CN113174354A - 一种重组罗伊氏乳酸杆菌及其制备方法、制剂和应用 - Google Patents

一种重组罗伊氏乳酸杆菌及其制备方法、制剂和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种重组罗伊氏乳酸杆菌及其制备方法、制剂和应用，涉及微生物的技术领域。具体地，本发明提供了一种能够表达和分泌乳铁蛋白肽的重组罗伊氏乳酸杆菌，采用喷雾干燥法制备的微胶囊菌剂及其在制备动物饲料添加剂、预防和/或治疗动物疾病、提高动物生长性能和免疫力中的应用。重组罗伊氏乳酸杆菌及其制剂，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌，沙门氏菌等耐药菌都有杀菌作用；同时，对猪大肠杆菌病、猪传染性胃肠炎、猪副伤寒等仔猪肠道疾病有一定的抵抗作用，还能提高断乳仔猪的免疫机能并改善其肠道微生态环境，促进断乳仔猪健康生长，可达到良好的抗生素替代效果，具有极高的实用价值和经济价值。

Description

一种重组罗伊氏乳酸杆菌及其制备方法、制剂和应用
技术领域
本发明涉及微生物的技术领域，具体涉及一种基因工程方式获得的重组罗伊氏乳酸杆菌(分泌乳铁蛋白肽)，喷雾干燥法制备的微胶囊菌剂和在制备动物饲料添加剂、预防和/或治疗动物疾病、提高动物生长性能和免疫力中的应用。
背景技术
我国是养猪生产大国，据统计分析发现猪大肠杆菌病、猪传染性胃肠炎，猪副伤寒等疾病对猪养殖业经济效益影响重大。猪大肠杆菌病是由病原性大肠杆菌引起的肠道传染性疾病；猪传染性胃肠炎是由猪传染性胃肠炎病毒引起的；猪副伤寒是由猪霍乱沙门氏菌(Salmonella choleraesuis)等沙门氏菌属细菌引起仔猪的一种传染病。在养殖业过去数十年间，饲用促生长抗生素作为药物饲料添加剂曾保障了动物健康，但抗生素滥用可能带来耐药菌、致畸、致癌等严重后果。根据农业农村部194号文件，自2021年1月1日，饲料中全面禁止添加促生长类药物饲料添加剂(中药类除外)的商品饲料，现代养殖业急需开发取代传统抗生素的无残留、无抗性诱导、安全无污染的新型生物饲料及其添加剂。
乳酸菌能够调节肠道菌群、调节黏膜与免疫系统功能，促进营养吸收及仔猪健康，作为重要的饲用抗生素替代品被应用。其中，罗伊氏乳酸杆菌(Lactobacillus reuteri)因能产生一种广谱抗菌物质罗伊氏素而被广泛使用，但目前常用的罗伊氏乳酸杆菌综合性能欠佳，在生产、加工、贮藏以及进入消化道的过程中易受各种不利因素的影响，导致菌体大量死亡，极大地降低了益生菌的效用。乳铁蛋白肽(LFCA)作为饲用抗生素替代品之一，其具有独特的抗菌作用机制，迅速杀菌作用且不易引发细菌的耐药性，且对抗生素耐药性细菌如金黄色葡萄球菌、沙门氏菌具有较好的杀伤作用。但具有生产效率低下及存储期较短的问题，难以实现工业化的大规模生产，限制了其在饲料添加剂中的应用发展。
因此，亟需提供一种融合乳铁蛋白肽和罗伊氏乳酸杆菌优势的，存储期长，抗逆性强，肠道内定植后能有效抑制沙门氏菌等致病菌感染的综合性能较好，无耐药性的重组罗伊氏乳酸杆菌及其制剂作为仔猪饲用抗生素替代品。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种重组罗伊氏乳酸杆菌，能够同时产生广谱抗菌物质罗伊氏素和乳铁蛋白肽，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌，沙门氏菌等耐药菌都有杀菌作用。同时，对猪大肠杆菌病、猪传染性胃肠炎、猪副伤寒等仔猪肠道疾病有一定的抵抗作用。可达到良好的抗生素替代效果，具有极高的实用价值和经济价值。
本发明第一方面提供了一种重组罗伊氏乳酸杆菌，其能够表达乳铁蛋白肽。
牛乳铁蛋白经胃蛋白酶水解可以产生多种乳铁蛋白肽(Lactoferrin-derivedpeptides)，是短肽或预期具有其活性的小肽。重组菌的乳铁蛋白肽序列，是经过优化的，来自乳铁蛋白的N端的Lactoferrin ampin(LFampin)和LfcinB，这两个片段具有疏水性，强阳离子特性和两个二硫键组成的空间螺旋结构，因此具有比乳铁蛋白更强的生物学活性。它的小分子质量和较高的热稳定性使其更容易穿越某些屏障。
示例性地，重组罗伊氏乳酸杆菌的保藏编号为CCTCC M 2021232，于2021年3月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，(地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号，联系电话：027-6875 2319)。
本发明中，重组罗伊氏乳酸杆菌(本文中也简称重组菌)不仅能够产生广谱抗菌物质罗伊氏素，还能表达和分泌乳铁蛋白肽，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌，沙门氏菌等耐药菌都有杀菌作用。
本发明第二方面提供了重组罗伊氏乳酸杆菌的制备方法，包括以下步骤：
采用基因工程手段，将编码乳铁蛋白肽的核苷酸序列可操作性地导入罗伊氏乳酸杆菌中，获得表达乳铁蛋白肽的重组罗伊氏乳酸杆菌。
进一步，重组罗伊氏乳酸杆菌的制备方法，包括以下步骤：
(a)获得目的基因：将增强子T7g10、肽聚糖水解酶信号肽、牛乳铁蛋白肽(LFcinB和LFampin)、EGFP标记基因串联获得目的基因；
(b)构建重组表达载体：将步骤(a)中目的基因插入到pPG载体中，获得重组表达载体；
(c)获得重组菌：将步骤(b)中重组表达载体导入罗伊氏乳酸杆菌中，构建表达牛乳铁蛋白肽的重组罗伊氏乳酸杆菌，诱导表达乳铁蛋白肽。
在本发明一种优选地实施方式中，重组罗伊氏乳酸杆菌的制备方法，包括以下步骤：
(1)获得目的基因：将增强子T7g10、肽聚糖水解酶信号肽、以及用linker连接的依据乳酸杆菌密码子偏嗜性优化的两段牛乳铁蛋白肽(LFampin和LFcinB)、EGFP标记基因串联合成并优化，命名为T7g10-LFCA-EGFP；
(2)构建重组表达载体：将步骤(1)中T7g10-LFCA-EGFP插入到含有组成型强启动子HCE、大肠杆菌强终止子rrnB T1T2的优化后的无抗性标记的pPG载体中，获得重组表达质粒(载体)pPG-T7g10-LFCA-EGFP；
(3)获得重组菌：将步骤(2)中重组表达载体导入猪源罗伊氏乳酸杆菌LR-CO21，构建表达牛乳铁蛋白肽的重组罗伊氏乳酸杆菌，诱导表达乳铁蛋白肽。
本发明中所使用的重组表达载体是组成型表达载体，因此目的蛋白(牛乳铁蛋白肽)的表达无需额外添加诱导剂，能够解决规模化生产上的难题。
本发明中，猪源罗伊氏乳酸杆菌LR-CO21是发明人在实验室从仔猪体内分离筛选得到的，具有较强耐酸、耐胆盐以及较好定植能力，可以在体内存留的时间较长。
示例性地，提供的罗伊氏乳酸杆菌(Lactobacillus reuteri)LR-CO21已于2019年8月5日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)；保藏编号为CCTCC M 2019601，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内武汉大学保藏中心；邮编：430072。罗伊氏乳酸杆菌(Lactobacillus reuteri)LR-CO21，即Lactobacillus reuteri LR-CO21，也简称为LR-CO21。在本发明一种优选地实施方式中，所述重组表达质粒(载体)pPG-T7g10-LFCA-EGFP的核苷酸序列包含或者由如下序列组成：
