JPH05508325A - ヒトのロータウイルスｈｃｒ３、そのリアソータント、及びこれらを含むワクチン組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトのロータウィルスＨＣＲ３、そのリアソータント、及びこれらを含むワクチ ン組成物 本発明は、主として、新規なヒトの細胞変性（ｃｙｔｏ−ｐａｔｈｉｃ）ロータ ウィルス（ｒｏｔａｖｉｒｕｇ）　％及びヒトのロータウィルス遺伝子の表現（ ｅｘｐｒｅｓｓ　１ｏｎ）のためのビーグル（ｙｅｈｉｃｌｅ　）としてそれを 使用することに関する。特に、本発明は、新しく分離された血清タイプ３　（Ｈ ＣＨ３）のヒトのロータウィルス、このウィルスから作られたりアソータント（ ｒｅａｓｓｏｒｔａｎｔ）　、及びウィルス自体とそのリアソータントとを含む ワクチンに関する。また、本発明は、好適なヒトのロータウィルス抗体が高い滴 定濃度（ｈｉｇｈ　ｔｉｔｅｒ）で表現されるようにウィルス及びそのリアソー タントを使用する方法、及びこれらの抗体を使用するワクチンを生成することに 関する。

ｌ豆晟宜遣 ロータウィルスは、伝染性胃腸炎（下痢）の１つの最も重要な病因学的要因であ り、この胃腸炎は世界中で幼児死亡の最大原因となっている。

急性の伝染性胃腸炎による幼児死亡数は年間で５００万乃至１０００万と推定さ れ［Ｗａｌｓｈ　ｅｔ　ａｌ、　胆」二重化Ｃ−Ｊ　Ｗｅｄ　出：９６７　（１ ９７９）コ、ロータウィルスが原因となるものは、総死亡数の１０乃至４０％を 占めている［ｄｅＺｏｙｓａ　ａｎｄ　Ｆｅａｃｈｏｍ、Ｂｕｌ上−ｊｌＨｏ　 ６３：５６９　（１９８５）］　。

ロータウィルス誘発型の伝染性胃腸炎は、先進国においてさえも、幼児死亡の上 位１０位の原因のうちの１つとなっている［）Ｉｏ　ｅｔ　ａｌ、　２７ｔｈ　 Ｉｎｔｅｒｓｅｉｅｎｃｅ　Ｃｏｎｆ、　Ａｎｔｉ−ｓｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ａ ｇｅｎｔｓ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ、　ｐ２　（１９８７）］　。

霊長動物及び牛に起源を持つロータウィルスは、直径が約７Ｏｎ−の球形ウィル スであり、二重カプシド（ｃａｐ−ｓ　ｉｄ）構造に特徴がある。ロータウィル スゲノムは、１１セグメントの二重に絡み合ったＲＮＡと、ＲＮＡポリメラーゼ とを有する。ロータウィルスゲノムセグメントの番号付けは独自に行れており、 従来では、分子の大きさや電気泳動に基づき行われていた。

現在判明している動物及びヒトのロータウィルスの大部分は、グループＡロータ ウィルスと呼ばれており、共通する交差反応型（ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｅ ）抗体を作り出す［Ｅｓｔｅｓ　ｅｔ　ａｌ、　Ｉｍｍｕｎｏｃｈ　ｍ１ｓｔｒ 　ｏｆ　Ｖｉｒ　ｅ　ＥｌｓｅｖｉｅｒＡｍｓｔｅｒｄａｍ：３８９　（１９８ ４）］　、　］Ｏ−タウイルの異なる種は、独特の血清タイプ特異ウィルス表面 抗体によって識別可能であり、この抗体は従来の血清中和（ＳＮ）テストできわ めて簡単に検出され得る。ＳＮテストにおいて、特定血清タイプの精製ウィルス に対して調製された抗血清は、異種血清タイプウィルスに対してよりも同種血清 タイプのウィルスに対して高いＳＮ滴定濃度を示す。

ヒトのロータウィルスの中で、現在、少なくとも６つの血清タイプが確認されて いる。これは、血清タイプ１゜２．３，４．８及び９であり［Ｗｙａｔｔ　ｅｔ 　ａｌ、堕Ｃ■２ｊ＠ｕｎｏ１　、　３７：１１０　（１９８３）；　Ｍａｔｓ ｕｎｏ　ｅｔ　ａｌ、Ｊ　Ｖｉｒｏｌ　、５４：６２３　（１９８５）；及びＣ １ａｒｋ　ｅｔ　ａｔ、　Ｊ　Ｃ１１ｎ　Ｍｉｃｒ　ｂｉｏｌ、録：１７５７　 ’　１９８７）］、血清タイプ１乃至４がヒトの感染の大部分を占めている。

動物及びヒトの種々の血清タイプの交差免疫性についての現在利用できる情報は 、ロータウィルス感染に対する免疫保護を与えるような血清タイプ特異抗原刺激 作用の必要性と矛盾した結果を与えている０例えば、動物についてのワクチン攻 撃研究に関する種々の報告を参照［Ｗｙａｔｔ　ｅｔ　ａｌ、　叙山狙勉工２０ ３：５４ｇ　（１９７９）；　Ｚｉｓｓｉｓ　ｅｔａｌ、　Ｉｎｆｅ　Ｄｉ　１ ４影１０６１　（１９８３）：　５ｈｅｒｉｄａｎ　ｅｔａｌ、　Ｊ　Ｉｎｆ　 ｃｔ　Ｄｉ　、　１４９：４３４　（１９８４）］　、　＊１”＝、ヒト及び動 物で評価されたロータウィルスワクチンについての種々の報告を参照［Ｍｅｂｕ ｓ　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ　Ａ、Ｖ　Ｍ　Ａ　、　囚：８８０　’１９７３）；　Ｔ ｈｕｒｂｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　Ｃｎ　、　Ｖｅｔ　Ｊ　、　１７：１９７　（１ ９７Ｂ）；　Ｖｅｓｉｋａｒｉ　ｅｔ　ａｌ、　Ａ■１ｋＺ：８０７　（１９８ ３）；　ＤｅＭｏｌ　ｅｔａｌ、　」飢匹ムｇ：１０８　（１９８６）；　Ｃ１ ａｒｋ　ｅｔ　ａｌ、　Ａｍｅｒ　Ｊ−ｉ　ｈ’　、　１ｉＱ：３５０　（１９ ８６）；　Ｋａｐｉｋｉａｎ　ｅｔ　ａｌ、　ＶＭｔ山ｈｅｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏ ｒｋ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ、、　３５７　（１９ ８５）；　Ｌｏｓｏｎｓｋｙ　ｅｔ　ａｌ、　Ｐｅ　ｉ　ｔｒ　Ｉｎｆｅｅｔ　 Ｄ’ｓ　、　５：２５　（１９８６）　；及びＳａｎｔｏｓｈａｍ　ｅｔ　ａｌ 、　２７ｔｈ　Ｉｎｔ、　Ｃｏｎｆ−Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ａｇｅｎｔ ｓ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ　ｐ＋　９９　（１９８７）コ。

有効なロータウィルスワクチンを開発する努力は現在まで徒労に終わっている［ ＨＦ、　Ｃ１ａｒｋ、　”Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ　Ｖａｃ−ｃｉｎｅｓ、ｕ旦阻且 旺、Ｐｌｏｔｋｉｎ　Ｓ、Ａ、、Ｍｏｒｔｉｍｅｒ　Ｅ、Ａ、、ｅｄｓ。

（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、Ｗ、Ｂ、５ａｕｎｄｅｒｓ：　１９８８）、ｐ、 ５１７；　［１（Ｆ。

Ｃ１ａｒｋ、Ｉｍｍ　ｎｊｚａｔｉｏｎ　Ｗｏｎｔ　ｏｒ、３：３　（１９８８ ）；　Ｒ，Ｓ。

Ｄａｕｍ　ａｔ　ａｌ、Ｎｅｗ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｖａｃｃｉ ｎｅｓ、”　ＩＪｙ、−Ｐｅｄｉａｔｒ　Ｉｎｆ　ｔ　Ｄｉｓ、、　ｑ：１　（ １９９１）］ｓまた、ロータウィルスワクチンの効能を報告したＷＨＯＮｅｗｓ 　ａｎｄ　Ａｃｔｉ−ｖｉｔｉｅｓ、”−力Ｊユニ對用工６７（５）：　５８３ −５８７　（１９８９）を参照。

動物に起源を持つワクチンは、経口投与される生きたウィルスを必要とする臨床 実験で評価されたとき、充分でないことが多い０例えば、牛のロータウィルスワ クチン株ＲＩＴ４２３７による幼児の免疫方法は安全であり且つ６０−８０％の 被投与者において測定可能な血清抗体反応を誘発したのであるが、フィンランド における実験で検出された早期保護反応（ｅａｒｌｙ　ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　 ｒｅｓ−ｐｏｎｓｅ）に続いて、アフリカ及び米国の臨床実験の不成功が報告さ れた［上記に示したＤａｕｍ　ｅｔ　ａｌを参照］。

ヒトのワクチンを使用してテストされた他の候補体、すなわち、猿に起源を持つ ロータウィルスＲＲＶ　（ＭＭＵ１８００６）は、ＲＩＴ４２３７より免疫性が あることがわかったが、ロータウィルス病に対して常に保護が与えられるとは限 らない、　［Ｇ、Ａ、　Ｌｏｓｏｎｓｋｙ　ｅｔ　ａｌ。

Ｐｅ　ｉ　ｒ　Ｘ　ｆｅｅｔ　Ｄｉ　５：２５　（１９８６）：及びＴ。

Ｖｅｓｉｋａｒｉ　ｅｔ　ａｔ、　Ｉｎｆ　ｃｔ　Ｄ’　出：８３２　（１９８ ６）コ。

低組織培養の継代レベルの牛に起源を持つロータウィルス、すなわち、株ＷＣ３ は、幼児に安全で且つ７０−９５％の被投与者に血清抗体反応を生じるのである が、やはり、保護が現われない場合もあり、その保護にも限界がある。

現在確認されているヒトのロータウィルスは、動物に起源を持つロータウィルス より、細胞培養中で培養することが極めて困難なものである。ヒトに起源を持つ ロータウィルスは、Ｋ＝　５ａｔｏ　＠ｔ　ａｌ、ｒ　ｈ　Ｖ’ｒ　ｌ　、　（ Ｊ：１５５（１９８１）及びＴ、　Ｕｒａｓａｗａ　ｅｔａｌ−、Ｍｉ　ｒ　ｉ 　ｌ　Ｉｍｍｎ　ｌ　。

