CN1366048A

CN1366048A - 一种绿色添加剂生物反应器及其构建方法和应用

Info

Publication number: CN1366048A
Application number: CN01129831A
Authority: CN
Inventors: 钟安清; 秦智锋; 储成才
Original assignee: SANFANGYUAN INFORMATION TECHN CO Ltd SHENZHEN
Current assignee: SANFANGYUAN INFORMATION TECHN CO Ltd SHENZHEN
Priority date: 2001-10-27
Filing date: 2001-10-27
Publication date: 2002-08-28

Abstract

本发明公开了一种绿色添加剂生物反应器及其构建方法和应用,通过目的基因的同源性分析、目的基因的人工修饰、目的基因的人工合成、基因重组、重组质粒转化小球藻等过程构建了可生产具有生物活性的抗畜禽病毒蛋白和促生长因子的生物反应器,用此生产的畜禽饲料添加剂具有增强对营养物质的吸收、改善肠道消化功能、提高乳奶产生和提高畜禽的瘦肉比例,抵抗动物疫病的侵袭等功效,解决了常规添加剂的耐药性和药物残留等问题,具有工艺简单、操作方便、技术效果好和对动物促生长、抗病毒作用明显等优点,广泛适用于各类动物的促生长和抗病毒侵袭之用。

Description

一种绿色添加剂生物反应器及其构建方法和应用

技术领域本发明涉及一种绿色添加剂生物反应器及其构建方法和应用，更具体地说，涉及一种利用小球藻生产抗畜禽病毒蛋白、促生长因子的方法及其应用。

背景技术众所周知，小球藻繁殖迅速，每20小时增长4倍。小球藻含有丰富的营养物质：包括氨基酸(有19种游离氨基酸，其中8种为人体必需氨基酸)、核酸、多肽、蛋白质、维生素、矿物质、多糖、植物激素和神秘成分等生物活性物质。另含特有的细胞活性物质----小球藻生长因子(Chlorella Growth Factor，简称CGF，以下同)，其生理功能被称之为“类荷尔蒙”，具有活化人体细胞功能，能使儿童生长发育加快，且具有激活淋巴细胞，增强机体免疫能力，抵抗外来疾病的入侵，促进人体受伤组织修复，减少或减轻因有机物、重金属等的中毒反应，还能防治胃溃疡、高血压和心血管等疾病。实验证明，小球藻喂养被注射癌细胞的老鼠，显示出很强的抗癌能力。

在现有技术中，用细菌、哺乳动物细胞作表达载体来表达外源蛋白已有不少报道，但将促进动物生长的PGH基因、PEGF基因、口蹄疫VP1抗原基因、猪传染性胃肠炎病毒抗原人工修饰基因、猪呼吸与生殖综合症病毒抗原基因、禽流感病毒的主要免疫原性蛋白HA基因、鸡新城疫病毒的主要免疫原性蛋白F基因、鸡传染性法氏囊病毒的主要免疫原性蛋白VP2基因置于小球藻上表达尚未见报道。

现有的动物促生长添加剂中，有化学合成的促生长添加剂，如β-激动剂(俗称“瘦肉精”)和生长激素，但因其是人工合成，具有顽固的热稳定性，使用后会在动物组织中形成累积性残留。由于这类化合物具有口服活性，违法使用会给消费者带来一些不良影响(如头晕眼花，呕吐等症状)，正受到国家的“封杀”。此外，市场上还有一些抗生素型促生长素，它们通过抑制肠道内的有害细菌而达到促生长的目的，由于它们属于抗生素，因此，必然面临耐药性和药物残留的问题。用促进动物生长的PGH基因、PEGF基因修饰小球藻后，其表达产物具有增强对营养物质的吸收，如糖、氨基酸和电解质，改善肠道消化功能，从而促进动物的生长，减少胰岛素的分泌、促进蛋白和糖的生成，减少脂肪沉积、促进脂肪溶解，从而提高畜禽的瘦肉比例，提高饲料的转化率，无毒、无副作用，在动物组织无残留，是一种典型的绿色环保型促生长添加剂。

现有技术用植物作表达载体来表达外源蛋白抗原并激发特异性的免疫应答，已有不少报道。但用基因修饰的小球藻开发抗病毒蛋白未见成功报道。

口蹄疫、猪传染性胃肠炎、猪呼吸与生殖综合症、禽流感、鸡新城疫、鸡传染性法氏囊炎是影响畜禽生产工业的主要疾病。现有的预防技术中，上述疾病的预防免疫有用死苗的，也有用弱毒苗的。但现有的免疫技术有诸多不完善因素：一是生产疫苗的厂家具有散毒的危险，二是弱毒苗具有“返祖”现象，更重要的是人为的传播了其他疾病，给病毒病的根除带来极大的困难。三是灭活苗和弱毒苗免疫的程序复杂，成本较高，免疫不确实。因此，要彻底地控制和消灭上述疾病病，必须开发一种安全、高效、低廉的替代品。研究表明：AIV的结构蛋白HA、NDV的结构蛋白F、IBDV的结构蛋白VP2携有各自病毒典型的抗原决定簇，可诱发IgA/IgG的产生，两者均可保护试验或本体动物抵抗强毒攻击。FMDV的结构蛋白VP1携有典型的抗原决定簇，可诱发中和抗体的产生。用VPI蛋白或其部分氨基酸合成肽免疫动物，均可保护试验或本体动物抵抗强毒攻击。

