CN1475137A - 鸡饲料添加剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含酵母细胞的生物组合物，其可以改善鸡的免疫功能。本发明还涉及生产所述生物组合物的方法，及所述生物组合物作为鸡饲料添加剂的应用方法。

Description

鸡饲料添加剂
1.技术领域
本发明涉及包含酵母细胞的生物组合物，其可以改善动物的免疫功能。本发明还涉及生产这种生物组合物的方法，及使用这种生物组合物作为动物饲料添加剂的方法。
2.背景技术
从二十世纪40年代开始将抗生素加入动物饲料中。在2000年的报道中，美国售出的抗生素有1/3以上用于畜牧业中，即一年大约一千八百万磅。它们用于治疗患病动物；预防圈养在狭窄畜圈或笼子里的其它动物免于感染；及使动物快速生长。从体积看，大多数抗生素用于前两个原因。只有6.1％的药物有生长促进作用。然而，在接触的动物数方面，生长促进作用巨大。这是因为农场主对全部畜类或禽类以低剂量但每天均给予抗生素。调节性低剂量抗生素不仅有助于保持牲畜健康，而且还改善营养的吸收，这有助于动物在较少饲料基础上更快生长，并因此提高利润，尤其在集约农场运作中。估计美国九千二百万头猪中有75％的猪常规摄取的饲料中加有抗生素。有大约6％的牛，25％的鸡和50％的火鸡也是这样做。
已知过量的抗生素和化学品、包括不被动物代谢的那些抗生素和化学品可以保留在机体内或被排泄。在第一种情况中，其可以累积在肉中(及在奶牛或山羊乳汁中)，被人体摄入。因此，存在这样的可能性即这些抗生素和化学品污染人类食物。其次及更重要地，微生物暴露于所述抗生素，使所述微生物产生抗生素抗性菌株。如果被排泄，这些抗生素和化学品将释放入环境中，可以进入土壤并与土壤微生物接触。已经有推测，即过一段时间后，常用抗生素表现出对抗一些微生物的效力降低，因为抗生素抗性的产生及这种抗性转移至包括在人体内导致感染的那些微生物在内的微生物。
逐渐有迹象提示广泛用于农场动物的抗生素逐渐降低用于治疗人类传染病尤其通过食物传染病原体导致的疾病的重要抗生素的效果。用低水平抗生素处理的农场动物产生细菌的药物抗性形式。在一种情况中，Synercid获准用于人体是在20世纪90年代，称为维及尼霉素的一种密切相关药物自从1974年已经用于牲畜。事实上，自从1990年在许多发达国家，人兽互传病原体的多药抗性菌株感染人体逐渐增多。特别引人注目的是鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)DT104的MR菌株的流行性传播，目前其表现为几乎在世界范围分布。在DT104菌株中，抗性谱增加是令人关注的。在世界上的许多区域，对环丙沙星的易感性降低的趋势逐渐增加。弯曲菌属(Campylobacters)的环丙沙星抗性微生物也在增加，关于这类分离株的报道遍布于世界许多国家。见Threllfall E.J.et al.，Acta Vet ScandSuppl 2000；93：63-8；Wegener H.C.，N Engl J Med.1999 May 20；340(20)：1525-32；Smith K.E.et al.，N Engl J Med.1999 May 20；340(20)：1581-2；Wegener H.C.et al.，Acta Vet Scand Suppl.1999；92：51-7。
由于考虑到使人体产生疾病的微生物中抗药性的产生，美国和欧盟的管理机构已经禁止或提议禁止在动物中使用某些抗生素作为生长促进剂。作为辩护，农场主和药厂反驳说减少使用抗生素将导致疾病和死亡率增加，而且由于使动物达到理想屠宰体重所需时间增加，使肉类更加昂贵。抗生素有助于动物较快增肥，因为它们不需要在抵抗疾病方面消耗能量。有反对意见说正是对生长促进剂的禁止将引起对健康产生巨大危险。不对其加以防护，动物可面临更严重的疾病。结果，兽医将采用大剂量治疗性抗生素。例如，在瑞典禁止使用抗生素当年，超过50000头猪死于腹泻。
很清楚的是在抗生素在畜牧业作为预防剂的应用被禁止或减少的同时，急迫需要替代方式降低农场动物感染疾病的几率。本发明提供了一种解决方案，即使用酵母改善动物的免疫功能。
动物饲料中包含真菌细胞或真菌发酵产物已经应用了一段时间。一些细菌、酵母和霉菌制品，通常称为益生菌或直接食用微生物，经口服或添加至动物饲料中能提供多种益处。然而，这种制品的作用机制不十分清楚，但确信它们发挥作用是通过改变动物的肠道微生物区系/小型生物群，从而改善肠道健康状态及改善营养吸收。在反刍动物中，所述制品可以改善在瘤胃中导致气体浪费性产生的发酵情况。
真菌细胞及产物在动物饲料中的应用例如见Miller出版公司(Minnetonka，Minn.)出版的年度饲料添加剂纲要，或以下专利文献：
美国专利No.3,903,307揭示了一种生产动物饲料的方法，其基于通过酵母如Candida utilis和Trichoderma veride发酵废糖蜜或甘蔗渣。
美国专利No.4,055,667揭示了一种液体动物饲料补剂，其包含用过的啤酒酵母在乙醇水溶液介质中的胶体混合物。
美国专利No.4,582,708揭示了一种动物饲料补剂，其包含具有发酵活性的活酵母细胞(糖酵母属菌种(Saccharomyces))，一种包含磨碎的谷类、磨碎的豆类或其混合物的增稠成分，一种矿物质混合物，一种液体结合剂，一种维生素混合物，及磨碎的高岭土。
美国专利No.5,624,686揭示了一种动物饲料添加剂，其通过培养某些细菌或酵母菌种(如Saccharomyces cerevisiae，Candida utilis)并破坏所述微生物细胞而制备，由此使得所述细胞的代谢物有效为动物所用。
美国专利No.6,214,337揭示了一种包含酵母葡聚糖的动物饲料，其衍生自多种酵母菌种(如Saccharomyces cerevisiae，Candida utilis)的细胞壁。
本文对文献的引用不意味着承认本文所引用任何文献是相关的现有技术，也不意味着承认所引用文献被看作对于本申请权利要求书的可专利性有实质的影响。所有对这些文献的日期的声明和对内容的陈述均基于申请人掌握的信息，并不意味着对这些文献的日期或内容的正确性的承认。
3.发明内容
本发明涉及一种生物组合物，其可以加入动物饲料中以降低家禽如鸡的传染病发生率。
在一个实施方案中，本发明提供了包含大量活酵母细胞的生物组合物，当被摄取时，所述酵母细胞能改善反刍动物如鸡的免疫功能。所述生物组合物可以用于降低鸡传染病发生率或使禽群的健康状态最佳化。
在另一个实施方案中，本发明提供了生产所述生物组合物的方法。具体地，本发明方法包括在一系列限定频率和场强的电磁场的存在下培养酵母细胞，由此所述酵母细胞成为代谢活性的并强力刺激动物免疫系统。多达4种不同酵母细胞成分可以用于形成生物组合物。所述酵母细胞还可以进行驯化(conditioning)步骤以改善其性能。所述驯化步骤包括在含有动物胃液、野山楂汁和野枣汁的培养基中培养所述酵母细胞。本发明涵盖如下的生产所述生物组合物的方法，所述方法包括在活化条件下培养所述酵母细胞，混合本发明的各种酵母细胞培养物，随后干燥所述酵母细胞并对终产物进行包装。在优选的实施方案中，起始酵母细胞可商购和/或可公开获得，例如但非限于Saccharomyces cerevisiae。
本发明生物组合物可以直接喂给动物或用作添加剂掺入正常动物饲料中。本发明涵盖包含本发明激活的酵母细胞和配料如沸石粉的动物饲料组合物。
4.附图说明
图1：激活和条件化酵母细胞。1：酵母细胞培养物；2：容器；3：电磁场原料；4：电极。
5.具体实施方案的描述
本发明涉及生物组合物，其能改善动物的免疫功能，和/或降低传染病发生率。本发明提供了生产所述生物组合物的方法以及所述生物组合物作为动物饲料添加剂的应用方法。
本发明的生物组合物包含酵母。与作为饲料成分的酵母传统应用不同，本发明的酵母细胞不是动物营养素的主要来源。本发明的酵母细胞作为补充物代替或减少目前常规加入牲畜饲料中的抗生素。所述酵母细胞当由动物口服或与饲料一起被摄取时是活的。在动物胃肠道中，所述酵母细胞能刺激动物免疫系统并改善免疫功能，从而降低传染病发生率。应用本发明的生物组合物可以降低商业动物运作中保持动物健康的总成本，及使在饲料中最少应用抗生素或不用抗生素切实可行。
尽管以下术语具有本领域中充分阐明的含义，以下仍阐述了所述术语在本文中的含义以便于解释本发明。
本文所用术语“饲料”，广义上是指任何种类的液体或固体物质，其用于营养动物或维持动物正常生长或加速其生长，包括新生动物及幼小的发育中动物。优选地，所述饲料是鸡饲料。
本文所用术语“动物”是指家鸟(livestock birds)，家禽(poultry)和鸡，特别包括蛋鸡，肉鸡和观赏鸡等所有品种。
