JPH07501558A - ロタウイルスに対する非経口的免疫化 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ロタウィルスに対する非経口的免疫化 本発明は、国立衛生研究所の補助によって部分的に支援された。従って、合衆国 政府は本発明に対して一定の権利を有し得る。

〔発明の分野〕

本発明は、一般的には、ロタウィルスに誘起された下痢性疾患に対するワクチン およびその使用方法の開発に関する。

より詳細に言うと、本発明は、生または不活化されたロタウィルス製剤類を単独 もしくは相互に組み合わせて、または経口ワクチン若しくはロタウィルスサブユ ニットワクチンと組み合わせて用いる、改良された非経口的免疫化方法の開発に 関する。

〔発明の背景〕

ロタウィルス類は、先進国および開発途上国の両方において、小児の激しい下痢 を起こす最も重要な単一の病原である。

Ｃｏｎｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｍｉｃ ｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　１ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ｉｎ　ｐｒｅｓｓ　（１ ９９２１゜開発途上国においては、２才未満の小児が年に５００．０００Å以上 、ロタウィルス感染によって死亡している。Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｍｅｄ ｉｃｉｎｅ、　“Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ　ｆｏｒ　ｉｍｍｕｎｉｘｉｎｇ　ａｇａ ｉｎｓｔ　ｒｏｆａｖｉｒｕｓ″ｉｎ　Ｎｅｗ　Ｖａｃｃｉｎｅ　Ｄｅｖｅｌｏ ｐｍｅｎｔ。

Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｐｒ１ｏｒｉｔｉｅｓ、　Ｖｏｌ、ｌ、　Ｄｉｓｅ ａｓｅｓ　ｏｆ　Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅｉｎ　ｆｈｅＵｎｉｔｅｄ　５ｌａｉｅ ｓ、　（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ＰｒｅｓｓｌＷ＋ｓｈｉｎｇｌｏ ｎ　Ｄ、Ｃ，１９８５）。先進国では、ロタウィルス感染による小児の死亡率は 低いが、入院は頻繁である。

合衆国においては、経口再水化剤溶液（ｏｒａｌ　ｔｅｈ７ｄｒｘｊｉｏｎｓｏ ｌｕｔｉｏｎ）の有効性および入手可能性にもかかわらず、ロタウィルス感染症 状で医療をめる小児の約１１％が、軽い脱水を生じて入院を必要としている。Ｋ ｏｏｐｍａｎ　ｅｌ　ａｌ、、　Ａｉｌ、１゜Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ、　１１９： １１４−１２３（１９８４）　；　Ｒｏｄｒｉｇｕｕ　ｅｌ　ａｌ、、　Ｐｅｄ ｉ［ｒ。

Ｉｎｆｅｃ、　Ｄｉｓ、　Ｊｌ、６：１７０−１７６ｆ１９８７）；　Ｇｌａｓ ｓ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｐｅｄｉａｌｒ、。

１１８：２７−３３　（１９９１）。疾病コントロールセンターは、合衆国にお いては毎年２２０．０００人の小児が胃腸炎のために入院しており、これら小児 の半数以上がロタウィルス関連の病気であると見積もっている。Ｈｏ　ｅｊ　ａ ｌ。Ｊ、　Ｉｎ１ｅｃ１．　Ｄｉｓ、　、　１５８：１１１２−Ｉｌ１６（１９ ８８）　。Ｌｓｌａｒｏｎ　ｅｌ　ａｌ、ｊｌｏｒｂｉｄ、Ｍｏｒｌａｌ、Ｗｅ ｅｋｌｙ　Ｒｔｐ、、３９：１−１４（１９９０）　；　Ｇｌａｓｓ　ｅｌ　ａ ｔ、　（１９９１）。テキサス州ヒユーストンの小児科大病院でのロタウィルス 感染の影響に関する最近の分析では、小児期におけるロタウィルス胃腸炎の入院 危険率は４８分の１であり、合衆国における推定入院ベッド費用のみで年に３億 ５２００万ドルに達する。Ｍａｌｓｏｎ　ａｎｄ　Ｅｓｔｅｓ。

Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、　１６２：５９８−６０４　（１９９０）。こ の見積もりは、ロタウィルス性胃腸炎の入院患者の年間費用が１兆ドルであると する、疾病コントロールセンターの見積もりに非常に近似している。Ｌｅ　Ｂａ ｒｏｎ　ｅｌ　ａｌ、　（１９９０）　ｏこのようなデータは、誕生後の最初の ２年間に、ロタウィルスに誘起された胃腸炎を防止するためのワクチンの必要性 を強調している。

小児のためのロタウィルスワクチン開発のために、幾つかの戦略が研究されてい る。Ｃｏｎｎｅｒｅｌ　ａｌ、　（１９９２）；　Ｋａｐｉｋｉａｎｅｆ　ａｌ 、、Ａｄｖ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、Ｂｉｏｌ、２５７＋６７−９０（１９９０）　。

今日まで、殆どの労力は小児のための経口生ワクチンの開発および試験に集中さ れてきた。何故なら、これらは局部的な粘膜抗体を刺激するために必要と思われ たからである。Ｋａｐｉｋｉａｎ　ｅｔ　ａｌ。

（１９９０）。不幸にも、幼児を動物（ウシ、サル）若しくはヒト（ＭＢ２）の 経口生ワクチン、または動物／ヒト再結合ワクチン（ｒｅａｓｓｏｒｌａｎｔ　 ｖａｃｃｉｎｅｓ）を用いた幼児のワクチン接種によっては、未だ全ての状況に おいて、良好な異型保護での充分な生着率（ｔａｋｅ　ｒａｔｅ）は達成されて いない。Ｃｏｎｎｅｒ　ｅｊ　ｇｌ、　（１９９２）。

経口中ロタウィルスワクチンを投与した小児に先天性母性抗体が存在すると、ワ クチンウィルスの複製が妨害されるため、ワクチンの生着率が低下する。Ｃａｄ ｒａｎｅｌ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｐｅｄｉａｌｒ、Ｇａ５１＋ｏｅｎｌｅｒｏ１ ．Ｎｕｔｒ、６：５２５−５２８（１９８７）；　Ｔａｉｉｍａ　ｅｆ　ａｌ、 。

Ｌ＋ｃｃｉｎｅ　８ニア１−７４（１９９０）　。母性抗体による干渉は、非経 口的に投与されたワクチンでは問題にならない。従って、異型免疫を刺激するた めに多価ワクチンが試験されているが、幾つかの生ウィルスの均衡のとれた製剤 を得ることは困難であることが証明されている。Ｐｅ＋ｅｘ−３ｃｈａｅｌ　ｅ ｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｍｉｃｒ。

ｂｉｏｌ、２８＋５５３−５５８（１９９０）：Ｆｌｏｔｅｓ　ｅｌ　ａｌ、、 Ｌａｎｃｅｔ　３３６：３３０−３３４　（１９９１）　；　Ｖｅｓｉｋａｒｉ 　ｅｌ　ａｌｌ、Ｖａｃｃｉｎｅ　９＋３３４−３３９（１９９１）；　Ｗｒｉ ｇｈｆ　ｅｔ　ａｔ、、Ｊ、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ、１６４：２７１−２７６（ １９９１）。

非複製性サブユニットワクチンを用いた別の戦略が提案されているが、今日まで 、このようなワクチンの潜在的な能動免疫性を誘起する能力は示されていない。

この一つの理由は、活性な保護を誘起するワクチン候補の能力を試験するために 、入手可能な動物モデルは少ししかないからである。例えば、広く用いられてい るロタウィルス感染の新生児マウスモデルでは、マウスは１４日齢までしか下痢 病に対して感受性ではないため、受動的保護しか研究できない。Ｗｏｌ（ｅｊ　 ａｌ、、Ｉｎｌ＜ｃｌ　Ｉｍｍｕｎ、３３：５６５−５７４　（１９８１）　； 　Ｒａｍｉｎｇ、　Ｍｉｃｒｏｂ、　Ｐａｊｈｏｇ、　４：１８９−２０２　（ １９８８）。

小児の感染に似た、ウサギにおけるロタウィルス感染のモデルが開発されている 。このモデルは、能動的な血清免疫および粘膜免疫の発現、並びにロタウィルス に対する抗原投与からの保護をモニターするために有効である。ＣｏｎｎＣｒ　 ｔｊ　１１、、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６２：１６２５−１６３３（１９８８） 　；　Ｃｏｎｎｅｒ　ｅｌ　ａｔ、、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６５：２５６３− ２５７１（１９９１）；　Ｔｈｏｕｌｅｓｓ　ｅｆ　ａｌ、、Ａｒｃｈ、Ｖｉｒ ｏｌ、８９：１６１−１７０（１９８６）　；　ＢａｍｂｒａＣｕｓ　ｅｊ　ａ ｌ、、Ａｒｃｈ、Ｖｉｒｏｌ、　１０７：２３７−２５１（１９８９）。

