CN105941928A - 一种具有杀菌增加营养吸收功能的猪饲料 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种具有杀菌增加营养吸收功能的猪饲料，所述的猪饲料中添加多肽，其通过筛选，从海参中获得。该多肽可以采用酵母进行批量的表达，从而用于饲料添加剂中去，其具有防止多种细菌的生长的效果，特别是针对猪的疾病，同时添加该多肽的饲料能够显著的增加仔猪的体重，具有较好的效果。

Description

一种具有杀菌增加营养吸收功能的猪饲料

技术领域

本发明涉及一种饲料，特别是一种具有杀菌增加营养吸收的猪饲料。

背景技术

猪肉是人们日常食用量最大的肉类，为满足人们日常生活中对猪肉的需求量，人们很早就开始进行大规模的饲养猪，现代养猪技术和饲料配制技术的快速发展，而大规模的养殖就会导致猪的自身免疫力下降，猪的成活率较低，且经常出现猪生长不均匀的现象，而为解决这类问题，人们开始给猪喂养含有激素或者抗生素的饲料，长期食用后会导致了猪的体内存在有害物质，同时也不利于人体的健康。另外，也容易造成猪肉品质变得粗老、缺少风味、适口性差等现象。

目前，国内作为添加剂生产应用的主要是蚕抗菌肽AD-酵母制剂，大多数的畜禽试验也是围绕这种抗菌肽进行的。温刘发等(2001b)通过在断奶仔猪的饲料中用抗菌肽代替抗生素，对仔猪的腹泻、生产性能等作了比较。结果表明，抗菌肽在仔猪断奶应激期间抗腹泻效果不比抗生素差，适量的抗菌肽比抗生素促生长的效果要好，但高剂量的抗菌肽则降低了仔猪的生长，推测造成这一现象的是高剂量的抗菌肽破坏了猪肠道内微生物种群的平衡，降低了猪肠的免疫力。黄永彤等(200`4)发现，抗菌肽对肉鸡有促进生长和提高免疫力作用，与中草药抗生素相比，在出栏率、平均体重、饲料效率等方面均无显著性差异，且在出栏前3d停喂，抽检无残留。温刘发等(2001a)通过饮水方式给粤黄鸡添加抗菌肽的饲养试验结果表明，抗菌肽可促进小鸡生长和减少排泄物氮含量。陈晓生等(2005a)于肉鸭日粮中添加液体的蚕抗菌肽AD-酵母制剂发现，血清代谢激素的活动显著增强，IGF-1浓度升高，营养物质合成加强，尿素氮浓度显著降低，体内氮排出减少。陈晓生等(2005b)发现抗菌肽能使肉鸭的产肉率提高，腹脂率、内脏器官比重降低，在适当剂量时，使用效果与金霉素基本一致。陈晓生等(2005c)发现，添加抗菌肽制剂2ml/kg能有效提高肉鸭生产性能，尤其是小鸭阶段(I～2周龄)效果显著；23ml/kg添加量均可显著提高产肉率。从尿素氮和总蛋白浓度结果看，添加抗菌肽会使机体在蛋白质合成量变化不大的情况下减少机体蛋白质的分解代谢，从而促进生长。虽然天然抗菌肽作为食品和饲料添加剂具有众多传统抗生素所没有的优点，但天然抗菌肽在动物组织中含量很少，直接从血淋巴中纯化抗菌肽成本太高，得率低，工序繁琐，并且在应用中表现出单一天然抗菌肽抗菌活力低和抗菌谱窄等缺陷。这些都不利于抗菌肽在食品和饲料添加剂中的广泛应用。另外虽然这些抗菌肽肽能够抗菌，但是效果还不是非常强，杀菌效果有待进一步提高、进一步的完善和加强。