本文所有术语“免疫功能”广泛涵盖了动物的特异性和非特异性免疫反应，包括体液和细胞介导的防御机制。动物的免疫功能能使动物免于病原体感染和/或从感染中康复，所述病原体如细菌，病毒，真菌，原生动物，蠕虫及其它寄生虫。动物的免疫功能还可以预防感染，特别是在动物初次暴露于病原体之后由相同病原体所致的未来感染。许多类型的免疫细胞参与提供免疫功能，包括淋巴细胞的各种亚型(B细胞，T细胞，K细胞，NK细胞)，不同类型的白细胞(巨噬细胞，中性粒细胞，嗜酸性粒细胞，嗜碱性粒细胞)，抗原呈递细胞(树状细胞，内皮细胞)及在具有免疫活性的特定器官和组织中发现的细胞(骨髓，淋巴结，胸腺，粘液囊，淋巴集结)。反刍动物免疫系统的详细阐述见于John E.Butler所著的反刍动物免疫系统，1981，Perseus Books，在此以其全文并入参考。
在一个实施方案中，本发明提供了生物组合物，其包含至少一种酵母细胞成分。每种酵母细胞成分包含一群活酵母细胞，其已经在特定条件下培养，由此所述酵母细胞能改善动物免疫功能。在优选实施方案中，本发明生物组合物包含多达4种酵母细胞成分。
根据本发明，在某些特定培养条件下，可使酵母代谢性激活，从而有效刺激及增强摄取该酵母的动物的免疫功能。不希望被任何理论或机制束缚，本发明人认为所述培养条件激活和/或增强酵母细胞中一个基因或一系列基因表达，由此所述酵母细胞变得能强力刺激动物免疫系统。预想某些酵母基因产物和动物免疫系统因子之间的相互作用由于所述酵母细胞在下述条件下培养后这些酵母基因产物水平提高而明显增强。据信这些相互作用涉及胃肠道内和淋巴结内排列的免疫细胞以及循环免疫细胞。这些相互作用的结果是动物的免疫功能改善，如对感染的应答及从感染中康复，及对疾病的抗性得以改善。保护所述动物免于许多类型的传染病，包括寄生虫疾病，例如但非限于由细菌，病毒，真菌，原生动物，蠕虫等所致那些疾病。应用所述生物组合物的益处通过得自动物的实验结果证实，示出对传染病抗性或从中迅速康复。
在一个实施方案中，本发明的生物组合物可以直接由动物摄取。在另一个实施方案中，所述生物组合物可以加入饲料中。如相关领域技术人员所已知的，可以使用许多方法和器具将本发明生物组合物与饲料混合。在一个特别的实施方案中，本发明酵母培养肉汤的混合物在喂食动物之前直接加入饲料中。也可以将酵母的干燥粉末在喂食动物之前直接加入饲料中。在本发明另一个实施方案中，将所述酵母细胞与饲料的生料混合，这样自然掺入所述酵母细胞。所述生物组合物可以通过任何自动机械化方式施加于饲料中和/或与饲料混合。
所用生物组合物的量部分取决于饲养方案，并可以根据经验确定。例如，生物组合物与动物饲料的比率范围在0.1％-1％干重，优选0.3％-0.8％，更优选大约0.5％。尽管非必需，本发明生物组合物还可以与其它类型补剂联合或轮流使用，这些补剂例如但非限于维生素，矿物质和疫苗。
以下5.1和5.2章节是本发明4种酵母细胞成分及其制备方法。5.3章节阐述了包含4种酵母细胞成分中至少一种成分的本发明生物组合物的生产。
5.1酵母细胞培养物的制备
本发明提供了酵母细胞，其能改善摄取该酵母细胞的动物的免疫功能。可以组合多达4种不同的酵母细胞成分生产所述生物组合物。
所述生物组合物的一种酵母细胞成分通过在一个交变电磁场或一系列多个交变电磁场(multiple alternating electromagnetic fields inseries)下，在适当培养基中将大量酵母细胞培养一段时间而产生。所述培养程序使酵母孢子萌发，酵母细胞生长及分化，并可以进行分批培养或连续培养程序。本文所用术语“交变电磁场”或“电磁场”或“EM场”是同义的。本发明所用电磁场可以通过本领域熟知的各种方法产生。设备示意图如图1所示。所需频率和所需场强的电磁场由电磁波源(3)产生，其包含能产生电磁波的一或多个信号发生器，优选正弦波，优选频率范围为1500MHZ-15000MHz。本领域熟知这种信号发生器。也可以使用能产生较窄频率范围信号的信号发生器。如果需要，还可以使用信号放大器以增大信号输出，及因此增强EM场强。
可以通过各种方式将电磁场应用于所述培养中，包括将酵母细胞置于连接电磁波源的信号发射器邻近。在一个实施方案中，电磁场通过浸没于酵母细胞培养物中的电极形式的信号发射器(1)产生。在一个优选实施方案中，一个电极是金属板，其置于不导电的容器(2)的底部，另一个电极包含多个导线或导管，它们配置在所述容器内部，由此电磁场的能量可以均匀分布于培养物中。对于垂直的培养容器，导线或导管的顶端置于距容器底部3-30cm内(即从底部起大约2-10％容器高)。所用电极导线数根据培养物体积和导线直径而定。例如，培养物体积为10升或更少时，可以使用直径在0.5-2.0mm之间的两或三条电极导线。培养物体积为10-100升时，电极导线或导管的直径可以为3.0-5.0mm。培养物体积为100-1000升时，电极导线或导管的直径可以为6.0-15.0mm。培养物体积为1000升以上时，电极导线或导管的直径可以为20.0-25.0mm。
在本发明的各种实施方案中，可以使用Saccharomyces，Candida，Crebrothecium，Geotrichum，Hansenula，Kloeckera，Lipomyces，Pichia，Rhodosporidium，Rhodotorula Torulopsis，Trichosporon，和Wickerhamia属酵母。
酵母菌株的非限制性实例包括Saccharomyces cerevisiae Hansen，ACCC2034，ACCC2035，ACCC2036，ACCC2037，ACCC2038，ACCC2039，ACCC2040，ACCC2041，ACCC2042，AS2.1，AS2.4，AS2.11，AS2.14，AS2.16，AS2.56，AS2.69，AS2.70，AS2.93，AS2.98，AS2.101，AS2.109，AS2.110，AS2.112，AS2.139，AS2.173，AS2.174，AS2.182，AS2.196，AS2.242，AS2.336，AS2.346，AS2.369，AS2.374，AS2.375，AS2.379，AS2.380，AS2.382，AS2.390，AS2.393，AS2.395，AS2.396，AS2.397，AS2.398，AS2.399，AS2.400，AS2.406，AS2.408，AS2.409，AS2.413，AS2.414，AS2.415，AS2.416，AS2.422，AS2.423，AS2.430，AS2.431，AS2.432，AS2.451，AS2.452，AS2.453，AS2.458，AS2.460，AS2.463，AS2.467，AS2.486，AS2.501，AS2.502，AS2.503，AS2.504，AS2.516，AS2.535，AS2.536，AS2.558，AS2.560，AS2.561，AS2.562，AS2.576，AS2.593，AS2.594，AS2.614，AS2.620，AS2.628，AS2.631，AS2.666，AS2.982，AS2.1190，AS2.1364，AS2.1396，IFFI 1001，IFFI  1002，IFFI  1005，IFFI  1006，IFFI  1008，IFFI  1009，IFFI  1010，IFFI1012，IFFI  1021，IFFI  1027，IFFI  1037，IFFI  1042，IFFI  1043，IFFI  1045，IFFI  1048，IFFI  1049，IFFI  1050，IFFI  1052，IFFI  1059，IFFI  1060，IFFI1063，IFFI  1202，IFFI  1203，IFFI  1206，IFFI  1209，IFFI  1210，IFFI  1211，IFFI  1212，IFFI  1213，IFFI  1215，IFFI  1220，IFFI  1221，IFFI  1224，IFFI1247，IFFI  1248，IFFI  1251，IFFI  1270，IFFI  1277，IFFI  1287，IFFI  1289，IFFI  1290，IFFI  1291，IFFI  1292，IFFI  1293，IFFI  1297，IFFI  1300，IFFI1301，IFFI  1302，IFFI  1307，IFFI  1308，IFFI  1309，IFFI  1310，IFFI  1311，IFFI  1331，IFFI  1335，IFFI  1336，IFFI  1337，IFFI  1338，IFFI  1339，IFFI1340，IFFI  1345，IFFI  1348，IFFI  1396，IFFI  1397，IFFI  1399，IFFI  1411，IFFI 1413；Saccharomyces cerevisiae Hansen Var. ellipsoideus(Hansen)Dekker，ACCC2043，AS2.2，AS2.3，AS2.8，AS2.53，AS2.163，AS2.168，AS2.483，AS2.541，AS2.559，AS2.606，AS2.607，AS2.611，AS2.612；Saccharomyces chevalieri