ウサギでは、盲腸での体液吸収効率が非常に高いので、ロタウィルスの接種に続 いて確実に下痢が観察される訳ではない。そのため、現在のウサギモデルにおけ る保護の測定は、臨床的な病気に基づくものではない。しかし、感染ウサギの全 小腸に亘って観察される組織病理学的な変化（Ｇｉｌｇｅｒ　ｅｌａｌ、、Ｇａ ５１＋ｏｅｎｌｅｒｏ１ｏｇｙ　１９４：Ａ１４６（１９８９）　）　、腸液の 量および濃度（ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙ）の変化、並びに抗体陰性のウサギを有 毒なＡｌａウィルスで感染させた後のウィルス消失の速度は、他の動物モデルで の実験的感染および下痢が観察される小児の天然感染に見られるように、ウィル ス感染の証拠である。

プラーク試験による感染ウィルスの検出と、ＥＬＩＳＡによるロタウィルス抗原 排出の検出とは、同等の感度を有していることが他の実験によって示された。

保護を媒介する抗ロタウィルスＩｇＧの能力は、哺乳マウスモデルにおける受動 保護研究のなかで既に報告されている。

０ｆｆｉｌ　ａｎｄ　Ｃ１ａｒｋ、　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、５４：５８−６４（１９ ８５）；　０ｆｆｉｔ　ａｎｄ　Ｄｕｄｚｉｋ、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｉｃｒ ｏｂｉｏｌ、２７；８８５−８８８（１９８９）＋　０ｆｆｉｌ　ｅｔ　ａｌ５ ．Ｊ。

Ｖｉｒｏｌ、　５８ニア０Ｏ−７０３（１９８６）　；　Ｍｘｌｓｕｉ　ｅｌ　 ａｔ、、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、Ｍｉｃｔｏｂｉｏｌ、２７＋７８０−７８２（１９ ８９）；　５ｈｅｒｉｄａｎ　ｅｌ　ａｌ、、Ｊ、Ｉｎｆｅｃｔ　Ｄｉｓ、１４ ９：４３４−４３８　（１９８４）。小児における感染からの保護を媒介し、病 気を回復させ、ウィルスの排出を減少させるといった腸内に存在するＩｇＧの能 力が、小児の受動的治療について、牛乳または血清免疫グロブリンを用いること によって示されている。

Ｂａｒｎｅｓ　ｅｌ　１１１．、　Ｌａｎｃｅｔ　ｌ：１３７１−１３７３（１ ９８２）：　Ｌｏｓｏｎｓｋｙ　ｅｊ　ａｌ、、　１．　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅ ｓｔ、　７６：２３６２−２３６７（１９８５）　；　Ｂｒｕｓｓｏｗ　ｅｆ　 ａｌ、、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　２５：９３２−９８６　 （１９８７）　；　Ｂ１１ｐｅｒｌ　ｅｌ　ａｌ、　、　Ｊ、　Ｉｎ１ｅｃｊ、 Ｄｉｓ、１５６：１５８−１６６（１９８７）　。初乳誘導されたウシにおいて は、皮下注射による高力価の抗体の投与に続いて、保護を媒介する循環抗ロタウ ィルス抗体が現れることが報告されている。Ｂｅ５ｓｅｒ　ｅｌ　ａｌ、、　Ｊ 、Ｖｉｒｏｌ、６２：２２３８−２２４２（１９８８ａ）　ｏ　この保護は、循 環Ｉ　ｇＧ、の腸への移行によって媒介されることが示された。Ｂｅ５ｓｅｒ　 ｅｌ　ａｌ、　（１９８８ａ）；　Ｂｅ５ｓｅｒ　ｅｌ　ａｌ、、　Ｊ、Ｖｉｒ ｏｌ。

６２：２２３４−２２３７　（１９８８ｂ）　。

生ウィルスおよび不活化ウィルスの直接的な比較に関する情報は、それが不活化 ロタウィルスの免疫原性の変化に関係するので、少ししか人手できない。ウシＲ ＩＴ４２３７０タウイルス株のホルマリンによる不活化はウィルスの変化を生じ させ、またこのようなウィルスでの非経口的（筋肉内）接種または胃内接種は、 ヒトロタウィルスで抗原投与された子ブタの交差保護を誘導し得なかったことが 報告されている。ｚｉｓｓｉｓ　ｅｌ　ａｌ、、Ｊ、Ｉｎｆｅｃ、Ｄｉｓ、１４ ８：１０６１−１０６８（１９８３）。ロタウィルス株ＲＲＶをβ−プロピオラ クトンにより不活化すると、子マウスの受動保護は達成されるが、生および不活 化ワクチンの凝血力価の比較によって測定されるＶＰ４反応性に変化を生じるこ とが報告されている。０ｆｆｉｌ　ａｎｄ　Ｄｕｄｉｋ（１９８９）〔発明の概 要〕 従って、本発明の一つの目的は、非経口的に使用することができる、ロタウィル スに対するワクチンを提供することである。

本発明の他の目的は、単独で投与することができ、或いはロタウィルスサブユニ ットワクチン若しくは経口ロタウィルスワクチンと組み合わせて投与することが できる、生または不活化ワクチンを提供することである。

本発明の一つの特徴は、ワクチンに使用されるロタウィルスが、培養可能な血清 型３の何れかのロタウィルス又はヒトロタウィルスが表現される他の培養可能な 血清型の何れかであることである。

本発明の他の特徴は、接種対象（幼児、成人または動物）の能動的免疫化によっ て、または誕生前に母親の免疫化による幼児又は若い動物の受動免疫を介して、 免疫化が達成されることである。

本発明の一つの側面は、ロタウィルス感染に対する生または不活化された非経口 的ワクチンであって、少なくとも一つのヒトロタウィルスを含むロタウィルス血 清型に分類されるウィルスを含をするワクチンである。

本発明の他の側面に従えば、ロタウィルス感染に対する生または不活化された非 経口的ワクチンであって、少なくとも一つのヒトロタウィルスを含むロタウィル ス血清型に分類されるウィルスを含有するワクチンで、ヒトまたは動物を免疫化 する方法が提供される。

更なる目的、特徴および利点は、以下に述べる本発明の好ましい実施例の説明か ら明らかであろう。

〔図面の簡単な説明〕

図１は、５Ａ１１０タウイルスのホルマリン不活化曲線である。感染性ウィルス の力価（ミリリットル当たりのＰＦＵ）は、各インキュベーション時間における ＭＡ−１０４細胞中のプラーク試験によって測定された。−◆−は未処理ウィル ス、−ｍ−はホルマリンを添加せずに３７℃でインキュベートしたウィルス、− ローはホルマリンで不活化したウィルスである。

好ましい実施態様の詳細 ウサギは、ロタウィルスに対する活性免疫の誘発および防御を調べるのに有用な モデルである事がわかっている。それ故、ウサギモデルは、ワクチンの非経口的 接種か、病毒性ウサギ（Ａｌａ）ロタウィルスの同型の抗原投与からウサギを防 御する免疫反応を誘発する事かできるかどうかを調べるために、本報告で使用さ れた。ウサギは生または不活化された血清型３のロタウィルス、５Ａ１１調製品 で接種された。このウィルスはそれ自身でもワクチンとして使用されつるが、ウ ィルスアジュバント組成の方が好ましい。

不活化ウィルスはホルマリン処理で調製された。他の不活化剤、例えば、β−プ ロピオラクトン、あるいは当該技術で良く知られているウィルス不活化技法なら どれも使用できる。

ウィルスの不活化はプラーク分析によって確定された。生および不活化ウィルス 調製品はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で希釈され、ふたつのアジュバント、つま りフロインドアジュバントまたはリン酸アルミニウムのうちのどちらかと結合さ れた。フロインドアジュバントは、大変有力な免疫調整物質である。リン酸アル ミニウムは、水酸化アルミニウムのように、人間における使用をＦＤＡで承認さ れたアジュバントである。リン酸カルシウム、ｂａｃｉｌｌｅＣｊ１ｍｒ目ｅ− Ｇｕｅｒｉｎ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｌｅｒｉｕｍ　ｐａｒｖｕｍおよびＢｏｒｄ ｅｔｅｌｌａ　ｐｅｒｆｕｓｓｉｓ等のアジュバントは広く当該技術で使用され ており、本報告でもこれらの代替が行われ得る。

