CN1621090A - 特异性卵黄免疫球蛋白口服冻干制剂及其制备方法及用途 - Google Patents
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Abstract
一种特异性卵黄免疫球蛋白口服冻干制剂及制备方法和用途。该冻干制剂的组份包括特异性免疫球蛋白、赋型剂和溶剂中溶质。其制备方法包括制备特异性病原体抗原;将该特异性病原体抗原加等量不完全福氏佐剂充分乳化作免疫原;用该免疫原对产蛋禽类动物进行强化免疫;从强化免疫后的产蛋禽类动物所产卵中提取特异性卵黄免疫球蛋白;将特异性卵黄免疫球蛋白与赋型剂、溶剂混合得到冻干原液;将冻干原液经冷冻干燥法制成特异性卵黄免疫球蛋白口服冻干制剂。本发明制备的卵黄免疫球蛋白制剂其特异性卵黄免疫球蛋白不易变性,可保持天然活性,加水溶解即可。该冻干制剂可用在制备由病原微生物引起的消化道感染疾病的药物或食品、保健品中。
Description
技术领域
本发明涉及一种免疫球蛋白口服冻干剂及其制备方法及用途,尤其涉及一种特异性卵黄免疫球蛋白口服冻干制剂及其制备方法及用途。
背景技术
由病原微生物经消化道感染引起的疾病非常多,如轮状病毒引起的婴幼儿秋冬季腹泻、脊髓灰质炎病毒引起的小儿麻痹症、甲型肝炎病毒引起的甲型肝炎、艾柯病毒引起的无菌性脑膜炎、幽门螺杆菌引起的胃炎、痢疾杆菌引起的腹泻等。目前对于细菌性疾病多用抗生素,大量长期使用易产生耐药性,并且抗生素对病毒、支原体、衣原体不起作用;而对于病毒性疾病,目前缺乏特效药物。并且抗生素、抗病毒类化学药物大多毒副作用明显,安全性方面不够理想。已上市的特异性的血清免疫球蛋白及单克隆抗体常用于注射治疗,因其制备成本高、产量低,无法满足口服给药剂量大的要求。
人们不断地寻找对抗各类微生物性疾病具有高效、安全、无毒副作用的各种方法和手段。80年代初期,国外有人开始了对鸡卵黄免疫球蛋白(IgY)研究,发现当用抗原免疫母鸡后,鸡不但能产生相应抗体并能将其转移和积累于卵黄中。近年来,国外已有报道证实当用病毒作抗原免疫产蛋母鸡时,蛋黄中能产生相应的抗该病毒的特异性多克隆鸡卵黄免疫球蛋白,且产量大,便于提纯,尤其鸡卵黄免疫球蛋白稳定性好,其耐酸碱和热能力与免疫球蛋白(IgG)相似,能抵抗幼龄动物的胃酸屏障,口服鸡卵黄免疫球蛋白可使实验动物获得对应病原体引起的胃肠道感染性疾病的免疫保护作用,因此,可用于口服防治经胃肠道感染的病毒性疾病,如轮状病毒引起的婴幼儿秋冬季腹泻。并且,引起消化道感染性疾病的病原体大多分布在消化道粘膜表面,而口服鸡卵黄免疫球蛋白抗体大部分经过消化道代谢,只有很少的一部分被吸收入血。因此,口服抗原特异性的鸡卵黄免疫球蛋白抗体有利于消化道局部集中大量病原体特异性的抗体,从而大大地提高治疗效果。
由于鸡卵黄免疫球蛋白抗体本身性质为蛋白质,因此喷雾干燥方法会在生产过程中对蛋白质的活性形成破坏,而冻干过程中蛋白质的活性受到极好的保护,口服液则不利于蛋白质的稳定,易导致降解。
发明内容
本发明解决了背景技术中喷雾干燥生产方法对卵黄免疫球蛋白抗体活性的破坏以及卵黄免疫球蛋白抗体口服液易降解的技术问题。
本发明的技术解决方案是:
一种特异性卵黄免疫球蛋白口服冻干制剂,其特殊之处在于:所述口服冻干制剂的组份为
特异性免疫球蛋白 125~625克/每10000毫升冻干原液;
