BR112013020855A2 - composição de aditivo de ração - Google Patents

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Abstract

COMPOSIÇÃO DE ADITIVO DE RAÇÃO, MICROORGANISMO DE ALIMENTAÇÃO DIRETA EM COMBINAÇÃO COM UMA PROTEASE E UMA FITASE, KIT, MÉTODO PARA PREPARAR A REFERIDA COMPOSIÇÃO, RAÇÃO, MÉTODO PARA PREPARAR UMA RAÇÃO, E PRÉ-MISTURA". A presente invenção refere-se a uma composição de aditivo de ração que compreende um micro-organismo de alimentação direta em combinação com uma protease e uma fitase, e um método para melhorar o desempenho de um indivíduo ou para melhorar a digestibilidade de uma matéria-prima em uma ração (por exemplo, digestibilidade de nutrientes, como digestibilidade de aminoácidos), ou para melhorar a retenção de nitrogênio, ou para melhorar a resistência do indivíduo à enterite necrótica ou para melhorar a razão de conversão de ração (FCR) ou para melhorar o ganho de peso em um indivíduo ou para melhorar a eficiência alimentar em um indivíduo ou para modular (por exemplo, melhorar) a resposta imune do indivíduo ou para promover o crescimento de bactérias benéficas no trato gastrointestinal de um indivíduo, sendo que o método compreende administrar a um indivíduo um micro-organismo de alimentação direta em combinação com uma protease e uma fitase.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSI- ÇÃO DE ADITIVO DE RAÇÃO, MICRO-ORGANISMO DE ALIMENTAÇÃO DIRETA EM COMBINAÇÃO COM UMA PROTEASE E UMA FITASE, KIT, MÉTODO PARA PREPARAR A REFERIDA COMPOSIÇÃO, RAÇÃO, 5 MÉTODO PARA PREPARAR UMA RAÇÃO, E PRÉ-MISTURA".
CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a métodos para melhorar com- posições de ração usando um micro-organismo de alimentação direta em combinação com uma combinação específica de enzimas, e a uma compo- sição de aditivo de ração que compreende um micro-organismo de alimenta- ção direta em combinação com uma combinação específica de enzimas. A presente invenção refere-se, adicionalmente, a usos e kits.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Enzimas suplementares são usadas como aditivos para ração animal, particularmente, rações para aves domésticas e suínos, como um meio de aprimorar as características de utilização de nutrientes e de desem- penho da produção. Misturas de enzimas estão disponíveis para aprimorar o valor nutricional de dietas contendo farelo de soja, farelos de proteína animal ou subprodutos alimentares com alto teor de fibras. O conceito de micro-organismos de alimentação direta (DFM) envolve a alimentação de micróbios benéficos a animais, como gado leiteiro, quando eles estão sob períodos de estresse (doença, alterações na ração, desafios ambientais ou de produção). Probióticos é um outro termo para esta categoria de aditivos de ração. Foi mostrado que os probióticos ou DFM aprimoram o desempenho do animal em estudos controlados. Os DFM in- cluem produtos à base de bactérias ou leveduras de alimentação direta. Embora combinações de DFMs com algumas enzimas tenham sido contempladas, a interação entre DFMs e enzimas nunca foi completa- mente compreendida. A presente invenção se refere a combinações especí- ficas inovadoras que surpreendentemente melhoram significativamente as características de desempenho de produção em animais.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO Segue-se folha 1a/78
1a/78 Um achado seminal da presente invenção é que um DFM em combinação com uma protease e uma fitase tem efeitos benéficos significa- tivos sobre o desempenho de um animal.
Segue-se folha 2/78
;— t' .
2/78 %m è Em particular, um achado seminal da presente invenção é que um DFM em combinação com uma protease e uma fitase tem efeitos benéfi- . cos significativos sobre o desempenho de um animal, incluindo a melhoria e de um ou mais dos seguintes: razão de conversão alimentar (FCR), capaci- " 5 dade de digerir uma matéria-prima (por exemplo, digestibilidade de nutrien- tes, como digestibilidade de aminoácidos), retenção de nitrogênio, Índice de sobrevivência, rendimento da carcaça, taxa de crescimento, ganho de peso, eficiência alimentar, resistência dos animais à enterite necrótica, a resposta irnune do indivíduo, o crescimento de bactérias benéficas no trato gastroin- lO testinal de um indivíduo. Um outro efeito surpreendente da presente invenção é que ela A: . "m " X pode reduzir a excreção de nutrientes no conteúdo de esterco (por exemplo, r " y 3 a~ reduzir o nitrogênio e o-fõsforo) do esterco de um individuo. .. W ~ ~ F % g. t Ern um aspecto, a presente invenção fornece uma composição 15 de aditivo de ração que compreende (ou consiste essencialmente em ou consiste em) um micro-organismo de alimentação direta em combinação com uma protease e uma fitase. Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método pa- ra melhorar o desempenho de um indivíduo ou para'melhorar a digestibilida- 20 de de uma matéria-prima em uma ração (por exemplo, digestibilidade de nu- trientes, como digestibilidade de aminoácidos), ou para melhorar a retenção de nitrogênio, ou para evitar os efeitos negativos da enterite necrótica ou pa- ra melhorar a razão de conversão alimentar (FCR) ou para melhorar o ganho de peso em um indivíduo ou para melhorar a eficiência alimentar em um in- . 25 divíduo duo,. ouou para para modular o promover (por exemplo, melhorar) crescimento a resposta de bactérias imune benéficas do indiví- no trato gas- trointestinal de um indivíduo, ou para reduzir populações de bactérias pato- gênicas no trato gastrointestinal de um indivíduo, ou para reduzir a excreção de nutrientes no esterco, sendo que o método compreende administrar a um 30 individuo um micro-organismo de alimentação direta em combinação com uma protease e uma fitase. Um aspecto adicional da presente invenção é o uso de um mi-
F- -
S @* 3/78 0 « 5p =- cro-organismo de alimentação direta em combinação com uina protease e uma fitase para melhorar o desempenho de um individuo ou para melhorar a ' digestibilidade de uma matéria-prima em uma ração (por exemplo, digestibi- b . lidade de nutrientes, como digestibilidade de aminoácidos), ou para melhorar " 5 a retenção de nitrogênio, ou para evitar os efeitos negativos da enterite ne- crótica ou para melhorar a razão de conversão alimentar (FCR) ou para me- lhorar o ganho de peso em um individuo ou para melhorar a eficiência ali- ' mentar em um indivíduo ou para modular (por exemplo, melhorar) a resposta imune do indivíduo, ou para promover o crescimento de bactérias benéficas 10 no trato gastrointestinal de um individuo, ou para reduzir populações de bac- térias patogênicas no trato gastrointestinal de um indivíduo, ou para reduzir a ;í excreção de nutrientes no estèrco. t W . k.AC ' Em um óutro aspecto da presente invenção, é fornecido um kit %- "" e que compreende um micro-organismo de alimentação direta, uma protease, Q4 ~ " 15 uma fitase (e, opcionalmente, pelo menos uma vitamina e/ou opcionalmente, pelo menos um mineral) e instruções para administração. Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método pa- ra preparar uma composição de, aditivo de ração, que compreende misturar um micro-organismo" de alimentação direta com uma protease e uma fitase e 20 (opcionalmente) embalar. Em ainda um aspecto adicional, a presente invenção fornece uma ração ou alimento para animais que compreende (ou consiste essenci- almente em ou consiste em) um micro-organismo de alimentação direta em combinação com uma protease e uma fitase- 25 Uma pré-mistura compreende uma composição de aditivo de ração que compreende (ou consiste essencialmente em ou consiste em) um micro-organismo de alimentação direta em combinação com uma protease e uma fitase, e pelo menos um mineral e/ou pelo menos uma vitamina. Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um método 30 para preparar um alimento para animais que compreende misturar um com- ponente de ração com uma composição de aditivo de ração que compreen- de (ou consiste essencialmente em ou consiste em) um micro-organismo de
\- _ 'y' " e * 4/78 ? .