Guillermond，AS2.131，AS2.213；Saccharomyces delbrueckii，AS2.285；Saccharomyces delbrueckii Lindnervar. mongolicus Lodder et van Rij，AS2.209，AS2.1157；Saccharomycesexiguous Hansen，AS2.349，AS2.1158；Saccharomyces fermentati(Saito)Lodder et van Rij，AS2.286，AS2.343；Saccharomyces logos van laer etDenamur ex Jorgensen，AS2.156，AS2.327，AS2.335；Saccharomycesmellis Lodder et Kreger Van Rij，AS2.195；Saccharomycesmicroellipsoides Osterwalder，AS2.699；Saccharomyces oviformisOsterwalder，AS2.100；Saccharomyces rosei(Guilliermond)Lodder etkreger van Rij，AS2.287；Saccharomyces rouxii Boutroux，AS2.178，AS2.180，AS2.370，AS2.371；Saccharomyces sake Yabe，ACCC2045；Candida arborea，AS2.566；Candida Krusei(Castellani)Berkhout，AS2.1045；Candida lambica(Lindner et Genoud)van. Uden et Buckley，AS2.1182；Candida lipolytica(Harrison)Diddens et Lodder，AS2.1207，AS2.1216，AS2.1220，AS2.1379，AS2.1398，AS2.1399，AS2.1400；Candida parapsilosis(Ashford)Langeron et Talice，AS2.590；Candidaparapsilosis(Ashford)et Talice Var. intermedia Van Rij et Verona，AS2.491；Candida pulcherriman(Lindner)Windisch，AS2.492；Candidarugousa(Anderson)Diddens et Loddeer，AS2.511，AS2.1367，AS2.1369，AS2.1372，AS2.1373，AS2.1377，AS2.1378，AS2.1384；Candidatropicalis(Castellani)Berkout，ACCC2004，ACCC2005，ACCC2006，AS2.164，AS2.402，AS2.564，AS2.565，AS2.567，AS2.568，AS2.617，AS2.1387；Candida utilis Henneberg Lodder et Kreger Van Rij，AS2.120，AS2.281，AS2.1180；Crebrothecium ashbyii(Guillermond)Routein，AS2.481，AS2.482，AS2.1197；Geotrichum candidum Link，ACCC2016，AS2.361，AS2.498，AS2.616，AS2.1035，AS2.1062，AS2.1080，AS2.1132，AS2.1175，AS2.1183；Hansenula anomala(Hansen)H et P sydow，ACCC2018，AS2.294，AS2.295，AS2.296，AS2.297，AS2.298，AS2.299，AS2.300，AS2.302，AS2.338，AS2.339，AS2.340，AS2.341，AS2.470，AS2.592，AS2.641，AS2.642，AS2.635，AS2.782，AS2.794；Hansenulaarabitolgens Fang，AS2.887；Hansenulajadinii Wickerham，ACCC2019；Hansenula saturnus(Klocker)H et P sydow，ACCC2020；Hansenulaschneggii(Weber)Dekker，AS2.304；Hansenula subpelliculosa Bedford，AS2.738，AS2.740，AS2.760，AS2.761，AS2.770，AS2.783，AS2.790，AS2.798，AS2.866；Kloeckera apiculata(Reess emend. Klocker)Janke，ACCC2021，ACCC2022，ACCC2023，AS2.197，AS2.496，AS2.711，AS2.714；Lipomyces starkeyi Lodder et van Rij，ACCC2024，AS2.1390；Pichia farinosa(Lindner)Hansen，ACCC2025，ACCC2026，AS2.86，AS2.87，AS2.705，AS2.803；Pichia membranaefaciens Hansen，ACCC2027，AS2.89，AS2.661，AS2.1039；Rhodosporidium toruloidesBanno，ACCC2028；Rhodotorula glutinis(Fresenius)Harrison，ACCC2029，AS2.280，ACCC2030，AS2.102，AS2.107，AS2.278，AS2.499，AS2.694，AS2.703，AS2.704，AS2.1146；Rhodotorula minuta(Saito)Harrison，AS2.277；Rhodotorula rubar(Demme)Lodder，ACCC2031，AS2.21，AS2.22，AS2.103，AS2.105，AS2.108，AS2.140，AS2.166，AS2.167，AS2.272，AS2.279，AS2.282；Saccharomycescarlsbergensis Hansen，AS2.113，ACCC2032，ACCC2033，AS2.312，AS2.116，AS2.118，AS2.121，AS2.132，AS2.162，AS2.189，AS2.200，AS2.216，AS2.265，AS2.377，AS2.417，AS2.420，AS2.440，AS2.441，AS2.443，AS2.444，AS2.459，AS2.595，AS2.605，AS2.638，AS2.742，AS2.745，AS2.748，AS2.1042；Saccharomyces uvarum Beijer，IFFI1023，IFFI 1032，IFFI 1036，IFFI 1044，IFFI 1072，IFFI 1205，IFFI 1207；Saccharomyces willianus Saccardo，AS2.5，AS2.7，AS2.119，AS2.152，AS2.293，AS2.381，AS2.392，AS2.434，AS2.614，AS2.1189；Saccharomyces sp.，AS2.311；Saccharomyces ludwigii Hansen，ACCC2044，AS2.243，AS2.508；Saccharomyces sinenses Yue，AS2.1395；SchizoSaccharomyces octosporus Beijerinck，ACCC 2046，AS2.1148；SchizoSaccharomyces pombe Linder，ACCC2047，ACCC2048，AS2.248，AS2.249，AS2.255，AS2.257，AS2.259，AS2.260，AS2.274，AS2.994，AS2.1043，AS2.1149，AS2.1178，IFFI 1056；Sporobolomyces roseusKluyver et van Niel，ACCC 2049，ACCC 2050，AS2.619，AS2.962，AS2.1036，ACCC2051，AS2.261，AS2.262；Torulopsis candida(Saito)Lodder，ACCC2052，AS2.270；Torulopsis famta(Harrison)Lodder et vanRij，ACCC2053，AS2.685；Torulopsis globosa(Olson et Hammer)Lodderet van Rij，ACCC2054，AS2.202；Torulopsis inconspicua Lodder et vanRij，AS2.75；Trichosporon behrendii Lodder et Kreger van Rij，ACCC2055，AS2.1193；Trichosporon capitatum Diddens et Lodder，ACCC2056，AS2.1385；Trichosporon cutaneum(de Beurm et al.)Ota，ACCC2057，AS2.25，AS2.570，AS2.571，AS2.1374；Wickerhamiafluoresens(Soneda)Soneda，ACCC2058，AS2.1388。通常优选Saccharomyces属酵母。在Saccharomyces cerevisiae酵母菌株中，优选Saccharomyces cerevisiae Hansen。
