间严格按照猪场规定，统一进行驱虫。每天饲喂3次，保证每次采食后料槽有少许余料，所有猪仔自由采食和饮水。保持猪舍卫生清洁和空气流通，定期对猪圈进行清扫和消毒。每天观察仔猪情况，记录仔猪的采食、精神状况及有无腹泻。试验期30d。
生长性能及腹泻率统计：分别于试验开始和结束时，晨饲前空腹称重，记录仔猪每天的耗料量及腹泻情况，以重复为单位计算耗料量，并计算各组仔猪平均日增重、平均日采食量、料重比及腹泻率。腹泻率(％)＝试验全期腹泻头次/(试验头数×试验天数)×100％。
实验结果：结果见表5。
表5不同处理组对断奶仔猪生长性能与腹泻率的影响
组别 平均日增重/(g/d) 平均日采食量/(g/d) 料重比 腹泻率/％
对照组 263.89±18.52 453.21±25.2 1.72±0.05 15.82±2.36
实施例3 299.41±22.28 481.05±32.96 1.60±0.04 6.29±2.85
实施例4 295.93±12.2 472.56±31.02 1.60±0.08 6.52±1.68
实施例5 289.12±14.34 471.22±15.38 1.63±0.04 6.51±3.18
实施例6 293.25±13.5 468.55±30.25 1.60±0.05 7.58±1.52
实施例7 284.29±14.2 466.9±12.34 1.64±0.07 6.49±1.8
对比例1 278.93±13.2 463.3±22.65 1.62±0.05 9.68±2.8
对比例2 277.12±14.32 469.36±21.84 1.63±0.04 8.69±1.19
对比例3 272.93±30.2 461.84±30.28 1.69±0.05 9.63±1.52
对比例4 261.21±17.63 456.38±26.3 1.75±0.05 15.88±0.84
对比例5 265.43±19.67 458.92±29.63 1.73±0.05 13.82±3.58
对比例6 271.85±13.25 461.21±24.9 1.69±0.05 10.22±3.12
由表5可知，与对照组相比，实施例3组平均日增重提高13.46％，且优于其余组。另外实施例3～实施例7组实验结果相近，实施例3～实施例7组平均日增重的平均值为292.4g/d，显著高于对照组、对比例3、对比例4、对比例5和对比例6。从实验结果可以看出，抗菌肽突变体OdM1-T、Myxinidin-T复配可以较明显改善平均日增重指标，且效果优于单一的抗菌肽突变体(OdM1-T或Myxinidin-T)。原始抗菌肽组(对比例4、对比例5)的平均日增重相较于对照组差异不大，说明抗菌肽突变体对平均日增重提高具有良好的效果。
由表5可知，与对照组相比，实施例3组料重比降低7％，且优于其余组。另外实施例3～实施例7组实验结果相近，实施例3～实施例7组料重比的平均值为1.62，显著低于对照组1.72，说明复配的抗菌肽突变体具有较好的降低料肉比的效果。实施例3～实施例7组料重比与对比例1、对比例2相近，说明单一组分的抗菌肽突变体同样具有较好的降低料肉比的效果。对比例3、对比例4、对比例5、对比例6与对照组相比料重比接近，说明低剂量或者原始的抗菌肽不能起到降低料肉比的效果。从实验结果可以看出，抗菌肽突变体OdM1-T、Myxinidin-T复配可以较明显改善料重比指标，且效果同单一的抗菌肽突变体(OdM1-T或Myxinidin-T)相近。原始抗菌肽组(对比例4、对比例5)的料重比相较于对照组差异不大，说明抗菌肽突变体对料重比的降低具有良好的效果。
由表5可知，实施例3～实施例7组实验结果相近，腹泻率的平均值为6.7％，显著低于对照组腹泻率15.82％，说明复配的抗菌肽突变体具有较好的降低腹泻率的效果。实施例3～实施例7组腹泻率优于对比例1、对比例2，说明单一组分的抗菌肽突变体同样具有较好的降低料肉比的效果但不及复配的效果。对比例3、对比例4、对比例5、对比例6与对照组相比腹泻率接近，说明低剂量或者原始的抗菌肽不能起到降低腹泻率的效果。从实验结果可以看出，抗菌肽突变体OdM1-T、Myxinidin-T复配可以较明显改善腹泻率指标，且效果优于单一的抗菌肽突变体(OdM1-T或Myxinidin-T)。原始抗菌肽组(对比例4、对比例5)的腹泻率相较于对照组差异不大，说明抗菌肽突变体对腹泻率的降低具有良好的效果。
综合上述结果，本实施例3～7预混合饲料添加剂对仔猪平均日增重、平均日采食量、料重比及腹泻率等仔猪生长指标改善显著，不同配方下的本发明混合饲料添加剂对仔猪生长指标均有明显提升，且其效果也明显高于对比例中的配方，尤其使用实施例3预混合饲料添加剂时，仔猪生长性能最佳，平均日增重为299.41g/d，平均日采食量481.05g/d，料重比1.60，腹泻率为6.29％。
上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州格拉姆生物科技有限公司
<120> 抗菌肽突变体及其应用
<130>
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Ala Thr Ala Trp Ala Phe Gly Pro His Gly Leu Leu Pro Ile Arg Pro
1 5 10 15
Ile Arg Ile Arg Pro Ala Cys Gly Lys Asp Lys Ser
20 25
<210> 2
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Gly Ile His Asp Ile Leu Lys Tyr Gly Lys Ala Arg
1 5 10
<210> 3
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Ala Thr Ala Trp Asp Phe Gly Pro His Gly Leu Leu Pro Ile Arg Pro
1 5 10 15
Ile Arg Ile Arg Pro Leu Cys Gly Lys Asp Lys Ser
20 25
<210> 4
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Gly Ile His Asp Ile Leu Lys Tyr Gly Lys Pro Ser
1 5 10

Claims (12)

1.一种多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种核酸分子，编码权利要求1所述多肽。
3.一种载体，包含权利要求2所述核酸分子。
4.一种细胞，包含权利要求3所述载体。
5.权利要求1所述多肽或权利要求2所述核酸分子或权利要求3所述载体或权利要求4所述细胞在以下(I)或(II)中的应用：
(I)制备抑菌剂；
(II)制备添加剂。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述菌为细菌。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述细菌为沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌。
8.一种添加剂，其包含权利要求1所述多肽。
9.根据权利要求8所述添加剂，其特征在于，所述添加剂为食品添加剂、饲料添加剂、化妆品添加剂或卫生产品添加剂。
10.根据权利要求9所述添加剂，其特征在于，所述添加剂为饲料添加剂。
11.根据权利要求10所述添加剂，其特征在于，所述饲料添加剂按重量百分计含有以下组分：5％～20％SEQ ID NO：1所示多肽、5％～20％SEQ ID NO：2所示多肽、1％～30％γ-氨基丁酸和1％～30％维生素C。
12.根据权利要求11所述添加剂，其特征在于，所述饲料添加剂按重量百分计含有以下组分：5％～10％SEQ ID NO：1所示多肽、10％～20％SEQ ID NO：2所示多肽、10％～20％γ-氨基丁酸和5％～10％维生素C。
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