９：１０２５　（１９８１）が最初に記述した方法を使用して、細胞培養中にお いて既に分離に成功している。これらの方法液（ｓｕｓｐｅｎｓｔｉｏｎｓ）の 接種を必要とし、接種された細胞の種々の「ブラインド（ｂｌｉｎｄ）Ｊ継代を 伴った。このようなウィルスは、一般的に、他の種のロータウィルスと比較して 成長が遅い、すなわち、ある種の牛及び猿を起源とするロータウィルスによって 得られる滴定濃度より１０−１００倍もその滴定濃度が小さい、従って、通常、 ヒトのロータウィルスを細胞培養に適用するにあたって、生体外での複製は不十 分であることが一般的に知られている。生体外でヒトのウィルスを大量に生成た めの効果のある手段を欠いているために、ウィルス及びその抗体組成物を検定す ることが妨げられる。

現在までのところ、ヒトのロータウィルスの分離体は猿を起源とする数例の細胞 タイプにおいてのみ増殖させられている。ヒトを起源とするロータウィルスは、 ヒトの倍数Ｃｄ１ｐｌｏｉｄ　）ＩＩ胞株（ＨＤＣ８）では増殖させられていな い、ＨＤＣ３は、現在、ヒトに使用するためのウィルスワクチンの生成に理想的 な細胞基質であると考えられテイル［例えば、Ｍ、　Ｒ，Ｈｉｌｌｅｍａｎ、　 Ｊ　Ｍ　Ｖｉｒｏｌ只：５　（１９９０）参照］。

さらに、ヒトのロータウィルスの分離の潜在的な病原性は殆ど知られていない、 これらの上述の困難性が原因して、ヒトのロータウィルスはワクチン使用のため に深く探求されていない。

動物に起源を持つワクチンは確実な保護が与えられないこと及びワクチン用とし て容易に培養できるヒトのロータウィルスを得ることが困難なことは、潜在的ワ クチン候補体としてロータウイルスリアソータントの形態に興味が注がれた。リ アソータント（ｒｅａｓｓｏｒｔａｎｔ　）は、所望の抗原をコードした１つの ロータウィルス（すなわちタイプ特異抗Ｊ［）から他のロータウィルスに遺伝子 を持ち込む（ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅ　）することによって生成される。この持 ち込みは、リアソートメント（ｒｅａｓｓｏｒｔｍｅｎｔ）と呼ばれ、ロータウ ィルスのＲＮＡゲノムの分画化（ｓｅｇ■ｅｎｔｅｄ）された性質及び特定の親 ロータウィルスの共同感染中における遺伝子リアソートメントの高頻度性のため に可能である。

牛／猿に起源を持つロータウイルスリアソータントにおいて、ｖ、ｐ、７及びｖ 、ｐ、４を主とする外側カプシド蛋白質は、大量に投与されたときの毒性のロー タウィルス攻撃に対して、鼠において保護免疫反応を独立して減じ得るというこ とが観察された［０ｆｆｉｔ　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、Ｖｉ凶上、　６０：（２）： ４９１−４９６　（１９８６）；　０ｆｆｉｔ　ｅｔ　ａｌ、　ＪＬＶｉｒｏｌ 　、　５７（２）＋３７６−３７８　（１９８６）］　。

ヒトのワクチン候補体として使用される観に知られているロータウィルスは、動 物のロータウィルスのｖ、ｐ。

７抗原をエンコードした１つの遺伝子生成物の置換を必要とした。動物ウィルス の遺伝子９又は８の３８ｋｄｖ、ｐ、７抗原はヒトの血清タイプロータウィルス の遺伝子をエンコードしたｖ、ｐ、７で置換された。米国特許第４，５７１，３ ８５号は、ヒトのロータウィルスを培養可能な動物のロータウィルスに組合せ且 つ３４−３８ｋｄ糖蛋白質、すなわち、動物ウィルスｖ、ｐ、７に特徴付けられ た抗体を具えた所定のりアソータントを選択することによって、ある種のヒト及 び動物の親株からロータウイルスリアソータントを生成する方法を開示している 。

［Ｍｉｄｔｈｕｎ　ｅｔ　ａｌ、　Ｌ−買工刹、、　Ｊ５：９４９　（ｉ９８５ ）；　Ｍｉｄｔｈｕｎｅｔ　ａｌ、　ｉｎ　Ｍｉ　ｉ　２１：８２２　（１９８ ６）］　。

動物ロータウィルス７グチン候補体と比較すると、ヒト／動物リアソーケントは 、ヒトの血清タイプ特異反応の向上はしているが厄介な事象を誘発することがわ かった。さらに、ＲＲＶリアソータントは誘導体は、臨床実験におけるかなりの 量のワクチンにおいて、望ましくない副作用、例えば、発熱や胃腸障害を抑える ［上述のＶｅｓｉｋａｒｉ　ｅｔ　ａｌ、上述のＬｏｓｏｎｓｋｙ　ｅｔ　ａｌ ］　。

リアソータントは２つのヒトの株の共同感染によって生成されたが、現在におい てそれらはワクチン使用において全くテストされていない［Ｕｒａｓａｗａ　ｅ ｔ　ａｔ、、　、ｌ、−ルＩ工Ｖｉｒｏ１　ｌ：１５５１−１５５９　（１９８ ７）］　。

幼児に効果のあるワクチンを経口投与した後、ロータウィルスに対して活発で有 効な抗体反応を誘発する他の困難性は、母由来の誘発（特に年少の幼児において 事実上普遍的特質）の既に存在する抗体を所有する幼児において活性免疫反応と かなり干渉すること、及び、第２回の経口投与で普遍的なｒ促進」抗体反応を得 ることが困難なことである［Ｃ１ａｒｋ　ｅｔ　ａｌ、　ｈ匹江ムｌｉ：３２７ 　（１９９０）］。

さらに、抗血清の中和を誘発するようなリアソータントの能力は、ヒトに効果的 で安全なワクチンとしてリアソータントの有用性をそれ自身水さない。

これらの弊害を死滅したロータウィルスワクチンを非経口的に投与することで克 服することでその可能性を追求することに、現在大きな興味が注がれている（例 えば、筋肉内接種又は皮下接種）、ワクチンを接種する場合、許容し得る細胞培 養基質、最も望ましくは、何らかのヒトの倍数細胞株においてウィルスが増殖さ れることが特に重要である０本発明以前においては、ヒトのロータウィルスでも 動物のロータウィルスでもＨＤＣ３中で増殖することが報告されていない。

従って、細胞培養中において高い滴定濃度で成長することができるヒトに起源を 持つロータウィルス及びそのリアソータント、これらのウィルス又はリアソータ ントを含むワクチン、並びに、ロータウィルス検知の分野における診断用並びに 検知用試薬を、この分野では依然必要としている。

１吏り一鷹１ １つの観点によると、本発明は、新規に新しく分離されたヒトの細胞変性ロータ ウィルス、血清タイプ３、これはＨＣＨ３と呼ばれるものを提供することである 。ＨＣＲ３Ａ及びＨＣＲ３Ｂと命名された、このウィルスの２つの株は、ロータ ウィルスの成長を普通に支持する細胞及びヒトの倍数細胞を含む宿主細胞タイプ の驚くべき広いスペクトルにおいて、高い滴定濃度で成長する独特な能力によっ て特徴付けられている。他のヒトのロータウィルスとは異なり、ＨＣＨ３は適切 な細胞培養へのヒトの幼児のスツールから直接分離することができ、感染の証拠 としてプラークの生成又は直ちに可視的な細胞変性作用が観察され得る。他のロ ータウィルスのためのブラインド継代は必要でない。

本発明の他の観点は、ヒトのロータウィルスを分離する新規な方法にあり、この 方法は、ロータウィルス又は他のウィルス源に感染した患者からのヒトのスツー ルサンプルをＭＡ１０４とは異なる適切な細胞培養中に直接接種し、そして、制 限付き又は適応なしに、感染の証拠としてプラークの生成又は直ちに可視的な細 胞変性作用のために培養を観察することからなる。１つの具体例では、この方法 は、胎児Ｒ，モンキー肺縦胞系統ＦＲｈＬ−２のような倍数細胞培養中にサンプ ルを接種し、その後、ヒトの倍数細胞中にウィルスを継代させることからなる。

本発明の他の観点は、細胞培養中において高い滴定濃度で迅速に成長する能力を リアソータントに与えるために、リアソータント株ＨＣＲ３からのかなりの遺伝 子分画を具え、ＨＣＨ３の抗原とは異なる望ましいロータウィルス抗原をコード した少なくとも１つの遺伝子を有するリアソータントにある。また、このリアソ ータントはＨＣＲ３成長能力を保持するように、さらに他のロータウィルスから のさらなる遺伝子分画を含むものであってもよい、１つの具体例において、この リアソータントはＨＣＨ３とは異なるヒトのロータウィルスの少なくとも１つの タイプ特異抗原によって特徴付けられている。他の具体例において、リアソータ ントは、ＨＣＨ３とは異なる１以上のヒトのロータウィルスからのタイプ特異抗 原によって特徴付けられている。興味の対象となっている測定されるべき如何な るロータウィルス遺伝子も、本発明のりアソータントの中に含まれる。他の具体 例において、さらなるロータウィルス親株は、牛のロータウィルスＷＣ３のよう な、ヒトのものでない株である。

本発明のさらに他の観点は、ロータウィルス増殖のために許容し得る公知の細胞 又はＨＤＣ３中において、生体外で上述のりアソータントを培養することにより 、ヒト又は他の動物のロータウィルス抗原を高いレベルで表現する方法を提供す ることである。上記の方法によって生成された興味ある増強された抗原は、所望 であれば、従来の蛋白質化学方法によってリアソータントから分離され得る。

本発明の他の観点では、ヒトのロータウィルス、又は、上記のように増強された 他の種のロータウィルスの抗原を有する診断学上の試薬を提供することである。

このような抗原又はそれらのりアソータントは、診断学上の試薬又は検知用試薬 として使用され得る。

本発明のさらに他の観点では、ヒトのロータウィルス感染によって生じる急性の 下痢に対して免疫学的保護を与えるワクチンを提供すること、弱毒化されたＨＣ Ｈ３及びそのリアソータントを含むワクチンを生成する方法を提供することであ る。