通常地，本发明所用酵母菌株可以得自私立或公立实验室培养物，或可公开获得的培养物保藏物，如美国典型培养物保藏中心，10801弗吉尼亚州马纳萨斯大学道，VA 20110-2209，和中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，中国科学院微生物所，中国北京海淀区2714信箱，邮编100080。
尽管是优选的，本发明酵母细胞成分的制备不限于用纯化的酵母菌株起始。每种酵母细胞成分可以通过培养不同菌种或菌株的酵母细胞混合物而产生。酵母细胞成分的组成可以通过本领域熟知的标准酵母鉴别方法确定。
在本发明的不同实施方案中，使用处理、转移及保存酵母的标准方法。尽管非必需，但当进行本发明生产过程时，需要无菌条件或清洁环境。也可以使用处理动物血液和免疫细胞及研究动物免疫功能的标准方法。这种方法的详细阐述见实验室方法进展：普通血液学2000，Assendelft等编辑，Arnold，Edward(出版人)；脊椎动物免疫学手册1998，Pastoret等编辑，学术出版社，及免疫学通用方法1991，Coligan等编辑，John Wiley & Sons公司，在此均以其全文并入参考。
在一个实施方案中，将第一种酵母细胞成分的酵母细胞在存在至少一个可变电磁(EM)场的情况下培养，频率范围为7750MHz-7780MHz，优选为7750MHz-7770MHz。可以施加一个单一EM场或一系列EM场，每个电磁场具有在一定范围内的不同频率，或一定范围内的不同场强，或一定范围内的不同频率和场强。尽管可以使用任何实用数量的EM场，但优选将酵母培养物暴露于一系列的2，3，4，5，6，7，8，9或10种不同EM场中。可以通过本领域已知方式施加的EM场的各自频率可以为7750，7751，7752，7753，7754，7755，7756，7757，7758，7759，7760，7761，7762，7764，7765，7766，7767，7768，7769，或7770MHz。
EM场的场强在22-320mV/cm内。在一个优选实施方案中，系列中开始的EM场比后来的EM场的场强低，由此酵母细胞培养物暴露于场强逐渐提高的EM场中。因此，可以将酵母细胞在较低场强(例如130-250mV/cm)培养24-64小时，然后在较高EM场强(例如250-320mV/cm)再培养10-40小时。所述酵母细胞培养物可以保持在相同容器中，当从一个EM场至另一个EM场转换时使用同一套电磁波发生器和发射器。
所述培养程序可以通过用细胞密度为大约105个细胞/ml的1ml选定的酵母菌株接种物接种100ml培养基起始。将起始培养基在35℃-37℃保持24-48小时，之后暴露于EM场中。所述培养程序优选在溶解氧浓度在0.025-0.08mol/m3的条件下进行，优选0.04mol/m3。氧的水平可以通过本领域已知的任何常规方法控制，包括但非限于搅拌和/或吹气。
所述培养最优选在液体培养基中进行，所述培养基中含有动物血清和酵母细胞可同化的营养素来源。表1提供了培养本发明第一种酵母细胞成分的培养基实例。
                        表1
培养基成分 数量
蔗糖或葡萄糖 20.0g
K2HPO4 0.25g
MgSO4·7H2O 0.2g
NaCl 0.22g
CaSO4·2H2O 0.5g
CaCO3 6.0g
尿素 0.2-5.0g
蛋白胨 15g
动物血清 2-5ml
高压灭菌水 1000ml
通常地，碳水化合物如糖，例如蔗糖，葡萄糖，果糖，右旋糖，麦芽糖，木糖等及淀粉，可以单独或组合使用作为培养基中可同化碳源。培养基中利用的碳水化合物来源的精确数量部分依赖于培养基中的其它配料，但碳水化合物的数量通常在培养基重量的大约0.1％-5％之间变化，优选大约0.5％和2％，最优选大约0.8％。在培养基中这些碳源可以单独使用，或可以组合使用这样的一些碳源。可以掺入培养基中的无机盐是能产生钠，钙，磷酸根，硫酸根，碳酸根等离子的常规盐。营养性无机盐的非限制性实例是(NH4)2HPO4，CaCO3，MgSO4，NaCl，和CaSO4。
动物血清是包含白细胞的一种血液组分，可以通过本领域已知的标准方法如密度梯度离心从全血(10-20ml)中制备。分离出红细胞并弃去。该血清可以用90-180ml双蒸馏水稀释。在将培养基高压灭菌并冷却至大约45℃之后，将血清加入培养基中。优选鸡血清。
应注意表1提供的培养基成分是非限制性的。可根据需要按比例增加或减少。本领域技术人员根据实际及经济利益如培养规模和培养基成分的当地供应可以对所述培养基进行各种修改。
尽管酵母细胞在EM场中培养仅几小时后就被激活，但所述酵母细胞可以在EM场中长期培养(例如一或多周)。在培养程序结束时，通过本领域已知的各种方法从培养物中回收组成本发明第一种酵母细胞成分的酵母细胞，并在大约0℃-4℃温度下贮存。回收的酵母细胞也可以干燥并以粉末形式贮存。
用Geotrichum candidum Link菌株AS2.616生产本发明第一种酵母细胞成分的一个非限制性实例见于下文第6节所述。
在另一个实施方案中，将第二种酵母细胞成分的酵母细胞在至少一个可变电磁(EM)场中培养，频率范围是6815MHz-6850MHz。可以施加一个单一EM场或一系列EM场，每个电磁场具有在一定范围内的不同频率，或一定范围内的不同场强，或一定范围内的不同频率和场强。尽管可以使用任何实用数量的EM场，但优选将酵母培养物暴露于一系列的2，3，4，5，6，7，8，9或10种不同EM场中。可以通过本领域已知方式施加的EM场的各自频率可以为6815，6816，6817，6818，6819，6820，6821，6822，6823，6824，6825，6826，6827，6828，6829，6830，6831，6832，6833，6834或6835MHz。
EM场强范围是25-330mV/cm。在一个优选实施方案中，系列中开始的EM场比后来的EM场的场强低，由此酵母细胞培养物暴露于场强逐渐提高的EM场中。因此，可以将酵母细胞在较低场强(例如170-260mV/cm)培养24-68小时，然后在较高EM场强(例如260-330mV/cm)再培养24-68小时。当从一个EM场至另一个EM场转换时，所述酵母细胞培养物可以保持在相同容器中，使用同一套电磁波发生器和发射器。
所述培养程序可以通过用细胞密度为大约105个细胞/ml的1ml选定的酵母菌株接种物接种100ml培养基起始。将起始培养基在35℃-37℃保持24-48小时，之后暴露于EM场中。所述培养程序优选在溶解氧浓度在0.025-0.08mol/m3的条件下进行，优选0.04mol/m3。氧的水平可以通过本领域已知的任何常规方法控制，包括但非限于搅拌和/或吹气。
所述培养最优选在液体培养基中进行，所述培养基中含有动物血清和酵母细胞可同化的营养素来源。表2提供了培养本发明第二种酵母细胞成分的培养基实例。
                           表2
 培养基成分  数量
 蔗糖或可溶淀粉  20.0g
 K2HPO4  0.25g
 MgSO4·7H2O  0.2g
 NaCl  0.22g
 CaCO3  0.5g
 Urea  2.0g
 蛋白胨  15g
 动物血清  2-5ml
 高压灭菌水  1000ml
通常地，碳水化合物如糖，例如蔗糖，葡萄糖，果糖，右旋糖，麦芽糖，木糖等及淀粉，可以单独或组合使用作为培养基中可同化碳源。培养基中利用的碳水化合物来源的精确数量部分依赖于培养基中的其它配料，但碳水化合物的数量通常在培养基重量的大约0.1％-5％之间变化，优选大约0.5％和2％，最优选大约0.8％。在培养基中这些碳源可以单独使用，或可以组合使用这样的一些碳源。可以掺入培养基中的无机盐是能产生钠，钙，磷酸根，硫酸根，碳酸根等离子的常规盐。营养性无机盐的非限制性实例是(NH4)2HPO4，CaCO3，MgSO4，NaCl，和CaSO4。
动物血清是包含白细胞的一种血液组分，可以通过本领域已知的标准方法如密度梯度离心从全血(10-20ml)中制备。分离出红细胞并弃去。该血清可以用90-180ml双蒸馏水稀释，优选含有102-103个T细胞/ml。在将培养基高压灭菌并冷却至大约45℃之后，将血清加入培养基中。优选鸡血清。