a)SEQ ID NO：1的核苷酸序列；
b)能够与SEQ ID NO：1的核苷酸序列或其互补序列进行杂交、且编码牛乳铁蛋白肽的核苷酸序列或其片段；
c)上述a)或b)的互补序列；或
d)由于遗传密码简并性从SEQ ID NO：1的核苷酸衍生的核苷酸序列。
SEQ ID NO：1的核苷酸序列为TCTAGAGATCTCTCCTTCACAGATTCCCAATCTCTTGTTAAATAACGAAAAAGCATCAATTAAAACGGCGGCATGTCTTTCTATATTCCAGCAATGTTTTATAGGGGACATATTGATGAAGATGGGTATCACCTTAGTAAAAAAAAAGAATTGCTATAAGCTGCTCTTTTTTGTTCGTGATATACTGATAATAAATTGAATTTTCACACTTCTGAAAAAAGGAGGGGAGACCACAACGGTTTCCCACTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAG(HCE启动子)GAAAAAAGGAGCTGGAACCGATG(T7g10增强子)ATG(起始密码子)AAATTAAAGCAATTAGTTACAGGCTTTATCACAGTTGCAACATTGGCTGGGGTTGGGGTTTCAGGGGTGGCTGCCACAACAGTTAAAGCT(肽聚糖水解酶信号肽)GAACAAAAGTTGATTTCAGAAGAAGATTTA(Myc标签)TTTAAATGCCGTCGTTGGCAATGGCGCATGAAGAAGTTGGGCGCTCCGAGTATTACCTGCGTTCGCCGCGCTTTT(LFcinB)GGCGGTGGCTCC(link)AGTGTTGATGGCAAAGAAGATTTGATTTGGAAATTGTTGAGTAAAGCTCAAGAAAAATTTGGCAAAAATAAAAGTCGT(LFampin)GCTGAAGCTGCGGCAAAAGAAGCAGCGGCTAAAGCT(link)GTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTGATAA(EGFP)CAGATCTGGCTGTTTTGGCGGATGAGAGAAGATTTTCAGCCTGATACAGATTAAATCAGAACGCAGAAGCGGTCTGATAAAACAGAATTTGCCTGGCGGCAGTAGCGCGGTGGTCCCACCTGACCCCATGCCGAACTCAGAAGTGAAACGCCGTAGCGCCGATGGTAGTGTGGGGTCTCCCCATGCGAGAGTAGGGAACTGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCCGCCGGGAGCGGATTTGAACGTTGCGAAGCAACGGCCCGGAGGGTGGCGGGCAGGACGCCCGCCATAAACTGCCAGGCATCAAATTAAGCAGAAGGCCATCCTGACGGATGGCCTTTTTGCGTTTCTACAAACTCTCTCGAGTAATGATAAGGTCACCCCTAGAGTCAACTAAAAGCCACTACTGTAATAGTTAAAATTGTTTAAAAGAGGAAATCAGTTTGTTATCAGTTGATTTCCTCTTTTATGTATCACTGTTTTCAGAGTAAGTTCCAATGGCTGGCATTGCTGTTAATATGACACTAGATGATATAAGTTATCATGTTAAGCTCGATGGTAAGTTGGGTTTAATTGATAGAAAACATAATAGTTATGAGATGCTTGAAATACCTACTAAAAATACATTTTTACCAAATTTTATATGATCAAGCTCGGCCGAGCTGTATTCTATAGTGTCACCTAAATCGTATGTGTATGATACATAAGGTTATGTATTAATTGTAGCCGCGTTCTAACGACAATATGTACAAGCCTAATTGTGTAGCATCTGGCTTACTGAAGCAGACCCTATCATCTCTCTCGTAAACTGCCGTCAGAGTCGGTTTGGTTGGACGAACCTTCTGAGTTTCTGGTAACGCCGTTCCGCACCCCGGAAATGGTCAGCGAACCAATCAGCAGGGTCATCGCTAGAGAGCTAGCAAGCTTGTCGAGTGCATATTTTCGGCAATCTTCTCAATGAGATGCTCTTCAGCATGTTCAATGATGTCGATTTTTTATTAAAACGTCTCAAAATCGTTTCTGAGACGTTTTAGCGTTTATTTCGTTTAGTTATCGGCATAATCGTTAAAACAGGCGTTATCGTAGCGTAAAAGCCCTTGAGCGTAGCGTGCTTTGCAGCGAAGATGTTGTCTGTTAGATTATGAAAGCCGATGACTGAATGAAATAATAAGCGCAGCGTCCTTCTATTTCGGTTGGAGGAGGCTCAAGGGAGTTTGAGGGAATGAAATTCCCTCATGGGTTTGATTTTAAAAATTGCTTGCAATTTTGCCGAGCGGTAGCGCTGGAAAATTTTTGAAAAAAATTTGGAATTTGGAAAAAAATGGGGGGAAAGGAAGCGAATTTTGCTTCCGTACTACGACCCCCCATTAAGTGCCGAGTGCCAATTTTTGTGCCAAAAACGCTCTATCCCAACTGGCTCAAGGGTTTGAGGGGTTTTTCAATCGCCAACGAATCGCCAACGTTTTCGCCAACGTTTTTTATAAATCTATATTTAAGTAGCTTTATTGTTGTTTTTATGATTACAAAGTGATACACTAATTTTATAAAATTATTTGATTGGAGTTTTTTAAATGGTGATTTCAGAATCGAAAAAAAGAGTTATGATTTCTCTGACAAAAGAGCAAGATAAAAAATTAACAGATATGGCGAAACAAAAAGGTTTTTCAAAATCTGCGGTTGCGGCGTTAGCTATAGAAGAATATGCAAGAAAGGAATCAGAACAAAAAAAATAAGCGAAAGCTCGCGTTTTTAGAAGGATACGAGTTTTCGCTACTTGTTTTTGATAAGGTAATATATCATGGCTATTAAAAATACTAAAGCTAGAAATTTTGGATTTTTATTATATCCTGACTCAATTCCTAATGATTGGAAAGAAAAATTAGAGAGTTTGGGCGTATCTATGGCTGTCAGTCCTTTACACGATATGGACGAAAAAAAAGATAAAGATACATGGAATAGTAGTGATGTTATACGAAATGGAAAGCACTATAAAAAACCACACTATCACGTTATATATATTGCACGAAATCCTGTAACAATAGAAAGCGTTAGGAACAAGATTAAGCGAAAATTGGGGAATAGTTCAGTTGCTCATGTTGAGATACTTGATTATATCAAAGGTTCATATGAATATTTGACTCATGAATCAAAGGACGCTATTGCTAAGAATAAACATATATACGACAAAAAAGATATTTTGAACATTAATGATTTTGATATTGACCGCTATATAACACTTGATGAAAGCCAAAAAAGAGAATTGAAGAATTTACTTTTAGATATAGTGGATGACTATAATTTGGTAAATACAAAAGATTTAATGGCTTTTATTCGCCTTAGGGGAGCGGAGTTTGGAATTTTAAATACGAATGATGTAAAAGATATTGTTTCAACAAACTCTAGCGCCTTTAGATTATGGTTTGAGGGCAATTATCAGTGTGGATATAGAGCAAGTTATGCAAAGGTTCTTGATGCTGAAACGGGGGAAATAAAATGACAAACAAAGAAAAAGAGTTATTTGCTGAAAATGAGGAATTAAAAAAAGAAATTAAGGACTTAAAAGAGCGTATTGAAAGATACAGAGAAATGGAAGTTGAATTAAGTACAACAATAGATTTATTGAGAGGAGGCATATCAAATGAACTTTAATAAAATTGATTTAGACAATTGGAAGAGAAAAGAGATATTTAATCATTATTTGAACCAACAAACGACTTTTAGTATAACCACAGAAATTGATATTAGTGTTTTATACCGAAACATAAAACAAGAAGGATATAAATTTTACCCTGCATTTATTTTCTTAGTGACAAGGGTGATAAACTCAAATACAGCTTTTAGAACTTGTTACAATAGCGACGGAGAGTTAGGTTATTGGGATAAGTTAGAGCCACTTTATACAATTTTTGATGGTGTATCTAAAACATTCTCTGGTATTTGGACTCCTGTAAAGAATGACTTCAAAGAGTTTTATGATTTATACCTTTCTGATGTAGAGAAATATAATGGTTCGGGGAAATTGTTTCCCAAAACACCTATACCTGAAAATGCTTTTTCTCTTTCTATTATTCCATGGACTTCATTTACTGGGTTTAACTTAAATATCAATAATAATAGTAATTACCTTCTACCCATTATTACAGCAGGAAAATTCATTAATAAAGGTAATTCAATATATTTACCGCTATCTTTACAGGTACATCATTCTGTTTGTGATGGTTATCATGCAGGATTGTTTATGAACTCTATTCAGGAATTGTCAGATAGGCCTAATGACTGGCTTTTATAATATGAGATAATGCCGACTGTACTTTTTACAGTCGGTTTTCTAATGTCACTAACCTGCCCCGTTAGTTGAAGAAGGTTTTTATATTACAGCTCCAAGATCTCCGCTTCTTTTATTTTTTTGT。
本发明第三方面提供了一种制剂，包含所述的重组罗伊氏乳酸杆菌，或所述的制备方法获得的重组罗伊氏乳酸杆菌。
对于所述制剂的剂型不做具体限定，示例性的，所述剂型可以选自微胶囊剂、可溶性液剂、可溶性粉剂、可溶性粒剂、可湿性粉剂、可乳化粉剂、悬乳剂、水分散性颗粒剂、可乳化颗粒剂、水漂浮分散颗粒剂。
在本发明一种优选地实施方式中，采用喷雾干燥法获得含有重组罗伊氏乳酸杆菌的微胶囊菌剂。
利用喷雾干燥技术微胶囊化重组罗伊氏乳酸杆菌，喷雾干燥后的制剂能够顺利通过动物胃部，并在到达肠道中时仍能够保持较高的存活率，发挥其对宿主有益的功效，具有含菌量高、能源消耗低、制备效率高、操作工艺简单、可连续生产、易于产业化的优势。喷雾干燥前重组菌抗逆性较低，在仔猪肠道内定植但存活率较低，喷雾干燥后大大增加了菌体的抗逆性及存储期，用干粉代替液体菌种，作为菌制品综合性能较强，可更好的作为抗生素替代品使用。
进一步，在本发明提供的技术方案的基础上，所述喷雾干燥法中加入喷雾干燥保护剂，喷雾干燥保护剂作为壁材，在微胶囊包覆工艺中将重组罗伊氏乳酸杆菌包裹于内部。
对喷雾干燥保护剂的具体组分不做限定，可选择本领域常规使用的组分。示例性地，所述喷雾干燥保护剂包括脱脂乳、L-谷氨酸钠、PVPK-30、糊精、明胶。以上述几种组分为壁材微胶囊化重组罗伊氏乳酸杆菌有效提高了重组罗伊氏乳酸杆菌保存活性。
示例性地，所述喷雾干燥保护剂，按重量分数计，包括脱脂乳15-20份、L-谷氨酸钠15-22份、PVPK-30 20-30份、糊精18-25份、明胶10-18份。
在本发明一种优选地实施方式中，所述喷雾干燥保护剂，按重量分数计，包括脱脂乳17.6份、L-谷氨酸钠18.55份、PVPK-30 25.5份、糊精22.1份、明胶14.5份。
进一步，在本发明提供的技术方案的基础上，所述制剂中，重组罗伊氏乳酸杆菌的活菌数为6×1012CFU/g～8×1012CFU/g。
本发明第四方面提供了重组罗伊氏乳酸杆菌，包含重组罗伊氏乳酸杆菌的制剂在制备动物饲料添加剂、提高动物生长性能和免疫力中的应用。
示例性地，所述动物为养殖动物，例如猪、牛、羊、鸡、鸭、鹅。
优选所述动物为猪；更优选仔猪。
示例性地，能够更好地提高动物免疫力，缓解一些仔猪常见病的流行，例如：猪大肠杆菌病、猪传染性胃肠炎，猪副伤寒，从而更好地提高动物生长性能。
本发明采用上述技术方案具有以下有益效果：
(1)本发明的重组罗伊氏乳酸杆菌，能够同时产生广谱抗菌物质罗伊氏素和乳铁蛋白肽，对多种仔猪肠道疾病具有抗病作用，可提高动物采食量、日增重和饲料利用率，调节肠道微生物区系，维护肠道菌群平衡，增强动物免疫机能及抗病能力，并促进消化吸收和合成代谢，无毒副、无耐药，同时存储期与抗逆性显著增加，可达到稳定、良好的抗生素替代效果。
(2)本发明中通过组成型强启动子HCE、增强子T7g10、肽聚糖水解酶信号肽等元件构成的pPG-T7g10-LFCA-EGFP，可分泌表达LFCA，无需额外添加诱导剂，能够解决规模化生产上的难题，并且降低人力物力成本。
(3)本发明提供了包含重组罗伊氏乳酸杆菌的微胶囊菌剂，存储期长，抗逆性强，肠道内定植后能有效抑制沙门氏菌等致病菌感染的综合性能较好。无耐药性的重组罗伊氏乳酸杆菌制剂作为仔猪饲用抗生素替代品，具有极高的实用价值和经济价值。
附图说明
图1所示为实施例1中目的基因T7g10-LFCA-EGFP的优化图谱。
图2所示为实施例1中pPG载体优化图谱。
图3所示为实施例1中构建重组表达质粒的流程示意图。
图4所示为实施例1中重组表达质粒pPG-T7g10-LFCA-EGFP的图谱。
图5所示为实施例1中重组菌表达蛋白Western blot鉴定图。
图6所示为实施例2中重组菌制剂在不同存储环境下活菌数变化曲线。