发明内容本发明的目的在于提供一种能够生产促进动物生长因子、抗动物疾病病毒蛋白的绿色添加剂生物反应器及其构建方法和应用。

为了达到上述目的，本发明提供了如下的技术方案：构建一种绿色添加剂生物反应器，该反应器由小球藻、信号肽基因和免疫原性基因、目标基因及基因修饰后的小球藻表达的具有生物活性的产物组成，其中的信号肽基因和免疫原性基因为：GGATCCATGGGGAAGMCGGCAGCCTGTGCTGCTTCTCTCTGCTGCTGCTGCTGCTTCTCGCCGGGTTGGCGTCCATGAATAAAGTAAAATTTTATGTTTTATTTACGGCGTTACTATCCTCTCTATGTGCACACGGAGCTCCCGGGTATGCACATGGAACACCTCAAAATATTACTGATTTGTGTGCAGAATACCACMCACACAAATACATACGCTAAATGATAAGATATTTTCGTATACAGAATCTCTAGCTGGAAAAAGAGAGATGGCTATCATTACTTTTAAGAATGGTGCAACTTTTCAAGTAGAAGTACCAGGTAGTCAACATATAGATTCACAAAAAAAAGCGATTGAAAGGATGAAGGATACCCTGAGGATTGCATATCTTACTGAAGCTAAAGTCGAAAAGTTATGTGTATGGAATAATAAAACGCCTCATGCGATTGCCGCAATTAGTATGGCAAATTCTAGA

其目标基因包括下列基因之一种：

(1)促进动物生长基因PGH基因：ATCTAGAATGGCCTTCCCGGCCATGCCCCTGTCGAGCCTGTTCGCCAACGCCGTGCTGCGCGCCCAGCACCTGCACCAGCTGGCCGCCGACACGTACAAGGAGTTCGAGCGCGCCTACATCCCGGAGGGTCAGCGCTACTCGATCCAGAACGCCCAGGCCGCCTTCTGCTTCTCGGAGACGATCCCGGCGCCGACGGGTAAGGACGAGGCCCAGCAGAGGTCGGACGTGGAGCTGCTGCGCTTCTCGCTGCTGCTGATTCAGTCGTGGCTGGGGCCCTTCATCCGCTGAGTCGACA

(2)促进动物生长的PEGF基因：TGGGGAAGAACGGCAGCCTGTGCTGCTTCTCTCTGCTGCTGCTGCTGCTTCTCGCCGGGTTGGCGTCCAACTCTTACTCTGAGTGCCCGCCGAGTCATGACGGGTACTGCCTTCACGGTGGTGTTTGTATGTACATTGAAGCTGTTGATTCTTACGCTTGCAACTGCGTTTTCGGTTACGTTGGTGAAAGATGCCAACATAGAGACCTTAAGTGGTGGGAACTTAGACATCATCATCATCATCAT

(3)口蹄疫VP1抗原基因：ACCACCTCCACAGGTGAGTCGGCTGACCCTGTGACTGCCACTGTTGAGAACTACGGTGGTGAGACACAGGTCCAGAGACGCCAACACACGGATGTCTCGTTCATATTAGACAGATTTGTGAAAGTAACACCAAAAGACCAAATTAATGTGTTGGACCTGATGCAAACCCCTGCACACACTTTGGTAGGCGCGCTCCTCCGTACTGCCACCTACTACTTCGCAGACCTAGAAGTGGCAGTGAAACACGAGGGGAACCTTACCTGGGTCCCGAATGGGGCGCCCGAGACAGCGTTGGACAACACCACCAATCCAACGGCTTACCACAAGGCACCGCTCACCCGGCTTGCACTGCCTTACACGGCACCACACCGTGTCTTGGCTACTGTTTACAACGGGAACTGCAAGTATGGCGAGAGCCCCGTGACCAATGTGAGAGGTGACCTGCAAGTATTGGCTCAGAAGGCGGCAAGAACGCTGCCTACCTCCTTCAATTACGGCGCCATCAAAGCCACTCGGGTGACTGAACTGCTTTACCGCATGAAGAGGGCCGAAACATACTGCCCCCGGCCTCTTTTGGCTATTCACCCAAGCGAAGCTAGACACAAACAAAAGATTGTGGCGCCTGTGAAACAGCTTTTG

(4)口蹄疫病毒抗原多肽链：TCTAGAACCAACAACGTCCGCGGTGACCTTCAGGTCCTCGCTCAGAAGGCCGAGCGCACCCTCCCACATCATAAGCAGCGGATCGTTGCCCCCGCAAAACAGCTCCTCACCAACAACGTCCGCGGTGACCTTCAGGTCCTCGCTCAGAAGGCCGAGCGCACCCTCCCATGAGTCGAC

(5)猪传染性胃肠炎病毒人工修饰抗原基因：

1 tctagaacca tggctttctt gaagagtttc ccattctacg ctttcttgtgcttcggacaa

61 tacttcgtgg ctgtgactca cgcagacaac ttcccatgct ctaagttgac caacaggacc

121 atcggtaatc aatggaactt gatcgagacc ttcttgttga actactcatc taggttgcca

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961 ccaagcttcg aggaggcagc ttctacattc tgcttcgagg gagctggcttcgaccaatgc

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1801 ttcaagcgaa actgcacgga ccaccaccat caccatcact aaccgcggtggagctc

(6)猪呼吸与生殖综合症病毒抗原基因：Atgttggggaaatgcttgaccacgggctgttgctcgcgattgctttctttgtggtgtatcgtgccgttctgttttgctgtgctcgtcaacgccaacagcaacagcagctctcattttcagttgatttataacttgacgctatgtgagctgaatggcacagattggctggctaacaaatttgactgggcagtggagacttttgtcatctttcccgtgttgactcacattgtttcctatggggcactcaccaccagccatttccttgacacagttggtctggtcactgtgtccaccgccgggttttatcacgggcggtatgtcttgagtagcatctacgcggtctgtgctctggctgcgttgattttgcttcgtcattaggcttgcgaagaactgcatgtcctggcgctactcttgtaccagatataccaacttccttctggacactaagggcagactctatcgttggcggtcgcccgttattgtagagaaagggggtaaggttgaggtcgagggtcacctgatcgacctcaaaagagttgtgcttgatggttccgtggcaacccctttaaccagagtttcagcggaacaatggggtcgtctctag