本発明の他の観点は、本発明の新規なりアソータントウイルスを調製する方法を 含んでいる。この方法は、感染培養中で遺伝子リアソータントを可能にし且つ望 ましいリアソータント用に選択された環境下において、遺伝性用に選択されたと 株、好ましくはヒトのロータウィルスと、ヒトのロータウィルスＨＣＲ３の混合 感染物を、適切な細胞培養に感染させることからなる。この方法の１つの独特の 具体例は、最初の細胞基質としてヒトの倍数細胞を使用している。ＨＤＣ８上に 混合物を直接置くことによって、これらの細胞上の孔を成長し得るリアソータン トの生成のために、独特の選択的な圧力が混合物を増加させるように使用される 。また、この方法は、ＭＡ１０４やＣＶ−１のようなヒトでない細胞基質中で混 合感染物を調製し、その後、ＨＤＣ８中でウィルスを継代させることとすること ができる。

感染した培養中に形成されたプラーグからの子孫クローンは、リアソータントに 独特な成長特性を与えるような、ＨＣＨ３株によって与えられるかなりのヒトの 遺伝子を具えた少なくとも１つの選択された血清タイプ特異抗原を含むリアソー タントの存在をＰＡＧＥによって検査するか、そのリアソータントを生成するよ うな他の選択的な圧力に被らせることができる。このようなリアソータントは、 ヒトにウィルスワクチンを生成するような適切な細胞基質中において、大量の望 ましいヒトの、ロータウィルス抗原を表示する潜在能力を有する。

本発明の他の観点は、従来の手段によって弱毒化されたＨＣＲ３０−タウイルス 又は本発明のりアソータントワクチンを使用して、ヒトのロータウィルス感染に 対してヒトにワクチンを投与する方法を提供することである。

本発明の他の観点及び効果は、以下の発明の詳細な説明の内容及びその実施例の 説明に基づいて明らかになるであろう。

第１図は、以下のタイプ３のロータウイルス：Ｂｒ１ｃｏｕｔａ　、　ＲＲＶ、 　）ＩＣＲ３＾、　ＨＣＲ３Ｂ、　５ＡＩＩ、Ｐ、　ＷＩ７８及びＥｂを分離さ せた電気泳動タイプゲルの写真である。

第２図は、リアソータントであるＨＣＲ３Ａ−７９−９（２回）、親株リアソー タントＷＩ７９−９　（これはＷＣ３とＷＩ７９ｃ７）　ｖ、　り−７遺伝子分 画との間のりアソータント）、親株）１ｃＲ３Ａ、及び祖父母株ＷＣ３が泳動し た電気泳動ゲルの写真である。

の　ｔ） 本発明は、独特Φ成長能力を具えた新規なヒトのロータウィルスの分離及び特徴 付けに関する。

ヒトに起源を持つＨＣＨ３の新規なロータウィルスは、従来からロータウィルス の成長をサポートすることのできる適切な細胞上において、高い滴定濃度で成長 する能力で特徴付けられている。このロータウィルスを高い滴定濃度で分離及び 成長させる適切な細胞は、霊長動物のＶＥＲＯ細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ−８１）　 、７７１Ｊカングリーンモンキーの幼児の細胞ＣＶ−１（ＡＴＣＣＣＣＬ−７０ ）；Ｂ５Ｃ−１（ＡＴＣＣＣＣＬ−２６）、胎児のグリーンモンキー細胞ＭＡ− １０４、及び１次霊長動物幼児細胞培養を含んでいる。驚くべきことに、この新 しく分離されたウィルスは、また、ヒトの倍数細胞中において、高い滴定濃度で 成長する。

本発明の目的のために、１次霊長動物幼児細胞は、上記霊長動物種から誘導され た幼児細胞の第１、第２（２番目）又は第３継代を含んでいる。ヒトの倍数細胞 ［ＨＤ３Ｃ］は、現在、ヒトのワクチンの開発で使用するのに好ましい、ヒトの ものでない細胞培養基質の各々を、１０％幼児小牛血清で補ったＢＨＫ培地［Ｍ ａｃＰｈｅｒｓｏｎ、　Ｉａｎｄ　Ｌ　５ｔｏｋｅｒ、■皿旦ｕ、　１６：１４ ７　（１９６２）］、１０％幼児小牛血清を持つイーグルの最小必須培地、又は １０％幼児小牛血清を持つ培地１９９で成長させることができる。ＨＤＣ８は、 １０％幼児小牛血清で補ったイーグルの最小必須培地でよく成長する。また、こ れらの培地に、所望であれば、１ミリリツター中２５ミリグラムのジエンタマイ シン（ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ）を含ませてもよい。

「高い滴定濃度Ｊ　（ｈｉｇｈ　ｔｉｔｅｒ）とは、培養溶液１ミリリッター当 り１０６ブラーク形成ユニツト（ｐｆｕ）より大きな成長を意味する。より望ま しくは、以下に詳細に述べられる本発明の分離されたウィルス及びリアソータン トは約１０″乃至１０９ｐｆｕ／ｍｌの滴定濃度によって特徴付けられている。

ＨＣＨ３の２つの株は、現在分離されており、また同定されている０分離ＨＣＲ ３Ａは、臨床研究中において、牛のロータウィルスワクチンＷＣ３（米国特許第 ４，６３６゜３８５に開示されている）の経口投与の３ＥＩ後に採取されたヒト の幼児のスツールから発見された。分離ＨＣＲ３Ｂは、ロータウィルスワクチン の投与前、通常のヒトの幼児から採取されたスツールから発見された。

双方の株は、事実上区別できるものでなく、まれながらヒト類に存在する安定な ウィルスと仮定される同じウィルスであると考えられていた。以下、簡便のため に、ＨＣＲ３Ａについてのみ説明することとし、ＨＣＲ３Ｂは同様に取り扱われ るものとする。ＨＣＲ３Ａは、米国メリーランド州、ロックビル、パークローン ドライブ１２３０１に所在するアメリカンタイブカルチャーコレグション（ＡＴ ＣＣ）に寄託された。この寄託の受付番号は、ＡＴＣＣＶＲ２３２５である。

分離ＨＣＲ３の分離方法は、成長したヒトのロータウィルスについての基本方法 とは全く異なり且つ好ましいものである。ウィルス株ＨＣＲ３Ａは新規な方法で 分離された。すなわち、ＭＡ１０４細胞の単層上に幼児スツール懸濁液を直接接 種し、感染を表すプラーク又は他のＣＰＥを直接観察し、次いで、ヒトの倍数細 胞系統（ＨＤＣ３）を含む適切な細胞基質にウィルスを継代させてなるものであ る。他のヒトのロータウィルスの分離と充ＡｌＯ４単層上に現われる「プラーク 」として顕示された細胞変性効果の領域から直接発見された。適応は必要でなか った。ＨＣＲ３Ａの分離は、実施例１において詳細に説明されている。

上記分離から収穫されたプラーグはＭＡ１０４上で次々と継代され、そして、直 ちに及び低い継代番号、例えば第２継代及び第３１１代で大きく変性した。この 変性には、既に述べたヒトのロータウィルス分離の特徴である長く続くブライン ド継代は不要であった。ＭＡ１０４細胞培養において第５継代未満で、各々のウ ィルスは、≧１０８０ｐｆｕ／■１の範囲の液体内で感染ウィルスの収穫を得た 。ウィルス濃度は、池の公知のヒトのロータウィルス株のその特徴を越えていた 。

以下の表■において報告されたＰＲＮ交差中和によって他のタイプのロータウィ ルスで行われた血清学分析の結果に基づくと、分離されたものはＨＣＨ３と命名 された。その理由は、これらのロータウィルス株が血清タイ１３表面蛋白質ｖ、 ｐ、７抗原性表現聾を所有しているためである０表１の抗体滴定濃度で明らかに なったことであるが、ＨＣＲ３０−タウイルスは、抗原的には、代表的な公知の ヒトのタイプ３０−タウイルス、ｐ及びＷＩ７８よりも、タイプ３猿のロータウ ィルスＳＡＩ　１により似ている。ＨＣＨ３は、タイプｌ、６．９のロータウィ ルスとは関係がない。

５ＡＩＩ　（３）　＞、Ｌ几虹並０　１１，５００　７６．２００　８，７５０ ＨＣＲ３Ａ（３）　１，０５０，０００　旺Ｊ並　１７，２００　１３５ＨＣＲ ３Ｂ（３）　９４７，０００　１０，８００　到Ｊ迎　＜２０ＲＰＶ　（３）　 ＜　２０　＜２０　＜２０　＜２０Ｐ　（３）　６１，１００　７００　５０　 ＜２０冒Ｉ７８　（３）　１００．０００　１３０　１０４５　＜２０Ｅｂ（３ ）　６５　＜２０　２０　８９０ＷＣ３（６）　＜　２０　＜２０　＜２０　２ ０，０００Ｗａ（１）　４５　８５　９０ １１１６１　（９）　＜　２０　＜２０　＜２０ＨＣＲ３Ａの細胞培養宿主域（ ｈｏｓｔ　ｒａｎｇｅ）の研究は、このウィルスが、従来ではロータウィルスの 生体外成長をサポートしていた細胞タイプの培養における適応なしに、高い滴定 濃度に複製する能力を具えていることを示している。このような細胞タイプは上 記に掲げられている。さらに、ＨＣＲ３Ａは、好ましいヒトのワクチン基質シス テム、すなわち、適応のない最小のヒトの倍数細胞（ＨＤＣ８）において、高い 滴定濃度に成長する。ＨＣＲ３ウィルスは、また、他のヒトのロータウィルスと 比較して、細胞培養（ＨＤＣ８を含む）中において高い滴定濃度、すなわち、約 １０６乃至１０９・Ｏで驚くべき成長を遂げる。

これらのウィルスは、また、これらの特徴ある電気泳動によって確認することが できる。第１図において、ＨＣＲ，３Ａ及びＨＣＲ３Ｂと他のタイプ３のロータ ウィルスの電気泳動を比較すると、ＨＣＨ３の両株は実質的に同一で、且つ、他 の公知のタイプ３の株と異なっていることがわかる１例えば、モンキータイプ３ 株５ＡＩＬ及びＲＲＶ　４．ｔ、ＨＣＲ３Ａ及びＨＣＲ３Ｂと比較シタトキ電気 泳動が全く違うことを示している。これは、５Ａ１１及びＨＣＲ３Ａが類似する 抗原特徴を持っていること（表■）の理由として重要である。ＨＣＲ３Ａ及びＢ は他のヒトのタイプ３の株、Ｐ、ＷＩ７８及びＢｒ１ｃｏｕｔαの電気泳動から 同様に識別され、また、鼠の株Ｅｂの電気泳動かも識別される。