图7所示为实施例5中重组菌对断乳仔猪日增重(Daily gain)的影响图。从左至右依次为：CON组、LR-CON组、LR-LFCA组、AB组。*P<0.05vs CON；**P<0.01vs CON。
图8所示为实施例5中重组菌对断乳仔猪料重比(Feed conversion ratio)的影响图。
图9所示为实施例5中重组菌对断乳仔猪免疫器官指数的影响图。其中，A为脾脏免疫指数(Index of Spleen)；B为胸腺免疫指数(Index of Thymus)。从左至右依次为：CON组、LR-CON组、LR-LFCA组、AB组。*P<0.05vs CON；**P<0.01vs CON。
图10所示为实施例6中重组菌对感染猪霍乱沙门菌仔猪腹泻率(Diarrhea rate)变化的影响图。从上至下依次为：CON组、SC+LR-CON组、SC+LR-LFCA组、SC+AB、SC组。
图11所示为实施例6中重组菌对感染猪霍乱沙门菌仔猪日增重(Daily gain)变化的影响图。
图12所示为实施例6中仔猪感染猪霍乱沙门菌后血清IgG含量图。**P<0.01vsSC；#P<0.05vs SC+LR-LFCA；##P<0.01vs SC+LR-LFCA。
图13所示为实施例6中仔猪感染猪霍乱沙门菌后肠黏液中sIgA含量图。**P<0.01vs SC；*P<0.05vs SC；#P<0.05vs SC+LR-LFCA；##P<0.01vs SC+LR-LFCA。
图14所示为实施例6中仔猪感染猪霍乱沙门菌后肠黏液中紧密连接蛋白的基因转录水平。从左至右依次为：SC组、SC+CON组、SC+LFCA组、SC+AB组。**P<0.01vs SC；*P<0.05vsSC；#P<0.05vs SC+LR-LFCA；##P<0.01vs SC+LR-LFCA。其中，A表示仔猪感染猪霍乱沙门菌后十二指肠、空肠、回肠肠黏液中Claudin-1的基因转录水平。B表示仔猪感染猪霍乱沙门菌后十二指肠、空肠、回肠肠黏液中ZO-1的基因转录水平。
图15所示为实施例6中仔猪感染猪霍乱沙门菌后肠黏液中TLR4、Myd88和MLCK的基因转录水平。分组与显著性比对与图14相同。其中，A表示仔猪感染猪霍乱沙门菌后肠黏液中MLCK的基因转录水平；B表示仔猪感染猪霍乱沙门菌后肠黏液中TLR4的基因转录水平；C表示仔猪感染猪霍乱沙门菌后肠黏液中Myd88的基因转录水平。
图16所示为实施例6中猪霍乱沙门菌定量的标准曲线。
图17所示为实施例6中感染仔猪十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠肠黏液中猪霍乱沙门菌的数量。**P<0.01vs SC；*P<0.05vs SC；#P<0.05vs SC+LR-LFCA；##P<0.01vs SC+LR-LFCA。
图18所示为实施例6中仔猪感染猪霍乱沙门菌后肠黏液中IL-4,IL-2,IL-12,IL-6含量。**P<0.01vs SC；*P<0.05vs SC；#P<0.05vs SC+LR-LFCA；##P<0.01vs SC+LR-LFCA。其中，A表示仔猪感染猪霍乱沙门菌后十二指肠、空肠、回肠肠黏液中IL-4含量；B表示仔猪感染猪霍乱沙门菌后十二指肠、空肠、回肠肠黏液中IL-2含量。C表示仔猪感染猪霍乱沙门菌后十二指肠、空肠、回肠肠黏液中IL-12含量。D表示仔猪感染猪霍乱沙门菌后十二指肠、空肠、回肠肠黏液中IL-6含量。
图19所示为实施例6中仔猪感染猪霍乱沙门菌后的组织病理切片，分别表示仔猪感染猪霍乱沙门菌后十二指肠、空肠、回肠、肝脏、脾脏、肺脏的组织病理切片。
具体实施方式
除非另有定义，本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下面结合具体实施例详细描述本发明，这些实施例用于理解而不是限制本发明。
下述实施例中，重组罗伊氏乳酸杆菌的保藏编号为CCTCC M 2021232，其在本文中的名称还可以为：重组罗伊氏乳酸杆菌、重组菌、重组菌pPG-LFCA-E/LR-CO21、pPG-LFCA-E/LR-CO21。
猪源罗伊氏乳酸杆菌LR-CO21的保藏编号为CCTCC M 2019601，其在本文中的名称还可以为：猪源罗伊氏乳酸杆菌、罗伊氏乳酸杆菌、LR-CO21。
实施例1构建重组罗伊氏乳酸杆菌pPG-LFCA-E/LR-CO21
(1)获得目的基因：将增强子T7g10、肽聚糖水解酶信号肽、以及用linker连接的依据乳酸杆菌密码子偏嗜性优化的两段牛乳铁蛋白肽(LFcinB和LFampin)、EGFP标记基因串联合成并优化，命名为T7g10-LFCA-EGFP，见图1目的基因T7g10-LFCA-EGFP的优化图谱；
(2)构建重组表达质粒：将步骤(1)中T7g10-LFCA-EGFP插入到含有组成型强启动子HCE、大肠杆菌强终止子rrnB T1T2的优化后的无抗性标记的pPG载体中(见图2的pPG载体优化图谱)，获得重组表达质粒(载体)pPG-T7g10-LFCA-EGFP，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；构建重组表达质粒的流程示意图见图3，重组表达质粒pPG-T7g10-LFCA-EGFP的图谱见图4；
(3)获得重组菌：将步骤(2)中重组表达质粒经电转化导入猪源罗伊氏乳酸杆菌LR-CO21，构建表达牛乳铁蛋白肽的重组罗伊氏乳酸杆菌pPG-LFCA-E/LR-CO21。
(4)诱导表达乳铁蛋白肽。
重组菌pPG-LFCA-E/LR-CO21经37℃发酵培养16-18h，无需诱导表达及蛋白纯化。制备蛋白样品，Western blot鉴定发现，约在38kDa处出现特异性反应条带，图5为重组菌表达蛋白Western blot条带图，说明融合蛋白LFCA-E在重组菌中成功表达。
表1元件详细说明
Figure BDA0003025972260000101
实施例2制备重组罗伊氏乳酸杆菌制剂
采用复合微胶囊包覆工艺制备包含重组罗伊氏乳酸杆菌的制剂
(1)准备喷雾干燥保护剂：以脱脂乳+L-谷氨酸钠+PVPK-30+糊精+明胶(脱脂乳17.6％；L-谷氨酸钠18.55％；PVPK-30 25.5％；糊精22.1％；明胶14.5％)为壁材；
(2)将重组菌发酵液离心后的菌泥(发酵条件为：温度为37℃，时间为12h，pH为5.5。发酵过程中的pH值，通过NaOH或者氨水随时进行调控)与上述喷雾干燥保护剂混合，制成重组菌悬液；
(3)将重组菌悬液进行喷雾干燥(喷雾干燥参数：进口温度140℃；出口温度60℃，风机80℃)，得到重组菌微胶囊制剂。
高温喷雾干燥后微胶囊中重组菌成活率为83.56％，活菌数达到7.32×1012CFU/g。
实施例3验证重组菌制剂的存储稳定性
将实施例2制备的微胶囊化的重组罗伊氏乳酸杆菌分别于4℃真空，非真空；25℃真空，非真空；37℃真空，非真空6种环境存储，测试100天内各存储条件下的活菌数。
重组菌制剂在不同存储环境下活菌数变化曲线见图6，随着天数的增加，不同环境存储下的活菌数都有明显下降，但4℃，真空环境中活菌数最高仍达为3×108CFU/g。表明本发明提供的重组罗伊氏乳酸杆菌制剂具有较好的保存活性。
实施例4验证重组菌制剂的抗逆性能
一、耐酸碱耐胆盐实验