发明内容

本发明的目的是提供一种成本低、具有抗菌作用同时促进营养吸收的的多肽猪饲料。

本发明的目的之一在于提供抗菌多肽在制备猪饲料中的应用。

本发明另外提供一种抗菌多肽的筛选方法，所述方法包括：所述多肽的筛选步骤包括：

一、预测筛选：根据获得的海参的基因组序列，寻找其中具有潜在编码功能的小开放阅读框，将这些小开放阅读框分别翻译出对应的氨基酸序列，从中筛选抗菌肽；

二、制备抗菌肽：根据步骤一中预测筛选的抗菌肽序列，利用固相合成法合成其中的部分多肽，并且使C端酰胺化，N端不含有蛋氨酸，制备抗菌肽，并进行质谱鉴定；

三、抗菌性检测：将抗菌肽用蒸馏水溶解成浓度为2mg/ml，采用琼脂糖扩散法进行抗菌活性检测；

四、溶血性检测：利用羊血红细胞检测抗菌肽的溶血作用；

五、制备广谱抗菌多肽：最终筛选到的具有广谱抗菌功能的多肽。

进一步的，所述步骤三中琼脂糖扩散法中使用的菌株为大肠杆菌、金黄葡萄球菌、白色假丝酵母、猪痢疾密螺旋体、猪流行性腹泻病毒一种或几种组合。

进一步的，所述步骤五中制备的多肽，其序列为：SEQ ID NO：1-21任一所示。

本发明另外提供一种多肽的制备方法，可将本发明多肽对应的基因与表达载体可操作地连接，得到能够表达本发明多肽的重组表达载体，进而可以通过诸如电转化法等转基因方法，将所述表达载体导入宿主细胞，得到转基因的转化体，例如基因工程菌。

因此，本发明还包括含有编码上述抗菌多肽的表达载体，以及转化了该表达载体的宿主细胞。

本发明还提供了一种制备上述多肽的方法，其是将上述表达载体转化宿主菌，筛选阳性克隆，诱导表达所述抗菌多肽，并分离纯化。

本发明的有益效果在于：本方法制备得到的抗菌肽，具有高效的杀菌效果，同时还能够促进猪营养吸收能力，将其作为成为饲料，可以避免饲料中添加抗生素药物，具有很好的应用前景。

具体实施方式

实施例1抗菌多肽的获得

提取海参DNA，通过全基因组测序获得染色体基因组序列，根据抗菌肽分子量小的特点，首先利用小开放阅读框分析软件sORFfinder从基因组序列中筛选具有潜在编码功能的小开放阅读框(sORFs)。将这些sORFs分别翻译出对应的氨基酸序列，利用抗菌肽预测软件CAMP从sORFs中筛选抗菌肽。共预测到可能性超过95％的序列146余条。

二、多肽的抗菌活性鉴定

选择23个可能性超过98％的序列，委托上海生工利用固相合成法合成，并将C末端酰胺化，合成后经HPLC纯化，纯度达到99.56％，并经质谱分析鉴定。

合成多肽序列如下：

HSSJ-1：VCSQPSGEYVNTYCFHRRQGVDWDMWS(SEQ ID NO：1)

HSSJ-2：GKQHCDCGQVEIYPTRTSMIQWKPKPS(SEQ ID NO：2)

HSSJ-3：FWQIKTQQIPAAQPEDHTWVQHIYQLR(SEQ ID NO：3)

HSSJ-4：CMSHAWAQMGICWHSLRCMPRRQIQSH(SEQ ID NO：4)

HSSJ-5：CWDYWRRSSLGHQSCEKWHWHKWGPQY(SEQ ID NO：5)

HSSJ-6：ELWHDPKEIFCYFEVRWKALYAACIWM(SEQ ID NO：6)

HSSJ-7：PPGDRNWAWPVWFQFVPPISPYWSYCN(SEQ ID NO：7)

HSSJ-8：QPPPFWSHKPPKERDLWHLSCQWYWHI(SEQ ID NO：8)

HSSJ-9：YLFFWYCWNVEHWQTWKQWNLVQRCHS(SEQ ID NO：9)

HSSJ-10：SRTDPREGIHWMMRKQLGQYTPRNRFN(SEQ ID NO：10)

HSSJ-11：TWDPRWRVVYKKPERNTWEGVCQQQDS(SEQ ID NO：11)

HSSJ-12：IAITRTKWSSIESAWTHSYRRRGRIHH(SEQ ID NO：12)

HSSJ-13：DHHHMPGVPRDHPQFHAPKPSCEMFQI(SEQ ID NO：13)

HSSJ-14：HVNSLTRDFTYGPLHVLGGYYWSFDVF(SEQ ID NO：14)

HSSJ-15：VFTWDCRDFHTKPNQFSWSINMGRWKP(SEQ ID NO：15)

HSSJ-16：EQWLKRVIFNSQSHWPRPTKQLPLDHL(SEQ ID NO：16)

HSSJ-17：IIFIHLRWECNPSESQYHSCLCEPQAP(SEQ ID NO：17)

HSSJ-18：IHKNNCTFSRYWRWGKPYPSAWYTSKR(SEQ ID NO：18)

HSSJ-19：WSHHITNHLWKPTMYREVDLAFAQDEW(SEQ ID NO：19)

HSSJ-20：QIPQQRSQRDMRSHEFCAMIKPPQDYA(SEQ ID NO：20)

HSSJ-21：GWDDLYMCQCSHWKPFWLYYTIKPQWR(SEQ ID NO：21)