ＨＣＲ３Ａのために第２図に示されるように、以下の実施例で詳細に説明される ＨＣＲ３Ａ−７９−９リアソータントは、その１１の遺伝子分画の配置に基づい て、ＷＩ７９−９及びＷＯ２の電気泳動と異なる電気泳動を持っている。ＨＣＲ ３Ａと比較すると、リアソータントは、遺伝子７又は遺伝子８のいずれかを表わ す遺伝子をコードしたｖ、ｐ、７がＷＩ７９−９の遺伝子をコードしたｖｐ７に よって置換されている。このｖｐ７は、すなわち、ＷＩ７９−９の分画９であり 、ＷＩ７９−９はＷＩ７９の祖父母の分画９である。この電気泳動はまた、牛の 株ＷＣ３がＨＣＨ３の電気泳動と全く異なることを示している。

）ｆｃＲ３Ａの他の独特な特徴は、ロータウィルスのサブグループ１に分類され ている。サブグループは、通常、放射性免疫検定法又は酵素結合された免疫吸着 検定を用いることによって、ウィルスを培養しないで検出される抗原の確認に基 づくものである。ヒトのロータウィルスの殆どは、現在、サブグループ２に属す るものと同定されている。動物のロータウィルスの殆どは、サブグループ１に属 する。

ＨＣＲ３Ａロータウィルス株のさらなる他の特徴は、−次、成長曲線によって示 されるような異常に急な成長にある。以下の表■では、ＭＡ１０４培養中におけ る僅か３代の継代後のＨＣＲ３Ａは２４時間以内で１０”の滴定濃度まで複製し 、ＨＣＲ３ＢはＭＡ１０４細胞中において僅か２代で同様の結果に到達したこと が示されている。現在、ＭＡ１０４細胞中のＨＣＲ３Ａ−７９−９リアソータン トは、２４乃至４８時間以内に同様のレベルまで複製し得ることが示されている 。現在、未だ知られていないヒトのロータウィルスは、より早期にその滴定濃度 まで複製し得ることが知られている。

表　■ 時間当たりの細胞培養におけるウィルスの滴定濃度ＨＣＲ３Ａ　ＨＣＲ３Ｂ 細胞タイプ　細胞タイプ 時間　ＣＶ　Ｉ　ＭＡ１０４　ＣＶ　Ｉ　ＭＡ１０４０　１ＸＩＯ”　３ＸＩＯ ”　ｌＸｌ０’　２．７Ｘ１０’２　２Ｘ１０”　５．０Ｘ１０”　７Ｘ１０２ １．３Ｘ１０’６　ＬＯＸ　１０２４．ＯＸ　１０”　９．ＯＸ　１０”　２． ６Ｘ　１０’１２　３．０Ｘ１０”　２．０Ｘ１０’　３．０Ｘ１０’　５Ｘ１ ０’２４、　２．３Ｘ　１０’　３．ｌＸ　１０”　２．ＯＸ　１０’　１．８ Ｘ　１０’４８　３．０Ｘ１０’　１．ｌＸ１０’　５．４ＸｌＯ’　６．０Ｘ １０’７２　ＬＯＸＩＯ’　１．０Ｘ１０＠３．０Ｘ１０’　３．８Ｘ１０’９ 　６　３、ＯＸ　１０’　ＩＸ　１０７　５Ｘ　１０’　２．ＯＸ　１０フ不純 物を含まず、他の蛋白質性材料を有する分離塵ウィルスに加えて、本発明は、ま た、検知及びワクチン用のためのウィルスを増殖する、新規で直接的な方法を提 供する。ＨＣＨ３は、適切な細胞上に直接接種することにより分離できるし、こ れらの細胞上で生成されるＣＰＥのプラーク又は他の領域から分離できる。ウィ ルスを引き続きさらに他の細胞上において継代することもできる。

ＨＣＲ３Ａは、例えば、ＭＡ１０４細胞のようなワクチン使用に適していない細 胞上において、従来の方法によって成長させることもできる。この方法によって 作られたウィルスは、検知試薬としての他の用途に適している。検知試薬は、そ のゲノム又は他のロータウィルスゲノムのウィルス成分（好ましくはヒトのロー タウィルス成分）を生成し得るものである。ウィルス、そのリアソータント、又 はこれらから従来の手段によって分離された抗原は、また、診断試薬又は抗体の 生成における抗原として使用される作用剤として使用され得る。

しかし、本発明は、また、ＭＡ１０４細胞上における継代や成長を必要とするこ となく、ウィルスを分離及び増殖させる方法を提供する。ＭＡ１０４はワクチン 用として好ましくないため、この方法は有用である。この方法によると、ＨＣＨ ３の株や、例えば、保管所のような他の源から得られたウィルスのサンプルに感 染した患者を、ウィルスや組織サンプルを選択された細胞タイプに直接接種し、 そして、感染を表示するＣＰＥにプラーク又は他の証拠用細胞を観察することに よって培養してもよい、直接接種用の望ましい細胞タイプの中で、ワクチン成分 用に特に望ましいものは、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＶ−１細胞、ＦＲｈＬ−２細胞、牛 のＲｈモンキー肺細胞系統（ｆｅｔａｌ　ｒｈｅｓｕｓ　ｍｏｎｋｅｙ　ｌｕｎ ｇ　ｃｅｌｌ　１ｉｎｅ）［Ｒ，１ｌａｌｌａｃｅ。

ｅｔ　ａｌ、　匡」ｎＱ、ｆｉ：３２３　（１９７３）コ、又はＷＩ３８のよう なヒトの倍数細胞である。しかし、他の細胞も使用することができる。最初の接 種の後、ウィルスをさらにＨＤＣ３又は選択された細胞タイプ上に継代させても よい。

ウィルスの増殖の後者のタイプの具体例として、患者からのスツール懸濁液が、 ＦＲｈＬ−２の細胞培養に直接接種された。第２継代では、ウィルス滴定濃度は ７Ｘ１０２であった。第３継代は、ＨＤＣ３１ＷＩ３８から作られ、ウィルス滴 定濃度は１×１０３であった。

分離されたウィルスＨＣＲ３Ａは、ヒトの患者にも安全に使用できるようにその 病原性が抑えられたタイプ３０一タウイルスワクチン成分として有用である。こ のようなワクチン調製の１つは、選択された組織培養中において適切回数だけ長 く連続した継代によって弱毒化されたＨＣＲ３Ａからなる。これにより、ウィル スの病原性が抑えられ、そして、ワクチン用の懸濁液中に効果のある作用剤とし て使用され得る。

適切な細胞系統は、ワクチン用に弱毒化された生きたウィルスとして使用される ＨＣＨ３株を、単独又はその連続継代したものを組合せて使用され得る（又は、 以下に説明される、リアソータントの発育用の第２親ロータウイルスの継代）０ 組合せで使用されるとき、分離型ではあるが異なる細胞系統を、ウィルスの種々 の継代の各々において使用できる。

動物細胞、好ましくは、ＶｅｒｏｌＣＶ−１、牛の剤某又はヒトの倍数細胞の１ つのタイプより多くのタイプにおける継代の適切回数は、約５０乃至１００継代 の範囲にある。しかし、許容し得るレベルまで弱毒化させるために、さらなる継 代が積み重ねられてもよい。

或いは、経口ワクチン用として、適切な細糸上における組織培養において、例え ば、約２５乃至３０℃の範囲の低温で、ウィルスを長い継代中で培養してもよい 、さらに他の具体例では、従来のようにホルマリンや他の公知の不活化剤でＨＣ Ｒ３ウィルスを処理死滅させた不活化ワクチンとして、ＨＣＲ３ウィルスを使用 してもよい。

この不活化、すなわち、死滅させたワクチン候補体は、非経口的投与用の安全な ワクチンとして使用するのに適しているであろう。

低い接種温度で継代させられたワクチン調製物は、数々の継代であるにもかかわ らず、新規なウィルスの特徴である高い滴定濃度を維持している。１つの実施例 として、ＨＣＲ３Ａは、３０℃でＭＡ１０４細胞に１４４回継され、その滴定濃 度は２Ｘ１０’を維持していた。第２の実施例において、ＨＣＲ３Ａは同じ温度 でＭＲＣ５細胞に３回継代され、その滴定濃度は］、Ｘ１０’を維持していた。

さらに他の実施例として、ＨＣＲ３Ａは、２５℃でＭＡ１０４細胞に６回継代さ れ、その滴定濃度は２Ｘ１０’であった。最後の実施例として、ウィルスは、３ ０℃でＣＶ−１細胞に３回継代され、その滴定濃度は３Ｘ１０’であった。

ヒトに投与しても安全なＨＣＲ３Ａからワクチン成分を生成する他の方法は、安 全であると知られており且つヒト用に弱毒された他のヒト又は動物のロータウィ ルス若しくはリアソータントにそのＨＣＲ３Ａを再配列（リアソート（ｒｅａｓ ｓｏｒｔ）　）することである、他のヒト又は動物のロータウィルス若しくはそ のリアソータント、例えば、弱毒化された牛のロータウィルスＷＣ３、すなわち 、後述するＷＣ３リアソータントｔＩ７Ｂ−９は、リアソータントワクチンの生 成に使用され得る。さらに、本発明のいかなるリアソータントも、例えばホルマ リンで処理することによりワクチン用に不活化してもよい。

このように、本発明の他の観点は、ＨＣＲ３Ａ及び選択された第２親ロータウイ ルス、すなわち、ロータウイルスリアソータントの混合感染によって調製された リアソータントにある０本発明は、ヒト及び動物双方の１以上の他の選択された ロータウィルスからの１以上のロータウィルス遺伝子分画を、ＨＣＨ３の１以上 の遺伝子分画の部位に含むロータウイルスリアソータントの構造を含んでいる。

リアソータントはＨＣＲ３Ａのかなりの遺伝子分画を含んでおり、そのリアソー タントは適切な細胞において高い滴定濃度で成長することができる。

リアソータントは、感染培養中で遺伝子リアソートメント（ｒｅａｓｓｏｒｔｍ ｅｎｔ）を可能にする環境下におし）で、適切な細胞基質に、（好ましくはワク チン用に弱毒化された）ＨＣＨ３及び選択された第２０−タウイルスを感染させ ることにより従来から作られている。混合感染は、各々の親ウィルスの高く且つ 同じ濃度を同時に複製することを確保することによって、リアソートメント能力 が最大となるように意図されている。感染の後、かなりの時間及び環境が遺伝子 リアソートメントのために与えられる。

混合感染の生成物を他の細胞培養単層に接種することによって誘発した個々のプ ラークにおいて、ウィルスは増殖させられた。

このような環境は、親の株の成長に有利なりアソータントを生成するように、混 合感染上において選択的な圧力を含んでいる。子孫クローンは、抗原をエンコー ドした遺伝子を与えるロータウィルスの血清タイプを超免疫抗血清で処理した後 ［例えば、米国特許第４，５７１，３８５号の方法を参照］、集団のプラーグ分 析を行なう前に、混合感染のウィルス生成物から選択され得る。好ましくは、抗 血清又はこの用途のモノクローナル（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ）抗体は親株の選択 された抗原を結合することができ、従って、その遺伝子分画を含むその親、すな わち、リアソータントが培養中で成長することを阻止する。