将重组菌(重组罗伊氏乳酸杆菌)及重组菌制剂经MRS(PH5.75)、MRS(pH2.0)、MRS(pH3.0)、MRS(pH4.0)、MRS(pH5.0)、MRS(pH6.0)、MRS(pH7.0)、MRS(pH8.0)、MRS(0.2％猪胆盐)、MRS(0.3％猪胆盐)、MRS(0.4％猪胆盐)、MRS(0.5％猪胆盐)孵育3h后，活菌计数测定重组菌及重组菌制剂对酸性条件及不同浓度猪胆汁盐的耐受性能。
测试结果见表2、表3。由结果可知，重组罗伊氏乳酸杆菌制剂可耐受0.5％浓度的的猪胆盐；在不同酸碱条件下具有较好的存活率。在相同环境下，相比于重组罗伊氏乳酸杆菌，重组罗伊氏乳酸杆菌制剂存活率更高，提高了对不良环境的抵抗能力。
表2重组罗伊氏乳酸杆菌制剂耐胆盐结果
Figure BDA0003025972260000111
注：同一列内上标字母不同表示组间差异显著(P<0.05)
表3重组罗伊氏乳酸杆菌制剂耐酸碱结果
Figure BDA0003025972260000112
注：同一列内上标字母不同表示组间差异显著(P<0.05)。
二、人工胃肠液耐受性实验
将重组菌培养至活菌数为1×108CFU/mL后，于人工胃液中孵育30min、60min、90min、120min后活菌计数；将菌悬液加入到人工肠液中孵育1h、2h、3h、4h后分别进行活菌计数，以各时间点的活菌数与加入胃液/肠液处理前活菌数的比值为存活率，进行重组菌及重组菌制剂人工胃肠液耐受性能的比较。
结果见表4、5。重组菌制剂可在人工胃液处理2h后具有良好的存活能力；重组菌制剂在人工肠液处理4h后仍可存活。在相同环境下，相比于重组罗伊氏乳酸杆菌，重组罗伊氏乳酸杆菌制剂存活率更高，提高了对不良环境的抵抗能力。
表4重组罗伊氏乳酸杆菌制剂人工胃液耐受性结果
Figure BDA0003025972260000121
注：同一列内上标字母不同表示组间差异显著(P<0.05)
表5重组罗伊氏乳酸杆菌制剂人工肠液耐受性结果
Figure BDA0003025972260000122
注：同一列内上标字母不同表示组间差异显著(P<0.05)。
实施例5验证重组菌对断乳仔猪生长性能的影响
一、对断乳仔猪日增重、料重比的影响
将54头28日龄断乳仔猪，随机分成4组：
第1组重组菌组(pPG-LFCA-E/LR-CO21，简称LR-LFCA)，饲喂基础日粮+1.2×1012CFU/kg表达乳铁蛋白肽的重组罗伊氏乳酸杆菌。
第2组为空菌组(LR-CON)，饲喂基础日粮+1.2×1012CFU/kg转入空载体质粒的罗伊氏乳酸杆菌。
第3组为抗生素组(AB)，饲喂基础日粮+硫酸新霉素，抗生素的添加量为每日口服200mg/kg的硫酸新霉素。
第4组为对照组(CON)，饲喂基础日粮+MRS液体培养基。
饲喂21d后，使断乳仔猪口服感染猪霍乱沙门菌10ml(4.72×109CFU/ml)，连续口服3d，设置观察期，连续观察7d。记录实验分组为重组菌组(SC+LR-LFCA)，空菌组(SC+LR-CON)，抗生素组(SC+AB)，感染组(SC)与对照组(CON)。
将断乳仔猪连续口服重组菌21d，检测重组菌对仔猪生长性能的影响。重组菌对断乳仔猪日增重(Daily gain)的影响如图7所示，与CON组相比，LFCA组极显著提高仔猪日增重(P<0.01)。重组菌对断乳仔猪料重比(Feed conversion ratio)的影响如图8所示，与CON组相比，LFCA组降低仔猪料重比(P<0.01)，LR-CON组与AB组、CON组差异不明显(P>0.05)。由此可得，在断乳仔猪饲料中添加表达乳铁蛋白肽的重组罗伊氏乳酸杆菌，可对断乳仔猪的生长性能起到一定的促进作用。
二、对断乳仔猪免疫器官指数的影响
在对断乳仔猪连续口服21d重组罗伊氏乳酸杆菌后，每组随机抽取三头仔猪，剖检取其脾脏与胸腺，检测四组仔猪的免疫器官指数。重组菌对断乳仔猪免疫器官指数的影响如图9所示。由图9中A得知，LR-LFCA组脾脏免疫器官指数相对于CON组显著增高(P<0.05)。LR-CON组、AB组与CON组无显著差异。由图9中B可得，LR-LFCA组胸腺免疫器官指数相对于CON组极显著增高(P<0.01)，LR-CON组相对于CON显著组增高(P<0.05)，AB组与CON组相比无明显差异(P>0.05)。表明重组菌可以促进仔猪的生长及免疫器官的发育。
实施例6断乳仔猪饲喂重组菌后抗猪霍乱沙门菌感染的效果分析
一、对感染后仔猪腹泻率的影响
在对断乳仔猪口服21d重组菌pPG-LFCA-E/LR-CO21后，对仔猪进行连续3d的猪霍乱沙门菌的感染，设置观察期，观察7d，统计各组的腹泻率，图10为重组菌对感染猪霍乱沙门菌仔猪腹泻率(Diarrhea rate)变化的影响图，图11为重组菌对感染猪霍乱沙门菌仔猪日增重(Daily gain)变化的影响图。
由图10可知，在断乳仔猪均感染猪霍乱沙门菌后，实验组与对照组均出现不同程度的发病症状。SC组仔猪精神沉郁状态及腹泻情况最为严重，出现水样腹泻。SC+LR-CON组与SC+LR-LFCA组仔猪状况呈现不同程度的减轻，SC+LR-LFCA组仔猪在感染6d时腹泻率为0，与SC组相比大幅度降低。
由图11可知，在断乳仔猪感染猪霍乱沙门菌后，SC+LR-LFCA，SC+LR-CON与SC组断乳仔猪日增重均呈现不同程度的降低。且SC+LR-LFCA组仔猪日增重降低幅度最小，达到接近抗生素组效果。
以上结果表明，在饲料中添加pPG-LFCA-E/LR-CO21，可显著降低断乳仔猪的腹泻率，提高断乳仔猪的日增重。证实了pPG-LFCA-E/LR-CO21对断乳仔猪感染猪霍乱沙门菌的保护作用。
二、对感染后仔猪肠黏膜sIgA以及血清中IgG的影响
分泌性sIgA，是在肠道黏膜免疫当中起到关键作用的是分泌型免疫球蛋白A(Secretory Immunoglobulin A,SIgA)，是阻止病原体入侵和定值黏膜的第一道防线。免疫球蛋白G(IgG)主要分布在血清和组织液中，是抗细菌、抗毒素和抗病毒抗体的主要组成部分，也是机体抗感染免疫的过程中的重要物质基础。
在对断乳仔猪口服21d重组菌pPG-LFCA-E/LR-CO21后，对仔猪进行连续3d的猪霍乱沙门菌的感染，观察7d后检测仔猪血清中IgG与十二指肠、空肠，回肠中sIgA含量。IgG抗体水平标准曲线为：y＝11.526x-0.6776；sIgA抗体水平标准曲线为：y＝22.712x-1.2917。
图12为仔猪感染猪霍乱沙门菌后血清IgG含量图，如图12可得，重组菌可以有效的提高免疫球蛋白的含量，其中SC+LR-LFCA组血清总IgG的抗体水平较SC组差异极显著(P<0.01)，和SC+AB组相比极显著提高IgG的抗体水平(P<0.01)。
图13所示为仔猪感染猪霍乱沙门菌后肠黏液中sIgA含量图，由结果图13可得，SC+LR-LFCA组十二指肠，空肠，回肠黏液中sIgA抗体水平较SC组差异极显著(P<0.01)，和SC+AB组相比极显著提高sIgA的抗体水平(P<0.01)。这表明重组菌pPG-LFCA-E/LR-CO21能够显著提高断乳期仔猪的黏膜免疫能力。
三、对感染后仔猪肠道紧密连接蛋白基因转录水平的影响
紧密连接蛋白Claudin-1和ZO-1位于肠上皮细胞膜外侧的顶部，与肠上皮细胞功能形成动态的选择性通透屏障，阻止潜在的有害物质和病原体进入机体。