HSSJ-22：WRMHWFCPSPSPQVGPRIASKVWYMNK(SEQ ID NO：22)

HSSJ-23：CGEPHTTRNWHFHFSHVYLHLEAIIII(SEQ ID NO：23)。

三、抗菌性检测：

将多肽用蒸馏水溶解成浓度为2mg/ml，采用琼脂糖扩散法进行抗菌活性检测。琼脂糖扩散法中使用的菌株为大肠杆菌、金黄葡萄球菌、白色假丝酵母、猪痢疾密螺旋体、猪流行性腹泻病毒。菌株复苏后，接种于普通LB培养基37℃过夜培养后，(白色假丝酵母接种于PD培养基中30℃过夜培养，)分别取50微升菌液涂布于LB固体培养基。静置带菌液吸收后，分别加入浓度为2mg/ml的多肽溶液10微升。37℃培养16小时后，观察抑菌圈的有无和大小。同时观察抑菌圈一周内是否有变化，判断抑菌时间长短。猪流行性腹泻病毒接种到猴胚胎肾上皮细胞系在细胞维持液培养，所述细胞维持液为含4％(V/V)犊牛血清和2mmol/l D-氨基葡萄糖盐酸的培养基。达到一定的病毒滴度之后，取10ml培养液2mg/ml的多肽溶液10微升，通过病毒量的检测来判断时候具有杀死病毒的作用；猪痢疾密螺旋体采用肉汤培养基进行培养，达到一定的病毒滴度之后，取10ml培养液2mg/ml的多肽溶液10微升，通过镜检判断多肽时候具有杀死螺旋体的作用；结果如表2所示。

表2多肽抗菌活性分析结果

+：有抗菌活性；—无抗菌活性

从表二可以看出，HSSJ-1～23均具有较好的抗菌特性。

四、抗菌肽的溶血性检测

利用羊血红细胞检测抗菌肽的溶血作用；将浓度为2mg/ml的抗菌肽HSSJ-1～23溶液10微升分别滴加在血平皿表面，以蒸馏水做对照。置于37℃24小时以上，然后观察溶血圈的有无。结果所有受测抗菌肽均没有出现溶血圈。初步结果表明，所述抗菌肽HSSJ-1～23均不存在溶血毒性。

实施例2抗菌多肽的大批量的制备

大肠杆菌DH5a购自宝生物工程(大连)有限公司，甲醇酵母(Pichia pastoris)GSl15,表达载体pPIC9K购自Invitrogen公司。

将GSl 15单菌落接种于5mlY PD(I％酵母浸膏，2％胰蛋白胨，2％D-葡萄糖)液体培养基中，28～30℃过夜培养，取100μI转接到50ml YPD培养基中继续培养，当其0D600在1.1～1.3之间时停止培养，离心5000rpm 5min，收集菌体，然后分别用冰冷的去离子水和D-山梨醇洗涤2次，最后加入Iml预冷的IM D-山梨醇，按每管200μI分装成备用的甲醇酵母GSl15感受态细胞，立即使用或保存于-70℃。

根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列翻译获得相应的核酸序列分别和毕赤酵母表达载体pPIC9K上的限制性内切酶位点特性，通过人工合成，在核酸序列上下游分别增加EcoRI和NotI位点，用EcoRI和NotI双酶切，再与EcoRI和NotI双酶切过的pPIC9K相连，转化大肠杆菌DH5α，构建该抗菌多肽的毕赤酵母表达载体pPIC9K-HSSJ-1。提取质粒，经EcoRI和NotI双酶切、测序鉴定。证实该抗菌多肽毕赤酵母重组表达载体pPIC9K-(HSSJ-1)构建成功。

分别用限制性内切酶BGII1、SacI等将重组质粒线性化，取线性DNAlμg(大约5μI)(无菌)与200μI酵母GS115感受态细胞混合，然后注入预冷的0.2cm电击杯中，轻敲电击杯，使混合物落于电击杯底部，在电击仪上设定电压为1500V,电容为50μF,电流25mA,电功率25W，电阻200Ω，进行电穿孔操作。电穿孔后立即加入Iml预冷的IM D-山梨醇，混匀后从中吸出200μI立即涂布于含2.0mg/mlG418的MD D-山梨醇平板(1.34％YNB,4X 10_5％生物素，2％D-葡萄糖，IM D-山梨醇)，然后倒置平板于28～30℃培养，2～4天后出现转化子，筛选出高表达菌株。

随机挑取生长出的酵母菌落YPD培养，按照PiOmega公司酵母基因组提取试剂盒所述方法提取酵母基因组，并以其为模板进行PCR扩增HSSJ-1序列，PAGE电泳检测紫外灯下观察，鉴定转化结果，显示有目的条带存在。