P ê a'limentação direta em combinação com uma protease e uma fitase. Em um outro aspecto, a presente invençào se refere a uma 0 ". composição de aditivo de ração para a prevenção e/ou tratamento de cocci- . diose e/ou enterite necrótica em um individuo. ' 5 . A presente invenção ainda fornece um método para prevenir e/ou tratar enterite necrótica e/ou coccidiose sendo que uma quantidade efi- caz de uma composição de aditivo de ração de acordo com a presente in- venção é administrada a um indivlduo.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS 10 A Figura 1 mostra que uma combinação de DFM (Enviva Pro® disponivel junto à Danisco NS) com uma combinação de uma protease (por a
W T exernplo, protease de Baci//us subti//s) e uma fitase (por exemplo, 500 + 3 m "j FTU/kg de Phyzyme XP (uma fitase de E. CO//) disponível junto à Danisco
W " NS) aprimorou significativamente (reduziu) os escores da lesão de enterite 15 necrótica no trato gastrointestinal dos animais em comparação ao controle estimulado. A Figura 2 mostra a porcentagem de mortalidade relacionada às lesões de enterite necrótica (NE) de 20 a 42 dias de idade. Uma combi- nação de DFM (Enviva Pro® disponível junto à Danisco NS) com uma com- 20 binação de uma protease (por exemplo, protease de Baci//us subti//s) e uma fitase (por exemplo, 500 FTU/kg de Phyzyme XP (uma fitase de E. coh) dis- ponível junto à Danisco NS) rnelhorou significativamente (reduziu) a mortali- dade por NE. A Figura 3 mostra o ganho de peso corporal de frangos de cor- 25 te de 0 a 23 dias em um modelo de estímulo de enterite necrótica. .Uma combinação de (Enviva Pro® disponível junto à Danisco A/S) com uma com- binação de uma protease (por exemplo, protease de Baci//Ús subti/is) e uma fitase (por exemplo, 500 FTU/kg de Phyzyme XP (urna fitase de E. coh) dis- ponível junto à Danisco NS) aprimorou significativamente o ganho de peso 30 corporal (ganho de PC) em frangos de corte estimulados com C/ostrid/um perfringens em comparação com o controle estimulado- A Figura 4 mostra o ganho de peso corporal de frangos de cor-
~ 0 . ¥
W »
W 5/78 6 u : te de 0 a 12 dias em um modelo de estímulo de enterite necrótica. Desvio padrão da média agrupado (SEM) = 4,86. ' N A Figura 5 mostra a razão de conversão alimentar de frangos
W de corte em um modelo de estímulo de enterite necrótica. Desvio padrão da ' 5 média agrupado = 0,026. A Figura 6 mostra a razão de conversào alimentar 0 a 23 d de frangos de corte em um modelo de estímulo de enterite necrótica. Desvio padrão da média agrupado = 0,022. A Figura 7 mostra um mapa de calor dos perfis de expressão 10 dos genes de interesse para todos os tratamentos para o jejuno aos 23 dias de idade. k Controle não estimuiado = controle não estimulado + fitase 4 é %. CC = Controle estimulado + fitase b' · CC+ Protease = Controle estimulado + fitase + protease " 15 CC+ EP = Controle estimulado + fitase + Enviva Pro CC+ EP + Protease = controle estimulado + fitase + protease + Enviva Pro. A Figura 8 mostra um mapa de calor do perfil de expressão de alfa amilase de galinha para todos os tratamentos no pâncreas em 23 dias de idade. 20 Controle não estimulado = controle não estimulado + fitase CC = Controle estimulado + fitase CC+ Protease = Controle estimulado + fitase + protease CC+ EP = Controle estimulado + fitase + Enviva Pro CC+ EP + Protease = controle estimulado + fitase + protease + Enviva Pro.
25 DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO De preferência, a(s) enzima(s) usada(s) na presente invenção é/são exógena(s) ao DFM. Em outras palavras, a(s) enzima(s) é/são, de pre- ferência, adicionada(s) ou misturada(s) com o DFM. Exceto onde definido em contrário, todos os termos técnicos e 30 científicos usados na presente invenção têm o mesmo significado conforme compreendido pelo versado na técnica à qual esta descrição pertence. Sin- gleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BlO-
t LOGY, 20 ED., John Wiley e Sons, New York, EUA (1994), e Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTÍONARY OF BIOLOGY, Harper Pe- b rennial, NY, EUA (1991) fornecem a um versado na técnica um dicionário "» geral de muitos termos usados na descrição- ' 5 Esta descrição não se limita aos métodos e materiais exemplifi- cadores aqui apresentados, e quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes aos aqui descritos podem ser usados na prática ou teste das modalidades desta descrição. Os intervalos numéricos incluem os números que definem o intervalo. Exceto onde indicado em contrário, quaisquer se- lO quências de ácidos nucleicos são escritas da esquerda para a direita na ori- entação 5' para 3': as sequências de aminoácidos são escritas da esquerda > para a direita na orientação amino para carbóxi, respectivamente. + » " % Os títulos aqui fornecidos não são limitações dos vários aspec-
W " tos ou modalidades desta descrição, que podem ser admitidos por referência à 15 ao relatório descritivo como um todo. Consequentemente, os termos defini- dos imediatamente abaixo são mais completamente definidos por referência ao relatório descritivo como um todo. Os aminoácidos são designados aqui usando o nome do ami- noácido, a abreviação de três letras ou a abreviação de uma letra.