(7)禽流感病毒的主要免疫原性蛋白基因即HA基因：ttgaattcttgaattcatggaaagaacagtgcttcttcttgcaacagtcagtcttgttaaaagtgatcagatttgcattggttaccatgcaaacaactcgacagagcaggttgacacaataatggaaaagaatgttactgttacacatgcccaagacatactggaaaggacacacaacgggaagctctgcgatctaaatggagtgaagcctctcattttgagggattgtagtgtagctggatggctcctcggaaaccctatgtgtgacgaattcatcaatgtgccggaatggtcttacatagtggagaaggccagtccagccaatgacctctgttatccagggaatttcaacgactatgaagaactgaaacacctattgagcagaataaaccattttgagaaaattcagatcatccccaaaagttcttggtccaatcatgatgcctcatcaggggtgagctcagcatgtccataccttgggaggtcctcctttttcagaaatgtggtatggcttatcaaaaagaacagtgcatacccaacaataaagaggagctacaataataccaaccaagaagatcttttggtactgtggggggttcaccatcctaatgatgcggcagagcagacaaagctctatcaaaatccaaccacctacatttccgttggaacatcaacactgaaccagagattggttccagaaatagctactagacccaaagtaaacgggcaaagtggaagaatggagttcttctggacaattttaaagccgaatgatgccatcaatttcgagagtaatggaaatttcattgctccagaatatgcatacaaaattgtcaagaaaggggactcaacaattatgaaaagtgaattggaatatggtaactgcaacaccaagtgtcaaactccaatgggggcgataaactctagtatgccattccacaacatacaccccctcaccatcggggaatgccccaaatatgtgaaatcaaacagattagtccttgcgactggactcagaaatacccctcaaagagagagaagaagaaaaaagagaggactatttggagctatagcaggttttatagagggaggatggcagggaatggtagatggttggtatgggtaccaccatagcaatgagcaggggagttgctactctgcagacaaagaatccactcaaaaggcaatagatggagtcaccaataaggtcaactcgatcattaacaaaatgaacactcagtttgaggccgttggaagggaatttaataacttggaaaggaggatagagaatttaaacaagaagatggaagacggattcctagatgtctggacttacaatgctgaacttctggttctcatggaaaatgagagaactctcgactttcatgactcaaatgtcaagaacctttacgacaaggtccgactacagcttagggataatgcaaaggagctgggtaatggttgtttcgaattctatcacaaatgtgataatgaatgtatggaaagtgtaaaaaacggaacgtatgactacccgcagtattcagaagaagcaagactaaacagagaggaaataagtggagtaaaattggaatcaatgggaacttaccaaatactgtcaatttattcaacagtggcgagttccctagcactggcaatcatggtagctggtctatctttatggatgtgctccaatggatcgttacaatgcagaatttgcatttaaatttgtgagttcagattgtagttaaaaacaccctgacgtcgagacgtacc

(8)新城疫病毒的主要免疫原性蛋白基因即F基因：ttgaattcatgggccccaaatcttctaccaatgtcccagcacctctgatgctgaccgtcaggattgcgctggcactgagctgtgtccgtctgacaaattctctcgatggaaggcctcttgcagctgcagggattgtagtaacgggagacaaagcagtcaacatatacacctcatctcagacagggtcaataatagtcaagttactcccaaatatgcctaaggataaagaggcgtgtgcaaaagccccgttggaggcatacaacaggacactgactgctttgctcaccccccttggtgattctatccgcaggatacaagagtctgcgactacgtccggaggaaggaggcagagacgctttataggtgccattatcggcagtgtagctcttggggttgccacagctgcccagataacagcagcctcagctctgatacaagccaaccagaatgctgccaacatcctccggcttaaagagagcattgctgcaactaatgaagctgtacatgaagtcactgacggattatcgcaactagcagtggcagttgggaagatgcagcagtttgttaatgaccagtttaataacacagctcaggaattggactgtataaaaattacacagcaggttggtgtagaactcaacctgtacctaactgaattgactacagtattcgggccacaaatcacttcccctgccttaactcagctgactatccaggcgctttacaatctagctggtggtaagatggattatttgttgactaagttaggtgttgggaacaaccaactcagctcattaatcggtagcggcttgatcaccggtaaccctattctgtacgattcacagactcaactcttaggtatacaggtaactttaccctcagtcggtaacctaaataatatgcgtgctacctacttggagaccttgtctgtaagcacaaccaagggatttgcctcagcacttgtcccaaaagtggtgacacaggtcgggtctgtgatagaggaacttgacacctcatactgtgtagagaccgatttggatttatattgtacaagaatagtgacattccctatgtctcctggtatttattcctgtctgagcggtaatacatcagcttgcatgtattcaaagactgaaggtgcacttactacgccatatatgactatcaagggctcagttattgccaattgcaagataacaacatgcagatgtgcagaccctccgggtatcatatcgcaaaattatggagaagctgtgtctctaatagataggcactcatgcaatgtcttatccttagacgggataactttgaggctcagtggagaatttgacgtaacttatcaaaagaatatctcaatattagattctcaggtaatagtgacaggcaatctcaatatctcaactgaacttgggaatgtcaacaactcgataagtaatgctttggataagttagaggaaagcaatagcaaacttgacaaagtcaatgtcaagctgaccggcacgtctgctctcattacctatatagttttaactatcatatctcttgtttgtggtatacttagcctggttctagcatgctatctgatgtataagcaaaaggcgcaacaaaagaccttattatggcttgggaataataccctaaatcagatgagggccactacaagaatctgaacacagagacgtccc