挑取不同阳性克隆，分别接种于50ml BMGY培养基中，30℃，250rpm振荡培养至0D600在4～6之间时取出，1500g离心5min，收集酵母细胞，然后重悬于装有1/5体积的BMMY培养基三角瓶中继续培养，24小时以后，每天补加甲醇至终浓度为0.5～1％。持续培养6～10天,离心取上清。

直接取HSSJ-1酵母表达上清作SDS-PAGE，电泳显示有目的蛋白表达，经测定蛋白量可达到300mg/L左右。Western-blotting检测可见HSSJ-1表达条带。序列测定表明，该多肽序列与预测相一致。说明蛋白表达为可溶性表达。

通过批量大规模的酵母表达，可以大规模获得HSSJ-1多肽。

基于HSSJ-1相同的表达原理，同样可以批量获得HSSJ-(2～23)的多肽。

实施例3抗菌多肽的攻毒保护试验

毒株为大肠杆菌K88。

半数致死量(LD50)的测定将大肠杆菌K88接种于含有0.5％葡萄糖营养肉汤中，37℃培养24h,0D650值为0.80。分别以0.05,0.10,0.15,0.20,0.25mL剂量腹腔注射小白鼠，每种剂量接种5只，观察并记录死亡情况。随菌液接种量的增加，小白鼠死亡数呈线性增加。用Reed及Meunch法计算，该菌液对小白鼠的半数致死量(LD50)为0.15mL。

将小白鼠480只分为26组，分别为空白对照组、毒株对照组、空载体酵母上清对照组、23种抗菌肽酵母表达上清组，对小白鼠采用灌服方式，空载体、抗菌肽酵母上清组每次灌服酵母上清0.5mL/只，对照组每次灌服生理盐水0.5mL/只，攻毒前给药I个星期，每天2次。用测LD50同一代的毒株培养液(0D650值为0.768)，以一个LD50的剂量腹腔接种小白鼠，观察记录临床表现和死亡情况。

表3抗菌多肽的攻毒保护作用

从表3中可以看出，在酵母表达上清组保护率比毒株及空载体酵母上清对照组高，差异极显著(P<0.01)，说明抗菌多肽具有较强的攻毒保护作用。

实施例4抗菌多肽的急性毒性试验

1、抗菌多肽小鼠灌胃急性毒性试验

取健康昆明种小鼠46只，雄雌各半，夜间禁食12h后用50％(抗菌多肽最大可灌胃浓度)的抗菌多肽每种2只按0.5ml/10g(小鼠最大可灌胃量)单次灌胃。结果为，药后10日内受试小鼠均未出现任何毒性反应，试验期间动物无一死亡。

另取92只昆明种小鼠，随机分为A和B二个剂量组，每组46只小鼠。夜间禁食12h后用最大浓度最大可给药量一日内间隔5小时分别灌胃给药2和3次(每种肽对应2只小鼠)。每次灌胃容量均为每10g体重0.5ml。

A组:间隔5小时一日内灌胃给药2次，其日总用药量为25X2g/kg；

B组:间隔5小时一日内灌胃给药3次，其日总用药量为25X3g/kg。

药后严密观察10日。观察项目包括活动情况、精神状态、呼吸情况、皮毛情况、尿和粪便的性状及颜色，鼻、眼、口腔有无异常分泌物，有无镇静、兴奋、抽搐、紫绀等中毒现象，有无死亡。记录受试鼠的每日饲料消耗量。

结果为，试验期间A、B两组受试鼠活动、精神状态、呼吸情况、皮毛、尿和粪便的性状及颜色均未出现任何异常现象，鼻、眼、口腔无异常分泌物，无死亡发生。试验各组受试鼠的体重和每日饲料消耗量均无显著性差异。试验结束后处死小鼠，解剖观察未见受试鼠的心、肝、脾、肺、肾等重要脏器出现任何异常。

实施例5本发明的抗菌多肽在动物饲料中的实验

将240只180日龄仔猪随机分成A、B二组，A组为对照组，在整个试验期不做任何治疗处理，共10只；其中5只正常生长；5只攻毒后也不治疗。B组共230只，每个抗菌肽对应10只。试验前期以拌服致病性猪痢疾密螺旋体进行攻毒，连续饲喂2d，B组为添加本发明的抗菌多肽序列1-17，试验期间以在25mg/kg多肽的添加量添加到饲料中，早、晚各1次，连续拌服4d，4天后正常饲喂处理，整个试验周期为15d，观察记录猪的患病和死亡情况，试验期结束后进行数据统计分析。同时统计15d前后体重的增加量。见表4。