20 O termo "proteína", para uso na presente invenção, inclui prote- Ínas, polipeptídeos, e peptideos. Para' uso na presente invenção, o termo "sequência de amino- ácidos" é sinônimo de "polipeptídeo" e/ou do termo "proteina". Em alguns casos, o termo "sequência de aminoácidos" é sinônimo do termo "peptídeo"; 25 em alguns casos, o termo "sequência de arninoácidos" é sinônimo do termo "enzima". Os termos "proteína" e "polipeptideo" são usados de forma in- tercambiável na presente invenção. Na presente descrição e nas reivindica- ções, os códigos convencionais de uma letra e três Ietras para os resíduos 30 de aminoácido podem ser usados. O código de 3 le'tras para os aminoáci- dos, como definido em conformidade corn a Cc'missâo Conjunta sobre No- menclatura Bioquimica (JCBN) da IUPACIUB. Tarnbém deve ser compreen-
* - s ' 7/78
N * ; |' - £- .dido que um polipeptídeo pode ser codificado por mais de uma sequência de nucleotídeos devido à degeneração do código genético. ' ' Outras definições de termos podem aparecer por toda o relató- © rio descritivo. Antes de as modalidades exemplificadoras serem descritas em ' 5 detalhes, deve-se compreender -que esta descrição não se limita às modali- dades particulares descritas, uma vez que isto pode, logicamente, variar. Também deve ser compreendido que a terminologia usada na presente in- venção tem o propósito apenas de descrever as modalidades particulares, e não se destina a ser limitante, já que o escopo da presente descrição. será 10 Iimitado apenas pelas reivindicações em anexo. Quando uma faixa de valores for fornecida, entende-se que ca- Èí' da valor interveniente, até o décimo da unidade do limite inferior a menos
W
J " @ que o contexto determine claramente de outro modo, entre os limites superi- f or e inferior daquela faixa também foi apresentado especificamente. Cada k 15 faixa menor entre qualquer valor declarado ou valor interveniente em uma faixa declarada e qualquer outro valor estabelecido ou interveniente em que a faixa estabelecida está abrangida dentro desta descrição. Os limites supe- rior e inferior destas faixas menores podem ser independentemente incluídos ou excluídos na faixa e cada faixa onde qualquer um, nenh,um,'ou ambos os \ 20 , limites estão incluídos nas faixas menores também está incluída nesta des- crição, sujeitos a qualquer limite excluído especificamente da faixa estabele- · cida. Quando a faixa estabelecida inciuir um ou ambos os limites, as faixas que excluem um ou ambos estes limites incluídos também estão incluídas nesta descrição. 25 Deve ser observado que, como usado aqui e nas reivindica- ções em anexo, as formas norsingu|ar "O," "a", "um", "uma" incluem referên- cias no plural a menos que o contexto claramente determine de outro modo. Desta forma, por exemplo, referência a "uma enzima" inclui uma pluralidade k destes agentes candidatos, e referência a "a ração" inclui referência a uma 30 ou mais rações e seus equivalentes conhecidos pelos versados na técnica, e assim em diante. As publicações discutidas aqui são fornecidas apenas para
= ., Z + e: ^ " ' 8/78 '" ·7 t "g descrição antes da data de depósito do presente pedido. Nada nelas deve ser considerado uma admissão de que tais publicações constituem técnica ^- + anterioràs reivindicações em anexo. - m - As enzimas para uso na presente invenção podem ser produzi- ' ' 5 das por cultura sólida ou submersa, inclusive em processos de batelada, de batelada alimentada e de fluxo continuo. A cultura é feita em um meio de crescimento que compreende um meio aquoso com sais minerais,, fatores de crescimento orgânicos, o material fonte de carbono e energia, oxigênio mo- lecular, e, logicamente, um inóculo inicial de uma ou mais espècies de micro- lO organismos específicas que serão empregadas. Micro-organismo de alimentação direta (DFM) È O termo "microbiano" da presente invenção é usado de forma » &' % . intercambiável com "micro-organismo". e De preferência, o DFM compreende um micro-organismo viá- . 15 vel. De preferência, o DFM compreende uma bactéria viável ou uma levedu- . ra viável ou fungos viáveis. De preferência, o DFM compreende uma bactéria viável. O termo "micro-organismo viável" significa um micro-organismo que é metabolicamente ativo ou capaz de se diferenciar. 20 Em urha modalidade, o DFM pode ser uma bactéria formadora de esporo e, portanto, o termo DFM pode ser compreendido de ou pode con- ter esporos, por exemplo, esporos bacterianos. Portanto, em uma modalida- de, o termo "micro-organismo viável" para uso na presente invenção pode incluir esporos microbianos, como endósporos ou conídios.
25 Em uma outra modalidade, o DFM na composição de aditivo de ração de acordo com a presente invenção não é compreendido de ou não contém esporos microbianos, por exemplo, endósporos ou conídios. O micro-organismo pode ser um micro-organismo de ocorrên- cia natural ou ele pode ser um micro-organismo transformado. O micro- 30 organismo pode, também, ser uma combinação de micro-organjsmos ade- quados. Em alguns aspectos, o DFM de acordo com a presente inven-
" F . ' m-l
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'" 9/78 q ¥
" iE ção pode ser um ou mais dos seguintes: uma bactéria, uma levedura, um fungo. "" De preferência, o DFM de acordo com a presente invenção é 4 u um micro-organismo probiótico. , [ 5 ' Na presente invenção, o termo micro-organismo de alimenta- ção direta (DFM) abrange bactérias de alimentação direta, leveduras de ali- " mentação direta, fungos de alimentação direta e combinações dos mesmos.
De preferência, o DFM é uma bactéria de alimentação direta.