赋型剂 625~1125克/每10000毫升冻干原液;
溶剂中溶质 50~200克/每10000毫升冻干原液。
上述口服冻干制剂的组份可采用:
特异性免疫球蛋白 250~500克/每10000毫升冻干原液;
赋型剂 750~1000克/每10000毫升冻干原液;
溶剂中溶质 90~150克/每10000毫升冻干原液。
上述溶剂中溶质可采用磷酸盐或氯化钠;其口服冻干制剂的组份为:
特异性免疫球蛋白 500克/每10000毫升冻干原液;
赋型剂 750克/每10000毫升冻干原液;
磷酸盐 143克/每10000毫升冻干原液。
上述溶剂中溶质可采用氯化钠;其口服冻干制剂的组份为:
特异性免疫球蛋白 500克/每10000毫升冻干原液;
赋型剂 750克/每10000毫升冻干原液;
氯化钠 90克/每10000毫升冻干原液。
上述口服冻干制剂的组份可包括矫味剂,其组份为10毫升/每10000毫升冻干原液。
上述矫味剂可采用橙味、桔味、草莓味或苹果味的香精等。
上述特异性卵黄免疫球蛋白可采用抗轮状病毒特异性卵黄免疫球蛋白、抗脊髓灰质炎病毒特异性卵黄免疫球蛋白、抗甲型肝炎病毒特异性卵黄免疫球蛋白、抗艾柯病毒特异性卵黄免疫球蛋白、抗幽门螺杆菌特异性卵黄免疫球蛋白或抗痢疾杆菌特异性卵黄免疫球蛋白等。
上述赋形剂可采用甘露醇、白蛋白、乳糖、山梨醇、木糖醇或阿糖醇等。
一种如上所述特异性卵黄免疫球蛋白口服冻干制剂的制备方法,其特殊之处在于:该制备方法包括
1).制备特异性病原体抗原;
2).将该特异性病原体抗原加等量不完全福氏佐剂充分乳化作免疫原;
3).用该免疫原对产蛋禽类动物进行强化免疫;
4).从强化免疫后的产蛋禽类动物所产卵中提取特异性卵黄免疫球蛋白;
5).将特异性卵黄免疫球蛋白与赋型剂、溶剂混合得到冻干原液;
6).将冻干原液经冷冻干燥法制成特异性卵黄免疫球蛋白口服冻干制剂。
上述用免疫原对产蛋禽类动物进行强化免疫的方法可采用:
1).对产蛋禽类动物进行两点、三点或多点注射1.5~2.5ml免疫原,一般以四点注射为宜;
2).在第二周、第四周分别重复免疫1次;
3).定期检测特异性卵黄免疫球蛋白中和效价,使产蛋禽类动物卵的特异性卵黄免疫球蛋白中和效价达400单位/ml以上即可。
上述用免疫原对产蛋禽类动物进行强化免疫的方法可采用:
当产蛋禽类动物的特异性卵黄免疫球蛋白中和效价达峰值后下降到400单位/ml以下时,对产蛋禽类动物半量加强免疫,使产蛋禽类动物的特异性卵黄免疫球蛋白中和效价达400单位/ml以上。
上述将特异性卵黄免疫球蛋白与赋型剂、溶剂混合得到冻干原液,该冻干原液中还包括与矫味剂混合。
一种如上所述特异性卵黄免疫球蛋白口服冻干制剂在制备由病原微生物引起的消化道感染疾病药物中的应用。
上述特异性卵黄免疫球蛋白可采用抗脊髓灰质炎病毒特异性卵黄免疫球蛋白、抗甲型肝炎病毒特异性卵黄免疫球蛋白、抗艾柯病毒特异性卵黄免疫球蛋白、抗幽门螺杆菌特异性卵黄免疫球蛋白或抗痢疾杆菌特异性卵黄免疫球蛋白等。
本发明具有如下优点:
1.在生产过程中可保证蛋白质的自然活性和制剂的稳定性,便于贮存及运输。冷冻干燥法工艺步骤少,冻干过程保持较低温度使特异性卵黄免疫球蛋白不易变性,保持天然活性,减少特异性卵黄免疫球蛋白在生产过程中的损失,并且有利于成品的长期保存和运输。