本発明を適用した新しく選択された方法は、候補体プラーグクローンの選択前に １以上の継代のためのＨＤＣＳに接種する操作を挿入している。この操作は、Ｈ ＤＣＳ中での複製を可能にする種々の遺伝子的組成の子孫のためのリアソートメ ント混合物を豊富にする。このことは、これらの細胞上の成長に不可欠なＨＣＲ ３遺伝子分画を含むリアソータントのみを選択させ、そしてまた、培養上におい て他の親株を成長を抑える。

さらに、混合感染操作は、最初のりアソータントで繰り返されてもよく、さらに 、ＨＣＨ３とは異なる２つのロータウィルスについての少なくとも２つの抗原を 含むリアソータントが得られ、ＨＣＨ３の特徴である成長能力を保持するように 、第３０−タウイルスで繰り返されてもよい。

リアソータント子孫クローンは、異種の形態学のプラークの選択、例えば、細胞 培養中において引き続き個々に培養される独立したプラークを収穫すること、又 は、混合感染からのウィルス生成物のプラーク検定によって検査される。感染培 養中に形成されたプラーグからの子孫クローンは、各々の親株からの遺伝子分画 を含むリアソータントの存在のためのＤｏｌａｎ　ｅｔ　ａｌ、　、Ｌ−工り抽 ユ１ｊ二ゆ１（社）ユ、２１ニア５３　（１９８５）の操作に従って、銀株を具 えた従来のポリアクリルゲル電気泳動（ＰＡＧＥ−８Ｓ）上で各々の親及び子孫 を移動させることによって同定された。各々の遺伝子分画は特徴ある電気泳動移 動度で移動するので、リアソータントの生成は、各々の親ロータウィルスの電気 泳動をリアソータントの電気泳動と比較することにより容易に同定される。

クローンのＰＡＧＥ−３Ｓが第２（又はさらなる）親ロータウィルスからの所望 の遺伝子分画をコードした少なくとも１つの遺伝子の存在を顧らかにすると、リ アソータント子孫クローンは選択される。クローンのＰＡＧＥ−８３が免疫保護 をめられているもの、例えば、ヒトのタイプ１親株からのｖ、ｐ、７遺伝子及び ／又はヒトのタイプ２親株からのｖ、ｐ、４遺伝子に対する抗原の存在を顕もか にする場合、リアソータントはワクチン用に選択される。このようなリアソータ ントを得るために感染及びゲル電気泳動法を行なうことは周知のことである。

本発明の１つの実施例によると、ロータウィルスＨＣＲ３のリアソータントは、 表現媒体動物（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｓ）として使用することに適 切である。ＨＣＨ３から遺伝した遺伝子分画のため、リアソータントは、細胞培 養を用いることを必要とすることなく子孫を生成する能力、及び、そのような子 孫を高い滴定濃度で生成する能力を具えている。リアソータントのこの特徴は、 選択されたロータウィルス抗原のいかなるものをも大量に生成するのに望ましい ＨＣＲ３リアソータントを作ることにある０例えば、本発明のりアソータントは 、親のロータウィルスを培養することが困難であるために僅かしか供給できない 他のヒトのロータウィルス抗原を大量に生成するために作られ得る。同様に、リ アソータントは、望ましい、大量の他の動物ロータウィルス構造蛋白質成分又は 抗原を生成するために適用されてもよい。

ＨＣＨ３のリアソータントにおける他の価値ある用途は、ヒトの倍数細胞中の大 量のロータウィルス抗原を最小値で且つ適応なしに表現する能力に係わる。ＨＤ ＣＳはワクチン調製に最適の細胞であるので、本発明のＨＣＲ３リアソータント は、ヒトに安全で且つヒトのロータウィルス感染に対して免疫保護を与える能力 のあるワクチンとして使用するのにも適合している。これらのリアソータントは 、ヒトのＨＣＲ３０−タウイルス、好ましくは弱毒化されたものと、疫学的に重 要なヒトの血清タイプを表現するロータウィルス、例えば、血清タイプ１゜２． ４．９のロータウィルスとの間における遺伝子的リアソートメントによって生成 される。好適なリアソータントは、選択されたロータウィルスからの少なくとも １つの遺伝子分画と、ロータウィルスＨＣＲ３のかなりの遺伝子分画とを含んで おり、ＨＤＣＳを含む種々の適切な細胞基質上において高い滴定濃度で成長する 能力を発揮する。病原性のヒトのロータウィルスは、好ましくは、少なくとも１ つの主たる血清タイプ特異抗原をロータウィルスに与える。

ヒトの感染の多くは血清タイプ１，２，３．４によって生じるので、第２０−タ ウイルスは少なくともｖ、ｐ。

７抗原をロータウィルスに与えることが望ましい、事実上、最も自然な感染のｖ 、ｐ、７特異性の最適な適用範囲は、ワクチン注射療法における種々の異なるリ アソータントの使用によってカバーされる。ｖ、ｐ、４蛋白質は、他の望ましい 血清タイプ特異抗原であり、この抗原は特定のヒトのロータウィルスの遺伝子分 画４によってコードされている。この遺伝子は、ウィルスに宿主特性の影響を与 えると信じられている。

１つの望ましい実施例において、本発明によるリアソータントは、ｖ、ｐ、４を エンコードしているＨＣＲ３０−タウイルス遺伝子４を含んでいる。この遺伝子 は、ｖ、ｐ、７遺伝子をエンコードした分ｍｃ通常は分画７゜８．９）を与える 好ましい血清タイプ、例えば、１の第２のヒトのロータウィルスを具えている。

第２のヒトのロータウィルスは、また、所望であれば、ｖ、ｐ、４をエンコード した遺伝子をリアソータントに与える。残りの遺伝子分画はＨＣＨ３によって単 独で与えられる。或いは、残りの遺伝子分画は、ＨＣＨ３及び第２０−タウイル ス親の両方からのものでもよい、ただし、充分なＨＣＲ３遺伝子分画がリアソー タント中の同様のＨＣＲ３成長特性を確保するために存在していなければならな い。

さらに望ましい実施例では、リアソータントは、所望の血清タイプの選択された ロータウィルス親の１つからのｖ、ｐ、７抗原と、２番目に望ましい血清タイプ からのｖ、ｐ、４抗原と、そのリアソータントの成長特性を確保するようなＨＣ Ｒ３Ａからのかなりの遺伝子分画とを含むように形成される。

遺伝子分画のどのような組合せも、望ましいワクチン特性を具えたリアソータン ト用のＨＣＨ３に再配列され得る。ただし、最終的なリアソータントにおけるＩ （ＣＲ３遺伝子分画は、高い滴定濃度及びＨＣＨ３のマルチ特異宿主細胞（ｍｕ ｌｔｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｈｏｓｔ　ｃｅｌｌ）の成長特性を具えたりアソー タントを構成するのに充分なものでなければならない、従って、１つの遺伝子分 よりも多くの遺伝子分画が、ＨＣＨ３よりも多くのヒトのロータウィルス親によ って与えられてもよい。

多くの株を個々の患者のワクチン注射に使用することができる。従って、第２親 ロータウイルスは、選択された血清タイプウィルスのどのようなものからのもの でもよい、また、選択されたヒトのロータウィルスを、所望であればリアソータ ント用に弱毒化してもよい、ワクチン成分の調製用には、血清タイプ特異抗原を エンコードした遺伝子分画に寄与するロータウィルスは、選択されたヒトの血清 タイプウィルスのどのようなものからのものでも望ましい、なお、牛のＷＯ２の ような安全な動物ロータウィルスも、また、ヒトのワクチン用のりアソータント を作るのに使用することができる。好適実施例では、選択された中和抗原をエン コードするヒトのロータウィルス遺伝子が、血清タイプ１のヒトのロータウィル スかも選択される。

ヒトのロータウィルス株の中で本発明に特に有用なものは、株ＷＩ７９と血清タ イプ１のＷＩＣＣＩである。

他の血清タイプも、本発明のリアソータントの構成に使用することができる０例 えば、血清タイプ２の株ＷＩ−３Ｇ２　；血清ダイブ３のＷＩ７７、ＷＩ７Ｂ及 びＰ；血清タイプ４の株ＷＩ−ＣＣ４及びＢｒ１ｃｏｕｔβ；並びに血清タイプ ９の株ＷＩ６１である。他の新規に同定されたヒトに起源を持つロータウィルス からの抗原は、また、ここに開示される方法及び生成物に有用であると考えられ る。

診断学的試薬又は検知試薬、或いは、恐らくは動物のワクチンの調製用には、第 ２０−タウイルス親を＆１かなる動物ロータウィルスから選択してもよい、ＨＣ Ｈ３を具えた別種ロータウィルス株の再配列の従来の手段を使用すると、望まし いロータウィルス蛋白質抗原のどのようなものでも、ＨＤＣ３を含む上述の適切 な細胞タイプにおいて高い滴定濃度に増殖させることができる。

本発明及び実施例中で後述する特別な具体例は、リアソータントＨＣＲ’３Ａ− ７９−９である。このリアソータントは、ＨＣＨ３からの遺伝子分画１−８．１ ０．１１を具えたヒトのロータウイルスリアソータントＷＩ７９−９　カラｖ　 、　ｐ　、７をエンコードした遺伝子分画９を含んでいる。このりアソータント をＨＤＣ３中で増殖することができる０本発明に含まれる他のりアソータントと 同様に、このリアソータントは、以下の開示に従って、当業者によって得ること ができる。

この模範的なリアソータント、ＨＣＲ３−７９−９は、受付番号ＡＴＣ：ＣＶＲ ２３２４（７）もとに１９９１年５月１日にＡＣＴＴに寄託された。ロータウィ ルスＨＣＲ３及びそのリアソータントは、それらが生成されて以来、アメリカ合 衆国ペンシルバニア州フィラデルフィアペンシルバニア大学の幼児病院において 、発明者であるドクター　エイチ　フレッド　グラーグの研究室で永久に保存さ れている。

ＨＣＲ３Ａを使用したワクチン成分用では上述したが、本発明のりアソータント はまた、１以上の細胞タイプで連続継代させること、低温で連続継代させること 、又はホルマリン若しくは他の不活化剤で不活化させることによって、弱毒化さ れ得る。同様に、安全であると知られているウィルス又はそれらのりアソータン ト、例えば、ＷＯ２又はＷＩ７９−９の再配列は、本発明のりアソータントから 安全なワクチン成分を生成するために使用され得る。