De preferência, o DFM é uma combinação que compreende
10 duas ou mais bactérias, por exemplo, três ou mais ou quatro ou mais; ou o DFM é uma combinação que compreende duas ou mais cepas bacterianas, : por exemplo, três ou mais ou quatro ou mais
-~ 4 De preferência, a bactéria ou bactérias é ou são isolada(s)- " Adequadamente, o DFM pode compreender um bactéria de um * 15 ou mais dos seguintes gêneros: Lactobacil/us, Lactococcus, Streptococcus, Baci/lus, Pediococcus, Enterococcus, Leuconostoc, Carnobacterium, Propio- nibacterium, Bifidobacterium, Clostridium e Megasphaera e combinações dos mesmos.
Em uma modalidade, o DFM pode ser selecionado dentre os
20 seguintes Baci/lus spp: Baci/lus subtilis, Bacillus cereus, Baci/lus lichenifor- mis e Bacil/us amyloliquefaciens.
Em uma modalidade, o DFM pode ser uma combinação que compreende duas ou mais cepas de Bacillus.
Em uma modalidade, o DFM pode ser uma combinação de du-
25 as ou mais das cepas de Bacil/us sUbtilis 3A-P4 (PTA-6506); 15A-P4 (PTA- 6507); 22C-P1 (PTA-6508): 2084 (NRRL B-500130): LSSAOI (NRRL-B- 50104): BS27 (NRRL B-50105): BS 18 (NRRL B-50633); e BS 278 (NRRL B-
50634). As cepas 3A-P4 (PTA-6506), 15A-P4 (PTA-6507) e 22C-P1
30 (PTA-6508) estão disponíveis ao público junto à Americ'an Type Culture CoHection (ATCC). As cepas 2084 (NRRL B-500130): LSSAOI (NRRL-B-50104);
4&i- k, ' g' z, I' 10178 '? m: ' i' BS27 (NRRL B-50105) estão disponíveis ao público junto à'Agricultural Re- . search Service Culture "Collection (NRRL). A cepa de Bacil/us subtilis i l S 7 " LSSAOI é algumas vezes chamada de B. subtilis 8. U.
Estas cepas são ensinadas em US 7.754.469 B2. r " ' 5 Baci/lus subtilis BS 18 e Baci//us subti/is BS 278 foram deposi- tadas por Andy Madisen de W227 N752 Westmound Dr. VVaukesha, Wl 53186, EUA para Danisco USA lnc. de W227 N752 Westmound Dr. Wau- kesha, Wl 53186, EUA de acordo com o Budapest Treaty (Tratado de Buda- peste) no Agricultural Research Service Culture Collection (NRRL) em 1815 ! > 10 North University Street, Peoria, lllinois 61604, Estados Unidos da América, sob os números de depósito NRRL B-50633 e NRRL B-50634, respectiva- , ¥ e mente, em 9 de janeiro de 2012.
L r a' b
L m ~ - % " Andy Madisen de W227 N752 Westmound Dr. Waukesha, Wl ' " 53186, EUA e Danisco USA Inc. de W227 N752 Westmound Dr. Waukesha, g 15 \Nl 53186, EUA autorizam a Danisco NS de Langebrogade 1, PO Box 17, DK-1OO1, Copenhagen K, Dinamarca a' se referir a estes materiais biológicos depositados neste pedido de patente e deram consentimento não reservado l e irrevogável ao material depositado sendo disponibilizado para o público. h q Em algumas modalidades, o DFM pode ser uma combinação l 20 que compreende as cepas de Bacillus subtilis, conforme detalhado na tabela L
P abaixo: I ' '!K ' " """ "' "" ¶-'-3= "" '" 1 ' ' ' ^ ^ " " ' 1 ' rÁ|??" '" r " ·') , -. "-- ,i |d4'í"b:j:sZ)b:"zj,4-!à*µ)L"R::")Wt,)}:)t':,2:7$j,(g2:'i,'à ui
T |dfm , " |X """ x I x J"' '""" :"". x x x x x x x x" x 0 b ( r p( combinação X X X jcomp eende X X X x x x í
X X X X X X
'a i 11/78 " a Em uma modalidade, o DFM pode ser selecionado a partir dos seguintes Lactococcus spp: Lactococcus cremoris e Lactococcus lactis e 3 " combinações dos mesmos. '& Em uma modalidade, o DFM pode ser selecionado dos seguin- ' 5 tes Lactobaci//us spp: Lactobaci//us buchneri, Lactobaci//us acidophi/us, Lac- tobaci//us casei, Lactobacil/us kefiri, Lactobaci//us bi/idus, Lactobaci//us bre- vis, Lactobaci//us he/veticus, Lactobaci//us paracasei, Lactobaci//us rhamno- sus, Lactobaci//us sa/ivarius, Lactobaci//us curvatus, Lactobaci//us bu/garicus, í Lactobaci//us sakei, Lactobaci//us reuteri, Lactobacil/us fermentum, Lactoba- lO cil/us farciminis, Lactobaci//us lactis, Lactobaci//us de/breuckii, Lactobacil/us p/antarum, Lactobaci//us parap/antarum, Lactobaci//us farciminis, Lactobaci- k " Rl //us rhamnosus, Lactobaci//us crispatus, Lactobaci//us gasseri, Lactobaci/lus » " , m.