2.制备的卵黄免疫球蛋白制剂具有低成本、高特异性、高效价的特点。免疫动物为普通级饲养,易于低成本地扩大饲养量,降低了主要生产原料—免疫禽蛋的成本;强化免疫使特异性卵黄免疫球蛋白的中和效价达到相当高水平,并可长期维持在高水平状态一年以上。
3.制品用途广泛,可用于预防、治疗某种病原微生物引起的消化道疾病的食品、保健品、药品的生产。
4.制品的辅料成份在口味上易让人接受,尤其受婴幼儿的喜爱,服用方便,加水溶解即可。
具体实施方式
本发明特异性卵黄免疫球蛋白制剂包含:有效量的抗某种病原体的特异性卵黄免疫球蛋白和食品卫生学、药学上可接受的赋型剂、稳定剂、矫味剂等辅料。其中特异性卵黄免疫球蛋白含量为20~40%。赋型剂可采用甘露醇、白蛋白、乳糖、山梨醇、木糖醇、阿糖醇等,其中甘露醇、乳糖为首选,因其成本低,既可在冻干中起骨架支撑作用,又可起蛋白稳定剂作用,还由于其味甜可以起到矫味剂作用,具三重功效。矫味剂也可采用橙味、桔味、草莓味、苹果味、水蜜桃味、哈密瓜味等公知的各种果味香精。
实施例一
1.免疫原制备
采用标准人型轮状病毒Wa株、猴型SA11株二联体为免疫原,MA-104细胞为病毒培养宿主细胞。
取工作细胞库中的MA104细胞株复苏于25ml培养方瓶中,在37℃、5%CO2、相对湿度80%条件下进行培养,用常规胰蛋白酶消化法,进行消化传代。培养液为含10%胎牛血清的DMEM培养液。MA104细胞在方瓶中传到一定量后再传于2500ml旋转培养瓶中37℃旋转培养,24h后,接种经20ug/ml胰蛋白酶37℃处理30min的轮状病毒液,每瓶接种5ml,吸附1h,吸去病毒液,换维持液(含2ug/ml胰蛋白酶的无血清DMEM培养基)37℃继续旋转培养72h左右,至细胞病变达80%以上时收获病毒培养液。病毒培养液反复冻融三次,间断超声破碎2min,6000rpm离心20min,上清中加入8%PEG6000,4℃过夜。8500rpm4℃离心20min,沉淀用0.05M PBS重悬。进行蛋白浓度及CPE测定,用0.05M PBS调病毒至1.0×103TCID50/ml。
2.对产蛋禽类动物进行强化免疫
产蛋禽类动物采用人工饲养或野生的禽类动物均可,一般采用人工饲养的鸡。选经检疫合格的产蛋鸡,普通级动物饲养。将二价轮状病毒液加等量不完全福氏佐剂充分乳化作免疫原。于每只产蛋鸡胸、腹及大腿内侧多点注射免疫原2.0ml,分别在第二周、第四周加强免疫1次,定期检测鸡卵黄免疫球蛋白中和效价,待鸡卵黄免疫球蛋白中和效价达400单位/ml后收集鸡蛋进行鸡卵黄免疫球蛋白提取。当鸡卵黄免疫球蛋白的中和效价达峰值后下降到400单位/ml以下对鸡半量加强免疫一次。
3.特异性卵黄免疫球蛋白的制备
先洗净鸡蛋表面,再对鸡蛋表面消毒,用去离子水冲净消毒液。将洗净的鸡蛋分离卵黄,搅散后加入PH4.0~PH5.0的灭菌纯化水,将卵黄稀释8倍,温和搅拌混匀后4℃静置过夜,沉淀脂质;分离上清后G3耐酸漏斗负压抽滤,滤过液中慢慢加入硫酸铵细粉至终浓度达饱和,搅拌均匀后4℃静置8h沉淀特异性卵黄免疫球蛋白,6000rpm4℃离心30min,沉淀用0.01M PBS重悬,用100K膜(low banding)超滤除残余硫酸铵及小分子蛋白。收集特异性卵黄免疫球蛋白-20℃冻存备用。
实施例二
1.免疫原制备
采用甲型肝炎病毒标准毒株(HAV)为免疫原,HeLa细胞为病毒培养宿主细胞。