(9)法氏囊病毒的主要免疫原性蛋白基因即VP2基因：ttgaattcatgacaaacctgcaagatcaaacccaacagattgttccgttcatacggagccttctgatgccaacaaccggaccggcgtccattccggacgacaccctggagaagcacactctcaggtcagagacctcgacctacaatttgactgtgggggacacagggtcagggctaattgcctttttccctggattccctggctcaattgtgggtgctcactacacactgcagagcaatgggaactacaagttcgatcagatgctcctgactgcccagaacctaccggccagctacaactactgcaggctagtgagccggagtctcacagtaaggtcaagcacactccctggtggcgtttatgcactaaacggcaccataaacgccgtgaccttccaaggaagcctgagtgaactgacagatgttagctacaatggattgatgtctgcaacagccaacatcaacgacaaaattgggaacgtcctagtaggggaaggggtcaccgtcctcagcttacccacatcatatgatcttgggtatgtgagacttggtgaccccatacccgctatagggcttgacccaaaaatggtagcaacatgtgacagcagtgacaggcccagagtctacactataactgcagccgatgattaccaattctcatcacaataccaacaaggtggggtaacgatcacactgttctcagccaacattgatgccatcacaagcctcagcgttgggggagagcttgtgtttaaaacaagcgtccacagccttgtactgggcgccaccatctaccttataggctttgatgggactgcggtaatcactagagctgtagccgcaaacaatgggctgacgaccggcatcgacaatcttatgccattcaatcttgtgattccaaccaacgagataacccagccgatcacatccatcaaactggagatagtgacctccaggagtggtggtcaggcaggggatcagatgtcatggtcggcaagtgggagcctagcagtgacgatccatggtggcaactatccaggggccctccgtcccgtcacactagtagcctacgaaagagtggcaacaggatctgtcgttacgctcgccggggtgagcaacttcgagctgatcccaaatcctgaactagcaaagaacctggttacggaatacggccgatttgacccaggggccatgaactacacaaaattgatactgagtgatggggaccgtcttggcatcaagaccgtctggccaacaagggagtacacagactttcgtgagtacttcatggaggtggccgacctcaactctcccctgaagattgcaggagcatttggcttcaaagacataatccgggccataagggacgtccc

本发明构建所述的绿色添加剂生物反应器的方法，包括基因重组、质粒构建、小球藻转化和重组蛋白的制备，其具体过程为：(1)插入质粒载体：采用分子生物学的方法人工合成目标基因，使目标基因含有启动子(Ubiquitin)和终止子，基因经过修饰成为小球藻所偏嗜的密码子，前端加信号肽基因(TMVΩ)，片段两端为内切酶位点(XbaI和sal I)，用相应的内切酶切表达载体和目的片段，T4连接酶连接重组，构建重组表达载体，然后(2)将上述重组质粒转入小球藻中进行表达，获得基因修饰小球藻：将重组质粒转化大肠杆菌(Escherichia coli Top10)进行大量繁殖，抽提重组质粒后，对生长至第4天的小球藻进行渗透处理，用6.0～9.0Kb的高脉冲电压，0.05～0.2s的短脉冲时间和多次脉冲(2ⁿ)的条件进行电击转化，或抽提重组质粒后包裹金弹，用6～9cm的子弹与靶细胞距离进行基因枪轰击渗透处理的小球藻，通过G418筛选基因修饰小球藻。

本发明的过程包括：目的基因的同源性分析、目的基因的人工修饰、目的基因的人工合成、基因重组、重组质粒转化小球藻。

本发明的绿色添加剂生物反应器的应用，是将基因修饰后的小球藻进行大量繁殖，成熟后干燥、碾碎并混入支撑粉制作成添加剂饲喂动物。

与现有技术相比，本发明具有以下明显的优点：一是生产技术简单，基因修饰后的小球藻生长迅速，成熟快，干燥方便；二是小球藻中的重组蛋白具有生物活性，可明显地促进动物的生长及抵抗病毒的攻击。

具体实施方式以下通过具体的实施例对本发明进行更加详细的描述：

实施例1

首先通过对猪、牛、羊(绵羊和山羊)、人的GH基因进行大量的分析和重组，选取具有相同保守区的功能片段进行分析。同时参照由于缺失了几个氨基酸而更能抵抗酶的消化的变异株来确定目的基因。为了提高在植物中的表达量，我们把目的片段与植物本身的一段信号肽基因相融合，来防止mRNA的降解。采用分子生物学的方法人工合成GH基因，该基因含有启动子(Ubiquitin)和终止子，基因经过修饰成为小球藻所偏嗜的密码子，前端为信号肽基因，片段两端为内切酶位点(Xba I和sal I)。用相应的内切酶切表达载体和目的片段，T4连接酶连接重组，构建相应的重组质粒。将重组质粒采用电击法转化大肠杆菌(Escherichia coli Top10)进行大量培养繁殖，抽提重组质粒。将在固体培养基上生长的直径约为1mm左右的单藻落接种于20ml液体培养基中，转速80～100rpm，温度20～25℃，光照培养16h，光照条件3000～4000lux，黑暗培养8h。后将，处于旺盛分裂期的小球藻用含有0.2mo1/L甘露醇和0.2mol/L山梨醇进行渗透处理1～2h，用6.0～9.0Kb的高脉冲电压，0.05～0.2s的短脉冲时间和多次脉冲(2ⁿ)，脉冲距离为2mm，进行100个循环周期的条件进行电击转化；或抽提重组质粒后包裹金弹，对培养至第4天，进行渗透处理过的小球藻，吸取0.4ml培养物铺于含固体培养基中央直径3cm的圆形有效轰击范围内，用6～9cm的子弹与靶细胞距离进行基因枪轰击转化。转化完毕后用培养液清冼两次，然后将0.4ml混合小球藻均匀涂于含含30μg/mlG418的固体培养基上，筛选出基因修饰小球藻。3周左右可见到藻落的长出，长出的藻落通过固体培养保存藻系，在含有G418 15μg/ml的液体培养中扩大繁殖。