W johnsonii e Lactobacil/us jensenii, e combinações de qualquer um dos mes- " mos. » " 15 Em uma modalidade, o DFM pode ser selecionado dos seguin- tes Bi/idobacteria spp: Bi/ídobacterium lactis, Bifidobacterium biifídium, Bih'- dobacterium Iongum, Bifidobacterium anima/is, Bifidobacterium breve, Bifi- dobacterium infantis, Bifidobacteriun7 catenulatum, Bih'dobacterium pseudo- catenu/atum, Bifidobacterium ado/escentis, e Bifidobacterium angu/atum, e 20 combinações de qualquer um dos mesmos. Adequadamente, o DFM pode compreender um bactéria de uma ou mais das seguintes espécies: Baci//us subti/is, Baci//us licheniformis, Baci//us amy/o//quefaciens, Enterococcus faecium, Enterococcus spp, e Pe- diococcus spp, Lactobaci/lus spp, Bifidobacterium spp, Lactobaci//us aci- 25 dophi/us, Pediococsus acidi/actici, Lactococcus lactis, Bihdobacterium bif/L - dum, Bacil/us subtilis, Propionibactehum thoenli, Lactobaci//us farciminis, " Lactobaci//us rhamnosus, Megasphaera elsdenii, C/ostridium butyricum, Bih dobacterium animalis ssp. animalis, Lactobacil/us reuteri, Bacil/us cereus, Lactobaci//us sa/ivarius ssp. Sa/ivarius, Propionibacteria sp e combinações 30 dos mesmos. A bactéria de alimentação direta usada na presente invenção pode ser do mesmo tipo (gênero, espécie e cepa) ou pode compreender
.q , e uma mistura de gêneros, espécies e/ou cepas Adequadamente, o DFM de acordo com a presente invenção a pode ser um ou mais dos produtos ou os micro-organismos contidos nestes
Q : produtos, conforme a tabela abaixo: ' jNome do pro)Empresa Micro-organismos ||ngredientes |dljto kimbióticos Enviva pro®.jDanisco ns :epa de Baci//us subtilis . 084 n° de acesso NRR (anteriomente conhecido coj 1-50013, mo Avicor©) :epa de Baci//us subti/is SSAOl . n° de acessc
IÊ ~ IRRL B-50104 e q- » ~ :epa de Baci/lus subti/is 'a. qu y 5A-P4 ATCC n° de cesso PTA-6507 alsporin® |Caipis - japão :epa de Baci//us subti/is |c3102 lostat® )Kemin |ndus¢Cepa de Bacil/us subti/i. ítries lnc. |PB6 ylactin® |DSM jEnterococcus faeciun |ncimb 10415 (sf68) ta||ipro® jchr. Hansenjcepa de Baci//us subti/i: pjs |c3102 |a||iproMax® |a||ipro®Tect® Chr. HansenjBaci//us licheniformis oultrY star® Biomin, lnc Enterococcus e ruto- liaossacarídeos rotexin® in lnt Lactobaci//us, Bifidob rium e um outro ra® Ipharma lnc. Cepa de Baci//us subti/igi Mos QST 713 |O|igossacarÍdeos )3-manana e p glucanos ^ cobiol® & jNorel s.a. |Baci//us amy/o/iquefacien . .
.cobiol® Plus i pect-5940 ortiflora® I jEnterococcus faeciut |sf68 ioPlus28® |DSM jBaci//us subti/is e Baci//u, jlicheniformis actiferm® jchr. Hansen j8actérias formadoras di £ jácido láctico 7 > 6 Enterococcus faecium úp
P fS|® jDanisco ns jcepa de Baci//us ea-Sacc® jAHtech jsaccharomyces cerevisi iomin IMB52® Biomin Fnterococcus faecium iomin C5® Biomin jpediococcus acidi/actici,| Enterococcus faecium,j Bifidobacterium anima/igi bsp. anima/is, Lactobaclj J/us reuteri Lactobacil/uj .
sa/ivarius ssp. sa//varius I Biacton® .hemVet Lactobaci//us farciminis Oralin E1707® hevita GmBH Enterococcus faecium Enterococcus faecium (2l Probios-pioneer hr Hansen PDFM® cepas) Lactococcus lactis DsMj 11037 orbiflore® Danisco Ani Lactobacil/us mamnosu mal Nutrition e Lactobaci//us farciminis nimavit® KRKA Baci//us subt//is çíb
W ital® ' " 0 -, 0 E : ,3 mbH cell llemand ccharomyces cerevisi- -evucell SC 0 &jLallemand jSaccharomyces CereV|S/q 3C1O® ME I |ae 3actocell jLallemand Peciiococcus acidi/acti lctiSaf® (ante¢Le Saffre jsaccharomyces cerevisi· iomente Bij |ae )Saf®) Ictisaf® SC47 jLe Saffre jsaccharomyces cerevisi· a· n )ae NCYC SC47 D'
K Aiya-Gold® |Miyarisan jc/ostridium butyricum
E F jpharrria 'ecinor e FecijNorel s.a )or PIus® I jEnterococcus faecium nteSwine® |ntegro Gida ve| kicaret AS re) resentado ela RM Asso4Saccharomyces cerevisi- iates Ltd |ae NCYC R-625 joSprint® 'roSol SpA jsaccharomyces cerevisia 'rovita® 'rovita jEnterococcus faecium € jLactobaci/lus rhamnosus tegal BV Pacillus subti/is e Asper' Yutraferma) jqi//us oiyzae 'oyocerin® Rubinum Vl "OYOCERIN® Rubinum acü/us cereus var. toyc CIMB 40112/CNCM I m Em uma modalidade, adequadamente, o DFM pode ser Enviva Pro®. Enviva Pro® está disponível comercialmente junto à Danisco NS e é m % * b 15/78 %
M e uma combinação da cepa de Bacil/us 2084, n° de acesso NRRI B-50013, da cepa de Baci//us LSSAOI, n° de acesso NRRL B-50104 e da cepa de Baci- # '4 " l/us 15A-P4 ATCC, n° de acesso PTA-6507 (conforme apresentado em US
7.754.469 B - aqui incorporado, a titulo de referência). ' 5 Adequadamente, o DFM pode compreender uma levedura do gênero: Saccharomyces spp. De preferência, o DFM que será usado de acordo com a pre- sente invenção é um micro-organismo que é geralmente reconhecido como seguro e que é, de preferência, aprovado pelo GRAS. 10 Um versado na técnica terá facilmente conhecimento de espé- cies e/ou cepas de micro-organismos dos gêneros aqui descritos que são a © usadas nos alimentos e/ou indústrias agrícolas e que são geralmente consi- b·.
' à derados adequados para o consumo animal. ~ ° De preferência, o DFM usados de acordo com a presente in- ." 15 venção é adequado para consumo animal. Vantajosamente, quando o produto é uma ração ou composi- ção de aditivo de ração, o DFM viável deve permanecer eficaz até a data de "validad'e" ou "vencimento" normal do produto durante o qual a ração ou composição de aditivo de ração é oferecida para venda pelo distribuidor. Os 20 periodos de tempo desejados e a vida útil normal variarão de ração para ra- ção e os elementos versados na técnica irão reconhecer que os tempos de vida útil irão variar dependendo do tipo de ração, do tamanho da ração, das temperaturas de armazenamento, condições de processamento, material pa- ra embalagem e equipamento de embalagem.