ヒトのロータウィルス感染によって生じる急性の下痢に対する免疫学的保護を提 供するワクチンは、本発明の１以上の新規なロータウィルス株又はリアソータン トを含んでいる。ワクチンとして使用するには、本発明によるリアソータントは 、深刻な副作用を生じることなく体内のロータウィルスを攻撃するように、大ヒ ト及び幼児の患者に保護免疫反応を誘発し得る、さならる特徴をもっている０選 択的には、ワクチンはまた、例えば、水酸化アルミニウムや水酸化マグネシウム の水性懸濁液のような、従来のワクチンアジュバント及び／又はキャリアを含ん でいてもよい０本発明によるワクチンの調製方法は、例えば、ＨＤＣ８細胞のよ うな適切な細胞基質に接種すること、及び、それにウィルス又はそのリアソータ ントを継代させることを含んでいる。その独特な性質のため、ＨＣＨ３は、何回 も継代させることなく、直ちに細胞変性する。１以上の異なるヒトの血清タイブ リアソータントを組合わせると、ワクチンは、ポリタイビック（ｐｏｌｙｔｙｐ ｉｃ）ウィルスの中和抗体反応を誘発できる。

従って、本発明には、１以上の新規なロータウィルス及びそのリアソータントで 、ヒトのロータウィルス感染に対してヒトをワクチン化する方法をも含んでいる 。声えば、異なるヒトのロータウィルス血清タイプからの所望の遺伝子分画を担 持したりアソータントを含む複数のワクチン組成物で、患者を連続的に又は同時 にワクチン注射することができる。ここに説明された１以上のリアソータントを 含むワクチン調製物は、少なくとも１回の適切な服用量で、好ましくは経口又は 鼻を通じて投与される。ワクチンが不活化された場合、ワクチンはまた注射によ って投与されてもよい、或いは、幼児に免疫を与える手段として、ワクチンが乳 母に投与されてもよい。

リアソータント又は弱毒化されたＨＣＲ３ウィルスによって形成されたワクチン の投与の全ての投与の服用量は、一般的に１０６より多く、約１０’乃至ｉｏ” プラーグ形成ユニット（ｐｆｕ）の範囲にあり、好ましい服用量は約１０７乃至 １０　”　ｐｆｕの範囲である。また、さらなるワクチンの服用は、約３乃至４ 週間の間隔で投与されてもよい、ワクチンは、幼児に免疫を与える目的のために 、幼児び直接投与されてもよいし、乳母に投与されてもよい、感染しやすい幼児 及び子供には、ロータウィルスシーズンの前に年毎に接種することが好ましい、 ヒトのロータウィルス感染は、同じシーズン中において種々の地域、例えば、冬 期の北東アメリカで生じることが観察された。シーズン前に、感染しゃすい幼児 や子供に繰り返し接種することが必要となろう。

薬学的に許容できるワクチンの調製、ｐＨ１等張、安定性等は、自明の事項であ る。また、従来のアジュバント、例えば、水酸化アルミニウムゲルが、ワクチン 組成物に使用されてもよい、ワクチン注射法を含む投与養成法は、種々の宿主及 び環境要因、例えば、患者の年令、投与の回数並びに地域的な位置及び環境を考 慮して決定される。

以下の実施例は、本発明の方法、組成物、及び特定の代表的なリアソータントウ ィルスを説明するものである。

１−ロー　ルス ヒトのロータウィルス株ＨＣＲ３Ａは、牛のロータウィルスワクチンＷＣ３（米 国特許第４．６３６．３８５号に記載されている。この文献は参照文献としてこ こに一体化される。）の経口投与後、３日で収集された研究対象幼児［ＣＣ３− １７］のスツールから発見された０分離ＨＣＲ３Ｂは、ロータウィルスワクチン の投与前、研究対象幼児Ｃ４−１（２９）から絞集されたスツールから発見され た。ＨＣＲ３Ａの分離のための以下の記載中の操作は、特に断りがない限り同一 である。

ＷＯ２［幼児ＷＣ３−１７］でワクチン注射された臨床学実験グループにおける １人の幼児のスツールは、スツールのプラーグ検定によって、ロータウィルスを 含むことが確認された。ロータウィルスを含むスツールは、５００ユニツトのペ ニシリン／■１，５００ミリグラムのストレプトマイシン／ｍｌ、４０ミリグラ ムのジェンタマイシン／寵１１５０ユニットの二スタチン（ｎｙｓｔａｔｉｎ　 ＋ファンギシディンともいう）／■１１及び２０ミリグラムのトリプシン／■ｌ を含む血清のないイーグルの最小必須培地中で、５％（ｗ　／　ｖ　）懸濁液中 に乳化された。スツール懸濁液は３０分間２０００Ｘｇで遠心分離によって精製 された。

精製された上澄み液は、前もってＰＢＳで２回洗浄された６つ孔ブラスチッグプ レート上においてＭＡ１０４細胞の単層培養物上に０．１ｍｌの容積で接種され た。このロータウィルスを含む液体を３７℃で３０分間吸収させた後、培養物は 、２ＸイーグルのＭＥＭ及び１％アガロースの均等混合物からなるとともに０． ５ミリグラム／ｍｌの純化トリプシンを含む２．５■ｌのアガロース上層に投入 され、そして、５％ＣＯ２を含む大気中において３７℃でインキュベートされた 。接種された細胞培養物は、接種後少なくとも３日間、２Ｘハンクス（Ｈａｎｋ ｓ）平衡塩溶液（ｂａｌａｎｃｅｄ　５ａｌｔ　５ｏｌｕｔｉｏｎ）及び１％ア ガロースを等部と、０．１■ｇ／ｍｌの中和赤い染料からなる上層を孔当り１． ５１加えることにより、活性化した染料で染色された。プレートは、染色後４時 間及びその後毎Ｂ、ウィルスのプラークの存在が確認された。

プラーグは、１．５鳳ｌのイーグルのＭＥＭ中において単層から収穫され、ＭＡ １０４中で連続して継代させられた。連続継代は、２４個の孔のプレート（１ｃ ｉｔ”面積／孔）中のＭＡ　１０４細胞固定培養上に０．２ｗ１ｌのプラーク懸 濁液を接種することにより行なわれた。二の継代は、細胞変性のものであった。

連続継代のため、０．５１の凍結及び解凍後の懸濁液が、７５ｃ■３フラスコ中 のＭＡ、１０４を感染するするために使用された。この高い細胞変性感染は、１ ．２　ｘ　１０’ｐｆｕ／■Ｌの収穫があった。

ＭＡ１０４細胞培養中における５継代未溝のものにおいて、ウィルスは、１ミリ リツトルの液体当り１０８・０プラーク形成ユニツト（ｐｆｕ　）以上の感染ウ ィルスを生成した。このウィルス濃度は、他のいかなるヒトのロータウィルス株 の特徴を示す数字（通常は１ミリリットル当り１０′′乃至１０　’ｐｆｕ）を も越えていた。

２−ＨＤＣ３の′ 実施例１のウィルスの連続継代が、次いで、ＨＤＣ３細胞の固定培養中で行なわ れた。ＨＤＣ３ＡＮ胞は、９゜３７５マイクログラム／■ｌの精製されていない トリプシン［Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｔａｒｏｔｙ］を補充されたＭＣＤＢ−１０４ 媒体を含んでいた０種々の継代レベルにおいて、適当なように、分離ロータウィ ルスをＭＡ１０４細胞培養中で生成された１つのプラーグの分離及び増殖によっ て遺伝学的に精製してもよい、囲まれたどのようなプラークからも分離された１ つのプラーク孔中の細胞の物理的吸引は、標準的方法によってこの細胞懸濁液中 に含まれるウィルスの連続増殖によって続けられた。

現在、０．３０マイクログラム／園ｌの精製トリプシンを含む血清のない媒体の 存在下において、ウィルスをＨＤＣ３細胞の固定培養に接種することが好ましい 、培養は、接種後７乃至１０日間、凍結及び解凍して収穫された。副綴代は、組 織培養フラスク中において、ＨＤＣ３細胞、すなわち、固定培養の他のローラチ ューブ中で作られた。

ＨＤＣ８細胞中における最初の３又は４の副培養後、ＨＣＲ３Ａの滴定濃度は低 下するかも知れず、ＭＡ１０４細胞の１つの富化継代（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ　 ｐａｓｓａｇｅ）を必要とするであろう、その後、ＨＤＣ３中においてさらなる 連続継代、例えば少なくとも毎日１５回の継代が繰り返して得られた。

元となったスツール懸濁液中におけるウィルスと比較される細胞培養適応ロータ ウィルスの同一性は、ポリアクリルアミドゲル中に誘発されるＲＮＡ電気泳動の 比較によって確認される。各々の細胞内容適応ロータウィルスの血清タイプは、 血清タイプ特異超免疫抗血清と、兎又はモルモット中で調製された原註ロータウ ィルスを反応させることによって決定され得る。

支ｉ叢主二Ｊ１以二３ン　−ＨＣＲ３−７９−９（７）−生滅２４個のくぼみの あるプレート中のＣＶＩ細胞培養物はＰＢＳで２回洗浄され、独立したくぼみは 、牛−ヒトリアソータントＷＩ７Ｂ−９の連続希釈液（ｓｅｒｉａｌｄｉｌｕｔ ｉｏｎｓ）を混合したＨＣＲ３Ａの連続希釈液ＪＨＤ　Ｃ８中で２５＃目細胞培 養継代及び１３＃目細胞継代を表わす株（ｓｔｏｃｋ）　Ｋ３３３Ｘｚコで感染 させられた。ＷＩ７９−９は、牛のロータウィルスＷＣ３の１０の遺伝子と、ヒ トのタイプ１０−タウイルスＷＩ７９から誘導された血清タイプ特異蛋白質ｖｐ ７をコードした遺伝子９を含んでいる。ＷＩ７９−９リアソ一タント株は、ＣＶ −１細胞培養中で成長させられた。このりアソータントは、１９８９年７月１２ 日に公表されたヨーロッパ特許出願第３２３、７０８号に詳細に記載されている 。この出願は米国出願第１２６，４７７号に対応しており、この文献は、リアソ ータントの構成を説明するためにここに一体化される。ＷＩ７９−９は、受付番 号ＶＲ２１９４及びＶＲ２１９ｆ３としてＡＴＣＣに寄託されている。

細胞が２回洗浄され、１３マイクロミリグラム／ｍｌの純化されていないトリプ シンを含む］、、、５ｕｌ／孔のストッカーズ（Ｓｔｏｃｋｅｒｓ）　Ｂ　ＨＫ 媒体に投入された後、ウィルスは、孔当り０．２ｕｌの総容積で３０分間細胞に 接触させられた。５０％を越える細胞を含む細胞変性効果は２４時間後において ほとんどのくぼみで顧らかになった。

