CN104945484B - 一种抗菌肽及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种抗菌肽，为人工设计合成的活性多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其分子量为1483.88Da，等电点为10.30。该抗菌肽在仔猪饲料中应用，主要用于抑菌、提高断奶仔猪日增重和采食量、降低料重比、降低断奶仔猪腹泻率，以及改善断奶仔猪肠道功能。与现有技术相比，本发明的抗菌肽具有分子量小、人工合成方便、杀菌作用强、细胞毒性低等优点，在仔猪饲料中应用能够显著改善仔猪肠道健康、提高仔猪的生长性能。

Description

一种抗菌肽及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种抗菌肽及其制备方法与应用，属于多肽技术领域。

背景技术

长期以来，抗生素作为生长促进剂应用于养猪业取得了非常好的效果，在生猪养殖中曾起了巨大作用，极大的促进了生猪养殖业的发展。然而，大量的科学研究表明，抗生素在生猪养殖业中长期大量的使用造成有害菌种产生耐药性和畜产品药物残留，极大的威胁人类的健康安全。因此，欧盟和韩国等发达国家已经全面禁止畜禽饲料中使用抗生素，寻找抗生素替代品便成为动物营养研究中的一大热点，特别是仔猪营养，因为仔猪免疫系统发育并不完善，很容易感染有害细菌而影响其生产性能，严重者甚至死亡。抗菌肽作为自然界生物中广泛存在的一种小分子活性多肽，具有抗菌谱广、热稳定性好和不易产生耐药性等特点，是替代抗生素重要的潜在物质。然而，天然来源的抗菌肽大多存在分子量大而具有免疫原性、抗菌活性不高、对动物细胞具有毒副作用或会导致溶血等缺陷，在一定程度上限制了抗菌肽在生猪养殖中的推广应用。通过分子设计和改造获得分子量小、抗菌活性高和对动物细胞无毒副作用的抗菌肽是促进抗菌肽在生猪养殖中应用的有效手段。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种抗菌肽及其制备方法与应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种抗菌肽，为人工设计合成的活性多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述的抗菌肽分子量为1483.88Da，等电点为10.30。

上述抗菌肽的制备方法，包括以下步骤：

1)抗菌肽的化学合成方法：按SEQ ID NO.1所示氨基酸序列，用全自动多肽合成仪(ABI433)合成抗菌肽全序列，并通过HPLC反相柱层析脱盐纯化；

2)纯化的抗菌肽分子量采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)测定，等电点使用等电聚焦电泳测定，氨基酸序列采用自动氨基酸序列测定仪进行解析。

本发明的抗菌肽在仔猪饲料中的应用。

所述的抗菌肽用于抑菌，尤其适用于对大肠杆菌、魏氏梭菌、沙门氏菌和枯草芽孢杆菌的抑菌。

所述的抗菌肽用于提高断奶仔猪日增重和采食量、降低料重比。

所述的抗菌肽用于降低断奶仔猪腹泻率。

所述的抗菌肽用于改善断奶仔猪肠道功能。

与现有技术相比，本发明的抗菌肽具有分子量小、人工合成方便、杀菌作用强、细胞毒性低等优点，在仔猪饲料中应用能够显著改善仔猪肠道健康、提高仔猪的生长性能。

附图说明

图1抗菌肽PD21的抗菌活性结果；

图2为抗菌肽PD21细胞毒性分析结果(猪小肠上皮细胞IPEC-1)；

图3为抗菌肽PD21对21日龄断奶仔猪生长性能的影响结果；

图4为抗菌肽PD21对21日龄断奶仔猪腹泻率的影响结果；

图5为抗菌肽PD21对21日龄断奶仔猪肠道形态结构的影响结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

抗菌肽的制备

1.抗菌肽的化学合成方法：按SEQ ID NO.1所示氨基酸序列，用全自动多肽合成仪(ABI433)合成抗菌肽全序列，并通过HPLC反相柱层析脱盐纯化；

2.纯化的抗菌肽分子量采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)测定，等电点使用等电聚焦电泳测定，氨基酸序列采用自动氨基酸序列测定仪进行解析。

本实施例得到抗菌肽含15个氨基酸残基，分子量为1483.88Da，等电点为10.30，其氨基酸序列为Lys Lys Leu Pro Asp Ile Leu Lys Ala Ala Met Ala Ala Ala Thr，以下均称为抗菌肽PD21。

实施例2

抗菌肽PD21抑菌实验

通过测定抗菌肽PD21最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)来反映其抗菌效果，最小抑菌浓度为检测不到细菌生长的最低样品浓度。采用二倍稀释法，具体方法如下：受试细菌接种于LB固体培养基上，然后于37℃培养箱中倒置培养。待菌落长出后，用一次性接种环挑取各受试细菌单菌落至LB液体培养基中，37℃培养箱中震荡培养至对数生长期。紫外分光光度计上检测菌液OD600，根据1 OD600＝1×10⁹CFU/mL将受试菌菌液用液体LB培养基稀释至2×10⁵CFU/mL。然后在无菌96孔板各孔中加入100μL LB液体培养基，然后在A1孔中加入100μL稀释到一定浓度的抗菌肽PD21样品(抗菌肽样品加入前用0.22μm微孔滤膜过滤除菌)，混匀后取100μL加入A2孔，A2孔混匀后再取100μL加入A3孔，依次倍比稀释，最后从A12孔吸出100μL弃去，至此抗菌肽PD21二倍浓度梯度样制成。向预先加入抗菌肽PD21的各孔中加入已稀释好的菌液100μL混匀，于37℃缓慢震荡培养16h，然后测定600nm处吸光值。结果计算：取检测不到细菌生长的孔和与之相邻的有细菌生长的孔中抗菌肽PD21浓度之和的平均值作为抗菌肽PD21最小抑菌浓度。测试结果如图1所示，其中PD21MIC：即抗菌肽PD21的最小抑菌浓度，所述结果为五次独立重复实验结果的平均值。从图1中可以看出抗菌肽PD21对大肠杆菌、魏氏梭菌、沙门氏菌和枯草芽孢杆菌均有非常强的杀伤作用。