应注意表2提供的培养基成分是非限制性的。可根据需要按比例增加或减少。本领域技术人员根据实际及经济利益如培养规模和培养基成分的当地供应可以对所述培养基进行各种修改。
尽管酵母细胞在EM场中培养仅几小时后就被激活，但所述酵母细胞可以在EM场中长期培养(例如一或多周)。在培养程序结束时，通过本领域已知的各种方法从培养物中回收组成本发明第二种酵母细胞成分的酵母细胞，并在大约0℃-4℃温度下贮存。回收的酵母细胞也可以干燥并以粉末形式贮存。
用Candida utilis Henneberg Lodder et Kreger Van Rij酵母株AS2.1180生产本发明第二种酵母细胞成分的一个非限制性实例见于下文第6节所述。
在另一个实施方案中，将第三种酵母细胞成分的酵母细胞在至少一个可变电磁(EM)场中培养，频率范围是8180MHz-8210MHz，优选8190-8210MHz。可以施加一个单一EM场或一系列EM场，每个电磁场具有在一定范围内的不同频率，或一定范围内的不同场强，或一定范围内的不同频率和场强。尽管可以使用任何实用数量的EM场，但优选将酵母培养物暴露于一系列的2，3，4，5，6，7，8，9或10种不同EM场中。可以通过本领域已知方式施加的EM场的各自频率可以为8190，8191，8192，8193，8194，8195，8196，8197，8198，8199，8200，8201，8202，8203，8204，8205，8206，8207，8208，8209或8210MHz。
EM场强度范围是28-350mV/cm。在一个优选实施方案中，系列中开始的EM场强比随后的EM场强低，由此所述酵母细胞暴露于强逐渐增加的EM场中。因此，酵母细胞可以在较低EM场强(例如160-260mV/cm)培养10-68小时，然后在较高EM场强(例如260-350mV/cm)再培养12-48小时。当从一个EM场转变为另一个EM场时，所述酵母细胞可以保留在相同容器内，使用同一套电磁波发生器和发射器。
所述培养程序可以通过用细胞密度为大约105个细胞/ml的1ml选定的酵母菌株接种物接种100ml培养基起始。将起始培养基在35℃-37℃保持24-48小时，之后暴露于EM场中。所述培养程序优选在溶解氧浓度在0.025-0.08mol/m3的条件下进行，优选0.04mol/m3。氧的水平可以通过本领域已知的任何常规方法控制，包括但非限于搅拌和/或吹气。
所述培养最优选在液体培养基中进行，所述培养基中含有动物血清和酵母细胞可同化的营养素来源。表3提供了培养本发明第三种酵母细胞成分的培养基实例。
                             表3
 培养基成分  数量
 蔗糖或可溶淀粉  20.0g
 MgSO4·7H2O  0.25g
 NaCl  0.2g
 Ca(H2PO4)  0.22g
 CaCO3  0.5g
 (NH4)2HPO4  3.0g
 K2HPO4  0.3g
 蛋白胨  15g
 动物血清  2-5ml
 高压灭菌水  1000ml
通常地，碳水化合物如糖，例如蔗糖，葡萄糖，果糖，右旋糖，麦芽糖，木糖等及淀粉，可以单独或组合使用作为培养基中可同化碳源。培养基中利用的碳水化合物来源的精确数量部分依赖于培养基中的其它配料，但碳水化合物的数量通常在培养基重量的大约0.1％-5％之间变化，优选大约0.5％和2％，最优选大约0.8％。在培养基中这些碳源可以单独使用，或可以组合使用这样的一些碳源。可以掺入培养基中的无机盐是能产生钠，钙，磷酸根，硫酸根，碳酸根等离子的常规盐。营养性无机盐的非限制性实例是(NH4)2HPO4，CaCO3，MgSO4，NaCl，和CaSO4。
动物血清是包含白细胞的一种血液组分，可以通过本领域已知的标准方法如密度梯度离心从全血(10-20ml)中制备。分离出红细胞并弃去。该血清可以用90-180ml双蒸馏水稀释。在将培养基高压灭菌并冷却至大约45℃之后，将血清加入培养基中。优选鸡血清。
应注意表3提供的培养基成分是非限制性的。可根据需要按比例增加或减少。本领域技术人员根据实际及经济利益如培养规模和培养基成分的当地供应可以对所述培养基进行各种修改。
尽管酵母细胞在EM场中培养仅几小时后就被激活，但所述酵母细胞可以在EM场中长期培养(例如一或多周)。在培养程序结束时，通过本领域已知的各种方法从培养物中回收组成本发明第三种酵母细胞成分的酵母细胞，并在大约0℃-4℃温度下贮存。回收的酵母细胞也可以干燥并以粉末形式贮存。
用Saccharomyces cerevisiae酵母菌株AS2.16生产本发明第三种酵母细胞成分的一个非限制性实例见于下文第6节所述。
在另一个实施方案中，将第四种酵母细胞成分的酵母细胞在至少一个可变电磁(EM)场中培养，频率范围是8400MHz-8430MHz，优选8400-8420MHz。可以施加一个单一EM场或一系列EM场，每个电磁场具有在一定范围内的不同频率，或一定范围内的不同场强，或一定范围内的不同频率和场强。尽管可以使用系列内任何实用数量的EM场，但优选将酵母培养物暴露于一系列的2，3，4，5，6，7，8，9或10种不同EM场中。可以通过本领域已知方式施加的EM场的各自频率可以为8400，8401，8402，8403，8404，8405，8406，8407，8408，8409，8410，8411，8412，8413，8414，8415，8416，8417，8418，8419或8420MHz。
EM场强度范围是30-380mV/cm。在一个优选实施方案中，系列中开始的EM场强比随后的EM场强低，由此所述酵母细胞暴露于强逐渐增加的EM场中。因此，酵母细胞可以在较低EM场强(例如160-300mV/cm)培养10-72小时，然后在较高EM场强(例如300-380mV/cm)再培养10-36小时。当从一个EM场转变为另一个EM场时，所述酵母细胞可以保留在相同容器内，使用同一套电磁波发生器和发射器。
所述培养程序可以通过用细胞密度为大约105个细胞/ml的1ml选定的酵母菌株接种物接种100ml培养基起始。将起始培养基在35℃-37℃保持24-48小时，之后暴露于EM场中。所述培养程序优选在溶解氧浓度在0.025-0.08mol/m3的条件下进行，优选0.04mol/m3。氧的水平可以通过本领域已知的任何常规方法控制，包括但非限于搅拌和/或吹气。
所述培养最优选在液体培养基中进行，所述培养基中含有动物血清和酵母细胞可同化的营养素来源。表4提供了培养本发明第四种酵母细胞成分的培养基实例。
                           表4
培养基成分  数量
淀粉  20.0g
(NH4)2HPO4  0.25g
K2HPO4  0.2g
MgSO4·7H2O  0.22g
NaCl  0.5g
CaSO4·2H2O  0.3g
CaCO3  3.0g
蛋白胨  15g
动物血清  2-5ml
高压灭菌的水  1000ml
通常地，碳水化合物如糖，例如蔗糖，葡萄糖，果糖，右旋糖，麦芽糖，木糖等及淀粉，可以单独或组合使用作为培养基中可同化碳源。培养基中利用的碳水化合物来源的精确数量部分依赖于培养基中的其它配料，但碳水化合物的数量通常在培养基重量的大约0.1％-5％之间变化，优选大约0.5％和2％，最优选大约0.8％。在培养基中这些碳源可以单独使用，或可以组合使用这样的一些碳源。可以掺入培养基中的无机盐是能产生钠，钙，磷酸根，硫酸根，碳酸根等离子的常规盐。营养性无机盐的非限制性实例是(NH4)2HPO4，CaCO3，MgSO4，NaCl，和CaSO4。
动物血清是包含白细胞的一种血液组分，可以通过本领域已知的标准方法如密度梯度离心从全血(10-20ml)中制备。分离出红细胞并弃去。该血清可以用90-180ml双蒸馏水稀释。在将培养基高压灭菌并冷却至大约45℃之后，将血清加入培养基中。优选鸡血清。
应注意表4提供的培养基成分是非限制性的。可根据需要按比例增加或减少。本领域技术人员根据实际及经济利益如培养规模和培养基成分的当地供应可以对所述培养基进行各种修改。
尽管酵母细胞在EM场中培养仅几小时后就被激活，但所述酵母细胞可以在EM场中长期培养(例如一或多周)。在培养程序结束时，通过本领域已知的各种方法从培养物中回收组成本发明第三种酵母细胞成分的酵母细胞，并在大约0℃-4℃温度下贮存。回收的酵母细胞也可以干燥并以粉末形式贮存。
用Geotrichum candidum Link酵母菌株AS2.361生产本发明第四种酵母细胞成分的一个非限制性实例见于下文第6节所述。5.2.酵母细胞的驯化
在本发明另一方面，激活的酵母细胞的性能可以如下最佳化：在存在取自待喂食所述生物组合物的动物类型的胃肠道中的物质的情况下培养激活的酵母细胞。包含这个驯化过程使激活的酵母细胞适应并耐受动物胃中的酸性环境。
根据本发明，如5.1节所述制备的激活的酵母细胞可以在具有表5所示成分的培养基中进一步培养。
                    表5  (/1000ml培养基)
培养基成分 数量
鸡胃液 300ml；在4℃贮存
野枣汁 300ml
野山楂汁 320ml
(NH4)2HPO4 0.25g