ロタウィルス非感染群から得られた月齢５−６ケ月のウサギがテストされた。対 照を除く全てのウサギは、ウィルスアジュバントまたはＰＢＳアジュバント組成 により筋肉内に免疫接種された。免疫接種されたウサギとは一回または二回免疫 接種されたものである。各ウィルス投与量は約ｌＸＩＯ２からｌＸｌ０８ＰＦＵ ／ｍｌ、好ましくはｌＸｌ０７ＰＦＵ／ｍｌである。免疫接種後、免疫接種され たすべてのウサギおよび対照は、少なくともｌＸｌ０２ＰＦＵ／ｍｌ、好ましく は３ＸＩＯ’　ＰＦＵ／ｍｌの病毒性Ａｌａロタウィルスで経口的に抗原投与さ れた。

経口抗原投与として、無希釈ウィルスまたはＰＢＳで希釈されたウィルス１ｍｌ が、Ｃｏｎｎｅｒ　（１９８８）らが記載しているように、先端の尖っていない 供給針を使用して、注射針口がら投与された。ワクチン−回投与のウサギについ ては、接種後生なくとも約１４日（ｄｐｖ）　、好ましくは少なくとも約２１　 ｄｐｖたって病毒性のＡｌａロタウィルスの抗原が投与される。ワクチンを二回 投与されたウサギについては、０日目に初期投与量が投与され、二回目の投与量 が少なくとも約１４日ｄｐｖ（好ましくは少なくとも約２１　ｄｐｖ　）で投与 され、経口抗原投与は、二回目の投与後生なくとも７日目（好ましくは少なくと も２１ｄｐｖ）から投与される。ウサギモデルを基本として、慣用免疫手法に従 い、ヒト幼児の免疫接種が当業者によって実現されるであろう。

下記の特定の例に記載した時点で、およびＣｏｎｎｅｒ　（１９９］）らが先に 記載しているように、腸洗浄サンプルおよび血清サンプルを全ウサギから採集し た。洗浄工程を行う時間が必要なので、−日に最高１０匹のウサギが検体化でき る。それ故、洗浄およびその対応する血清サンプルが三日（できれば連続日）に わたって、各時点で採集された。データ分析のために、三日のサンプリング日間 で相違があってはならない。糞便のサンプルが抗原投与後０から１０日（＋Ｉｐ ｃ）に採集された。

ロタウィルスの排泄を測定するために、抗原ＥＬＩＳＡ法がＣｏｎｎｅｒら（１ ９８８）が先に記載している方法の改変法を使用して行なわれた。改変法は、簡 単に言うと以下の通りである。ポリビニルクロリドプレートを、１００μｍの過 度に免疫感作されたモルモット抗Ａｌａ血清で一晩室温で被覆し、ウェルをＰＢ Ｓ中５％のスキムミルク２００μｌで、２時間、３７℃で遮蔽した。一連の各工 程の試薬容量は、１００μｌであった。結合体はＰＢＳ中５％のスキムミルクで 希釈された。もし平均の複製ウェルのＡ４，４値が０．１より大きく、この吸光 度が陰性の希釈対照の吸光度値上の二つの標準偏差値以上であれば、サンプルは 陽性とみなされた。陽性対照として、各プレート上にはＡｌａｌミストツクウィ ルス続希釈物も入れられた。

抗体反応を測定するために、血清中および腸サンプル中の全抗ロタウィルス抗体 （ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＧ）を測定するためのＥＬＩＳＡ法が、先にＣｏｎｎｅ ｒら（１９９１）に記載されているように行われた。ＩｇＡ濃度を測定するため 、および血清および腸サンプル中の抗ロタウィルスＩｇＡ抗体を測定するための ＥＬＩＳＡ法が、先にＣｏｎｎｅｒら（１９９１）に記載されている手法の改変 法を使用して行われた。特に、この分析は、（ｉ）ビオチン（Ｇｕ＋５ｄｏｎｅ ｆ　ａｔ、、Ｊ、　Ｈｉｓｊｏ、Ｃｙｌｏ、２７：　１１３１−１１３９　（１ ９７９））に結合するウサギのＩｇＡ　（Ｃｏｌｅ、　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　 Ａｎｆｉｂｏｄ７　Ｎｅｗｓ　７：　２３−２４（１９８９））　（Ｃａｒｏｌ 　Ｃｏ１ｅ　ｏｆ　Ｎａｖａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、Ｂｅ１ｈｅｓｄａ。

Ｍｄ、提供）に特異的なモノクローナル抗体、（ｉｉ）アビジンホースラデッシ ューパーオキシダーゼ（ＩＩＲＰ）結合（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂ。

ｐｒａｆｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、Ｃａ１ｉｆ、）、および （ｉ　ｉ　ｉ）　ＴＭＢ（３ｊ’、　５．５’−１ｅｌｒａｍｅｌｈｙｌｂｅｎ ｘｉｄｉｎｅ）基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ　＆Ｐｅｒｒｙ　Ｌａｂｏｒａｌｏ ｒ、ｉｅｓ、Ｉｎｃ、Ｇａｉｌｈｅｒｓｂｕｒｇ、　Ｍｄ、）を使用して改変さ れた。抗原投与前後の腸洗浄サンプルについて全１ｇＡ濃度が測定された。個々 のウサギの連続サンプルにおける全ＩｇＡ濃度が１から４．４倍にしか変化しな いので、ＩｇＡ抗ロタウイルス力価は先に記載されている（Ｃｏｎｎｅｒら（＋ ９９１））ように、正規化されなかった。

腸サンプル中のＩｇＧ抗ロタウィルス抗体を計１定するＥＬＩＳＡ法が、ＩＩＲ Ｐ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ　（Ｈｙｃｌｏｎｅ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。

Ｉｎｃ、、Ｌｏｇａｎ、　Ｕｆａｈ　）を結合体として使用したこと以外は、全 抗体ＥＬＩＳＡ　（Ｃｏｎｎｅｒら（＋９９１））法と同様に行なわれた。

全抗体力価が、不対のサンプルについてのウイルコクソン順位和二標本検定を使 用して比較された。各ワクチン接種グループでは、ウサギの数が少ないので、抗 体力価およびウィルス排泄日数の統計学的比較が、（リン酸アルミニウムまたは フロインドアジュバント中のいずれかの）生および不活化ウィルス間、または、 （生および不活化）ウィルス−フロインドアジュバントと（生および不活化）ウ ィルス−リン酸アルミニウム間のみて行なわれたにすぎない。ウィルス排泄日数 平均の比較が５ｔｕｄｅｎｔテストを使用して行なわれた。生のＡｌａ抗原投与 からの防御性か、Ｆｉｓｈｅ「ｓ完全テスト両側検定を使用して分析された。

本実験では、ウサギが、フロインドアジュバントまたはリン酸アルミニウム中の 生および不活化５Ａ１１ウイルスによる二回（−回ではなく）のワクチン接種後 に、Ａ１ｇウィルス抗原投与からウサギが防御された。これらの実験における防 御性は、抗原投与後のウィルス排泄を調べる事で評価された。対照ウサギは全て 、ウィルス（平均排泄期間：５日）を排出したのに対し、二回ワクチン接種され たウサギはどれも、ＥＬＩＳＡによって検出した際に、検出可能なウィルスを排 泄しなかった。ウサギの非経口ワクチン接種後のウィルス感染（ウィルス排泄） を防御することは、経口抗原投与後まで、ウィルスワクチン接種されたウサギの 腸内でＩｇＡが検出されなかったので、抗ロタウィルスＩｇＡではなく抗ロタウ ィルスＩｇＧが腸内に存在することと関連していた。これらの結果は、腸内抗ロ タウイスＩｇＧ抗体が防御に介在している事を示唆する。

本発明の背景で述べた当該技術の抗体研究は、抗ロタウィルスＩｇＧによってウ サギが保護されていたという仮説を支持している。しかしながら、当該技術の研 究は、本実験におけるＩｇＧが、非経口接種によって刺激される活性免疫によっ て誘発され、受動催乳性免疫またはＩｇＧの経口投与によってではないという本 報告の結果と著しく相違している。

ロタウィルス表面抗原ＶＰ７またはＶＦ６とモノクローナル抗体との反応性にお ける微妙な差異、または全体のウィルスとポリクローナル抗体との反応性の微妙 な相違は、アジュバントと混合される前に、不活化ロタウィルスと生ロタウィル ス調製物とを比較したＥＬＩＳＡ法によって観察された。免疫反応と防御もまた 、二つのアジュバント；フロインドアジュバントおよびリン酸アルミニウムを使 用して比較された。二つのアジュバント中で、生および不活化ワクチンによって 誘発された血清および腸内抗体力価には変化が現れなかったけれども、各グルー プにおいてウサギ数が少ないために抗体の力価を統計的に比較するのは不可能で あった。しかし、二つのアジュバントで誘発される力価は、アジュバントの種に よるウサギのグループ化によって比較された。二回のワクチン接種後、リン酸ア ルミニウムアジュバントによってワクチン接種されたウサギと比較すると、フロ インドアジュバントでワクチン接種されたウサギにおいて著しく高い血清抗ロタ ウィルスの力価が誘発された、けれども、両グループにおいての防御性は観察さ れた。しかし、これら二つのアジュバントは、腸におけるＩｇＧまたは全抗ロタ ウイルス力価に著しい相違を誘発しなかった事は、ワクチン・アジュバント両組 成によって誘発される防御性が同一レベルであることを説明している。

