CN112521456A - 一种抗菌肽及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种抗菌肽及其制备方法与应用。本发明提供的抗菌肽氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示,分子量为1555Da,等电点为12.18,所述抗菌肽经全自动多肽合成仪合成,并经HPLC反相柱层析脱盐纯化所得。本发明提供的抗菌肽分子量小,抗菌谱广,抗菌活性高,主要作用用于抑菌,对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、巴氏杆菌有显著的抑菌效果;可以作为饲料添加剂,应用于动物生产上,改善断奶仔猪的肠道健康;并通过提高断奶仔猪免疫球蛋白的浓度,提高断奶仔猪的免疫力,降低腹泻率,促进动物的健康生长。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种抗菌肽及其制备方法与应用。
背景技术
在畜牧养殖业中,抗生素作为饲料添加剂在动物日粮中被广泛应用,因为抗生素在提高动物生长性能和减少疾病方面发挥着重要的作用。研究发现,在动物日粮中使用抗生素,通过影响动物肠道微生物在其体内的定植从而起到促进动物健康生长的作用。然而,伴随着抗生素的大量使用、甚至滥用,它也随之产生了诸多不良影响,比如容易引起动物菌群失衡、产生耐药性、畜产品残留、危害人类的健康等。因此,要解决长期使用抗生素所造成的弊端,研究可以改善畜禽健康,提高生产性能且安全无毒的能替代抗生素的饲料添加剂具有重要意义。
抗菌肽作为自然界生物中广泛存在的一种小分子活性多肽,具有抗菌谱广、热稳定性好和不易产生耐药性等特点,是替代抗生素重要的潜在物质。然而,天然来源的抗菌肽大多存在分子量大而具有免疫原性、抗菌活性不高、对动物细胞具有毒副作用或会导致溶血等缺陷,在一定程度上限制了抗菌肽在生猪养殖中的推广应用。通过分子设计和改造获得分子量小、抗菌活性高和对动物细胞无毒副作用的抗菌肽是促进抗菌肽在生猪养殖中应用的有效手段。
基于此,中国专利申请CN109874909A公开了一种基于抗菌肽的饲料添加剂及制备工艺,但是,其是在抗菌肽的基础上又加入了女贞子萃取物、中草药提取物、酶解松针粉等多种组分,与抗菌肽一起,达到提高抑菌能力的效果,且其仅适用于常规畜禽,不能替代抗生素,但是对幼猪的肠道促进能力不足,且抗菌肽及其组分的共同加入,大大提高了饲料的制作成本。
同时,中国发明专利CN105166323B公开了一种复合饲料添加剂,其中加入了芽孢杆菌抗菌肽和芽孢杆菌益生菌,该复合饲料添加剂虽然可以替代抗生素,并具有防治各种动物腹泻、提高动物生产性能及免疫力等多种功能,但是该抗菌肽仅对芽孢杆菌具有抑制作用,并不能有效抑制其他细菌的生长,且最终的效果也没有很好。
综上所述,现有技术中的抗生素替代品普遍具有抗菌活性低,对动物细胞具有毒副作用或会导致溶血等缺陷。
发明内容
针对现有技术中普遍存在的缺陷,本发明创造性地提供了一种抗菌肽及其制备方法与应用。本发明提供的抗菌肽对动物常见感染君有显著的抑菌效果;可以作为饲料添加剂,应用于动物生产上,改善断奶仔猪的肠道健康。
为了达到上述目的,本发明采用的技术方案为:
一种抗菌肽,所述抗菌肽具有如SEQ ID NO.1所述的氨基酸序列,分子量为1555Da,等电点为12.18。
RDRWVISAVRGFIH(SEQ ID NO.1);
本发明还提供了所述抗菌肽的制备方法,包括如下步骤:
S1、将抗菌肽按SEQ ID NO.1所述序列信息进行合成,然后经无菌纯化水稀释至45~55μg/mL,得氨基酸溶液;
S2、将步骤S1制得的氨基酸溶液经HPLC反相柱层析脱盐纯化,即得。