基因修饰后的小球藻中所含外源基因GH，可经PCR、Southern检测存在：收集对数生长期(约1×10⁸个/ml)的小球藻细胞，采用改良的CTAB法抽提小球藻总DNA。基因修饰后的小球藻中所含外源基因GH所转录出的RNA，可经Northern检测存在。基因修饰后的小球藻中所含的外源蛋白，经ELISA和Western blot检测其存在，阳性对照为空质粒转化的小球藻抽提物中混有人工合成的多肽GH(10ug/ml)，阴性对照为空质粒转化的小球藻抽提物。结果显示基因修饰后的小球藻中含有外源蛋白GH，能够与蛋白中相应的多肽血清发生明显的反应。在Western blot检测中，用抗GH的血清可检测到特异性的条带，分子量为1-10KDa，得出与ELISA相同的检测结果。

家畜进食含上述添加剂的饲料两周后，与空白对照组相比较，增重率明显提高，超过了市场上销售的促生长型添加剂的水平。

实施例2

采用分子生物学的方法人工合成PEGF基因，该基因含有启动子(Ubiquitin)和终止子，基因经过修饰成为小球藻所偏嗜的密码子，前端为信号肽基因，片段两端为内切酶位点(Xba I和sal I)。用相应的内切酶切表达载体和目的片段，T4连接酶连接重组，构建相应的重组质粒。将重组质粒采用电击法转化大肠杆菌(Escherichiacoli Top10)进行大量培养繁殖，抽提重组质粒。将在固体培养基上生长的直径约为1mm左右的单藻落接种于20ml液体培养基中，转速80～100rpm，温度20～25℃，光照培养16h，光照条件3000～4000lux，黑暗培养8h。后将，处于旺盛分裂期的小球藻用含有0.2mol/L甘露醇和0.2mol/L山梨醇进行渗透处理1～2h，用6.0～9.0Kb的高脉冲电压，0.05～0.2s的短脉冲时间和多次脉冲(2ⁿ)，脉冲距离为2mm，进行100个循环周期的条件进行电击转化；或抽提重组质粒后包裹金弹，对培养至第4天，进行渗透处理过的小球藻，吸取0.4ml培养物铺于含固体培养基中央直径3cm的圆形有效轰击范围内，用6～9cm的子弹与靶细胞距离进行基因枪轰击转化。转化完毕后用培养液清冼两次，然后将0.4ml混合小球藻均匀涂于含含30μg/mlG418的固体培养基上，筛选出基因修饰小球藻。3周左右可见到藻落的长出，长出的藻落通过固体培养保存藻系，在含有G418 15μg/ml的液体培养中扩大繁殖。其它操作同实施例1。

实施例3

采用分子生物学的方法人工合成口蹄疫VP1抗原基因基因，该基因含有启动子(Ubiquitin)和终止子，基因经过修饰成为小球藻所偏嗜的密码子，前端为信号肽基因，片段两端为内切酶位点(Xba I和sal I)。用相应的内切酶切表达载体和目的片段，T4连接酶连接重组，构建相应的重组质粒。将重组质粒采用电击法转化大肠杆菌(Escherichia coli Top10)进行大量培养繁殖，抽提重组质粒。将在固体培养基上生长的直径约为1mm左右的单藻落接种于20ml液体培养基中，转速80～100rpm，温度20～25℃，光照培养16h，光照条件3000～4000lux，黑暗培养8h。后将，处于旺盛分裂期的小球藻用含有0.2mol/L甘露醇和0.2mol/L山梨醇进行渗透处理1～2h，用6.0～9.0Kb的高脉冲电压，0.05～0.2s的短脉冲时间和多次脉冲(2ⁿ)，脉冲距离为2mm，进行100个循环周期的条件进行电击转化；或抽提重组质粒后包裹金弹，对培养至第4天，进行渗透处理过的小球藻，吸取0.4ml培养物铺于含固体培养基中央直径3cm的圆形有效轰击范围内，用6～9cm的子弹与靶细胞距离进行基因枪轰击转化。转化完毕后用培养液清冼两次，然后将0.4ml混合小球藻均匀涂于含含30μg/mlG418的固体培养基上，筛选出基因修饰小球藻。3周左右可见到藻落的长出，长出的藻落通过固体培养保存藻系，在含有G418 15μg/ml的液体培养中扩大繁殖。其它操作同实施例1。