表4抗菌多肽对仔猪肠道疾病的影响

试验结果表明，抗菌多肽对致病菌引起的肠道疾病的防治效果比较好，能有效的取代抗生素的治疗作用，更有利于食品安全，是抗生素的理想替代品。同时，本发明的23种多肽均能够相对于对照大幅度的增加体重，这说明，本发明的多肽具有促进猪营养吸收的功效。

序列表

〈110〉杨洋

〈120〉一种具有杀菌增加营养吸收功能的猪饲料

〈210〉1

〈211〉27

〈212〉PRT

〈400〉HSSJ-1

VCSQPSGEYVNTYCFHRRQGVDWDMWS

〈210〉2

〈211〉27

〈212〉PRT

〈400〉HSSJ-2

GKQHCDCGQVEIYPTRTSMIQWKPKPS

〈210〉3

〈211〉27

〈212〉PRT

〈400〉HSSJ-3

FWQIKTQQIPAAQPEDHTWVQHIYQLR

〈210〉4

〈211〉27

〈212〉PRT

〈400〉HSSJ-4

CMSHAWAQMGICWHSLRCMPRRQIQSH

〈210〉5

〈211〉27

〈212〉PRT

〈400〉HSSJ-5

CWDYWRRSSLGHQSCEKWHWHKWGPQY

〈210〉6

〈211〉27

〈212〉PRT

〈400〉HSSJ-6

ELWHDPKEIFCYFEVRWKALYAACIWM

〈210〉7

〈211〉27

〈212〉PRT

〈400〉HSSJ-7

PPGDRNWAWPVWFQFVPPISPYWSYCN

〈210〉8

〈211〉27

〈212〉PRT

〈400〉HSSJ-8

QPPPFWSHKPPKERDLWHLSCQWYWHI

〈210〉9

〈211〉27

〈212〉PRT

〈400〉HSSJ-9

YLFFWYCWNVEHWQTWKQWNLVQRCHS

〈210〉10

〈211〉27

〈212〉PRT

〈400〉HSSJ-10

SRTDPREGIHWMMRKQLGQYTPRNRFN

〈210〉11

〈211〉27

〈212〉PRT

〈400〉HSSJ-11

TWDPRWRVVYKKPERNTWEGVCQQQDS

〈210〉12

〈211〉27

〈212〉PRT

〈400〉HSSJ-12

IAITRTKWSSIESAWTHSYRRRGRIHH

〈210〉13

〈211〉27

〈212〉PRT

〈400〉HSSJ-13

DHHHMPGVPRDHPQFHAPKPSCEMFQI

〈210〉14

〈211〉27

〈212〉PRT

〈400〉HSSJ-14

HVNSLTRDFTYGPLHVLGGYYWSFDVF

〈210〉15

〈211〉27

〈212〉PRT

〈400〉HSSJ-15

VFTWDCRDFHTKPNQFSWSINMGRWKP

〈210〉16

〈211〉27

〈212〉PRT

〈400〉HSSJ-16

EQWLKRVIFNSQSHWPRPTKQLPLDHL

〈210〉17

〈211〉27

〈212〉PRT

〈400〉HSSJ-17

IIFIHLRWECNPSESQYHSCLCEPQAP

〈210〉18

〈211〉27

〈212〉PRT

〈400〉HSSJ-18

IHKNNCTFSRYWRWGKPYPSAWYTSKR

〈210〉19

〈211〉27

〈212〉PRT

〈400〉HSSJ-19

WSHHITNHLWKPTMYREVDLAFAQDEW

〈210〉20

〈211〉27

〈212〉PRT

〈400〉HSSJ-20

QIPQQRSQRDMRSHEFCAMIKPPQDYA

〈210〉21

〈211〉27

〈212〉PRT

〈400〉HSSJ-21

GWDDLYMCQCSHWKPFWLYYTIKPQWR

〈210〉22

〈211〉27

〈212〉PRT

〈400〉HSSJ-22

WRMHWFCPSPSPQVGPRIASKVWYMNK

〈210〉23

〈211〉27

〈212〉PRT

〈400〉HSSJ-23

CGEPHTTRNWHFHFSHVYLHLEAIIII

Claims (3)

1.一种具有杀菌增加营养吸收功能的猪饲料，其特征在于：其包括常规饲料以及特定多肽。

2.如权利要求1所述的猪饲料，其特征在于：所述多肽序列如SEQ ID NO：1-23任一项所示。

3. SEQ ID NO：1-23任一项所示的多肽在制备用于防治疾病感染的饲料中的应用。