优选地,步骤S1所述的合成过程为经全自动多肽合成仪合成抗菌肽全序列。优选地,步骤S2所述HPLC反相柱层析脱盐纯化的具体操作过程为:(1)流动相配置:配置缓冲液A和缓冲液B各1L,在备好的量筒中用Teflon包被的磁转子将溶液搅拌均匀,用0.2μm PTEE过滤器过滤缓冲液A和B,将洗脱液瓶用塞子封闭,以防止有机溶剂挥发;
(2)抗菌肽样品的制备:先检测样品的纯度,如果存在不溶颗粒,用0.2μm PTEE滤膜过滤;
(3)用RP-HPLC进行脱盐纯化:
①检测HPLC系统:
a、用洗脱液A进空白样,先在100%洗脱液A中等梯度洗脱,再在100%洗脱液B中梯度洗脱;
b、用硫脲或硝酸钠来测量柱的死体积,从而确定洗脱时间;
②蛋白质脱盐
a、将含盐样品注入反相柱中,按照流速为2.5mL/min,用100%洗脱液A洗脱3min,盐洗脱时间为柱的死时间,
b、用100%洗脱液B一步洗脱洗脱蛋白3min,收集得到的蛋白质组分。
优选地,步骤(1)中所述缓冲液A为质量分数为0.1%的三氟乙酸水溶液;所述缓冲液B为含0.09%三氟乙酸的2-丙醇溶液。
本发明还提供了一种所述的抗菌肽作为饲料添加剂在动物生产中的应用。
优选地,所述抗菌肽的加入量为25~200mg/kg。
本发明中,将抗菌肽纯化后,用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱测定抗菌肽的分子量为1555Da,用电聚焦电泳方法测定抗菌肽的等电点,并用自动氨基酸序列测定仪解析抗菌肽的所有氨基酸序列,确保与本发明所述SEQ ID NO.1的氨基酸序列一致,进一步保证了本发明抗菌肽的正确性。
与现有技术相比,本发明提供的抗菌肽具有如下优势:
(1)本发明提供的抗菌肽,分子量小,抗菌谱广,抗菌活性高,主要用于抑菌,对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、巴氏杆菌有显著的抑菌效果;
(2)本发明提供的抗菌肽,可以作为饲料添加剂,应用于动物生产上,改善断奶仔猪的肠道健康;
(3)本发明提供的抗菌肽,通过提高断奶仔猪免疫球蛋白的浓度,提高断奶仔猪的免疫力,降低腹泻率,促进动物的健康生长。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解释,但是应当注意的是,以下实施例仅用以解释本发明,而不能用来限制本发明,所有与本发明相同或相近的技术方案均在本发明的保护范围之内。若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段,所用原料为市售商品。
所述全自动多肽合成仪可购自培安有限公司,型号为美国CEM Liberty;所述基质辅助激光解析电离飞行时间质谱可购自日本电子株式会社,型号为JMS-S3000 SpiralTOF;所述自动氨基酸序列测定仪可购自德国-曼默博尔,型号为A300 advanced;所述基础日粮可购自傲农饲料;所述大肠杆菌菌株号为ATCC 25922,金黄色葡萄球菌菌株号为ATCC6538,枯草芽孢杆菌菌株号为ATCC 6633,沙门氏菌菌株号为ATCC 14028,均保存自申请人实验室。
实施例1一种抗菌肽
所述抗菌肽的制备方法,包括如下步骤:
S1、将抗菌肽按SEQ ID NO.1所述序列信息,用全自动多肽合成仪合成,然后经无菌纯化水稀释至45μg/mL,得氨基酸溶液;
S2、将步骤S1制得的氨基酸溶液经HPLC反相柱层析脱盐纯化,即得;所述HPLC反相柱层析脱盐纯化的具体过程为:
(1)流动相配置:配置缓冲液A和缓冲液B各1L,在备好的量筒中用Teflon包被的磁转子将溶液搅拌均匀,用0.2μm PTEE过滤器过滤缓冲液A和B,将洗脱液瓶用塞子封闭,以防止有机溶剂挥发;所述缓冲液A为质量分数为0.1%的三氟乙酸水溶液;所述缓冲液B为含0.09%三氟乙酸的2-丙醇溶液;
(2)抗菌肽样品的制备:先检测样品的纯度,如果存在不溶颗粒,用0.2μm PTEE滤膜过滤;
(3)用RP-HPLC进行脱盐纯化:
①检测HPLC系统:
a、用洗脱液A进空白样,先在100%洗脱液A中等梯度洗脱,再在100%洗脱液B中梯度洗脱;
b、用硫脲或硝酸钠来测量柱的死体积,从而确定洗脱时间;
②蛋白质脱盐
a、将含盐样品注入反相柱中,按照流速为2.5mL/min,用100%洗脱液A洗脱3min,盐洗脱时间为柱的死时间,
b、用100%洗脱液B一步洗脱洗脱蛋白3min,收集得到的蛋白质组分。
实施例2一种抗菌肽
所述抗菌肽的制备方法与实施例1类似;
与实施例1的区别在于,实施例2中将抗菌肽经无菌纯化水稀释至55μg/mL。
实施例3一种抗菌肽
所述抗菌肽的制备方法与实施例1类似;
与实施例1的区别在于,实施例3中将抗菌肽经无菌纯化水稀释至50μg/mL。
试验例1抑菌试验
1.试验样品:本发明实施例1-3制得的抗菌肽;
2.试验菌种:大肠杆菌,金黄色葡萄球菌,枯草芽孢杆菌,沙门氏菌;
3.试验方法:将上述各菌种分别接种于LB固体培养基上,然后于37℃培养箱中倒置培养,待菌落长出后,用一次性接种环挑取各受试细菌单菌落至LB液体培养基中,37℃培养箱中震荡培养至对数生长期。
用紫外分光光度计上检测菌液OD600,根据OD600=1×109CFU/mL将受试菌菌液用液体LB培养基稀释至为5×105CFU/mL左右。然后在无菌96孔板各孔中加100μL LB液体培养基,然后在A1孔中加100μL稀释到一定浓度的抗菌肽PD21样品(抗菌肽样品加入前用0.22μm微孔滤膜过滤除菌),混匀后取100μL加入A2孔,A2孔混匀后再取100μL加入A3孔,依次倍比稀释,最后从A12孔吸出100μL弃去,至此抗菌肽二倍浓度梯度样制成。向预先加入抗菌肽的各孔中加入已稀释好的菌液100μL混匀,于37℃缓慢震荡培养24h,然后测定600nm处吸光值;每组试验做五次重复。
结果计算:取检测不到细菌生长的孔和与之相邻的有细菌生长的孔中抗菌肽浓度之和的平均值作为抗菌肽最小抑菌浓度(MIC)。
4.试验结果:具体试验结果见表1。
表1不同抗菌肽的最小抑菌浓度对比
由上表1可知,本发明实施例1-3制得的抗菌肽对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌及沙门氏菌的最小抑菌浓度均较低。
试验例2抗菌肽对断奶仔猪免疫功能、肠道健康和生长性能的影响
1.试验样品:基础日粮,实施例3制得的抗菌肽;
2.试验对象:24日龄,体重相差±2kg的断奶仔猪300头,随机分成5个处理组,每个处理组设置6个重复,每个重复10头。对照组不添加抗菌肽,饲喂基础日粮,试验1组日粮添加抗菌肽25mg/kg,试验2组日粮添加抗菌肽50mg/kg,试验3组日粮添加抗菌肽100mg/kg,试验4组日粮添加抗菌肽200mg/kg,试验期为30天。各组别具体添加量如表2所述。
表2不同组添加的饲料
组别 | 饲粮 |
对照组 | 基础饲粮 |
试验1组 | 基础饲粮+25mg/kg抗菌肽 |
试验2组 | 基础饲粮+50mg/kg抗菌肽 |
试验3组 | 基础饲粮+100mg/kg抗菌肽 |
试验4组 | 基础饲粮+200mg/kg抗菌肽 |
3.试验结果:
3.1对断奶仔猪的免疫功能以30天后免疫球蛋白的含量为依据进行测定,试验结果如表3所示。
表3不同试验组免疫球蛋白的含量
项目 | 对照组 | 试验1组 | 试验2组 | 试验3组 | 试验4组 |
IgA(g/L) | 0.563 | 0.652 | 0.703 | 0.752 | 0.698 |
IgM(g/L) | 0.158 | 0.175 | 0.248 | 0.316 | 0.299 |
IgG(g/L) | 2.036 | 2.378 | 3.015 | 3.564 | 3.258 |
由表3可知,与对照组相比,添加本发明所述抗菌肽作为饲料添加剂,可以提高断奶仔猪的免疫球蛋白的浓度,其中试验3组(添加量为100mg/kg)效果最佳。