利用Real-time PCR检测十二指肠、空肠，回肠组织中紧密连接蛋白Claudin-1和ZO-1的基因转录水平，图14为仔猪感染猪霍乱沙门菌后肠黏液中紧密连接蛋白的基因转录水平统计结果图，仔猪感染SC后回肠紧密连接蛋白ZO-1和Claudin-1的基因转录水平降低。与SC组相比，SC+LR-CON组和SC+LR-LFCA组仔猪十二指肠、空肠，回肠紧密连接蛋白ZO-1和Claudin-1的基因转录水平显著增加(*P<0.05；**P<0.01)，但是SC+LR-LFCA组优于SC+LR-CON组。且SC+LR-LFCA组与SC+AB组无明显差异(P>0.05)。
四、对感染后仔猪肠道TLR4、Myd88和MLCK基因转录水平的影响
肠上皮细胞与细胞之间的紧密连接蛋白的表达受到多种信号通路的调控，包括：Rho/Rho激酶通路、蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)通路、MLCK(myosin Light chainkinase，MLCK)通路和MAPK(mitogen-activated protein kinase,，MAPK)、TLR通路等。
经过Real-time PCR检测，仔猪感染猪霍乱沙门菌后肠黏液中TLR4、Myd88和MLCK的基因转录水平结果如图15中A、B、C所示。与SC组相比，SC+LR-LFCA组显著降低了致病菌导致的仔猪肠道TLR4基因的转录水平升高，进而降低了Myd88基因转录水平，最终降低了MLCK基因转录水平(*P<0.05，**P<0.01)。且SC+LR-LFCA组效果与SC+AB组相近，表明pPG-LFCA-E/LR-CO21可作为一种断乳仔猪的替代抗生素的有前途的饲料添加剂。SC+LR-CON组也可以降低致病菌导致的TLR4、Myd88和MLCK基因转录水平的升高，但是没有达到SC+LR-LFCA组水平。上述结果表明重组菌pPG-LFCA-E/LR-CO21组有效调控MLCK信号通路，断乳期仔猪口服pPG-LFCA-E/LR-CO21显著缓解了致病菌感染导致的这一现象。
五、对感染后仔猪肠道黏膜中猪霍乱沙门菌定殖量的影响
取实验室已构建好的猪感染猪霍乱沙门菌(Salmonella choleraesuis)标准质粒，以质粒拷贝数的对数为纵坐标，以Ct值为横坐标制作标准曲线，图16为猪霍乱沙门菌定量的标准曲线。Real-time PCR方法检测结果如图17，图17为感染仔猪十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠肠黏液中猪霍乱沙门菌的数量。
结果显示，SC+LR-LFCA组与SC+LR-CON组肠黏液中猪霍乱沙门菌数量极显著低于SC组(P<0.01)，SC+LR-LFCA与SC+LR-CON组相比前者效果更明显，在十二指肠(Duodenum)、空肠(Jejunum)，回肠(Ileum)中SC+LR-LFCA组极显著低于SC+LR-CON组(P<0.01)，结肠(colon)中SC+LR-LFCA组显著低于SC+LR-CON组(P<0.05)，盲肠(cecum)中SC+LR-LFCA组与SC+LR-CON组无明显差异。但SC+LR-LFCA组肠黏液中猪霍乱沙门菌数量低于SC+LR-CON组，且在十二指肠、空肠、回肠、结肠，盲肠中，SC+LR-LFCA组猪霍乱沙门菌定植量与SC+AB组相近且差异不明显(P>0.05)。
六、对感染后仔猪肠道炎症因子表达量的影响
按照剂量加入购自武汉酶免生物科技有限公司的IL-4、IL-2、IL-12、IL-6酶联免疫检测试剂盒中提供的标准品，读取OD450的数值，根据数值绘制免疫球蛋白浓度与OD450的阳性标准曲线，其中IL-4抗体水平标准曲线为：y＝41.377x-2.0495；IL-2抗体水平标准曲线为：y＝133.09x-17.711，IL-12抗体水平标准曲线为：y＝150.3x-22.778，IL-6抗体水平标准曲线为：y＝449.88x-201.6。图18所示为仔猪感染猪霍乱沙门菌后肠黏液中IL-4,IL-2,IL-12,IL-6含量。
如图18中A所示，与SC组相比，SC+LR-LFCA组十二指肠中仔猪肠黏液中IL-4含量差异不显著(P>0.05)，但有上升的趋势，空肠与回肠中仔猪肠黏液中IL-4含量极显著提高(P<0.01)，且空肠与回肠中SC+LR-LFCA组与SC+AB组无明显差异。
如图18中B所示，与SC组相比，SC+LR-LFCA组空肠中仔猪肠黏液中IL-2含量极显著降低(P<0.01)，回肠与十二指肠中仔猪肠黏液中IL-2含量无明显差异(P>0.05)。但在空肠中，SC+LR-LFCA组与SC+AB组IL-2含量差异不明显且含量较相近。
如图18中C所示，与SC组相比，SC+LR-LFCA组十二指肠，回肠中仔猪肠黏液中IL-12含量极显著降低(P<0.01)，空肠中仔猪肠黏液中IL-12含量显著降低(P<0.05)。且SC+LR-LFCA组与SC+AB组IL-12含量差异不明显且含量较相近(P>0.05)。
如图18中D所示，与SC组相比，SC+LR-LFCA组十二指肠、空肠，回肠中仔猪肠黏液中IL-6含量极显著降低(P<0.01)，且十二指肠中SC+LR-LFCA组与SC+AB组IL-12含量差异不明显且含量较相近(P>0.05)。
上述结果表明断乳期仔猪口服pPG-LFCA-E/LR-CO21可以提高仔猪肠黏液中抑炎因子的含量，降低仔猪肠黏液中促炎因子的含量，提高仔猪的抗炎能力。
七、对感染后仔猪肠黏膜组织病理学影响
在观察期结束后处死仔猪，剖检取出主要病变组织，肺脏、肝脏、脾脏和十二指肠，空肠，回肠。4％多聚甲醛固定做石蜡切片及HE染色以观察各组主要组织器官的病理组织学变化情况见图19，图19所示为仔猪感染猪霍乱沙门菌后的组织病理切片图。
由图19可知，SC+LFCA组与SC+AB组少量炎性细胞及嗜酸性粒细胞浸润，SC+LR-CON组及SC组固有层较多炎性细胞浸润，粘膜上皮细胞部分变性坏死。SC组、SC+LR-CON组、SC+AB组肺脏(lung)均出现不同程度的炎性细胞浸润与肺泡上皮细胞增生的情况，SC+LFCA组增生及浸润情况均较轻。SC组脾脏淋巴细胞轻度减少，SC+LR-CON组、SC+AB组未见病变。肝脏组织出现不同程度的肝细胞变性萎缩的情况，且SC组可见窦状隙可见少量嗜中性粒细胞浸润，肝细胞大面积变性萎缩，SC+AB组与SC+LFCA组部分细胞轻度变性。
上述结果显示，感染后仔猪空肠皱缩，回肠肠绒毛严重破损，重组菌组肠绒毛的破损情况较轻，保持了肠绒毛的完整性。空菌组一定程度上也缓解了SC对肠绒毛造成的损伤，但没有重组菌效果显著。表明重组菌可有效改善肠黏膜绒毛表面的破损情况。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。
<110> 东北农业大学
<120> 一种重组罗伊氏乳酸杆菌，制剂及其制备方法和应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pPG-T7g10-LFCA-EGFP核苷酸序列
<400> 1