細胞は凍結及び解凍によって収穫された。

各々の感染させられた細胞懸濁液はＰＡＧＥ　（ポリアクリルアミドゲル電気泳 動）によって検査され、各々の親ウィルスから等量の遺伝子分画を調製すること が、さらなる研究のために選択された。この混合物はＨＤＣ８細胞の２４個のく ぼみのあるプレートを感染するために使用された。ＨＤＣ８細胞は、次いで、区 画媒体ＭＣＤＢ−１０４に投入され、それに、モノクローナル（■ｏｎｏ−ｅｌ ｏｎａｌ）抗体１５９−Ｔ３が希釈度１　：　６０，０００の比率で加えられた 。ＨＤＣ３細胞は、ＨＤＣ３の成長に対応する遺伝子分画を選択するために使用 された。ＭＡｂ１５９−Ｔ３はタイプ３ｖｐ　７を含むウィルスを中和する。こ のＭＡｂは、ＨＣＲ３Ａを中和するが、ＷＩ７９−９との混合感染から誘導され た血清タイプ１ｖｐ７によってｖｐ７が置換されたＨＣＲ３Ａは中和しない。

この感染物は、２４時間後に凍結及び解凍によって収穫されたとき、７５％を越 えて細胞変性効果を示した。

収穫された細胞懸濁液は、連続希釈液中において標準プラーク検定中のＭＡ１０ ４細胞上に接種された。その内には、ＭＡｂ１５９−Ｔ３が希釈度１：２５，０ ００でアガロース上層に加えられた。１：１０００で希釈され細胞培養中で成長 した。

これらの収穫されたプラーク副産物はＰＡＧＥによって検査された。１つのウィ ルス群は、血清タイプ１０−タウイルスＷＩ７９の遺伝子９によって置換された 遺伝子９を具えたＨＣＲ３Ａゲノムからなることが示された。

このリアソータントはＨＣＲ３Ａ−７９−９と命名された。

ＨＣＨ３Ａ−７９−９は、タイプ３０−タウイルスＶｐ７と反応ｔ６ＭＡｂ　１ ５９−Ｔ３、又は、１：２０゜８３５の滴定濃度で）ｌｃＲ３Ａロータウィルス を中和したタイプ３ヒトのロータウィルスＷＩ７９［発明者によって供給される 血清Ｒ２１３ｃｌに対するポリグローナル（ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ）抗血清によ って、中和されなかった。リアソータントによるタイプ１ｖｐ７の収穫は、同種 のタイプ１０−タウイルスＷＩ７９に対する同様の中和滴定濃度（１：　９，９ ２５）を与えるタイプｌロータウィルスに対する複分岐抗血清によって１：１５ ，７７０の滴定濃度に中和させられた事実によって確認された。

４つのさらなるプラーク純化が抗血清の不存在下でＨＣＲ３Ａ−７９〜９につい て行なわれ、そして、ＭＡＬ０４中の９つのさならる継代がこのリアソータント のＡＴＣＣ寄託（ロットＦＰＯ８１）の調製の前に行なわれた。

ＨＣＲ３Ａ−７９−９は、超免疫抗血清についてのＶＮテストでは抗原的に２価 である。それは、ヒトの血清タイプｌ及び血清タイプ３のロータウィルスに対す る抗血清と反応する。ＨＣＲ３Ａ−７９−９０−タウイルスは、ＨＤＣ８ＩＩ胞 培養中で複製する。経口接種された大人及び幼児用の弱毒化は行なわれなかった 。しかし、必要ならば、従来の方法（例えば、拡張細胞培養継代、低温継代）に よって弱毒化を行なってもよい、ＨＣＲ３Ａ−７９−９リアソータントは、高比 率のワクチンにおいて、ロータウィルス血清タイプ１及び／又は血清タイプ３の ためのＶＮ抗体特異性を誘発することが予想される。

ＨＣＲ３Ｂのための同様のリアソータントを上述の方法に準じた方法によって調 製することができる。

−戸　戸　−２め　・ リアソータントロータウイルスＨＣＲ３Ａ−７９−９は、上述のように、非病原 的に継代することによって、ワクチン用に調製され得る。リアソータントがヒト のワクチン用に許容し得る程度に安全であるとき、好気性及び嫌気性のバクテリ ア、マイコバクテリア並びに細菌類の培養用の標準的な研究室培地中にワクチン を接種してなる繁殖不能テストが行なわれた。ワクチンは、培養内において３Ｔ ３マウス細胞の接種によってマイコプラズマのためにテストされ、細胞内細胞変 性ＤＮＡ用ヘキスト（）ｌｏｅｃｈ３ｔ）染料で染色することが行なわれた。非 遺伝性ウィルスのテストは、ワクチンウィルスの複製を抑制するように、従来の 方法によって得られた血清タイプ特異抗ロータウィルス血清の存在下において、 ヒト及び霊長動物細胞培養の接種を含んでいる。そして、テストは、ＣＰＥ及び ／又は赤血球吸着の発生のために観察された。

大人のマウス及び新しく生まれたマウスは、ワクチンを脳内に及び経口で接種さ れ、その後３０Ｅｒ間観察された。大人のモルモットは腹腔内に接種され、接種 後１５日間観察された。

ＨＣＲ３Ａ　−７９−９リアソータントロータウイルスワクチンの感染滴定濃度 は、標準的なプラーグ検定により測定された。

−戸゛の投与 大人へのワクチンの投与二大人のボランティアには、胃酸を緩和するために３０ １のマーロックス（Ｍａａｌｏｘ）　ヲ経ロ投与した後、１回分の総服用量（１ ０’ｐｆｕ）のＨＣＲ３Ａ、　−７９−９ワクチンが経口で与えられた。全ての 大人は臨床学的に正常でいられることが予想された。感染後３Ｅｒで収集された スツールサンプル中にワクチンロータウィルスを排泄した者はいなかった。

幼児へのワクチンの投与：　ＨＣＲａＡ−７９−９’７７チンは、２．０■ｌの ワクチン及び０．５■ｌのチェリーシロップを含む容積２．５■ｌで幼児に経口 で投与された。

幼児は、胃酸を緩和するため、ワクチンの前３０分において、幼児処方として３ ０■■のマーロックス、又は、体重１ｋｇ当り１■ｌのマーロッグスが与えられ た０次いで、２体の幼児は、服用量１０　”　’ｐｆｕのＨＣＲａＡ−７９−９ が与えられ；２人は服用量１０６・’ｐｆｕが与えられ；そして、４０人の幼児 は服用量１０７・’ｐｆｕが与えられた。

ワクチンに関連する病状が観察されることは予想されなかった０種々のワクチン 服用が行なわれた多くの幼児は、ロータウィルス血清タイプ１又は３に対するウ ィルス中和血清抗体反応を生じることが予想された。ＨＣＲａＡ−７９−９の最 初の服用に対するこの免疫反応は、血清タイプ１、すなわち、ＷＩ７９に対して 最も頻度が高く生じることが予想され、リアソータントロータウイルスの２価の 抗原構成を反映している。

幼児においてＨＣＲａＡ−７９−９に対する免疫反応の誘発効果は、最初の服用 後３０日に、経口で第２「促進Ｊ　（ｂｏｏｓｔｅｒ　）服用を与えることによ ってさらに助長され得る。このような促進は、最初の接種のために使用されたＨ ＣＲａＡ−７９−９リアソータントウイルス、又は、ＨＣＲａＡ−７９−９リア ソータントの両方のウィルス親からなるワクチンから、構成してもよい、促進服 用に伴って、血清タイプ３０−タウイルスに対する抗体は、血清タイプ１０−タ ウイルスで得られた抗体に類似する度数で誘発され得る。従って、抗体は、２つ の血清タイプ１及び３に対して誘発され得る。これは、米国における幼児のロー タウィルス病に対して最も頻繁に生じていることである。

便に排出されたワクチンウィルスは、１０％スツール懸濁液のＭＡ　Ｉ　０４ｍ 胞中でプラーク検定によって測定される。ワクチン後スツールサンプル５日で誘 発した選択されたウィルスプラークは、収穫され、ＭＡ１０４細胞中で増殖させ られ、そして、ＰＡＧＥによってワクチンウィルス遺伝子をのために評価された 。全ての血清サンプルプレワクチン及び服用後１と２は、ＨＣＲ３ウィルス及び 抗原を与えるロータウィルス株に対するプラーグ中和抗体の終点で滴定された。

ワクチン又は血清陽性プレワクチンに対する陽性反応を示す全ての血清は、タイ プ１，２，３．４０−タウイルスについてテストされた。陽性反応は、血清中和 抗体で３倍の増加量であった。

８−ＨＣＲＡ− ヒトの倍数細胞株培養中で成長するようになっている多くのＨＣＲ３Ａロータウ ィルスは、まず、大人のボランティアに投与され、次いで幼児に投与された。３ 人の大人には１０５・’ｐｆｕの服用が与えられ、７人の大人には１０７・’ｐ ｆｕの服用が与えられた。高い服用量が与えれた３人の大人は、投与前接種株に 対して血清陰性であった。

いずれの大人も病状を示さなかった。（血清抗体反応は測定されなかった。） ＨＣＲａＡが与えられた最初の９人の幼児には、米国特許第４．６３６．３８５ 号に記載されるように、牛に起源を持つＷＣ３ワクチンの経口服用の後、促進接 種として４週間ＨＣＲ３Ａが１０４又は１０　’ｐｆｕのいずれかが与えられた 。血清学的なデータは８人の幼児から得られた。ＨＣＲａＡの促進服用は、８人 中５人（６２，５％）において、ＨＣＲａＡ又はタイプ１０−タウイルスに対し て血清抗体上昇を誘発した。３人の各々は投与前ＨＣＲ３Ａに血清学的に陰性で あり、３人中３人（１００％）とも１０８・０の服用で促進された。

１２人の幼児は、１０２乃至１０　’　ｐｆｕの範囲の滴定濃度でＨＣＲａＡの ２回連続した経口服用が与えられた。

血清学的データは、これらの幼児のうち１０人から得られた。５体く５０％）は 、ワクチン後、ＨＣＲａＡ及び／又はタイプ１０−タウイルスに対して血清抗体 滴定濃度の上昇を示した。抗体反応比率は、ＨＣＲａＡ及び／又はタイプ１０− タウイルスに元から血清学的に陰性な幼児では５／７（７１％）であり、幼児の ３人中３人とも（１００％）２回の服用１０５・０が与えられた。