取工作细胞库中的HeLa细胞株复苏于25ml培养方瓶中,在37℃、5%CO2、相对湿度80%条件下进行培养,用常规胰蛋白酶消化法,进行消化传代。培养液为含10%胎牛血清的DMEM培养液。细胞在方瓶中传到一定量后再传于2500ml旋转培养瓶中37℃旋转培养,24h后,接种甲型肝炎病毒液,每瓶接种5ml,吸附1h,换维持液(无血清DMEM培养液),37℃继续旋转培养至细胞病变达80%以上时收获病毒培养液。病毒培养液反复冻融三次,间断超声破碎2分钟,6000rpm离心20min,上清中加入8%PEG6000,4℃过夜。8500rpm4℃离心20min,沉淀用0.05M PBS重悬。进行蛋白浓度及CPE测定,用0.05M PBS调病毒至1.0×103TCID50/ml。
2.对产蛋禽类动物进行强化免疫
采用经检疫合格产蛋鸡,普通级动物饲养。将甲型肝炎病毒液加等量不完全福氏佐剂充分乳化作免疫原。于每只产蛋鸡胸、腹及大腿内侧多点注射免疫原2.0ml,分别在第二周、第四周加强免疫1次,定期检测特异性卵黄免疫球蛋白中和效价,待特异性卵黄免疫球蛋白中和效价达400单位/ml后收集鸡蛋进行特异性卵黄免疫球蛋白提取。当特异性卵黄免疫球蛋白的中和效价达峰值后下降到400单位/ml以下对鸡半量加强免疫一次。
3.特异性免疫球蛋白的制备
制备方法同实施例一。
实施例三
1.免疫原制备
采用艾柯病毒2、4、6型三联体病毒为免疫原,人羊膜传代细胞为病毒培养宿主细胞。
取工作细胞库中的人羊膜传代细胞复苏于25ml培养方瓶中,在37℃、5%CO2、相对湿度80%条件下进行培养,用常规胰蛋白酶消化法,进行消化传代。培养液为含10%胎牛血清的DMEM培养液。人羊膜传代细胞在方瓶中传到一定量后再传于2500ml旋转培养瓶中37℃旋转培养,24h后,接种艾柯病毒液,每瓶接种5ml,吸附1h,换维持液(无血清DMEM培养基)37℃继续旋转培养72h左右,至细胞病变达80%以上时收获病毒培养液。病毒培养液反复冻融三次,间断超声破碎2min,6000rpm离心20min,上清中加入8%PEG6000,4℃过夜。8500rpm4℃离心20min,沉淀用0.05M PBS重悬。进行蛋白浓度及CPE测定,用0.05M PBS调病毒至1.0×103TCID50/ml。
2.对产蛋禽类动物进行强化免疫
采用经检疫合格产蛋鸡,普通级动物饲养。将三价艾柯病毒液加等量不完全福氏佐剂充分乳化作免疫原。于每只产蛋鸡胸、腹及大腿内侧多点注射免疫原2.0ml,分别在第二周、第四周加强免疫1次,定期检测特异性卵黄免疫球蛋白中和效价,待特异性卵黄免疫球蛋白中和效价达400单位/ml后收集鸡蛋进行特异性卵黄免疫球蛋白提取。当特异性卵黄免疫球蛋白的中和效价达峰值后下降到400单位/ml以下对鸡半量加强免疫一次。
3.特异性免疫球蛋白的制备
制备方法同实施例一。
实施例四
1.免疫原制备
采用痢疾杆菌为免疫原。
接种痢疾杆菌于营养肉汤培养基中在35℃培养,定期测定其OD600,当OD600不再升高时停止培养,4000RPM离心收集菌体,0.1MPBS悬浮菌体,间断超声20min,6000RPM离心收集菌体细胞碎片沉淀,再用0.1MPBS重悬。
2.对产蛋禽类动物进行强化免疫