K2HPO4 0.2g
MgSO4·7H2O 0.22g
NaCl 0.5g
CaSO4·2H2O 0.3g
CaCO3 3.0g
含有＞108个细胞/ml的第一种酵母细胞成分的酵母培养物；见表1 20ml
含有＞108个细胞/ml的第一种酵母细胞成分的酵母培养物；见表2 20ml
含有＞108个细胞/ml的第一种酵母细胞成分的酵母培养物；见表3 20ml
含有＞108个细胞/ml的第一种酵母细胞成分的酵母培养物；见表4 20ml
该过程可以根据需要按比例增加或减少。
鸡的胃液，可以通过将大约500-1000g新屠宰动物胃内容物与1000-2000ml水混合，并在无菌条件下过滤以获得澄清的液体而制备，其在使用前可在4℃贮存。
野枣汁是将每克碾碎的野枣与5ml水混合经过滤而制备。野山楂汁是将每克碾碎的野山楂与5ml水混合经过滤而制备。
将酵母细胞混合物在系列电磁场中培养大约48-96小时。根据所包括的酵母菌株，每个电磁场频率相应于5.1节所述4种频率范围之一。如果四种酵母成分均存在，可以使用以下4种频带组合：7750-7780MHz；6815-6850MHz；8180-8210MHz；8400-8420MHz。所述EM场可以相继或同时施加。在此程序中通常将所述酵母细胞置于85mV/cm-320mV/cm范围的EM场强中。
在酵母细胞培养物暴露于EM场时，所述培养物在大约5℃-38℃之间循环的温度下温育。例如在一个典型循环中，起始培养温度为大约37℃，逐渐降低至大约5℃，然后逐渐升高至大约38℃进行再次循环。每个完整循环持续大约3小时。在循环结束时，可以通过在大约3500rpm离心回收激活和驯化的酵母细胞，并贮存于4℃。5.3生物组合物的生产
本发明还提供了一种生产包含本发明酵母细胞的生物组合物的方法。优选地，本发明生物组合物包含通过5.1节所述方法激活并通过5.2节所述方法驯化的酵母细胞。最优选地，所述生物组合物包含所有4种酵母细胞成分。
为大量生产本发明的生物组合物，可以按比例扩大培养程序，用5.1节制备并优选如5.2节所述方法驯化的激活的酵母细胞起始。为举例示出按比例扩大程序，以下阐述了生产1000kg所述生物组合物的方法：
将4种酵母细胞成分的每一种贮存培养物均加入培养基中，所述培养基包含在250升水中的100kg淀粉。然后将激活的酵母细胞在各自频率和120-450mV/cm场强的电磁场中，在35°-38℃培养。将培养程序进行大约48-96小时，或者酵母细胞数目达到大约2×1010/ml。此时，激活的酵母细胞必须贮存在大约0-4℃，而且如果不立即使用，在24小时内干燥贮存。对4种酵母细胞的每一种重复该程序。为生产包含所有4种酵母细胞成分的生物组合物，将4种中每一种激活的酵母细胞成分的250升培养物培养基(即共1000升)混合并组合600kg淀粉。
由于激活的酵母细胞和生物组合物不是必需立即使用，因此制备的酵母细胞和生物组合物可以在两阶段干燥程序中干燥。在第一个干燥阶段，将酵母细胞在第一个干燥器中在不超过65℃，不超过10分钟的条件下干燥，以便酵母细胞迅速静止。然后将酵母细胞置入第二个干燥器中，并在不超过70℃，不超过30分钟的条件下干燥，以进一步除去水分。在这两个阶段后，水含量应低于5％。优选在这两个干燥阶段遵守温度和干燥时间，以便酵母细胞不丧失其活力和功能。然后将干燥的酵母细胞冷却至室温。干燥的酵母细胞还可以在离析器中筛选以选择优选大小的颗粒。干燥的细胞然后可以置于散装装袋机中包装。6. 实施例
以下实施例例证了可以用作动物饲养添加剂的一种生物组合物的生产。
所述生物组合物包括以下四种酵母成分：Geotrichum candidumLinkAS2.616，Candida utilis Henneberg Lodder et Kreger Van RijAS2.1180，Saccharomyces cerevisiae AS2.16，和Geotrichum candidumLink AS2.361。每种酵母细胞成分均能抑制Aspergillus fumigatus感染的发生及降低受感染的鸡的死亡率。制备4种酵母细胞成分，如下分别测试：
将含有大约105细胞/ml的AS2.616的一种起始培养物置于如图1所示的容器(2)中，其中含有表1所示成分的培养基。最初，在无电磁场的情况下将酵母细胞在36±1℃培养约24个小时。然后，在相同培养基中，在36±1℃，将酵母细胞在按指定顺序施加的一系列八个电磁场中培养：7752MHz，132mV/cm，10小时；7758MHz，132mV/cm，10小时；7763MHz，132mV/cm，22小时；7766MHz，132mV/cm，22小时；7752MHz，320mV/cm，10小时；7758MHz，320mV/cm，10小时；7763MHz，320mV/cm，10小时；及7766MHz，320mV/cm，10小时。如5.2节所述，将酵母细胞在下述两个电磁场系列中，通过在鸡胃液和山楂汁中进一步培养以驯化：7763MHz，320mV/cm，10小时；7766MHz，320mV/cm，10小时。在最后培养阶段之后，酵母细胞既可以在24小时内使用以生产所述生物组合物，也可以干燥贮存，如5.3节所述。
如下测试该第一种酵母细胞成分对禽类的有益作用：用1800只鸡进行测试(保持生蛋的中国鸡品种，北方品种No.6)，所有鸡均大约2周龄。体重在≤10％内。将动物分成四组，每组450只鸡，每组总重量在≤8％以内。将4组鸡的每组再进一步分为3个亚组，每个亚组150只鸡。在每组中一式三份进行实验。将每只鸡均皮下注射含有5×107个导致曲霉病的Aspergillus fumigatus的5ml溶液。第一组鸡(A组)喂食表6所示包含抗生素混合物的饮食。
                        表6：含抗生素的动物饲料成分
成分   每公吨数量 备注
基本饲料(未添加抗生素)   1000kg 购自中国Jingdai饲料厂
杆菌肽锌   100g 4,000,000单位
莫能菌素   100g
硫酸粘菌素   40g 400,000,000单位
黄霉素   40g 40,000,000单位
氯四环素   30g 30,000,000单位
土霉素   40g 40,000,000单位
潮霉素B   10g 10,000,000单位
越霉素A   10g 10,000,000单位
盐酸安普罗铵   30g
二硝托胺(Zoalene)   100g
B组鸡喂食包含激活的AS2.616酵母细胞的饲料。所述激活的酵母细胞存在于一种添加剂中，所述添加剂是将所述干燥的细胞与沸石粉(小于200目)以大约109个酵母细胞/g沸石粉的比率混合制备。每995kg基本饲料加入5kg所述饲料添加剂，产生含有0.5％重添加剂或5×1012个酵母细胞的改良饲料。第三组鸡(C组)喂食含有添加剂的饲料，所述添加剂与B组所用添加剂相同制备，除了AS2.616酵母细胞未被激活。D组鸡喂食既无抗生素又无酵母添加剂的基本饮食。5周后，各组鸡的健康状况示于下表7。
                        表7：用不同饮食喂养的鸡的健康状况
组  总数/组  患病动物总数 重病动物数 死亡动物数  康复的动物数  仍未康复的动物数
A  450  67(22+23+23) 56(17+19+20) 52  15  15
B  450  21(5+9+7) 3(1+2+0) 0  3  5
C  450  232(76+76+80) 223(73+75+75) 220  0  12
D  450  236(78+78+80) 231(71+83+77) 229  0  2
为制备第二种成分，将含有大约105细胞/ml的AS2.1180的一种起始培养物置于如图1所示的容器(2)中，其中含有表2所示成分的培养基。最初，在无电磁场的情况下将酵母细胞在36±1℃培养约22个小时。然后，在相同培养基中，在36±1℃，将酵母细胞在按指定顺序施加的一系列八个电磁场中培养：6825MHz，180mV/cm，24小时；6827MHz，180mV/cm，24小时；6832MHz，180mV/cm，10小时；6835MHz，180mV/cm，10小时；6825MHz，330mV/cm，24小时；6827MHz，330mV/cm，24小时；6832MHz，330mV/cm，10小时；及6835MHz，330mV/cm，10小时。如5.2节所述，将酵母细胞在下述两个电磁场中，通过在鸡胃液和山楂汁中进一步培养以驯化：6825MHz，330mV/cm，24小时；6827MHz，330mV/cm，24小时。在最后培养阶段之后，酵母细胞既可以在24小时内使用以生产所述生物组合物，也可以干燥贮存，如5.3节所述。
如下测试该第二种酵母细胞成分对禽类的有益作用：用1800只鸡进行测试(保持生蛋的中国鸡品种，北方品种No.6)，均大约2周龄。体重在≤10％内。将鸡分成四组，每组450只鸡，每组总重量在≤8％以内。将4组鸡的每组再进一步分为3个亚组，每个亚组150只鸡。在每组中一式三份进行实验。将每只鸡均皮下注射含有5×107个导致曲霉病的Aspergillus fumigatus的5ml溶液。第一组鸡(A组)喂食表8所示包含抗生素混合物的饮食。