实施例4

采用分子生物学的方法人工合成口蹄疫病毒抗原多肽链基因，该基因含有启动子(Ubiquitin)和终止子，基因经过修饰成为小球藻所偏嗜的密码子，前端为信号肽基因，片段两端为内切酶位点(Xba I和sal I)。用相应的内切酶切表达载体和目的片段，T4连接酶连接重组，构建相应的重组质粒。将重组质粒采用电击法转化大肠杆菌(Escherichia coli Top10)进行大量培养繁殖，抽提重组质粒。将在固体培养基上生长的直径约为1mm左右的单藻落接种于20ml液体培养基中，转速80～100rpm，温度20～25℃，光照培养16h，光照条件3000～4000lux，黑暗培养8h。后将，处于旺盛分裂期的小球藻用含有0.2mol/L甘露醇和0.2mol/L山梨醇进行渗透处理1～2h，用6.0～9.0Kb的高脉冲电压，0.05～0.2s的短脉冲时间和多次脉冲(2ⁿ)，脉冲距离为2mm，进行100个循环周期的条件进行电击转化；或抽提重组质粒后包裹金弹，对培养至第4天，进行渗透处理过的小球藻，吸取0.4ml培养物铺于含固体培养基中央直径3cm的圆形有效轰击范围内，用6～9cm的子弹与靶细胞距离进行基因枪轰击转化。转化完毕后用培养液清冼两次，然后将0.4ml混合小球藻均匀涂于含含30μg/mlG418的固体培养基上，筛选出基因修饰小球藻。3周左右可见到藻落的长出，长出的藻落通过固体培养保存藻系，在含有G418 15μg/ml的液体培养中扩大繁殖。其它操作同实施例1。

实施例5

采用分子生物学的方法人工合成猪传染性胃肠炎病毒人工修饰抗原基因，该基因含有启动子(Ubiquitin)和终止子，基因经过修饰成为小球藻所偏嗜的密码子，前端为信号肽基因，片段两端为内切酶位点(Xba I和sal I)。用相应的内切酶切表达载体和目的片段，T4连接酶连接重组，构建相应的重组质粒。将重组质粒采用电击法转化大肠杆菌(Escherichia coli Top10)进行大量培养繁殖，抽提重组质粒。将在固体培养基上生长的直径约为1mm左右的单藻落接种于20ml液体培养基中，转速80～100rpm，温度20～25℃，光照培养16h，光照条件3000～4000lux，黑暗培养8h。后将，处于旺盛分裂期的小球藻用含有0.2mol/L甘露醇和0.2mol/L山梨醇进行渗透处理1～2h，用6.0～9.0Kb的高脉冲电压，0.05～0.2s的短脉冲时间和多次脉冲(2ⁿ)，脉冲距离为2mm，进行100个循环周期的条件进行电击转化；或抽提重组质粒后包裹金弹，对培养至第4天，进行渗透处理过的小球藻，吸取0.4ml培养物铺于含固体培养基中央直径3cm的圆形有效轰击范围内，用6～9cm的子弹与靶细胞距离进行基因枪轰击转化。转化完毕后用培养液清冼两次，然后将0.4ml混合小球藻均匀涂于含含30μg/mlG418的固体培养基上，筛选出基因修饰小球藻。3周左右可见到藻落的长出，长出的藻落通过固体培养保存藻系，在含有G418 15μg/ml的液体培养中扩大繁殖。其它操作同实施例1。

实施例6

采用分子生物学的方法人工合成猪呼吸与生殖综合症病毒抗原基因，该基因含有启动子(Ubiquitin)和终止子，基因经过修饰成为小球藻所偏嗜的密码子，前端为信号肽基因，片段两端为内切酶位点(Xba I和sal I)。用相应的内切酶切表达载体和目的片段，T4连接酶连接重组，构建相应的重组质粒。将重组质粒采用电击法转化大肠杆菌(Escherichia coli Top10)进行大量培养繁殖，抽提重组质粒。将在固体培养基上生长的直径约为1mm左右的单藻落接种于20ml液体培养基中，转速80～100rpm，温度20～25℃，光照培养16h，光照条件3000～4000lux，黑暗培养8h。后将，处于旺盛分裂期的小球藻用含有0.2mol/L甘露醇和0.2mol/L山梨醇进行渗透处理1～2h，用6.0～9.0Kb的高脉冲电压，0.05～0.2s的短脉冲时间和多次脉冲(2ⁿ)，脉冲距离为2mm，进行100个循环周期的条件进行电击转化；或抽提重组质粒后包裹金弹，对培养至第4天，进行渗透处理过的小球藻，吸取0.4ml培养物铺于含固体培养基中央直径3cm的圆形有效轰击范围内，用6～9cm的子弹与靶细胞距离进行基因枪轰击转化。转化完毕后用培养液清冼两次，然后将0.4ml混合小球藻均匀涂于含含30μg/mlG418的固体培养基上，筛选出基因修饰小球藻。3周左右可见到藻落的长出，长出的藻落通过固体培养保存藻系，在含有G418 15μg/ml的液体培养中扩大繁殖。其它操作同实施例1。

实施例7

采用分子生物学的方法人工合成禽流感病毒的主要免疫原性蛋白基因即HA基因，该基因含有启动子(Ubiquitin)和终止子，基因经过修饰成为小球藻所偏嗜的密码子，前端为信号肽基因，片段两端为内切酶位点(Xba I和sal I)。用相应的内切酶切表达载体和目的片段，T4连接酶连接重组，构建相应的重组质粒。将重组质粒采用电击法转化大肠杆菌(Escherichia coli Top10)进行大量培养繁殖，抽提重组质粒。将在固体培养基上生长的直径约为1mm左右的单藻落接种于20ml液体培养基中，转速80～100rpm，温度20～25℃，光照培养16h，光照条件3000～4000lux，黑暗培养8h。后将，处于旺盛分裂期的小球藻用含有0.2mol/L甘露醇和0.2mol/L山梨醇进行渗透处理1～2h，用6.0～9.0Kb的高脉冲电压，0.05～0.2s的短脉冲时间和多次脉冲(2ⁿ)，脉冲距离为2mm，进行100个循环周期的条件进行电击转化；或抽提重组质粒后包裹金弹，对培养至第4天，进行渗透处理过的小球藻，吸取0.4ml培养物铺于含固体培养基中央直径3cm的圆形有效轰击范围内，用6～9cm的子弹与靶细胞距离进行基因枪轰击转化。转化完毕后用培养液清冼两次，然后将0.4ml混合小球藻均匀涂于含含30μg/mlG418的固体培养基上，筛选出基因修饰小球藻。3周左右可见到藻落的长出，长出的藻落通过固体培养保存藻系，在含有G418 15μg/ml的液体培养中扩大繁殖。其它操作同实施例1。