采用经检疫合格产蛋鸡,普通级动物饲养。将细菌体细胞碎片悬液加等量不完全福氏佐剂充分乳化作免疫原。于每只产蛋鸡胸、腹及大腿内侧多点注射免疫原2.0ml,分别在第二周、第四周加强免疫1次,定期检测特异性卵黄免疫球蛋白中和效价,待特异性卵黄免疫球蛋白中和效价达400单位/ml后收集鸡蛋进行特异性卵黄免疫球蛋白提取。当特异性卵黄免疫球蛋白的中和效价达峰值后下降到400单位/ml以下对鸡半量加强免疫一次。
3.特异性免疫球蛋白的制备
制备方法同实施例一。
特异性免疫球蛋白口服法冻干剂的制备方法
实施例五
配方:
特异性卵黄免疫球蛋白 500克
甘露醇 750克
果味香精 10毫升
0.1mol/L磷酸盐缓冲液(PBS) 加至10000毫升
制备:
按配方配制好后,分装冻干盘中进行冷冻干燥,冻干后磨成粉状分装铝塑袋密封保存。
实施例六
配方:
特异性卵黄免疫球蛋白 500克
乳糖 750克
果味香精 10毫升
0.1mol/L磷酸盐缓冲液PBS 加至10000毫升
制备:
按配方配制好后,分装冻干盘中进行冷冻干燥,冻干后磨成粉状分装铝塑袋密封保存。
口服冻干抗特异性病原体卵黄免疫球蛋白制剂的保护效果
1.口服冻干抗特异性病原体卵黄免疫球蛋白制剂的稳定性实验
以抗轮状病毒特异性卵黄免疫球蛋白稳定性试验为例。将制备的抗轮状病毒特异性卵黄免疫球蛋白制剂分别在室 25℃和4℃保存,分别测定其ELISA免疫效价,结果如下:
抗轮状病毒特异性卵黄免疫球蛋白制剂稳定性实验结果
原始 60天 120天 180天 240天
25℃ 1∶12000 1∶10240 1∶10240 1∶10240 1∶9600
4℃ 1∶12000 1∶10240 1∶10240 1∶10240 1∶10240
2.抗轮状病毒特异性卵黄免疫球蛋白制剂的体外药效学实验
以抗轮状病毒特异性卵黄免疫球蛋白药效学试验为例,采用MA-104细胞病变抑制法测其中和效价。
MA-104细胞常规铺96孔细胞培养板,以待感染轮状病毒与倍比稀释的特异性卵黄免疫球蛋白混合,37℃作用1h,培养板每孔加入100μl病毒--特异性免疫球蛋白混合液,37℃吸附1h,加入含2%胎牛血清、2μg/ml胰酶的维持液100μl,72h后镜下观察结果。结果表明,所制备的特异性卵黄免疫球蛋白对Wa株的中和效价为8.19×103(TCID50),对SA11株的中和效价为8.5×103(TCID50)。
Claims (14)
1.一种特异性卵黄免疫球蛋白口服冻干制剂,其特征在于:所述口服冻干制剂的组份为
特异性免疫球蛋白 125~625克/每10000毫升冻干原液;
赋型剂 625~1125克/每10000毫升冻干原液;
溶剂中溶质 50~200克/每10000毫升冻干原液。
2.如权利要求1所述的特异性卵黄免疫球蛋白口服冻干制剂,其特征在于:所述口服冻干制剂的组份为
特异性免疫球蛋白 250~500克/每10000毫升冻干原液;
赋型剂 750~1000克/每10000毫升冻干原液;
溶剂中溶质 90~150克/每10000毫升冻干原液。
3.如权利要求1所述的特异性卵黄免疫球蛋白口服冻干制剂,其特征在于:所述的溶剂中溶质为磷酸盐或氯化钠;所述口服冻干制剂的组份为
特异性免疫球蛋白 500克/每10000毫升冻干原液;
赋型剂 750克/每10000毫升冻干原液;
磷酸盐 143克/每10000毫升冻干原液。