                    表8：含有抗生素的动物饲料成分
成分     每公吨数量  备注
基本饲料(未添加抗生素)     1000kg  购自中国Jingdai饲料厂
杆菌肽锌     100g  4,000,000单位
莫能菌素     100g
粘菌素硫酸盐     40g  400,000,000单位
黄霉素     40g  40,000,000单位
氯四环素     30g  30,000,000单位
土霉素     40g  40,000,000单位
潮霉素B     10g  10,000,000单位
越霉素A     10g  10,000,000单位
盐酸安普罗铵     30g
二硝托胺(Zoalene)     100g
B组鸡喂食包含激活的AS2.1180酵母细胞的饲料。所述激活的酵母细胞存在于一种添加剂中，所述添加剂是将所述干燥的细胞与沸石粉(小于200目)以大约109个酵母细胞/g沸石粉的比率混合制备。每995kg基本饲料加入5kg所述饲料添加剂，产生含有0.5％重添加剂的改良饲料。第三组鸡(C组)喂食含有添加剂的饲料，所述添加剂与B组所用添加剂相同制备，除了AS2.1180酵母细胞未被激活。D组鸡喂食既无抗生素又无酵母添加剂的基本饮食。5周后，各组鸡的健康状况示于下表9。
             表9：用不同饮食喂养的鸡的健康状况
组  总数/组  患病动物总数 重病动物数 死亡动物数  康复动物数  仍未康复动物数
A  450  66(21+22+23) 62(16+24+22) 62  0  4
B  450  22(5+9+7) 5(2+2+1) 1  19  2
C  450  242(77+82+83) 233(70+78+85) 233  0  9
D  450  247(71+77+99) 244(70+76+98) 244  0  3
为制备第三种成分，将含有大约105细胞/ml的AS2.16的一种起始培养物置于如图1所示的容器(2)中，其中含有表3所示成分的培养基。最初，在无电磁场的情况下将酵母细胞在36±1℃培养约33个小时。然后，在相同培养基中，在36±1℃，将酵母细胞在按指定顺序施加的一系列八个电磁场中培养：8192MHz，169mV/cm，10小时；8200MHz，169mV/cm，10小时；8203MHz，169mV/cm，24小时；8207MHz，169mV/cm，24小时；8192MHz，289mV/cm，12小时；8200MHz，289mV/cm，12小时；8203MHz，289mV/cm，12小时；及8207MHz，289mV/cm，12小时。如5.2节所述，将酵母细胞在下述两个电磁场中，通过在鸡胃液和山楂汁中进一步培养以驯化：8203MHz，289mV/cm，12小时；8207MHz，289mV/cm，12小时。在最后培养阶段之后，酵母细胞既可以在24小时内使用以生产所述生物组合物，也可以干燥贮存，如5.3节所述。
如下测试该第三种酵母细胞成分对禽类的有益作用：用1800只鸡进行测试(保持生蛋的中国鸡品种，北方品种No.6)，均大约2周龄。体重在≤10％内。将鸡分成四组，每组450只鸡，每组总重量在≤8％以内。将4组鸡的每组再进一步分为3个亚组，每个亚组150只鸡。在每组中一式三份进行实验。将每只鸡均皮下注射含有5×107个导致曲霉病的Aspergillus fumigatus的5ml溶液。第一组鸡(A组)喂食表10所示包含抗生素混合物的饮食。
                  表10：含有抗生素的动物饲料成分
成分     每公吨数量  备注
基本饲料(未添加抗生素)     1000kg  工作中国Jingdai饲料厂
杆菌肽锌     100g  4,000,000单位
莫能菌素     100g
粘菌素硫酸盐     40g  400,000,000单位
黄霉素     40g  40,000,000单位
氯四环素     30g  30,000,000单位
土霉素     40g  40,000,000单位
潮霉素B     10g  10,000,000单位
越霉素A     10g  10,000,000单位
盐酸安普罗铵     30g
二硝托胺(Zoalene)     100g
B组鸡喂食包含激活的AS2.16酵母细胞的饲料。所述激活的酵母细胞存在于一种添加剂中，所述添加剂是将所述干燥的细胞与沸石粉(小于200目)以大约109个酵母细胞/g沸石粉的比率混合制备。每995kg基本饲料加入5kg所述饲料添加剂，产生含有0.5％重添加剂的改良饲料。第三组鸡(C组)喂食含有添加剂的饲料，所述添加剂与B组所用添加剂相同制备，除了AS2.16酵母细胞未被激活。D组鸡喂食既无抗生素又无酵母添加剂的基本饮食。5周后，各组鸡的健康状况示于下表11。
            表11：用不同饮食喂养的鸡的健康状况
 组  总数/组  患病动物总数 重病动物数 死亡动物数  康复动物数  仍未康复动物数
 A  450  77(21+24+32) 75(21+23+31) 75  0  2
 B  450  24(6+10+8) 7(2+3+2) 1  17  6
 C  450  255(78+81+90) 253(78+80+95) 253  0  2
 D  450  262(76+88+98) 259(75+88+96) 259  0  3
为制备第四种成分，将含有大约105细胞/ml的AS2.361的一种起始培养物置于如图1所示的容器(2)中，其中含有表4所示成分的培养基。最初，在无电磁场的情况下将酵母细胞在36±1℃培养约35个小时。然后，在相同培养基中，在36±1℃，将酵母细胞在按指定顺序施加的一系列八个电磁场中培养：8402MHz，165mV/cm，10小时；8408MHz，165mV/cm，10小时；8411MHz，165mV/cm，26小时；8420MHz，165mV/cm，26小时；8402MHz，336mV/cm，9小时；8408MHz，336mV/cm，9小时；8411MHz，336mV/cm，9小时；及8420MHz，336mV/cm，9小时。如5.2节所述，将酵母细胞在下述两个电磁场中，通过在鸡胃液和山楂汁中进一步培养驯化：8411MHz，336mV/cm，9小时；8420MHz，336mV/cm，9小时。在最后培养阶段之后，酵母细胞既可以在24小时内使用以生产所述生物组合物，也可以干燥贮存，如5.3节所述。
如下测试该第四种酵母细胞成分对禽类的有益作用：用1800只鸡进行测试(保持生蛋的中国鸡品种，北方品种No.6)，均大约2周龄。体重在≤10％内。将鸡分成四组，每组450只鸡，每组总重量在≤8％以内。将4组鸡的每组再进一步分为3个亚组，每个亚组150只鸡。在每组中一式三份进行实验。将每只鸡均皮下注射含有5×107个导致曲霉病的Aspergillus fumigatus的5ml溶液。第一组鸡(A组)喂食表12所示包含抗生素混合物的饮食。
                     表12：含有抗生素的动物饲料成分
成分     每公吨数量  备注
基本饲料(未添加抗生素)     1000kg  各自中国Jingdai饲料厂
杆菌肽锌     100g  4,000,000单位
莫能菌素     100g
粘菌素硫酸盐     40g  400,000,000单位
黄霉素     40g  40,000,000单位
氯四环素     30g  30,000,000单位
土霉素     40g  40,000,000单位
潮霉素B     10g  10,000,000单位
越霉素A     10g  10,000,000单位
盐酸安普罗铵     30g
二硝托胺(Zoalene)     100g
B组鸡喂食包含激活的AS2.361酵母细胞的饲料。所述激活的酵母细胞存在于一种添加剂中，所述添加剂是将所述干燥的细胞与沸石粉(小于200目)以大约109个酵母细胞/g沸石粉的比率混合制备。每995kg基本饲料加入5kg所述饲料添加剂，产生含有0.5％重添加剂的改良饲料。第三组鸡(C组)喂食含有添加剂的饲料，所述添加剂与B组所用添加剂相同制备，除了AS2.361酵母细胞未被激活。D组鸡喂食既无抗生素又无酵母添加剂的基本饮食。5周后，各组鸡的健康状况示于下表13。
   表13：用不同饮食喂养的鸡的健康状况
 组  总数/组  患病动物总数 重病动物数 死亡动物数  康复动物数  仍未康复动物数
 A  450  69(17+25+27) 63(16+22+25) 63  0  6
 B  450  33(11+9+13) 31(9+913) 29  3  1
 C  450  227(69+77+81) 212(69+75+68) 212  0  15