tctagagatc tctccttcac agattcccaa tctcttgtta aataacgaaa aagcatcaat 60
taaaacggcg gcatgtcttt ctatattcca gcaatgtttt ataggggaca tattgatgaa 120
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tgttgagtaa agctcaagaa aaatttggca aaaataaaag tcgtgctgaa gctgcggcaa 600
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tcctggtcga gctggacggc gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg 720
agggcgatgc cacctacggc aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc 780
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accccgacca catgaagcag cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc 900
aggagcgcac catcttcttc aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt 960
tcgagggcga caccctggtg aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg 1020
gcaacatcct ggggcacaag ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc tatatcatgg 1080
ccgacaagca gaagaacggc atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac atcgaggacg 1140
gcagcgtgca gctcgccgac cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc 1200
tgctgcccga caaccactac ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac cccaacgaga 1260
agcgcgatca catggtcctg ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg 1320
acgagctgta caagtgataa cagatctggc tgttttggcg gatgagagaa gattttcagc 1380
ctgatacaga ttaaatcaga acgcagaagc ggtctgataa aacagaattt gcctggcggc 1440
agtagcgcgg tggtcccacc tgaccccatg ccgaactcag aagtgaaacg ccgtagcgcc 1500
gatggtagtg tggggtctcc ccatgcgaga gtagggaact gccaggcatc aaataaaacg 1560
aaaggctcag tcgaaagact gggcctttcg ttttatctgt tgtttgtcgg tgaacgctct 1620
cctgagtagg acaaatccgc cgggagcgga tttgaacgtt gcgaagcaac ggcccggagg 1680
gtggcgggca ggacgcccgc cataaactgc caggcatcaa attaagcaga aggccatcct 1740
gacggatggc ctttttgcgt ttctacaaac tctctcgagt aatgataagg tcacccctag 1800
agtcaactaa aagccactac tgtaatagtt aaaattgttt aaaagaggaa atcagtttgt 1860
tatcagttga tttcctcttt tatgtatcac tgttttcaga gtaagttcca atggctggca 1920
ttgctgttaa tatgacacta gatgatataa gttatcatgt taagctcgat ggtaagttgg 1980
gtttaattga tagaaaacat aatagttatg agatgcttga aatacctact aaaaatacat 2040
ttttaccaaa ttttatatga tcaagctcgg ccgagctgta ttctatagtg tcacctaaat 2100
cgtatgtgta tgatacataa ggttatgtat taattgtagc cgcgttctaa cgacaatatg 2160
tacaagccta attgtgtagc atctggctta ctgaagcaga ccctatcatc tctctcgtaa 2220
actgccgtca gagtcggttt ggttggacga accttctgag tttctggtaa cgccgttccg 2280
caccccggaa atggtcagcg aaccaatcag cagggtcatc gctagagagc tagcaagctt 2340
gtcgagtgca tattttcggc aatcttctca atgagatgct cttcagcatg ttcaatgatg 2400
tcgatttttt attaaaacgt ctcaaaatcg tttctgagac gttttagcgt ttatttcgtt 2460
tagttatcgg cataatcgtt aaaacaggcg ttatcgtagc gtaaaagccc ttgagcgtag 2520
cgtgctttgc agcgaagatg ttgtctgtta gattatgaaa gccgatgact gaatgaaata 2580
ataagcgcag cgtccttcta tttcggttgg aggaggctca agggagtttg agggaatgaa 2640
attccctcat gggtttgatt ttaaaaattg cttgcaattt tgccgagcgg tagcgctgga 2700
aaatttttga aaaaaatttg gaatttggaa aaaaatgggg ggaaaggaag cgaattttgc 2760
ttccgtacta cgacccccca ttaagtgccg agtgccaatt tttgtgccaa aaacgctcta 2820
tcccaactgg ctcaagggtt tgaggggttt ttcaatcgcc aacgaatcgc caacgttttc 2880
gccaacgttt tttataaatc tatatttaag tagctttatt gttgttttta tgattacaaa 2940