4.如权利要求1所述的特异性卵黄免疫球蛋白口服冻干制剂,其特征在于:所述溶剂中溶质为氯化钠;所述口服冻干制剂的组份为
特异性免疫球蛋白 500克/每10000毫升冻干原液;
赋型剂 750克/每10000毫升冻干原液;
氯化钠 90克/每10000毫升冻干原液。
5.如权利要求1或2或3或4之任一权利要求所述的特异性卵黄免疫球蛋白口服冻干制剂,其特征在于:所述口服冻干制剂的组份包括矫味剂,其组份为10毫升/每10000毫升冻干原液。
6.如权利要求5所述的特异性卵黄免疫球蛋白口服冻干制剂,其特征在于:所述的矫味剂为橙味、桔味、草莓味或苹果味的香精。
7.如权利要求1或2或3或4之任一权利要求所述的特异性卵黄免疫球蛋白口服冻干制剂,其特征在于:所述的特异性卵黄免疫球蛋白为抗轮状病毒特异性卵黄免疫球蛋白、抗脊髓灰质炎病毒特异性卵黄免疫球蛋白、抗甲型肝炎病毒特异性卵黄免疫球蛋白、抗艾柯病毒特异性卵黄免疫球蛋白、抗幽门螺杆菌特异性卵黄免疫球蛋白或抗痢疾杆菌特异性卵黄免疫球蛋白。
8.如权利要求1或2或3或4之任一权利要求所述的特异性卵黄免疫球蛋白口服冻干制剂,其特征在于:所述的赋形剂为甘露醇、白蛋白、乳糖、山梨醇、木糖醇或阿糖醇。
9.一种如权利要求1所述特异性卵黄免疫球蛋白口服冻干制剂的制备方法,其特征在于:该制备方法包括
1).制备特异性病原体抗原;
2).将该特异性病原体抗原加等量不完全福氏佐剂充分乳化作免疫原;
3).用该免疫原对产蛋禽类动物进行强化免疫;
4).从强化免疫后的产蛋禽类动物所产卵中提取特异性卵黄免疫球蛋白;
5).将特异性卵黄免疫球蛋白与赋型剂、溶剂混合得到冻干原液;
6).将冻干原液经冷冻干燥法制成特异性卵黄免疫球蛋白口服冻干制剂。
10.如权利要求9所述的特异性卵黄免疫球蛋白口服冻干制剂的制备方法,其特征在于:所述用免疫原对产蛋禽类动物进行强化免疫的方法包括
1).对产蛋禽类动物进行两点、三点或多点注射1.5~2.5ml免疫原;
2).在第二周、第四周分别重复免疫1次;
3).定期检测特异性卵黄免疫球蛋白中和效价,使产蛋禽类动物卵的特异性卵黄免疫球蛋白中和效价达400单位/ml以上即可。
11.如权利要求9或10所述的特异性卵黄免疫球蛋白口服冻干制剂的制备方法,其特征在于:所述用免疫原对产蛋禽类动物进行强化免疫的方法包括
当产蛋禽类动物的特异性卵黄免疫球蛋白中和效价达峰值后下降到400单位/ml以下时,对产蛋禽类动物半量加强免疫,使产蛋禽类动物的特异性卵黄免疫球蛋白中和效价达400单位/ml以上。
12.如权利要求11所述的特异性卵黄免疫球蛋白口服冻干制剂的制备方法,其特征在于:所述的将特异性卵黄免疫球蛋白与赋型剂、溶剂混合得到冻干原液,该冻干原液包括与矫味剂混合。
13.一种如权利要求1所述特异性卵黄免疫球蛋白口服冻干制剂在制备由病原微生物引起的消化道感染疾病药物中的应用。
14.如权利要求13所述的特异性卵黄免疫球蛋白口服冻干制剂在制备由病原微生物引起的消化道感染疾病药物中的应用,其特征在于:所述的特异性卵黄免疫球蛋白为抗脊髓灰质炎病毒特异性卵黄免疫球蛋白、抗甲型肝炎病毒特异性卵黄免疫球蛋白、抗艾柯病毒特异性卵黄免疫球蛋白、抗幽门螺杆菌特异性卵黄免疫球蛋白或抗痢疾杆菌特异性卵黄免疫球蛋白。
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