25 Em algumas modalidades, é importante que o DFM seja tole- rante ao calor, isto é, seja termotolerante. Este é particularmente o caso nó qual a ração é peletizada. Portanto, em uma modalidade, o DFM pode ser um micro-organismo termotolerante, como uma bactéria termotolerante, in- ciuindo, por exemplo Baci//us spp.
30 Em algumas modalidades, pode ser preferencial que o DFM seja uma bactérias formadora de poros, como Bacil/i, por exemplo, Baci//us spp. Os bacilos são capazes de formar endósporos estáveis quando as con-
F 7 ': " 16/78 b'
A
W '€ dições para o crescimento são desfavoráveis e são muito resistentes ao ca- lor, pH, umidade e desinfetantes. $ Em uma modalidade, adequadamente, o DFM pode reduzir ou evitar o estabelecimento intestinal de micro-organismos patogênicos (como "" ' 5 C/ostridium perfringens e/ou E. co/i e/ou Sa/mone//a spp e/ou Campy/obacter spp.). O DFM de acordo com a presente invenção pode ser qualquer DFM adequado. Em uma modalidade, o seguinte ensaio "ensaio DFM" pode ser usado para determinar a adequação de um micro-organismo para ser um 10 DFM. A título de esclarecimento, em uma modalidade, um DFM selecionado como a cepa inibitória (ou um DFM antipatógeno) de acordo com o "ensaio b DFM" ens"nado aqui é um DFM adequado para uso de acordo com a pre t P
D - á, sente invenção, isto é, na composição de aditivo de ração de acordo com a " presente invenção- p " 15 Ensaio DFM: Cada tubo foi semeado com um patógeno representativo de um agrupamento representativo. O sobrenadante de um DFM potencial cultivado aerobicamente ou anaerobicamente foi adicionado aos tubos semeados e incubado. 20 Após a incubação, a densidade óptica (OD) dos tubos de con- trole e com sobrenadante tratado foi medida para cada patógeno. Colônias de cepas (DFM em potencial) que produziram uma OD reduzida em comparação ao controle foram classificadas como uma ce- pa inibitória (ou um DFM antipatógeno). 25 O ensaio DFM, como usado aqui, é explicado em mais deta- lhes em US2009/0280090 - aqui incorporado, a título de referência. De preferência, o patógeno representativo usado no ensaio é um (ou mais) dos seguintes: Clostridium, como C/ostridium perfringens e/ou C/ostridium dihici/e, e/ou E. co/i e/ou Sa/mone//a spp e/ou Campy/obacter 30 spp. Em uma modalidade preferencial, o ensaio é conduzido com um ou mais de Clostridium perfringens e/ou C/ostridium dihici/e e/ou E. CO/i, de pre- ferência, C/ostridium perfringens e/ou C/ostridium dihici/e, com .mais prefe-
P t 17/78 q T' 2 rência, C/ostridium perfringens. Em uma modalidade, o DFM da presente invenção é, de prefe- .
Y rência, um antipatógeno. a O termo "antipatógeno", como usado aqui, significa que o DFM '" 5 se opõe a um efeito (por exemplo, um efeito negativo) de um patógeno. Em uma modalidade, para determinar se um DFM é um antipa- tógeno de acordo com a presente invenção, o ensaio de DFM mencionado acima pode ser usado. Um DFM é considerado um antipatógeno ou um DFM antipatógeno, se ele for classificado como uma cepa inibitória no ensaio de 10 DFM acima mencionado, particularmente, quando o patógeno é C/ostridium perfringens. a. " e- Em uma modalidade, o DFM antipatógeno pode ser uma ou * " E mais das seguintes bactérias: m ê - Cepa de Baci/lus subti/is 2084 n° de acesso NRRI B-50013, 15 Cepa de Baci//us subtills LSSAOI, n° de acesso NRRL B- 50104, Cepa de Bacü/us subti/is 15A-P4 n° de acesso ATCC PTA- 6507, Cepa de Baci//us subti/is 3A-P4, n° de acesso ATCC PTA-6506, 20 e Cepa de Baci//us subti/is BS27, n° de acesso ATCC NRRL B-
50105. A título de esclarecimento, estas cepas estão disponiveis e são refe- ridas no documento US 7.754.459 B. Em uma modalidade, o DFM usado de acordo com a presente 25 invenção não é a cepa de Lactobaci//us gasseri BNR 17, n° de acesso KCTC 10902BP, conforme apresentado em WO2008/016214. De preferência, o DFM não é um micro-organismo inativado. Em uma modalidade, o DFM, como usado aqui, é uma composi- ' ção que compreende um ou mais micro-organismos de DFM, conforme des- 30 crito aqui. A composição pode compreender, adicionalmente, as enzimas da presente invenção. A composição pode ser alimentada a um animal como um micro-organismo de alimentação direta (DFM). Um ou mais veículos ou outros
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N « ' 18/78
G ¥ " ingredientes podem ser adicionados ao DFM. O DFM pode. ser apresentado sob várias formas físicas, por exemplo, como uma cobertura, como um con- *
W centrado solúvel em água para uso como uma calda líquida ou para ser adici- . onado a um substituto de leite, cápsula de gelatina, ou géis. Em uma modali- ' 5 dade da forma de cobertura, produto de fermentação seco por congelamento é adicionado a um veículo, como soro de leite, maltodextrina, sacarose, dex- trose, calcário (carbonato de cálcio), cascas de arroz, cultura de levedura, amido seco, e/ou silico aluminato de sódio. Em uma modalidade do concen- trado solúvel em água para uma calda líquida ou suplemento substituto de lei- lO te, o produto de fermentação seco por congelamento é adicionado a um veí- culo solúvel em água, como soro de leite, maltodextrina, sacarose, dextrose, 4 ~