二つのアジュバントによって誘発される血清力価における統計学的に重篤な相違 は、抗体投与後も残った。抗体投与後に、血清力価に若干の増加もあるいは増加 さえみられなかったので、驚きはなかった。これらのウサギは検出可能なウィル ス感染から防御されたので、腸内でウィルスの複製はまったく、または最小限し かおこらなかったようだ。投与ウィルスの投入量、または限られたウィルス複製 は、血清学的反応ではなくて、腸の反応を誘発あるいは増加に十分であったであ ろう。腸の抗体の誘発（Ｉ　ｇＡ）は、−匹のウサギを除いて全ウサギで観察さ れた。ＩｇＧおよび全１ｇの増加は３匹のウサギで観察された。

ウィルスでワクチン接種されたウサギのうち、−匹を除いた全てのウサギで、生 ウィルスによる経口抗体投与後に検出可能なＩｇＡ反応があった。これらの結果 は、非経口−経口、経口−非経口の組み合わせによるワクチン接種法もまた、腸 のＩｇＧ、ＩｇＡ免疫を誘発するために使用することができる事を示している。

本発明は、ここに記載され、実施例のためにのみ使用されたシミアン（ｓｉｍｉ ａｎ）・ロタウィルス５ＡＩＩクローン３の使用に限定されるものではない。本 発明は、ヒトロタウィルスに代表される培養可能な血清型３であればどれでも、 または他の培養可能な血清型ならばどれでも使用できる。ここで使用されている 血清型は、抗原抗体反応を特異的に中和することによるウィルスのクラス分けで ある。

実施例１ ０タウイルスワクチンの調製 ウィルス：　ワクチン用に使用されるシミアンロタウィルス５ＡＩＩクローン３ とウサギ抗体投与接種用および酵素結合免疫吸収分析（ＥＬＩＳＡ法）に使用さ れる＾ｌａウサギロタウィルスは共に、Ｃｏｎｎｅｒら（１９８８）；　Ｔａｎ ａｋａ　ｅｌ　ａｌ、、Ａｒｃｈ、Ｖｉｒｏｌ。

９８：　２５３−２６５（１９８８）；　Ｔｈｏｕｌｅｓｓ　ｅｌ　ａｌ、＾ｒ ｃｈ、　Ｖｉｒｏｌ、　８９：１６１−１７０　（１９８６）　；およびＥｒ１ ｃｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　４３：　８２５−８３９　（１９ ８２）によって先に記載されている。シミアンロタウィルス５ＡＩＩおよびＡｌ ａウサギロタウィルスは共に血清型３であり、そのＶＰ７反応性を基本とした。

Ｔａｎａｋａ、Ｃｔ　ａｔ、。

（１９８８）；　Ｔｈｏｕｌｅｓｓ　ｅｌ　ａｌ、　（１９８６）；　Ｈｏ５ｈ ｉｎｏ　ｅｌ　ａｌ、、Ｊ、Ｉｎｆｅｃｌ、Ｄｉｓ、１４９：　６９４−７０２ 　（１９８４）、これらのウィルスは、Ｃｏｎｎｅｒ　（１９８８）らによって 先に記述されているように、トリプシンの存在下でアカゲザル胎児腎臓（ＭＡ１ ０４）細胞中で培養された。

ＭＡＩ０４細胞溶解物によって作製された。溶解物は、細胞変性効果が最大にな ったところで感染ＭＡ１０４細胞を採収し、凍結、解凍し、細胞を超音波破壊し て作製された。不活化されたウィルスは、下記の手順を使用して約３７℃、振賭 器上でホルマリン（組織培養培地ＭＩ９９で、最終濃度的０．００９２５％にな るまで連続希釈されたもの）処理によって調製された。ウィルスサンプルは、プ ラーク分掛によってウィルスの不活化の程度をテストするためにホルマリンの添 加後、０．　１０．２０．　３０゜６０分、および２．４．６．２４．４８．７ ２時間で採集された。残留ホルマリンは、重亜硫酸ナトリウム（０，３５％溶液 中１５０μｍ／ｍｌのウィルス）を各時点で採集された各サンプルおよび７２時 間目の全ウィルス調製物に添加して中正口された。

対照５Ａ１１サンプルはホルマリンで処理されなかったが、約３７°Ｃ１振薇器 上で、約７２時間インキュベーションされ、次いで４°Ｃて貯蔵された。不活化 された５ＡＩＩウイルス及び対照５Ａ１１ウイルス調製物は、力価／ｌ１１定ま で４℃で貯蔵され、リン酸アルミニウムへ吸着させるか、フロインドアジュバン トと混合された。ホルマリンにより７２時間で不活化されたウィルス調製物は、 ワクチンとして使用された。

５ＡＩＩの不活化は、初めの６時間の間に力価を１０７ＰＦＵから１０’５ｐｒ ｕに減らす事で急激に進展した（図１）。不活化カーブの傾斜はこの初期期間後 、減少し、４８時間までには完全な不活化が起こった。

ウィルスワクチンの調製：　下記の方法を使用して、５ＡＩＩウイルスがリン酸 アルミニウムへ吸着された。生および不活化５ＡＩＩウイルス調製物がリン酸緩 衝食塩（ＰＢＳ）で希釈され、（調製物の元の力価を基準にした）　２Ｘ１０’ プラ一ク形成単位（ＰＦυ）のウィルスが生じ、１５００　ｒｐｍＳ１５分で超 音波破壊および洗浄された。ウィルス１ｍｌにつきリン酸アルミニウム約０．０ ７ｍ１を添加する前に、リン酸アルミニウムが、振薇器上、４°Ｃ１数時間で混 合された。全リン酸アルミニウムが添加されるまで、リン酸アルミニウムが５分 から１０分につき０．５ｍｌの割合で添加され、そして次にウィルスリン酸アル ミニウム混合物が、さらに２時間振薇された。リン酸アルミニウム吸着ウィルス 調製物は次に１０．０ＯＯＸ　ｇで１０分間遠心分離された。上澄液を除去し保 存され、ペレットがＰＢＳ中で元の容量になるまで懸濁され、使用するまで４℃ で貯蔵された。

ＰＢＳの対照調製物は同様の方法で処理された。吸着有効性がイムノプロットに よって、上澄液、ペレットおよび未処理動性は約５０％であると推定された。

５ＡＩＩフロインドアジユバントワクチン投与が、リン酸アルミニウム調製物と 同量の５ＡＩＬ抗原を確実に含む様に、フロインドアジュバント中の５ＡＩＩワ クチン調製物が、次の様に調製された。ウィルスのリン酸アルミニウムに対する 吸着有効性が、吸着前の元の調製物（２Ｘ　１０７ＰＦＵ）の５０％であること がわかったので、リン酸アルミニウムΦ５Ａ１１調製物１ｍｌ中のウィルスの量 がｌＸｌ０’　ＰＦυであることが推定された。それ故、生および不活化された ５ＡＩＩ−フロイントワクチンとして、完全フロインドアジュバント（最初のワ クチン投与）または不完全フロインドアジュバント（二回目のワクチン投与）が ｌ：ｌで混合された後、ｌＸｌ０７ＰＦＵ／ｍｌを得るためにウィルスが希釈さ れた。対照ＰＢＳ−フロイント調製物が同様の方法で調製された。

上記に述べた生ウィルス−リン酸アルミニウム、不活化ウィルス−リン酸アルミ ニウム、不活化ウィルス−フロインドアジュバント、および生ウィルス−フロイ ント組成が、ウィルス−アジュバント組成と本報告では呼ばれる。上記に述べた ＰＢＳ　リン酸アルミニウムおよびＰＢＳフロイント組成がＰＢＳアジュバント 組成またはＰＢＳ対照として本報告では呼ばれる。