实施例3

抗菌肽PD21的细胞毒性实验

猪小肠上皮细胞IPEC-1培养于含有5％太牛血清、200U/mL双抗(青霉素和链霉素各100U/mL)，5ug/L表皮生长因子(EGF)的HAM’S/F12培养基中培养至对数期，用磷酸盐缓冲液(HyClone)清洗三遍后，加入0.25％的胰蛋白酶消化至单个细胞，加入HAM’S/F12培养基后400g离心4分钟，弃上清后用新鲜的HAM’S/F12培养基悬浮细胞，调整至细胞密度为1×10⁶个/mL，然后往96孔细胞培养板每孔中加入200uL，待细胞贴壁后加入不同浓度抗菌肽PD21，至于二氧化碳培养箱(37℃、5％CO₂)培养24小时后，每孔中加入20uL CCK-8(碧云天)CCK-8溶液，继续培养2小时，然后用酶标仪检测450nm波长的吸光值。检测结果如图2所示，PD21-300：300ug/mL抗菌肽PD21；PD21-200：200ug/mL抗菌肽PD21；PD21-100：100ug/mL抗菌肽PD21；PBS：磷酸盐缓冲液(对照组)，所述实验结果为五次独立实验结果的平均值。从图2中可以看出，虽然抗菌肽PD21细胞毒作用随着其添加浓度而增加，但是PD21细胞很小。即使在300ug/mL的浓度下，抗菌肽PD21对猪小肠上皮细胞IPEC-1也存在很低(小于10％)的细胞毒副作用。

实施例4

抗菌肽PD21对断奶仔猪生长性能和肠道健康的影响

选取21日龄运输后断奶仔猪270头，采用单因子试验设计，按体重和性别随机分到3个处理组，对照组不添加抗菌肽PD21，PD21-40组日粮中添加抗菌肽PD2140mg/kg；；PD21-80组日粮中添加抗菌肽PD21 80mg/kg；，每组9个重复，每个重复10头猪，试验期10天。抗菌肽PD21对断奶仔猪生产性能、腹泻率和肠道形态结构的影响见图3-5，图3中，PD21-40组日粮中抗菌肽PD21的添加量为40mg/kg；PD21-80组日粮中抗菌肽PD21的添加量为80mg/kg。图4中，PD21-40组日粮中抗菌肽PD21的添加量为40mg/kg；PD21-80组日粮中抗菌肽PD21的添加量为80mg/kg。图5中，PD21-40组日粮中抗菌肽PD21的添加量为40mg/kg；PD21-80组日粮中抗菌肽PD21的添加量为80mg/kg。从图3的试验结果可以看出抗菌肽PD21可显著提高断奶仔猪日增重和采食量、降低料重比。从图4的试验结果可以看出抗菌肽PD21能够显著降低断奶仔猪腹泻率。从图5的试验结果可以看出抗菌肽PD21能够显著提高断奶仔猪空肠和回肠绒毛高度及绒毛高度与隐窝深度的比值，说明抗菌肽PD21能够显著改善断奶仔猪肠道功能。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种抗菌肽，其特征在于，为人工设计合成的活性多肽，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，所述的抗菌肽分子量为1483.88Da，等电点为10.30。

2.一种如权利要求1所述的抗菌肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)按SEQ ID NO.1所示氨基酸序列，用全自动多肽合成仪合成抗菌肽全序列，并通过HPLC反相柱层析脱盐纯化；

2)纯化的抗菌肽分子量采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱测定，等电点使用等电聚焦电泳测定，氨基酸序列采用自动氨基酸序列测定仪进行解析。

3.一种如权利要求1所述的抗菌肽在制备仔猪饲料中的应用。

4.根据权利要求3所述的一种抗菌肽的应用，其特征在于，所述的抗菌肽用于抑菌。

5.根据权利要求4所述的一种抗菌肽的应用，其特征在于，所述的抗菌肽用于对大肠杆菌、魏氏梭菌、沙门氏菌和枯草芽孢杆菌的抑菌。

6.根据权利要求3所述的一种抗菌肽的应用，其特征在于，所述的抗菌肽用于提高断奶仔猪日增重和采食量、降低料重比。

7.根据权利要求3所述的一种抗菌肽的应用，其特征在于，所述的抗菌肽用于降低断奶仔猪腹泻率。

8.根据权利要求3所述的一种抗菌肽的应用，其特征在于，所述的抗菌肽用于改善断奶仔猪肠道功能。