胃腸炎に相当する症状（ゆるい便に加えて発熱や嘔吐）が、ＷＣ３０−タウイル スのみについての促進服用としてＨＣＲａＡが与えられた幼児９人のうち３人に おいて、ＨＣＲａＡの投与後７日以内に観察された。胃腸炎に相当する症状が、 ＨＣＲａＡを２回服用した１２人の幼児のうち５人から観察された。これらの症 状は、最初の服用後においてのみ現われた。　Ｈ，Ｆ、Ｃ１ａｒｋ　ｅｔ　ａｔ 、　Ｌ士ＬｌＬ、　！ｉ１１：５７０　（１９８８）に記載される症状記録シス テムを使用して、症状を伴った９人の幼児のうち８人が「軽い病気（腸ｉ１ｄ　 ｄｉｓｅａｓｅ）Ｊとして分類された。「中程度の病気（ｍｏｄｅｒａｔｅ　ｄ ｉｓｅａｓｅｌ＋を示す病気を伴った１人の幼児は、同時に中耳炎を治療中であ った。

結論として、臨床学的に測定されたＨＣＲ３Ａの調製物は、重いタイプの病気と 比較したとき、幼児用をして明白に弱毒化されていた。総括的に、ＨＣＲ３Ａは 、１８人の幼児のうち１０人（５６％）に免疫反応を誘発した。その幼児には、 １回の促進接種として、又は、ＨＣＲ，３Ａの２回の服用計画内で、ＨＣＲ３Ａ が投与されていた。この反応速度は、ヒトのロータウイルスリアソータントが測 定された他の実験においてヒトのロータウィルスに対する免疫反応速度によく似 ている０反応は、元から血清陰性の幼児において、及び１０’・０乃至１０６・ ０ｐｆｕのＨＣＲ３ＡＩｌｉ用が与えられた幼児において、さらに増強された。

ワクチン実験で得られたデータは、本発明のワクチン組成物の効能を表わし、そ して、さらには、弱毒化は誘発した免疫反応に大きな悪影響を及ぼすことはなか った。従って、ＨＣＲ３Ａは、可能性あるヒトのロータウィルスワクチン候補体 として、真剣な考慮に値する。

ここでの開示に基づいて、当業者は、本発明の方法及び組成物に種々の改変を加 えることができるであろう。

このような改変は、添付の請求の範囲に含まれるものと信じられる。

要　約 本発明は、主として、血清タイプ３　（ＨＣＲ３）の新規なヒトの細胞変性ロー タウィルス、及び、ヒトのロータウィルス遺伝子の表現のためのビーグルとして それを使用することに関する。また、本発明は、新規なロータウイルスリアソー タント、この新規なロータウィルス及びそのリアソータントを使用したワクチン 、並びに、それらの調製並びに投薬のための方法に関する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ヒトの蛋白質又は他の汚染物を実質的に含まない血清タイプ３、サブグルー プ１、（ＨＣＲ３）のヒトのロータウイルスであって、５未満の継代で高い滴定 濃度までに細胞培養内で成長する能力によって特徴付けられている、ヒトのロー タウイルス。 ２．適切な細胞培養への感染したスツールの直接接種、及び、培養単層上で感染 を直接表示するプラークの観察、並びにプラークからウイルスの選択的連続増殖 によって生成される、請求項１記載のロータウイルス。 ３．前記適切な細胞は、霊長動物ＶＥＲＯ細胞、アフリカンケリーンモンキー腎 臓細胞ＣＶ−１、ＢＳＣ−１、胎児のケリーンモンキー細胞ＭＡ−１０４、１次 霊長動物腎臓細胞培養、及びヒト若しくは他の哺乳動物の倍数細胞からなる群か ら選択される、請求項２記載のロータウイルス。 ４．株ＨＣＲ３Ａを有する、請求項１記載のロータウイルス。 ５．株ＨＣＲ３Ｂを有する、請求項１記載のロータウイルス。 ６．前記「高い滴定濃度」は１×１０５ｐｆｕ／ｍｌよりも大きいことを意味す る、請求項１記載のロータウイルス。 ７．ＨＣＲ３を分離及び成長させる方法であって、適切な細胞培養中に前記ウイ ルスを直接接種し、アダプテーション（適応）なしにプラーク又は可視的に検出 可能な細胞変性作用を誘発させることからなる、方法。 ８．前記適切な細胞培養は、霊長動物ＶＥＲＯ細胞、アフリカンケリーンモンキ ー腎臓細胞ＣＶ−１、ＢＳＣ−１、胎児のグリーンモンキー細胞ＭＡ−１０４、 １次霊長動物腎臓細胞培養、及びヒト若しくは他の哺乳動物の倍数細胞からなる 群から選択される、請求項７記載の方法。 ９．リアソータントへのＨＣＲ３成長特性に寄与するように、選択されたロータ ウイルスからの少なくとも１つの遺伝子分画と、ＨＣＲ３からのかなりの遺伝子 分画とを有する、ロータウイルスリアソータント。 １０．前記選択されたロータウイルスからの前記遺伝子分画が主血清タイプ特異 中和抗原をエンコードしており、前記リアソータントが、ヒトのＨＣＲ３株ロー タウィルス若しくはそれと実質的に同一の前記株の子孫から、又は前記ＨＣＲ３ 及び選択された株の双方に、単独で起源を持つロータウイルス分画を残すことに よって特徴付けられている、請求項９記載のリアソータント。 １１．さらに、第２の選択されたロータウイルスからの遺伝子分画を有する、請 求項１０記載のリアソータント。 １２．前記選択されたロータウイルスはヒトのロータウィルスである、請求項１ ０記載のリアソータント。 １３．前記選択されたロータウイルスは、ウイルス血清タイプ１、血清タイプ２ 、血清タイプ３、血清タイプ４、血清タイプ８及び血清タイプ９からなる群から 選択される、請求項１２記載のリアソータント。 １４．前記選択されたロータウイルスからの前記遺伝子分画は、ｖ．ｐ．７中和 抗原をエンコードしている、請求項１３記載のリアソータント。 １５．前記第２に選択されたロータウイルスからの前記遺伝子分画は、ｖ．ｐ． ４中和抗原をエンコードしている、請求項１１記載のロータウイルス。 １６．ＨＣＲ３Ａ−７９−９を有する、請求項１０記載のリアソータント。 １７．前記選択されたロータウイルスは動物のロータウイルスである、請求項１ ０記載のリアソータント。 １８．前記選択されたロータウイルスはＷＣ３である、請求項１７記載のリアソ ータント。 １９．ロータウイルスリアソータントを生成する方法であって、リアソータント ヘのＨＣＲ３成長特性に寄与するように、前記選択された抗原をエンコードした 第２ロータウイルスからの少なくとも１つの遺伝子分画と、ＨＣＲ３からのかな りの遺伝子分画とを有するリアソータントのためのセンタの選択的な圧力下にお いて、ＨＣＲ３及び選択された第２ロータウイルスの混合感染物を適切な細胞培 養内で成長させることからなる、方法。 ２０．前記適切な細胞培養は、霊長動物ＶＥＲＯ細胞、アフリカングリーンモン キー腎臓細胞ＣＶ−１、ＢＳＣ−１、胎児のグリーンモンキー細胞ＭＡ−１０４ 、１次霊長動物腎臓細胞培養、及びヒト若しくは他の哺乳動物の倍数細胞からな る群から選択される、請求項１９記載の方法。 ２１．前記第２のロータウイルスはヒトのロータウイルスである、請求項１９記 載の方法。 ２２．前記選択された抗原は血清タイプ特異抗原である、請求項１９記載の方法 。 ２３．前記第２のロータウイルスは動物のロータウイルスである、請求項１９記 載の方法。 ２４．さらに、同じ又は他の適切な細胞培養中に前記リアソータントを継代させ ることからなる、請求項１９記載の方法。 ２５．前記「選択的な圧力」は、その複製を防止するように、ＨＣＲ３又は第２ ロータウイルスに結合し得る抗体を前記細胞培養に加えることからなる、請求項 １９記載の方法。 ２６．前記「選択的な圧力」は、前記第２のロータウイルスの成長をサポートし 得ない細胞培養中で、前記混合感染物又はその子孫を継代させることからなる、 請求項１９記載の方法。 ２７．選択されたロータウイルスからの選択された抗原を大量に生成する方法で あって、適切な培養中で請求項１０のリアソータントを培養し、かくして、前記 遺伝子分画が前記選択された抗原をエンコードすることからなる、方法。 ２８．ＨＣＲ３Ａ及びＨＣＲ３Ｂから選択されたロータウイルスとて適切な担体 を有してなるワクチン組成物であって、自然のロータウイルスを攻撃するように 前記ワクチンがヒトの大人及び幼児の患者に保護免疫反応を誘発し得るようにな っている、ワクチン組成物。 ２９．請求項１０の少なくとも１つのリアソータントロータウイルスを有するヒ トのロータウイルスによって生じる急性の下痢に対して免疫学的保護を与えるワ クチン。 ３０．前記選択されたロータウイルスからの前記遺伝子分画がｖ．ｐ．７抗原を エンコードした遺伝子分画であり、残りのロータウイルス分画が、ＨＣＲ３株ロ ータウィルス若しくはそれと実質的に同一の前記株の子孫から、又は前記ヒトの 株の双方に単独で起源を持つ、請求項２９記載ワクチン。 ３１．弱毒化されたワクチン組成物を生成する方法であって、ヒトの倍数細胞に ＨＣＲ３又は請求項１０のりアソータントを直接接種し、感染を示すプラークを 観察することからなる、方法。 ３２．さらに、１以上の霊長動物ＶＥＲＯ細胞、アフリカングリーンモンキー腎 臓細胞ＣＶ−１、ＢＳＣ−１、胎児のグリーンモンキー細胞ＭＡ−１０４、１次 霊長動物腎臓細胞培養、及びヒト若しくは他の哺乳動物の倍数細胞から選択され る適切な細胞培養に、充分な数の継代を介して前記ウイルスを継代させることか らなる、請求項３１記載の方法。 ３３．前記継代を約２５乃至約３０°Ｃの間の温度で行なうことからなる、請求 項３１記載の方法。 ３４．さらに、適切な不活化剤で前記ウイルスを不活化することからなる、請求 項３１記載の方法。 ３５．ヒトのロータウイルス感染に対してヒトをワクチン接種する方法であって 、弱毒化されたＨＣＲ３ロータウイルスを有するワクチンを約１０８．０乃至約 １０９．０ｐｆｕの範囲の服用で経口、鼻を通じて又は注射によって少なくとも １回ヒトに投与することからなる、方法。