実施例２ ０タウイルスの単一投与可能性 ウサギ、接種物、およびサンプル採集二　本研究に使用された５つの異腹からの 月齢５−６のウサギは、先に報告（Ｃｏｎｎｅｒら（１９８９，１９９１））さ れたように隔離ユニットで成育された特異病原（ロタウィルス）のない群から得 られた。実験のために、ウサギが群から隔離され、Ｂａｙｌｏｒ　ＣｏＣｏ１１ ｅｄ　ｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅにあるＢＬ２封じ込め施設にある隔離庫または開放 型の檻に入れられた。４対照動物を除く全ウサギが、実施例１に記載するように ウィルス−アジュバントまたはＰＢＳアジュバント組成組成１マｌ肉内にワクチ ン接種された。使用されたウィルス−アジュバントは生のウィルス−リン酸アル ミニウム、不活化ウィルス−リン酸アルミニウム、不活化ウィルス−フロイント 、生ウィルス−フロイントであった。

使用されたウィルスは、血清型３０タウイルス、５Ａ１１テあった。しかしなが ら、ヒトロタウィルスに代表される血清型３０タウイルスなら何でも、あるいは 他の培養可能な血清型なら何でも使用できる。不活化ウィルス、ウィルス−アジ ュバント組成およびＰＢＳ対照が実施例１に記載されたように調製された。同一 ロットのウィルスまたはワクチン調製物が全ウサギのワクチン接種に使用された 。全ウサギが、＾１ａウィルス、３Ｘ１０’　ＰＦυで経口的に抗体投与された 。腸洗浄および血清サンプルが、下記に述べた時点および表１の時点で全ウサギ から採集された。

１６ウサギがＯｄｐｖで一回目のワクチンが接種され、２０ｄｐＶで抗体投与さ れた。血清および腸洗浄サンプルがワクチン接種前に、１７．　から１８　ｄｐ ｖ、　４１から４５　ｄｐｖ　（２０から２４　ｄｐｃ）で採集された。二つの ワクチン接種グループ（生ウィルス−フロイント、および生ウィルス−リン酸ア ルミニウム）のうちの各々のグループから一匹のウサギが、抗体投与前に無量・ 係（無ロタウィルス）下痢性疾病（壊死性腸炎）で死亡した。

これらのウサギは分析から除外された。

免疫反応および一回のワクチン投与後の防御全ウサギは、これらの実験開始以前 にはロタウィルス抗体陰性であり、全ての対照ウサギは抗体投与後まで抗体陰性 のままであった（表１）。全ワクチン接種ウサギは１７がら１８ｄｐｖまてにセ ロコンバートされ、両方のアジュバントの生および不活化されたウィルス間にお いて、または、リン酸アルミニウムまたはフロインドアジュバント中のウィルス 間においても、力価の統計的に重篤な相違はみられなかった。只２匹のウサギが 、１７から１８　ｄｐｖで検出可能な腸内の全抗体反応（力価＝５）を保持して いた。

ウィルスの排泄から決定されるように、抗体投与（２０ｄｐｖ）からの防御およ び統計学的に重篤な相違は、生５Ａ１１−　アジュバント（平均５．７５日）ま たは不活性５ＡＩＩ−アジュバント（平均５，１６日）でワクチン接種されたウ サギ間、あるいは５Ａ１１−　リン酸アルミニウム（平均４．６日）とＳＡＩ＋ −フロインドアジュバント（平均６．２０）または対照グループでワクチン接種 されたウサギ間（平均５．７５日）の平均のウィルス排泄口では、みられなかっ た。抗体投与後に全ウサギで力価が４倍以上増加したけれども、抗体投与後にウ ィルスワクチン接種されたグループのいづれにおいても血清学的抗体反応におけ る重篤な相違は見られなかった。全ウサギは、抗体投与後、検出可能な腸の全抗 体反応があった。予想出来なかった発見は抗体投与後、腸のＩｇＧに特異的抗ロ タウィルス抗体が全てのウィルスワクチン接種されたウサギおよび対照動物−匹 で検出されたことであった。−匹を除く全ウサギで抗体投与後１ｇＡ抗ロタウィ ルス反応が現われた。

実施例３ ０タウイルスの連続投与可能性 ウサギ、接種物およびサンプル採集；　実施例２に記載されたように、隔離ユニ ットで成育された特異病原（ロタウィルス）のない群からウサギが得られた。４ 匹の対照動物（下記参照）を除く全ウサギが、実施例１に記載するようにウィル ス−アジュバントまたはＰＢＳアジュバント組成組成１マｌ９日、間を置いて二 回筋肉内にワクチン接種された。使用されたウィルス−アジュバントは生のウィ ルス−リン酸アルミニウム、不活性化ウィルス−リン酸アルミニウム、不活性化 ウィルス−フロイント、生ウィルス−フロイントであった。

使用されたウィルスは血清型３０タウイルス、５ＡＩＩであった。

しかしながら、ヒトロタウィルスに代表される血清型３０タウイルスなら何でも 、あるいは他の培養可能な血清型なら何でも使用できる。不活性化ウィルス、ウ ィルス−アジュバント組成およびＰＢＳ対照が実施例１に記載されたように調製 された。同一ロットのウィルスまたはワクチン調製物が全ウサギのワクチン接種 に使用された。全ウサギが、Ａｌａウィルスの３ＸＩ０５ＰＦＵで経口的に抗体 投与された。腸洗浄および血清サンプルが、下記に述べた時点および表２の時点 で全ウサギから採集された。

１８ウサギがＯｄｐｖでワクチン接種され、４９ｄｐｖで増量され、７］　ｄｐ ｖで抗体投与された（二回目投与から２２日目）。四つのワクチン接種グループ （生ウィルス−リン酸アルミニウム、不活性化ウィルス−リン酸アルミニウム、 不活性化されたウィルス−フロイントおよびＰＢＳフロイント）の各々から一匹 のウサギが、実験の継続中に発生した無関係（無ロタウィルス）な下痢性疾病（ 上記参照）で死亡した。これらのウサギは分析から除外された。８３ｄｐｖで、 ４匹の追加非ワクチン接種対照動物が本実験に投入された。血清および腸洗浄サ ンプルまたは両者がワクチン接種前、４９　ｄｐｖ　（血清サンプルのみ）、８ ３から８４　ｄｐｖ　（二回目の投与から１４日から１５５日目）９１から９２ ６ｐｖ　（２ｇから２１６ｐｃ）で採集された。

免疫反応および二回のワクチン投与後の防御：　全ウサギは、これらの実験開始 以前にはロタウィルス抗体陰性であり、全ての対照ウサギは抗体投与後まで抗体 陰性のままであった（表２）。全ワクチン接種ウサギは最初のワクチン投与後に 七ロコンバートされ、５Ａ１１フロインドアジユバントワクチン（生および不活 性グループ共に）のよって誘発された血清抗体力価が、５ＡＩＩ−リン酸アルミ ニウムワクチン（Ｐ＜　０．０２）によって誘発された力価よりも高かった。二 回目のワクチン投与後、Ｓ＾１１血清フロインドアジュバントによって誘発され る力価よりも依然低いけれとも、５ＡＩＩ−リン酸アルミニウムワクチン接種ウ サギの抗体力価が著しく増加した（　Ｐ＜０、０５）。前記の実験では一回目の ワクチン投与後の反応が欠如していたことを基に、本実験では、腸の洗浄サンプ ルは最初のワクチン投与後には採集されなかった。二回目のワクチン１１与後、 ＳＡ−］］１−リン酸アルミニウでワクチン接種されたウサギの抗体力価は著し く増加した（Ｐ　＜０．０５）　、けれども、それらは、５ＡＩＩフロインドア ジユバント（Ｐ＜０．０５）で誘発される物よりも力価は依然低かった。−回目 のワクチン投与後の反応性の欠如に基すき、本実験では一回目のワクチン投与後 、腸の洗浄サンプルは採集されなかった。

二回目のワクチン投与後、１４から１５日（６３から６４ｄｐｖ）で、全ウサギ で検出可能な抗体（Ｉｇ＾、ＩｇＭ、ＩｇＧ）が腸内にあった（表２）。腸内１ ｇ＾抗ロタウィルスは検出されなかったが、腸内１ｇＧ抗ロタウィルス抗体が、 全ワクチン接種されたウサギで検出された（力価の範囲、ｌＯから３２０）。腸 内のＩｇＧまたは全１ｇ力価について、いづれのアジュバント中の生ウィルスま たは不活性化されたウィルスでワクチン接種されたウサギと、フロインドアジュ バントまたはリン酸アルミニウム中のウィルスでワクチン接種されたウサギとの 間に統計学的に重篤な相違はみられなかった。