 D  450  276(98+79+99) 271(98+77+96) 271  0  5
包含所有4种酵母细胞成分的生物组合物通过将每种成分的干燥细胞与沸石粉(小于200目)以大约1×109个酵母细胞/g沸石粉的比率混合制备。每995kg基本饲料加入5kg酵母和沸石粉的混合物，产生含有0.5％重酵母和沸石粉的一种添加剂。用1800只鸡进行测试(保持生蛋的中国鸡品种，北方品种No.6)，均大约2周龄。体重在≤10％内。将鸡分成四组，每组450只鸡，每组总重量在≤8％以内。将4组鸡的每组再进一步分为3个亚组，每个亚组150只鸡。在每组中一式三份进行实验。将每只鸡均皮下注射含有5×107个导致曲霉病的Aspergillus fumigatus的5ml溶液。第一组鸡(A组)喂食表14所示包含抗生素混合物的饮食。
                   表14：含有抗生素的动物饲料成分
成分     每公吨数量  备注
基本饲料(未添加抗生素)     1000kg  购自中国Jingdai饲料厂
杆菌肽锌     100g  4,000,000单位
莫能菌素     100g
粘菌素硫酸盐     40g  400,000,000单位
黄霉素     40g  40,000,000单位
氯四环素     30g  30,000,000单位
土霉素     40g  40,000,000单位
潮霉素B     10g  10,000,000单位
越霉素A     10g  10,000,000单位
盐酸安普罗铵     30g
二硝托胺(Zoalene)     100g
B组鸡喂食包含如上述制备的生物饲料添加剂的饲料。第三组鸡(C组)喂食含有添加剂的饲料，所述添加剂与B组所用添加剂相同制备，除了所述酵母细胞未被激活。D组鸡喂食既无抗生素又无生物饲料添加剂的基本饮食。5周后，各组鸡的健康状况示于下表15。
  表15：用不同饮食喂养的鸡的健康状况
 组  总数/组  患病动物总数 重病动物数 死亡动物数  康复动物数  仍未康复动物数
 A  450  77(23+27+27) 73(23+26+24) 73  0  4
 B  450  2(1+1+0) 0 0  2  0
 C  450  231(71+79+81) 229(71+78+80) 229  0  2
 D  450  247(96+81+70) 242(96+79+67) 242  0  5
以上结果表明本发明生物组合物是一种有价值的动物饲料添加剂，其可以用于保持动物健康，及帮助动物从感染中康复。
本发明不限于具体的实施方案的范围，所述实施方案只是举例示出了本发明的各个方面，其功能等价方法和成分包含在本发明范围内。本领域技术人员通过前述教导和所附权利要求书，可以对本发明加以各种修改。这种修改应在所附权利要求范围内。

Claims (24)

1.一种生物组合物，其包含至少一种如下酵母细胞成分：
(a)含有大量酵母细胞的第一种酵母细胞成分，其通过将所述酵母细胞在一个或一系列电磁场中培养而制备，电磁场频率为7750-7770MHz，场强为22-320mV/cm；
(b)含有大量酵母细胞的第二种酵母细胞成分，其通过将所述酵母细胞在一个或一系列电磁场中培养而制备，电磁场频率为6815-6835MHz，场强为25-330mV/cm；
(c)含有大量酵母细胞的第三种酵母细胞成分，其通过将所述酵母细胞在一个或一系列电磁场中培养而制备，电磁场频率为8190-8210MHz，场强为28-350mV/cm；
(d)含有大量酵母细胞的第四种酵母细胞成分，其通过将所述酵母细胞在一个或一系列电磁场中培养而制备，电磁场频率为8400-8420MHz，场强为30-380mV/cm。
2.权利要求1的生物组合物，其包含(a)，(b)，(c)和(d)的酵母细胞成分。
3.权利要求1或2的生物组合物，其中酵母细胞是Saccharomyces，Candida，和Geotrichum细胞。
4.权利要求1或2的生物组合物，其中所述酵母细胞是Saccharomyces cerevisiae，Candida utilis，Geotrichum candidum细胞。
5.权利要求1或2的生物组合物，其中所述酵母细胞是干燥的。
6.一种动物饲料组合物，其包含权利要求1或2的生物组合物和鸡饲料。
7.权利要求6的动物饲料组合物，其中所述生物组合物还包含沸石粉，比率为大约109酵母细胞/1g沸石粉。
8.权利要求7的动物饲料组合物，其中占0.5％重的是权利要求1或2的生物组合物。
9.一种制备生物组合物的方法，所述方法包括在频率为7750-7770MHz，场强为22-320mV/cm的一个电磁场或一系列电磁场中培养大量酵母细胞。
10.权利要求9的方法，其中所述方法还包括在一或多个电磁场中，在包含鸡胃液、野山楂汁和野枣汁的培养基中培养所述大量酵母细胞。
11.一种制备生物组合物的方法，所述方法包括在频率为6815-6835MHz，场强为25-330mV/cm的一个或一系列电磁场中培养所述大量酵母细胞。
12.权利要求11的方法，其中所述方法还包括在一或多个电磁场中，在含有鸡胃液、野山楂汁和野枣汁的培养基中培养所述大量酵母细胞。
13.一种制备生物组合物的方法，所述方法包括在频率为8190-8210MHz，场强为28-350mV/cm的一个或一系列电磁场中培养所述大量酵母细胞。
14.权利要求13的方法，其中所述方法还包括在一或多个电磁场中，在含有鸡胃液、野山楂汁和野枣汁的培养基中培养所述大量酵母细胞。
15.一种制备生物组合物的方法，所述方法包括在频率为8400-8420MHz，场强为30-380mV/cm的一个或一系列电磁场中培养所述大量酵母细胞。
16.权利要求15的方法，其中所述方法还包括在一或多个电磁场中，在含有鸡胃液、野山楂汁和野枣汁的培养基中培养所述大量酵母细胞。
17.一种生产动物饲料组合物的方法，所述方法包括：
(a)制备权利要求1的一或多种酵母细胞成分，
(b)将(a)酵母细胞成分干燥，及
(c)将所述干燥的酵母细胞与沸石粉和鸡饲料混合。
18.权利要求17的方法，其中所述干燥步骤包括(i)在不超过65℃温度下干燥一段时间，由此所述酵母细胞休眠；及(ii)在不超过70℃温度下干燥一段时间，以使水分降低至5％以下。
19.一种降低鸡传染病发生率的方法，包括在一段时间内为鸡喂食一种动物饲料组合物，所述动物饲料组合物包含至少一种以下酵母细胞成分：
(a)含有大量酵母细胞的第一种酵母细胞成分，其通过将所述酵母细胞在一个或一系列电磁场中培养而制备，电磁场频率为7750-7770MHz，场强为22-320mV/cm；
(b)含有大量酵母细胞的第二种酵母细胞成分，其通过将所述酵母细胞在一个或一系列电磁场中培养而制备，电磁场频率为6815-6835MHz，场强为25-330mV/cm；
(c)含有大量酵母细胞的第三种酵母细胞成分，其通过将所述酵母细胞在一个或一系列电磁场中培养而制备，电磁场频率为8190-8210MHz，场强为28-350mV/cm；
(d)含有大量酵母细胞的第四种酵母细胞成分，其通过将所述酵母细胞在一个或一系列电磁场中培养而制备，电磁场频率为8400-8420MHz，场强为30-380mV/cm。
20.权利要求19的方法，其中所述动物饲料组合物包含(a)，(b)，(c)和(d)酵母细胞成分，和沸石粉。
21.权利要求19的方法，其中所述酵母细胞是Saccharomycescerevisiae，Candida utilis，和Geotrichum candidum细胞。
22.权利要求19的方法，其中所述酵母细胞成分和沸石粉占所述动物饲料组合物重量的5％。
23.权利要求1或2的组合物，其中用于制备第一种酵母细胞成分的大量酵母细胞包括Geotrichum candidum Link AS2.616细胞，其中用于制备第二种酵母细胞成分的大量酵母细胞包括Candida utilisHenneberg Lodder et Kreger Van Rij AS2.1180细胞，其中用于制备第三种酵母细胞成分的大量酵母细胞包括Saccharomyces cerevisiaeAS2.16，及其中用于制备第四种酵母细胞成分的大量酵母细胞包括Geotrichum candidum Link AS2.361细胞。
24.权利要求6的动物饲料组合物，其中用于制备第一种酵母细胞成分的大量酵母细胞包括Geotrichum candidum Link AS2.616细胞，其中用于制备第二种酵母细胞成分的大量酵母细胞包括Candida utilisHenneberg Lodder et Kreger Van Rij AS2.1180细胞，其中用于制备第三种酵母细胞成分的大量酵母细胞包括Saccharomyces cerevisiae AS2.16细胞及其中用于制备第四种酵母细胞成分的大量酵母细胞包括Geotrichum candidum Link AS2.361细胞。
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