W amido seco, silico aluminato de sódio, e um liquido é adicionado para formar a
X & " ®
W calda ou o suplemento é adicionado a leite ou um substituto de leite. Em uma
K " modalidade da forma de cápsula de gelatina, o produto de fermentação seco r· 15 por congelamento é adicionado a um veículo, como soro de leite, maltodextri- na, açúcar, calcário (carbonato de cálcio), cascas de arroz, cultura de levedu- ra, amido seco e/ou silico aluminato de sódio. Em uma modalidade, as bacté- rias e o veícub são colocados em uma cápsula de gelatina degradável. Em uma modalidade da forma de géis, o proàuto de fermentação seco por conge- 20 lamento é adicionado a um veículo, como óleo vegetal, sacarose, dióxido de silício, polissorbato 80, propileno glicol, hidróxi anisol butiiado, ácido cítrico, etoxiquina, e/ou colorido artificial para formar o gel. O(s) DFM(S) pode(m), opcionalmente, ser misturado(s) com uma formulação seca de aditivos incluindo, mas não se limitando a, substratos de 25 crescimento, enzimas, açúcares, carboidratos, extratos e microingredientes promotores de crescimento. Os açúcares poderiam incluir os seguintes: lacto- se; maltose; dextrose; malto-dextrina; giicose; frutose; manose; tagatose; sor- bose; rafinose; e galactose. Os açúcares variam de 50 a 95%, individualmente ou em combinação. Os extratos poderiam incluir sohiveis da fermentação de 30 levedura ou Ievedura secana faixa de 5 a 50%. Os substratos de crescimento poderiam incluir: tripticase, na faixa de 5 a 25%; Iactato de sódio, na faixa de 5 a 30%: e, Tween 80, na faixa de 1 a 5°/0. Os carboidratos poderiam inclui ma-
_-n
Ü 4 ¥ e 19/78 4 u , ¥ nitol, sorbitol, adonitol e arabitol. Os carboidratos poderiam estar na faixa de 5 a 50% individualmente ou em combinaçâo. Os microingredientes poderiam €
P " incluir os seguintes: carbonato de cálcio, na faixa de 0,5 a 5,0%; cloreto de cálcio, na faixa de 0,5 a 5,0%; fosfato dipotássico, na faixa de 0,5 a 5,0%: fos- ' 5 fato de cálcio, na faixa de 0,5 a 5,0%; proteinato de manganês, na faixa de 0,25 a 1,OO°/o; e, manganês, na faixa de 0,25 a 1,O°/o. Para preparar os DFMS aqui descritos, a(s) cultura(s) e O(S) ve- ículo(s) (quando usado(s)) podem ser adicionados a um misturador de fitas ou de pás e misturados durante cerca de 15 minutos, embora a temporiza- lO ção possa ser aumentada ou reduzida. Os componentes são misturados de modo que resulte em uma mistura uniforme das culturas e veículos. O pro- %. "" duto final é, de preferência, um pó fluxível seco. O(s) DFM(S) ou a composi- à . " , ção compreendendo o mesmo pode ser adicionada a uma ração animal ou · uma pré-mistura de ração, adicionada à água de um animal, ou administrada = 15 de outras formas conhecidas na técnica (de preferência, simultaneamente com as enzimas da presente invenção). Uma ração para um animal pode ser suplementada com um ou mais DFM(s) aqui descritos ou com uma composi- ção aqui descrita. Por "uma mistura de pelo menos duas cepas," entende-se uma " 20 mistura de duas, três, quatro, cinco, seis ou mesmo mais cepas.' Em algu- mas modalidades de uma mistura de cepas, as proporções podem variar de i°/o a 99%. Outras modalidades de uma mistura de cepas são de 25% a 75°/o. Modalidades adicionais de uma mistura de cepas são aproximadamen- te 50% para cada cepa. Quando uma mistura compreender mais de duas , 25 cepas, as cepas podem estar presentes em proporções substancialmente iguais ou em proporções diferentes na mistura. O DFM pode ser administrado adequadamente. Adequadamente, as dosagens de DFM na ração podem estar entre cerca de 1X1O' UFC/g de ração a cerca de 1X1O' UF'C/g de ração, 30 adequadaniente, entre cerca de 1X1O' UFC/g de ração a cerca de 1x1O' UFC/g de ração, adequadamente, entre cerca de 7,5X1O' UFC/g de ração a cerca de 1X1O' UFC/g de ração.
è 20/78 M7 ~ Em uma modalidade, o DFM é administrado na ração a mais que cerca de 1X103 UFC/g de ração, adequadamente, mais que cerca- de $ 1X1O' UFC/g de ração, adequadamente, mais que cerca de 7,5X1O' UFC/g de ração. 5 Adequadamente, dosagens de DFM na composição de aditivo de ração podem ser entre cerca de 1x105 UFC/g de composição a cerca de 1x10'3 UFC/g de composição, adequadamente, entre cerca de 1x106 UFC/g de composição a cerca de 1x1O" UFC/g de composição, adequadamente, entre cerca de 3,75x1O' UFC/g de composição a cerca de 1x1O" UFC/g de 10 composição. Em uma modalidade, o DFM é administrado na composição de "' aditivo de ração a mais que cerca de 1x105 UFC/g de composiçào, adequa- .= ' ) damente, mais que cerca de 1x106 UFC/g de composição, adequadamente, è mais que cerca de 3,75x1O' UFC/g de composição.