gtgatacact aattttataa aattatttga ttggagtttt ttaaatggtg atttcagaat 3000
cgaaaaaaag agttatgatt tctctgacaa aagagcaaga taaaaaatta acagatatgg 3060
cgaaacaaaa aggtttttca aaatctgcgg ttgcggcgtt agctatagaa gaatatgcaa 3120
gaaaggaatc agaacaaaaa aaataagcga aagctcgcgt ttttagaagg atacgagttt 3180
tcgctacttg tttttgataa ggtaatatat catggctatt aaaaatacta aagctagaaa 3240
ttttggattt ttattatatc ctgactcaat tcctaatgat tggaaagaaa aattagagag 3300
tttgggcgta tctatggctg tcagtccttt acacgatatg gacgaaaaaa aagataaaga 3360
tacatggaat agtagtgatg ttatacgaaa tggaaagcac tataaaaaac cacactatca 3420
cgttatatat attgcacgaa atcctgtaac aatagaaagc gttaggaaca agattaagcg 3480
aaaattgggg aatagttcag ttgctcatgt tgagatactt gattatatca aaggttcata 3540
tgaatatttg actcatgaat caaaggacgc tattgctaag aataaacata tatacgacaa 3600
aaaagatatt ttgaacatta atgattttga tattgaccgc tatataacac ttgatgaaag 3660
ccaaaaaaga gaattgaaga atttactttt agatatagtg gatgactata atttggtaaa 3720
tacaaaagat ttaatggctt ttattcgcct taggggagcg gagtttggaa ttttaaatac 3780
gaatgatgta aaagatattg tttcaacaaa ctctagcgcc tttagattat ggtttgaggg 3840
caattatcag tgtggatata gagcaagtta tgcaaaggtt cttgatgctg aaacggggga 3900
aataaaatga caaacaaaga aaaagagtta tttgctgaaa atgaggaatt aaaaaaagaa 3960
attaaggact taaaagagcg tattgaaaga tacagagaaa tggaagttga attaagtaca 4020
acaatagatt tattgagagg aggcatatca aatgaacttt aataaaattg atttagacca 4080
tggacttcat ttactgggtt taacttaaat atcaataata atagtaatta ccttctaccc 4140
attattacag caggaaaatt cattaataaa ggtaattcaa tatatttacc gctatcttta 4200
caggtacatc attctgtttg tgatggttat catgcaggat tgtttatgaa ctctattcag 4260
gaattgtcag ataggcctaa tgactggctt ttataatatg agataatgcc gactgtactt 4320
tttacagtcg gttttctaat gtcactaacc tgccccgtta gttgaagaag gtttttatat 4380
tacagctcca agatctccgc ttcttttatt tttttgt 4417

Claims (10)

1.一种重组罗伊氏乳酸杆菌，其特征在于，其能够表达乳铁蛋白肽。
2.根据权利要求1所述的重组罗伊氏乳酸杆菌，其特征在于，所述重组罗伊氏乳酸杆菌的保藏编号为CCTCC M 2021232。
3.权利要求1或2所述的重组罗伊氏乳酸杆菌的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
采用基因工程手段，将编码乳铁蛋白肽的核苷酸序列可操作性地导入罗伊氏乳酸杆菌中，获得表达乳铁蛋白肽的重组罗伊氏乳酸杆菌。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a)获得目的基因：将增强子T7g10、肽聚糖水解酶信号肽、乳铁蛋白肽、EGFP标记基因串联获得目的基因；
(b)构建重组表达载体：将步骤(a)中目的基因插入到pPG载体中，获得重组表达载体；
(c)获得重组菌：将步骤(b)中重组表达载体导入罗伊氏乳酸杆菌中，构建表达乳铁蛋白肽的重组罗伊氏乳酸杆菌，诱导表达乳铁蛋白肽。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(b)中重组表达载体的核苷酸序列包含或者由如下序列组成：
a)SEQ ID NO：1的核苷酸序列；
b)能够与SEQ ID NO：1的核苷酸序列或其互补序列进行杂交、且编码乳铁蛋白肽的核苷酸序列或其片段；
c)上述a)或b)的互补序列；或
d)由于遗传密码简并性从SEQ ID NO：1的核苷酸衍生的核苷酸序列。
6.一种制剂，其特征在于，包含权利要求1或2所述的重组罗伊氏乳酸杆菌，或权利要求3-5任一项所述的制备方法获得的重组罗伊氏乳酸杆菌。
7.根据权利要求6所述的制剂，其特征在于，所述制剂的剂型选自微胶囊剂、可溶性液剂、可溶性粉剂、可溶性粒剂、可湿性粉剂、可乳化粉剂、悬乳剂、水分散性颗粒剂、可乳化颗粒剂、水漂浮分散颗粒剂；
优选地，所述制剂为微胶囊菌剂。
8.根据权利要求7所述的制剂，其特征在于，采用喷雾干燥法获得微胶囊菌剂；所述喷雾干燥法中加入喷雾干燥保护剂；
优选地，所述喷雾干燥保护剂包括脱脂乳、L-谷氨酸钠、PVPK-30、糊精、明胶；
优选地，所述喷雾干燥保护剂，按重量分数计，包括脱脂乳15-20份、L-谷氨酸钠15-22份、PVPK-30 20-30份、糊精18-25份、明胶10-18份；
优选地，所述喷雾干燥保护剂，按重量分数计，包括脱脂乳17.6份、L-谷氨酸钠18.55份、PVPK-30 25.5份、糊精22.1份、明胶14.5份。
9.根据权利要求6-8任一项所述的制剂，其特征在于，所述制剂中重组罗伊氏乳酸杆菌的活菌数为6×1012CFU/g～8×1012CFU/g。
10.权利要求1或2所述的重组罗伊氏乳酸杆菌，或权利要求3-5任一项所述的制备方法获得的重组罗伊氏乳酸杆菌，或权利要求6-8任一项所述的制剂在制备动物饲料添加剂、提高动物生长性能和免疫力中的应用。
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