3.2肠道健康(空肠)结果见表4。
表4不同试验组肠道健康结果
由表4可知,与对照组相比,添加本发明所述抗菌肽作为饲料添加剂,可以改善断奶仔猪的肠道健康,其中试验3组(添加量为100mg/kg)效果最佳。
3.3仔猪生长性能试验结果见表5。
表5不同试验组生长性能试验结果
项目 | 对照组 | 试验1组 | 试验2组 | 试验3组 | 试验4组 |
初始平均体重(kg) | 7.10 | 7.11 | 7.13 | 7.15 | 7.09 |
结束平均体重(kg) | 28.95 | 29.94 | 30.16 | 32.87 | 31.53 |
平均日增重(g/d) | 0.73 | 0.76 | 0.77 | 0.86 | 0.81 |
日均采食量(kg) | 1.17 | 1.20 | 1.20 | 1.26 | 1.23 |
料重比 | 1.60 | 1.58 | 1.56 | 1.47 | 1.52 |
成活率(%) | 93.00 | 95.00 | 96.00 | 99.00 | 98.00 |
死亡率(%) | 7 | 5 | 4 | 1 | 2 |
由表5可知,与对照组相比,添加本发明所述抗菌肽作为饲料添加剂,可以提高断奶仔猪的生长性能,其中试验3组(添加量为100mg/kg)效果最佳。
最后应当说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制,尽管参照较佳实施例对本发明做了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (7)
1.一种抗菌肽,其特征在于,所述抗菌肽具有如SEQ ID NO.1所述的氨基酸序列,分子量为1555Da,等电点为12.18。
2.一种如权利要求1所述抗菌肽的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
S1、将抗菌肽按SEQ ID NO.1所述序列信息进行合成,然后加无菌纯化水稀释至45~55μg/mL,得氨基酸溶液;
S2、将步骤S1制得的氨基酸溶液经HPLC反相柱层析脱盐纯化,即得。
3.如权利要求2所述的制备方法,其特征在于,步骤S1所述的合成过程为经全自动多肽合成仪合成抗菌肽全序列。
4.如权利要求2所述的制备方法,其特征在于,步骤S2所述HPLC反相柱层析脱盐纯化的具体操作过程为:
(1)流动相配置:配置缓冲液A和缓冲液B各1L,在备好的量筒中用Teflon包被的磁转子将溶液搅拌均匀,用0.2μm PTEE过滤器过滤缓冲液A和B,将洗脱液瓶用塞子封闭,以防止有机溶剂挥发;
(2)抗菌肽样品的制备:先检测样品的纯度,如果存在不溶颗粒,用0.2μm PTEE滤膜过滤;
(3)用RP-HPLC进行脱盐纯化:
①检测HPLC系统:
a、用洗脱液A进空白样,先在100%洗脱液A中等梯度洗脱,再在100%洗脱液B中梯度洗脱;
b、用硫脲或硝酸钠来测量柱的死体积,从而确定洗脱时间;
②蛋白质脱盐
a、将含盐样品注入反相柱中,按照流速为2.5mL/min,用100%洗脱液A洗脱3min,盐洗脱时间为柱的死时间,
b、用100%洗脱液B一步洗脱洗脱蛋白3min,收集得到的蛋白质组分。
5.如群里要求4所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)中所述缓冲液A为质量分数为0.1%的三氟乙酸水溶液;所述缓冲液B为含0.09%三氟乙酸的2-丙醇溶液。
6.一种如权利要求1所述的抗菌肽作为饲料添加剂在动物生产中的应用。
7.如权利要求6所述的应用,其特征在于,所述抗菌肽的加入量为25~200mg/kg。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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