７１　ｄｐｖで抗体投与された後、４から６日で（平均５日）（表２）５つの全 対照ウサギがウィルスを排泄した。ＳＡ　１１をワクチン投与されたウサギはど れもウィルスを排泄しなかった。これは５ＡＩＬによるウィルスを非経口ワクチ ン接種によって抗体投与された生の病毒性＾１ａウィルスからウサギを能動的に 防御したことを示している。ウィルスを排泄したワクチン接種したウサギと対照 ウサギの数の差は、統計学的には重篤であった（Ｐ・０．００１）。

全５つの対照ウサギが、Ａｌａウィルス抗体投与後、七ロコンバートされた。ウ ィルスワクチン接種されたウサギの血清抗ロタウイルス力価は抗体投与の後、少 ししか変化しなかった。唯一、−匹のウサギ（Ｎｏ、　９）が、力価に重篤な変 化（４倍低下）を与えた。経口投与によって誘発された対照ウサギの最終の血清 力価は、非経口ＳＡ］１フロイントワクチン（Ｐ＜０、０２）によって誘発され た力価よりも低かったが、５ＡＩＩ　−リン酸アルミニウムワクチン（Ｐ　＜　 ０．０５）で誘発された力価よりも高かった。

抗体投与後、５つの対照ウサギすべてにおいて腸の抗体の転換が起こった。抗ロ タウィルスＩｇＡ抗体の高い力価が、経口抗体投与後、対照ウサギで誘発された 。腸のＩｇＡ抗ロタウィルス抗体も一匹のワクチン接種されたウサギ（Ｎｏ、　 ７）を除く全てのウサギで誘発された。これは、経口抗体投与時に存在していた ＩｇＧが局所的なＩｇＡ反応の誘発で阻害されなかった事を示している。−匹の ウサギ（Ｎｏ、　７）では、腸のＩｇＧ力価に１６倍の低下が見られたのに対し 、３から９のワクチン接種されたウサギにおいて、腸のＩｇＧ抗ロタウィルス抗 体力価に４倍以上の増加が観察された。５匹の対照のうち２匹がまた、抗体投与 後、腸のＩｇＧ抗ロタウィルス抗体の高い力価を持っていた。

実施例４ 非経ロー経ロワクチン組み合せ接種 実施例２で記載されたように、ウサギは特異病原（ロタウィルス）のない群から 得られた。ウサギは、Ｏｄｐｖに少くなとも一回は実施例１に記載されたウィル ス−アジュバント　１ｍｌで筋肉内にワクチン接種される。好ましくは二回目の 筋肉内ワクチン接種は少なくとも１４　ｄｐｖで、最も好ましくは少なくとも２ １　ｄｐｖで行う。使用されたウィルス−アジュバントは、生ウィルス−リン酸 アルミニウム、不活性化ウィルス−リン酸アルミニウム、不活性化ウィルス−フ ロイント、および、生ウィルス−フロイントから選択される。このウィルスは５ ＡＩＩであり、血清型３のロタウィルスであれば何でも、またはヒトロタウィル スに代表されるその他の培養可能な血清型であれば何でしよい。不活性化ウィル ス、ウィルス−アジュバント組成、およびＰＢＳ対照は実施例１に記載されたよ うに調製される。ウサギは、次ぎに、少なくとも生または不活性化ＳＡＩ＋、生 または不活性化Ａ１ｇウィルス、または当該技術で知られたロタウィルスワクチ ンならどれでも使用して、少なくともｌ　Ｉ　１０２ＰＦυ、好ましくは３１１ ０　’　ＰＦＵで経口的にワクチン接種される。経口ワクチン接種は、最後の筋 肉内注入後、少なくとも７日目に、好ましくは少なくとも２１１日目投与される のがよい。

実施例５ 経ロー非経ロワクチン組み合せ接種 実施例２で記載されたように、ウサギは特異病原（ロタウィルス）のない群から 得られる。ウサギは、少（なとも−回は生または不活性化５ＡＩＩ、生または不 活性化Ａｌａウィルス、または当該技術で知られたロタウィルスワクチンならど れでも使用して、］Ｘ１ｌ）２ＰＦυ、好ましくは３ＸｌＯ’　ＰＦＵで経口的 にワクチン接種される。ウサギは、次ぎに、実施例１に記載されたウィルス−ア ジュバント　１ｍｌで、経ロワアクチン接種後、少なくとも７０目、好ましくは 少なくとも２１１日目、少なくとも一回は筋肉内にワクチン接種される。使用さ れたウィルス−アジュバントは、生ウィルス−リン酸アルミニウム、不活性化ウ ィルス−リン酸アルミニウム、不活性化ウィルス−フロイント、および、生ウィ ルス−フロイントから選択される。このウィルスは５ＡＩＩであり、血清型３の ロタウィルスであれば何でも、またはヒトロタウィルスに代表されるその他の培 養可能な血清型であれば何でもよい。不活性化ウィルス、ウィルス−アジュバン ト組成、およびＰＢＳ対照は実施例１に記載されたように調製される。

実施例６ 非経ローサブユニットワクチン組み合せ接種実施例２で記載されたように、ウサ ギは特異病原（ロタウィルス）のない群から得られた。ウサギは、Ｏｄｐｖ、お よび１４−４９　ｄｐｖに二回筋肉内にワクチン接種される。好ましくは二回目 の筋肉内ワクチン接種は少なくとも２１　ｄｐｖで行われる。

ウィルス−アジュバントは二回のワクチン接種のうちの一回に使用される。ロタ ウィルスのサブユニットワクチン−アジュバントがもう一方に使用される。ウィ ルス−アジュバントは、実施例１に記載された生ウィルス−リン酸アルミニウム 、不活性化ウィルス−リン酸アルミニウム、不活性化ウィルス−フロイント、お よび、生ウィルス−フロイントから選択される。このウィルスは、血清型３０タ ウイルス、またはヒトロタウィルスに代表されるその他の培養可能な血清型であ れば何でもよい。不活性化ウィルス。ウィルス−アジュバント組成およびＰＢＳ 対照が調製される。実施例１に記載されたウィルス−アジュバント１ｍｌが、ワ クチン接種の間に投与される。

使用されるサブユニットワクチンは、ＶＰＩ、　ＶＦ６．　ＶＦ６．　ＶＦ６、 ＶＦ６．　ＶＦ６．ＶＦ６．　ＶＦ６．　Ｎ５３５．　Ｎ５３４、およびＮ５２ ８からなるグループより選択された二つ以上のロタウィルス蛋白の組み合わせか ら生産される。好ましくは、サブユニットワクチンは組換分子から作製される。

組換分子を生産する方法であれば度の方法でもよいが、組換分子を生産する下記 の方法が好ましい。その方法は、（り遺伝子１、遺伝子２、遺伝子３、遺伝子４ 、遺伝子５、遺伝子６、遺伝子７、遺伝子８、遺伝子９、遺伝子１０、遺伝子１ １からなるロタウィルス遺伝子のグループより選択される少なくとも二つのロタ ウィルス遺伝子をバキュロウィルス　トランスファー　ベクタに挿入し；（ｂ） バキュロウィルス　トランスファー　ベクタ中の少なくイルスで５ｐｏｄｏｐｌ ｅｒｘ　Ｉｔｕｇｉｐ＜ｒｄｘに共トランスフェクトすることによって＾ｕｆｏ ｇｒａｐｈｉ　ｃａｌｉｌｏｔｎｉｃｘ　ｎｕｃｌＣｉｔ　ｐｏ１７ｈｔｄｒｏ ｓロウイルスゲツムＤＮＡに挿入し；（Ｃ）閉塞陰性プラークを同定することに より、または、特異的遺伝子プローブによってハイブリダイズすることにより、 またはその両方により組換ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎプロモータ・ロタウィルス遺伝 子分子を選択し；および（ｄ）組換分子を含有するウィルスストックを得るため に、該プラークを精製することからなる。より好ましくは、サブユニットワクチ ンはＶＦ６．　ＶＦ６．　ＶＦ６．　ＶＦ６のうち二つ以上の組み合わせから作 製される。サブユニットワクチンは例えば、フロインドアジュバントまたはリン 酸アルミニウムのようなアジュバントによって投与される。１ｍｌのサブユニッ トワクチンがワクチン−アジュバントｍｌあたり、少なくとも０．５μｇ１好ま しくは２０μｇのロタウィルス蛋白の割合で投与される。