实施例8

采用分子生物学的方法人工合成新城疫病毒的主要免疫原性蛋白基因即F基因，该基因含有启动子(Ubiquitin)和终止子，基因经过修饰成为小球藻所偏嗜的密码子，前端为信号肽基因，片段两端为内切酶位点(Xba I和sal I)。用相应的内切酶切表达载体和目的片段，T4连接酶连接重组，构建相应的重组质粒。将重组质粒采用电击法转化大肠杆菌(Escherichia coli Top10)进行大量培养繁殖，抽提重组质粒。将在固体培养基上生长的直径约为1mm左右的单藻落接种于20ml液体培养基中，转速80～100rpm，温度20～25℃，光照培养16h，光照条件3000～4000lux，黑暗培养8h。后将，处于旺盛分裂期的小球藻用含有0.2mol/L甘露醇和0.2mol/L山梨醇进行渗透处理1～2h，用6.0～9.0Kb的高脉冲电压，0.05～0.2s的短脉冲时间和多次脉冲(2ⁿ)，脉冲距离为2mm，进行100个循环周期的条件进行电击转化；或抽提重组质粒后包裹金弹，对培养至第4天，进行渗透处理过的小球藻，吸取0.4ml培养物铺于含固体培养基中央直径3cm的圆形有效轰击范围内，用6～9cm的子弹与靶细胞距离进行基因枪轰击转化。转化完毕后用培养液清冼两次，然后将0.4ml混合小球藻均匀涂于含含30μg/mlG418的固体培养基上，筛选出基因修饰小球藻。3周左右可见到藻落的长出，长出的藻落通过固体培养保存藻系，在含有G418 15μg/ml的液体培养中扩大繁殖。其它操作同实施例1。

实施例9

采用分子生物学的方法人工合成法氏囊病毒的主要免疫原性蛋白基因即VP2基因，该基因含有启动子(Ubiquitin)和终止子，基因经过修饰成为小球藻所偏嗜的密码子，前端为信号肽基因，片段两端为内切酶位点(Xba I和sal I)。用相应的内切酶切表达载体和目的片段，T4连接酶连接重组，构建相应的重组质粒。将重组质粒采用电击法转化大肠杆菌(Escherichia coli Top10)进行大量培养繁殖，抽提重组质粒。将在固体培养基上生长的直径约为1mm左右的单藻落接种于20ml液体培养基中，转速80～100rpm，温度20～25℃，光照培养16h，光照条件3000～4000lux，黑暗培养8h。后将，处于旺盛分裂期的小球藻用含有0.2mol/L甘露醇和0.2mol/L山梨醇进行渗透处理1～2h，用6.0～9.0Kb的高脉冲电压，0.05～0.2s的短脉冲时间和多次脉冲(2ⁿ)，脉冲距离为2mm，进行100个循环周期的条件进行电击转化；或抽提重组质粒后包裹金弹，对培养至第4天，进行渗透处理过的小球藻，吸取0.4ml培养物铺于含固体培养基中央直径3cm的圆形有效轰击范围内，用6～9cm的子弹与靶细胞距离进行基因枪轰击转化。转化完毕后用培养液清冼两次，然后将0.4ml混合小球藻均匀涂于含含30μg/mlG418的固体培养基上，筛选出基因修饰小球藻。3周左右可见到藻落的长出，长出的藻落通过固体培养保存藻系，在含有G418 15μg/ml的液体培养中扩大繁殖。其它操作同

实施例1。

Claims

1、一种绿色添加剂生物反应器，其特征在于：反应器由小球藻、信号肽基因和免疫原性基因、目标基因及基因修饰后的小球藻表达的具有生物活性的产物组成，其中的信号肽基因和免疫原性基因为：GGATCCATGGGGAAGAACGGCAGCCTGTGCTGCTTCTCTCTGCTGCTGCTGCTGCTTCTCGCCGGGTTGGCGTCCATGAATAAAGTAAAATTTTATGTTTTATTTACGGCGTTACTATCCTCTCTATGTGCACACGGAGCTCCCGGGTATGCACATGGAACACCTCAAAATATTACTGATTTGTGTGCAGAATACCACAACACACAAATACATACGCTAAATGATAAGATATTTTCGTATACAGAATCTCTAGCTGGAAAAAGAGAGATGGCTATCATTACTTTTAAGAATGGTGCAACTTTTCAAGTAGAAGTACCAGGTAGTCAACATATAGATTCACAAAAAAAAGCGATTGAAAGGATGAAGGATACCCTGAGGATTGCATATCTTACTGAAGCTAAAGTCGAAAAGTTATGTGTATGGAATAATAAAACGCCTCATGCGATTGCCGCAATTAGTATGGCAAATTCTAGA