実施例７ 受動免疫 ヒトまたは動物の胎児の、ロタウィルス感染に対する受動免疫は、実施例２から ６に記載されているように、３つの免疫感作方法のどれかの方法の下で、母親を 能動的に免疫感作する事によって成し遂げられる。ａ）母親を初期投与で免疫感 作し、その子供が生まれる前に、増強免疫をあたえる。ｂ）母親をその子供が生 まれる前に、初期投与で免疫感作し、母親の授乳中に増強免疫をあたえる。Ｃ） 母親を初期投与で免疫感作し、母親の授乳中に増強免疫をあたえる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．少なくとも１種のヒトロタウイルスを含むロタウイルス血清型に分類される 生きたウイルスを含有するロタウイルス感染に対する非経口生ワクチン ２．前記ロタウイルス血清型が、血清型１、血清型２、血清型３、血清型４、血 清型８、血清型９、血清型１０、および血清型１２からなる群より選ばれる請求 の範囲第１項記載のワクチン。 ３．前記ロタウイルス血清型が血清型３である請求の範囲第１項記載のワクチン 。 ４．前記ウイルスがアジュバントと共に投与される請求の範囲第１項記載のワク チン。 ５．ウイルスが少なくとも１種のヒトロタウイルスを含むロタウイルス血清型に 分類される、不活化ウイルス；および 該ウイルスと混合されたアジュバント を含有するロタウイルス感染に対する非経口不活化ワクチン。 ６．前記ロタウイルス血清型が、血清型１、血清型２、血清型３、血清型４、血 清型８、血清型９、血清型１０、および血清型１２からなる群より選ばれる請求 の範囲第５項記載のワクチン。 ７．前記ロタウイルス血清型が血清型３である請求の範囲第５項記載のワクチン 。 ８．前記ウイルスがアジュバントと共に投与される請求の範囲第５項記載のワク チン。 ９．請求の範囲第１項記載のワクチンの１回投与量を少なくとも２回非経口的に 投与することを包含するロタウイルス感染に対する動物もしくはヒトの免疫方法 であって、該１回投与量の各々が約１×ｌ０２ないし約１×１０８ＰＦＵ／ｍＩ のウイルスを含有する免疫方法。 １０．各１回投与量が約１×１０７ＰＦＵ／ｍＩのウイルスを含有する請求の範 囲第９項記載の方法。 １１．第２の１回投与量を、第１の投与の少なくとも１４日後に投与する請求の 範囲第９項記載の方法。 １２．請求の範囲第５項記載のワクチンの１回投与量を少なくとも２回非経口的 に投与することを包含するロタウイルス感染に対する動物もしくはヒトの免疫方 法であって、該１回投与量の各々が約１×１０２ないし約１×１０８ＰＦＵ／ｍ Ｉのウイルスを含有する免疫方法。 １３．各１回投与量が約１×１０７ＰＦＵ／ｍＩのウイルスを含有する請求の範 囲第１２項記載の方法。 １４．第２の１回投与量を、第１の投与の少なくとも１４日後に投与する請求の 範囲第１２項記載の方法。 １５．ロタウイルス感染に対する動物もしくはヒトの免疫方法であって、 （ａ）少なくとも１種のヒトロタウイルスを含むロタウイルス血清型に分類され るウイルスを約１×ｌ０２ないし約１×１０８ＰＦＵ／ｍＩ含有する生ワクチン の１回投与量を少なくとも１回非経口的に投与する工程、および（ｂ）少なくと も１種のヒトロタウイルスを含む該ロタウイルス血清型に分類される不活化ウイ ルスを約１×１０２ないし約１×ｌ０８ＰＦＵ／ｍＩ含有する不活性型ワクチン の１回投与量を少なくとも１回非経口的に投与する工程を包含し、工程（ａ）お よび（ｂ）はいかなる順序で行なってもよい方法。 １６．少なくとも１種のヒトロタウイルスを含む前記ロタウイルス血清型が、血 清型１、血清型２、血清型３、血清型４血清型８、血清型９、血清型１０、およ び血清型１２からなる群より選ばれる請求の範囲第１５項記載の方法。 １７．前記生ワクチンの１回投与量が１×１０７ＰＦＵ／ｍＩのウイルスを含み 、かつ前記不活化ワクチンの１回投与量が約１×１０７ＰＦＵ／ｍＩのウイルス を含む請求の範囲第１５項記載の方法。 １８．工程（ａ）および（ｂ）を、少なくとも１４日間おいて行なう請求の範囲 第１５項記載の方法。 １９．ロタウイルス感染に対する動物もしくはヒトの免疫方法であって、 （ａ）請求の範囲第１項もしくは第５項に記載のワクチンの１回投与量を少なく とも１回非経口的に投与する工程であって、該１回投与量が約１×１０２ないし １×１０８ＰＦＵ／ｍＩのウイルスを含む工程；および （ｂ）少なくとも１×１０２ＰＦＵのロタウイルスワクチンを経口投与する工程 、 を包含し、該工程（ａ）および（ｂ）はいかなる順序で行なってもよい方法。 ２０．請求の範囲第１項もしくは第５項のワクチンの前記１回投与量が約１×Ｉ ０７ＰＦＵ／ｍＩのウイルスを含む請求の範囲第１９項記載の方法。 ２１．工程（ａ）および（ｂ）を少なくとも７日間おいて行なう請求の範囲第１ ９項記載の方法。 ２２．ロタウイルス感染に対する動物もしくはヒトの免疫方法であって、 （ａ）請求の範囲第１項もしくは第５項に記載のワクチンの１回投与量を少なく とも２回非経口的に投与する工程であって、該１回投与量の各々が約１×１０２ ないしｌ×１０８ＰＦＵ／ｍＩのウイルスを含み、かつ第２の１回投与量を第１ の投与の約１４ないし約４９日後に投与する工程；および（ｂ）少なくともｌ× １０２ＰＦＵのロタウイルスワクチンを経口投与する工程、 を包含し、該工程１ａ）および（ｂ）はいかなる順序で行なってもよい方法。 ２３．請求の範囲第１項もしくは第５項の前記１回投与量が、各々約１×１０７ ＰＦＵ／ｍＩのウイルスを含む請求の範囲第２２項記載の方法。 ２４．工程（ａ）および（ｂ）を少なくとも７日聞おいて行なう請求の範囲第２ ２項記載の方法。 ２５．ロタウイルス感染に対するヒトもしくは動物幼児の免疫方法であって、 （ａ）第１のワクチンの１回投与量を少なくとも１回非経口的に投与する工程、 および （ｂ）第２のワクチンの１回投与量を少なくとも１回非経口的に投与する工程、 を包含し、該第１のワクチンが約１×１０２ないし約１×１０８ＰＦＵ／ｍＩの 請求の範囲第１項もしくは第５項に記載のワクチンであり、該第２のワクチンが 少なくとも０．５μｇのロタウイルスサブユニットワクチンであり、かつ工程（ ａ）および（ｂ）はいかなる順序で行なってもよい方法。 ２６．前記第１のワクチンが、約１×１０７ＰＦＵ／ｍＩの請求の範囲第１項も しくは第５項に記載のワクチンである請求の範囲第２５項記載の方法。 ２７．工程（ａ）および（ｂ）を、いかなる順序で行なってもよく、かつ少なく とも１４日間おいて行なう請求の範囲第２５項記載の方法。 ２８．ロタウイルス感染に対するヒトもしくは動物幼児の受動免疫方法であって 、 幼児が誕生する前に、請求の範囲第１項記載のワクチンの１回投与量を少なくと も２回母親に非経口的に投与する工程を包含し、各々の１回投与量が約１×１０ ２ないし約１×ｍ８ＰＦＵ／ｍＩのウイルスを含む方法。 ２９．ロタウイルス感染に対するヒトもしくは動物幼児の受動免疫方法であって 、 幼児が誕生する前に、請求の範囲第５項記載のワクチンの１回投与量を少なくと も２回母親に非経口的に投与する工程を包含し、各々の１回投与量が約１×１０ ２ないし約１×１０８ＰＦＵ／ｍＩのウイルスを含む方法。 ３０．ロタウイルス感染に対する動物もしくはヒト幼児の受動免疫方法であって 、 幼児が誕生する前に、少なくとも１種のヒトロタウイルスを含むロタウイルス血 清型に分類されるウイルスを約１×１０２ないし約１×１０８ＰＦＵ／ｍＩ含有 する生ワクチンの１回投与量を少なくとも１回母親に非経口的に投与する工程、 および 前記母親に、幼児が誕生する前に、少なくとも１種のヒトロタウイルスを含む前 記ロタウイルス血清型に分類される不活化された形態のウイルスを約１×１０２ ないし約１×１０８ＰＦＵ／ｍＩ含有する不活化ワクチンの１回投与量を少なく とも１回非経口的に投与する工程、 を包含し、工程（ａ）および（ｂ）はいかなる順序で行なってもよく、かつ少な くとも１４日間おいて行なわれる方法。 ３１．ロタウイルス感染に対する動物もしくはヒト幼児の受動免疫方法であって 、 （２）幼児が誕生する前に、請求の範囲第１項もしくは第５項記載のワクチンの １回投与量を少なくとも１回母親に非経口的に投与する工程であって、該１回投 与量が約１×１０２ないし約１×１０８ＰＦＵ／ｍＩのウイルスを含む工程；お よび（１）前記母親に、幼児が誕生する前に、少なくとも１×１０２ＰＦＵのロ タウイルスワクチンを経口投与する工程、を包含し、該工程（ａ）および（ｂ） はいかなる順序で行なってもよく、かつ少なくとも７日聞おいて行なわれる方法 。 ３２．ロタウイルス感染に対する動物もしくはヒト幼児の受動免疫方法であって 、 （ａ）幼児が誕生する前に、母親に第１のワクチンの１回投与量を少なくとも１ 回非経口的に投与する工程、および（ｂ）前記母親に、幼児が誕生する前に、第 ２のワクチンの１回投与量を少なくとも１回非経口的に投与する工程、を包含し 、該第１のワクチンが約１×１０２ないし約１×１０８ＰＦＵ／ｍＩの請求の範 囲第１項もしくは第５項に記載のワクチンであり、該第２のワクチンが少なくと も０．５μｇのロタウイルスサブユニットワクチンであり、および工程（ａ）お よび（ｂ）はいかなる順序で行なってもよく、かつ少なくとも１４日間おいて行 われる方法。 ３３．ロタウイルス感染に対するヒトもしくは動物幼児の受動免疫方法であって 、 請求の範囲第１項記載のワクチンの１回投与量を少なくとも２回養母に非経口的 に投与する工程を包含し、各々の１回投与量が約１×１０２ないし約１×１０８ ＰＦＵ／ｍＩのウイルスを含み、かつ第２の１回投与量が第１の投与の少なくと も１４日後に投与される方法。 ３４．ロタウイルス感染に対するヒトもしくは動物幼児の受動免疫方法であって 、 請求の範囲第５項記載のワクチンの１回投与量を少なくとも２回養母に非経口的 に投与する工程を包含し、各々の１回投与量が約１×ｍ２ないし約１×１０８Ｐ ＦＵ／ｍＩのウイルスを含み、かつ第２の１回投与量が第１の投与の少なくとも １４日後に投与される方法。 ３５．ロタウイルス感染に対する動物もしくはヒト幼児の受動免疫方法であって 、 （ａ）少なくとも１種のヒトロタウイルスを含むロタウイルス血清型に分類され るウイルスを約１×１０２ないし約１×１０８ＰＦＵ／ｍＩ含有する生ワクチン の１回投与量を少なくとも１回養母に非経口的に投与する工程、および（ｂ）前 記養母に、少なくとも１種のヒトロタウイルスを含む前記ロタウイルス血清型に 分類される不活化された形態のウイルスを約１×１０２ないし約１×１０８ＰＦ Ｕ／ｍＩ含有する不活化ワクチンの１回投与量を少なくとも１回非経口的に投与 する工程、 を包含し、工程（ａ）および（ｂ）はいかなる順序で行なってもよい方法。 ３６．ロタウイルス感染に対する動物もしくはヒト幼児の受動免疫方法であって 、 （ａ）約１×１０２ないし約１×１０８ＰＦＵ／ｍＩのワクチンの１回投与量を 少なくとも１回養母に非経口的に投与する工程であって、該ワクチンが、少なく とも１種のヒトロタウイルスを含むロタウイルス血清型に分類される生きている ウイルスを含有するロタウイルス感染に対する生ワクチン、および少なくとも１ 種のヒトロタウイルスを含むロタウイルス血清型に分類される不活化ウイルスを 含有するロタウイルス感染に対する不活化ワクチンからなる群より選ばれる工程 ；および、 （ｂ）前記養母に少なくとも１×１０２ＰＦＵのロタウイルスワクチンを経口投 与する工程、 を包含し、前記工程（ａ）および（ｂ）はいかなる順序で行なってもよい方法。 ３７．ロタウイルス感染に対する動物もしくはヒト幼児の受動免疫方法であって 、 （ａ）約１×１０２ないし約１×１０８ＰＦＵ／ｍＩの第１のワクチンの１回投 与量を少なくとも１回養母に非経口的に投与する工程であって、該第１のワクチ ンが、少なくとも１種のヒトロタウイルスを含むロタウイルス血清型に分類され る生きているウイルスを含有するロタウイルス感染に対する生ワクチン、および 少なくとも１種のヒトロタウイルスを含むロタウイルス血清型に分類される不活 化ウイルスを含有するロタウイルス感染に対する不活化ワクチンからなる群より 選ばれる工程；および、 （ｂ）少なくとも０．５μｇの第２のワクチンの１回投与量を少なくとも１回養 母に非経口的に投与する工程であって、該第２のワクチンがロタウイルスサブユ ニットワクチンである工程、 を包含し、該第１および第２のワクチンはいかなる順序で投与してもよい方法。 ３８．ロタウイルス感染に対するヒトもしくは動物幼児の受動免疫方法であって 、 約１×１０２ないし約１×１０８ＰＦＵ／ｍＩの請求の範囲第１項記載のワクチ ンの１回投与量を少なくとも２回母親に非経口的に投与することを包含し、第１ の投与量を幼児が誕生する前に該母親に投与し、かつ第２の投与量を該母親が幼 児を養育している間に投与する方法。 ３９．ロタウイルス感染に対するヒトもしくは動物幼児の受動免疫方法であって 、 約１×１０２ないし約１×１０８ＰＦＵ／ｍＩの請求の範囲第５項記載のワクチ ンの１回投与量を少なくとも２回母親に非経口的に投与することを包含し、第１ の投与量を幼児が誕生する前に該母親に投与し、かつ第２の投与量を該母親が幼 児を養育している間に投与する方法。 ４０．ロタウイルス感染に対する動物もしくはヒト幼児の受動免疫方法であって 、 少なくとも１種のヒトロタウイルスを含むロタウイルス血清型に分類されるウイ ルスを約１×１０２ないし約１×１０８ｐＦＵ／ｍＩ含有する生ワクチンの１回 投与量を少なくとも１回母親に非経口的に投与する工程、および前記母親に、少 なくとも１種のヒトロタウイルスを含む前記ロタウイルス血清型に分類される不 活化された形態のウイルスを約１×１０２ないし約１×１０８ＰＦＵ／ｍＩ含有 する不活化ワクチンの１回投与量を少なくとも１回非経口的に投与する工程、 を包含し、生ワクチンおよび不活化ワクチンはいかなる順序で投与してもよく、 一方の投与が前記母親の幼児が誕生する前に行なわれ、他方の投与が前記母親が 幼児を養育している間に行なわれる方法。 ４１．ロタウイルス感染に対する動物もしくはヒト幼児の受動免疫方法であって 、 （ａ）約１×１０２ないし約１×１０８ＰＦＵ／ｍＩのワクチンの１回投与量を 少なくとも１回母親に非経口的に投与する工程であって、該ワクチンが少なくと も１種のヒトロタウイルスを含むロタウイルス血清型に分類される生きたウイル スを含有するロタウイルス感染に対する生ワクチン、および少なくとも１種のヒ トロタウイルスを含むロタウイルス血清型に分類される不活化ウイルスを含有す るロタウイルス感染に対する不活化ウイルスからなる群より選ばれる工程；およ び（ｂ）前記母親に、少なくとも１×１０２ＰＦＵのロタウイルスワクチンを経 口投与する工程、 を包含し、該非経口投与および該経口投与はいかなる順序で行なわれてもよく、 および一方の投与が前記母親の幼児が誕生する前に行なわれ、かつ他方の投与が 前記母親が幼児を養育している間に行なわれる方法。 ４２．ロタウイルス感染に対する動物もしくはヒト幼児の受動免疫方法であって 、 （ａ）約１×１０２ないし約１×１０８ＰＦＵ／ｍＩの第１のワクチンの１回投 与量を少なくとも１回母親に非経口的に投与する工程であって、該ロタウイルス ワクチンが、少なくとも１種のヒトロタウイルスを含むロタウイルス血清型に分 類される生きてたウイルスを含有するロタウイルス感染に対する生ワクチン、お よび少なくとも１種のヒトロタウイルスを含むロタウイルス血清型に分類される 不活化ウイルスを含有するロタウイルス感染に対する不活化ワクチンからなる群 より選ばれる工程；および、 （ｂ）少なくとも０．５μｇの第２のワクチンの１回投与量を少なくとも１回母 親に非経口的に投与する工程であって、該第２のワクチンがロタウイルスサブユ ニットワクチンである工程、 を包含し、該第１および第２ワクチンはいかなる順序で投与されてもよく、およ び一方の投与が前記母親の幼児誕生の前に行なわれ、かつ他方の投与が前記母親 が幼児を養育している間に行なわれる方法。