其目标基因包括下列基因之一种：

(5)猪传染性胃肠炎病毒人工修饰抗原基因：

1 tctagaacca tggctttctt gaagagtttc ccattctacg ctttcttgtgcttcggacaa

61 tacttcgtgg ctgtgactca cgcagacaac ttcccatgct ctaagttgaccaacaggacc

121 atcggtaatc aatggaactt gatcgagacc ttcttgttga actactcatctaggttgcca

181 ccaaactctg acgacgtgtt gggtgactac ttcccaactg tgcaaccttggttcaactgc

241 atcaggaaca actctaacga cttgtacgtg actttggagaacttgaaggc tctctactgg

301 gactacgcta ctgagaacat cacctggaac cacaggcaaaggttgaacgt ggtggtgaac

361 ggatacccat acagtatcac agtgacaaca acccgcaacttcaactctgc tgagggtgct

421 attatctgca tttgcaaggg aagtccacca actaccaccaccgagtctag tttgacttgc

481 aactggggaa gtgagtgcag gttgaaccac aagttccctatctgtccatc taactcagag

541 gcaaactgcg gaaacatgct gtacggcttg caatggttcgcagacgaggt ggtggcttac

601 ttgcatggag ctagttaccg gattagtttc gagaaccaat ggtctggcactgtgacattc

661 ggtgacatgc gggccacaac attggaggtg gctggcacgttggtggactt gtggtggttc

721 aacccagtgt acgatgtcag ttactacagg gtgaacaacaagaacgggac taccgtggtg

781 agcaactgca ctgaccaatg cgctagttac gtggctaacgtgttcactac acagccagga

841 ggattcatcc catcagactt tagtttcaac aactggttcc tcttgactaacagcagcact

901 ttggtgagtg gtaagttggt gaccaagcag ccgttgctcg ttaactgcttgtggccagtc

961 ccaagcttcg aggaggcagc ttctacattc tgcttcgagg gagctggcttcgaccaatgc

1021 aatggagctg tgctcaacaa tactgtggac gtgattaggttcaacctcaa cttcactaca

1081 aacgtgcaat cagggaaggg tgccacagtg ttctcattgaacacaaccgg tggagtcact

1141 ctcgagattt catgctacac agtgagtgac tcgagcttct tcagttacggagagattccg

1201 ttcggcgtga ctgacggacc acggtactgc tacgtgcactacaacggcac agctctcaag

1261 tacctcggaa cactcccacc tagtgtgaag gagattgctatcagtaagtg gggccacttc

1321 tacattaacg gttacaactt cttcagcaca ttcccaattg actgcatctcattcaacttg

1381 accactggtg acagtgacgt gttctggaca atcgcttacacaagctacac tgaggcactc

1441 gtgcaagttg agaacacagc tattacaaag gtgacgtactgcaacagtca cgttaacaac

1501 attaagtgct ctcaaattac tgctaacttg aacaacggat tctaccctgtttcttcaagt

1561 gaggttggac tcgtgaacaa gagtgttgtg ctcctcccaagcttctacac acacaccatt

1621 gtgaacatca ctattgggct cggaatgaag cgtagtgggtacgggcaacc aatcgcctca

1681 acattgagta acatcacatt gccaatgcag gaccacaacaccgatgtgta ctgcattcgg

1741 tctgaccaat tctcagttta cgtgcattct acttgcaaga gtgctttgtgggacaatatt

1801 ttcaagcgaa actgcacgga ccaccaccat caccatcactaaccgcggtg gagctc

(6)猪呼吸与生殖综合症病毒抗原基因：Atgttggggaaatgcttgaccacgggctgttgctcgcgattgctttctttgtggtgtatcgtgccgttctgttttgctgtgctcgtcaacgccaacagcaacagcagctctcattttcagttgatttataacttgacgctatgtgagctgaatggcacagattggctggctaacaaatttgactgggcagtggagacttttgtcatctttcccgtgttgactcacattgtttcctatggggcactcaccaccagccatttccttgacacagttggtctggtcactgtgtccaccgccgggttttatcacgggcggtatgtcttgagtagcatctacgcggtctgtgctctggctgcgttgatttgcttcgtcattaggcttgcgaagaactgcatgtcctggcgctactcttgtaccagatataccaacttccttctggacactaagggcagactctatcgttggcggtcgcccgttattgtagagaaagggggtaaggttgaggtcgagggtcacctgatcgacctcaaaagagttgtgcttgatggttccgtggcaacccctttaaccagagtttcagcggaacaatggggtcgtctctag

2、构建权利要求1所述的绿色添加剂生物反应器的方法，包括基因重组、质粒构建、小球藻转化和重组蛋白的制备，具体过程为：

(1)插入质粒载体：采用分子生物学的方法人工合成目标基因，使目标基因含有启动子(Ubiquitin)和终止子，基因经过修饰成为小球藻所偏嗜的密码子，前端加信号肽基因(TMVΩ)，片段两端为内切酶位点(Xba I和sal I)，用相应的内切酶切表达载体和目的片段，T4连接酶连接重组，构建重组表达载体，然后

(2)将上述重组质粒转入小球藻中进行表达，获得基因修饰小球藻：将重组质粒转化大肠杆菌(Escherichia coli Top10)进行大量繁殖，抽提重组质粒后，对生长至第4天的小球藻进行渗透处理，用6.0～9.0Kb的高脉冲电压，0.05～0.2s的短脉冲时间和多次脉冲(2ⁿ)的条件进行电击转化，或抽提重组质粒后包裹金弹，用6～9cm的子弹与靶细胞距离进行基因枪轰击渗透处理的小球藻，通过G418筛选基因修饰小球藻。

3、权利要求1所述的绿色添加剂生物反应器的应用，其特征在于：将基因修饰后的小球藻进行大量繁殖，成熟后干燥、碾碎并混入支撑粉制作成添加剂饲喂动物。