J " 15 Em uma modalidade, o DFM é administrado na composição de aditivo de ração a mais que cerca de 2X1O' UFC/g de composição, adequa- damente, mais que cerca de 2x1O' ufc/g de composição, adequadamente, mais que cerca de 3,75X1O' UFC/g de composição- Para uso na presente invenção, o termo "UFC" significa unida- 20 des de formação de colônia e é uma medida das células viáveis na qual uma colônia representa um agregado de células derivado de uma única célula progenitora. Protease O termo protease, como usado aqui, é sinônimo de peptidase 25 ou proteinase. A protease para uso na presente invenção pode ser uma subti- lisina (E.C. 3.4.21.62) ou uma bacilolisina (E.C. 3.4.24.28) ou uma protease de serina alcalina (E.C. 3.4.21.x) ou uma queratinase (E.C. 3.4.X.X). De preferência, a protease de acordo com a presente invenção 30 é uma subtilisina. As proteases adequadas incluem aquelas de origem animal, vegetal ou microbiana. Mutantes obtidos mediante engenharia de proteínas é' 21/78 ¥ ou quimicamente modificados também são adequados. A protease pode ser uma protease de serina ou uma metaloprotease, por exemplo, uma protease 0
Q " microbiana alcalina ou protease semelhante a tripsina. Exemplos de protea- . ses alcalinas são as subtilisinas, especialmente aquelas derivadas de Baci- " 5 l/us sp., por exemplo, a subtilisina Novo, a subtilisina Carlsberg, a subtilisina 309 (vide, por exemp/o, a patente US n° 6.287.841), a subtilisina 147, e a subtilisina 168 (vide, por exemp/o, WO 89/06279). Exemplos de proteases semelhantes a tripsina são tripsina (por exemplo, de origem suína ou bovi- na), e Fusarium proteases" (vide, por exemp/o,- WO 89/06270 e WO 10 94/25583). Exemplos de proteases úteis incluem, mas não se limitam a, as variantes descritas no WO 92/19729 e WO 98/20115.· .b "' Em uma modaiidade preferencial, a protease para uso na pre- . J ' sente invenção pode ser uma ou mais das proteases em um ou mais dos % ·? produtos comerciais abaixo': t çr jproduto comerci P1po de proq jal® Empresa Èease jFonte de protease µvizyme 1100 Danisco NS kubti|isina )3acil/us subtih's jAvizyme 1202 Danisco NS Pubti|isina Paci//us subtih's µvizyme 1302 Danisco NS kubti|isina µaci//us subti/is jAvizyme 1500 Danisco NS kubti|isina Paci//us subtilis jAvizyme 1505 ' Danisco NS kubti|isina µaci//us subti/is jkemzyme Plus seco jkemin jBaciloiisina µaci//us amy/o/iquefaciens |Kemzvme.W seco iKemjn |Baci|oÍisina Baci//us amy/o/iquefaciens |Trichoderma longibrachia- Natuzyme Bioproton jprotease |tum /Trichoderma reesei Porzyme 8300 Danisco Pubti|isina µacj//us subti/is jgene de Nocardiopsis DSM/Novozy jprotease dek}asjna expresso em Ba- Ronozyme ProAct mes Perina a|ca|inaki//us h'cheniformis Versazyme/Cibenza DPlOO Novus !Queratinase jBaci//us licheniformis 15 Em uma modalidade, a protease pode ser uma protease de B.
3' . de aditivo de ração a menos que cerca de 40Q.OOO PU/g de composição, adequadamente, menos que cerca de 200.000 PU/g de composição, ade- -. , quadamente, menos que cerca de 100.000 PU/g de composição, adequa- damente, menos que cerca de 80.000 PU/g de composição, adequadamen- " 5 te, menos que cerca de 70.000 PU/g de composição, adequadamente, me- nos que cerca de 60.000 PU/g de composição. Será entendido que uma unidade de pr'otease (PU) é a quanti- dade de enzima que libera do substrato (solução de caseína a 0,6%) um mi- crograma de composto fenólico (expresso como equivalentes de tirosina) em 10 um minuto em pH 7,5 (tampão de Na2PO4 40 mM/ácido Iático) e 40°C. lsto pode ser chamado de ensaio para determinar 1 PU. , " Em uma modalidade, adequadamente, a enzima, é cIassificada 4
VF ' usando a cIassificação EC acima, e a classificação EC designa uma .enzima « ~ z que tem esta atividade quando testada no ensaio ensinado aqui para deter- . , q , 15 minar 1 PU. Fitase . A fitase para uso na presente invenção pode ser classificada como uma 6-fitase (classificada como 3.1.3.26) ou uma 3-fitase (classificada como E.C. 3.1.3.8). . : e .
20 Em uma modalidade, a fitase pode ser uma 6-fitase (E.C.
3.1.3.26). L Em uma modalidade preferencial, a fitase para uso na presente invenção pode ser uma ou mais das fitases em um ou mais dos produtos comerciais abaixo: Produto comerj .
cial® . jEmpresa pipo de fitase Fonte de fitase Finase jABvista )3-fitase jTrichoderma reesei jgene de E. co/i expres-j lso em Trichoderma reej Finase EC 'ista 6-fitase ' Natuphos F 3-fitase spe[q/7/us Ni!
jFitase (tipolTrichoderma longibra jjão especifi-jchiatum /Trichodermt )Natuzyme Bioproton icado) jreesei jgene de E. CO/i expres |OPTIPHOS® Huvepharma AD j-fitase po em Pichia pastoris )Um gene consenso ex |Dresso em Hansenuk itase Sp1002 |DSM fitase ene de E. co/i expres ) em Schizosaccaho XP nisco fitase vces pombe » Pene de E. co/i expres-j P" ' m
W jQuantum 2.50oD,j [ jo em Pichia pastoris ou| ' |5.0OOL |A8Vista j"-fitase ,Trichoderma
L jgene de Citrobacte/l jRonozyme Hi4 : fraakji expresso em Asj !Phos (M/L) jDsM/Novozymes [3-fitase pergi//us o/yzae jgene de Peniphora /j/cij fxpresso em Asperg/1/uq jRonozyme np jDsM/Novozymes j-fitase !oryzae jgene de Peniphora lycij fxpresso em Aspergi//usj jRonozyme p jDsM/Novozymes k-fitase |o/yzae jRovabio phy jAdisseo j3-fitase |Penicil/ium funicu/osum I O termo gene consenso, como usado aqui, significa que o vetor de DNA usado para transformar o organismo contém um gene de fitase sin- tético com base em uma sequência consenso, um gene URA da levedura não patogênica Saccharomyces cerevisiae e a origem de replicação do 5 plasmídio pBR322 de Escherichia co/i- Em uma modalidade, a fitase é uma fitase de Citrobacter deri- vada, por exemplo, de Citrobacter freundii, de preferência, C. freundii NCIMB 41247 e suas variantes, por exemplo, conforme apresentado em m , L *
A 6 " k 25/78
W " WO2006/038062 (aqui incorporado, a tltulo de referência) e ' WO2006/038128 (aqui incorporado, a titulo de referência), Citrobacter braa- e ."
F kii YH-15 conforme apresentado em WO 2004/085638, Citrobacter braakii ATCC 51113 conforme apresentado em WO2006/037328 (aqui incorporado, ' ^ 5 a título de referência), assim como suas variantes, por exemplo, conforme apresentado em WO2007/112739 (aqui incorporado, a título de referência) e WO2011/117396 (aqui incorporado, a título de referência), Citrobacter ama- /onaticus, de preferência, Citrobacter ama/onaticus ATCC 25405 ou Ci- trobacter ama/onat/cus ATCC 25407 conforme apresentado em 10 WO2006037327 (aqui incorporado, a título de referência), Citrobacter gi/lenii, de preferência, Citrobacter gi//enii DSM 13694 conforme apresentado em
K " B WO2006037327 (aqui incorporado, a título de referência), ou po/ipeptideos ' e das espécies Citrobacter intermedius, Citrobacter koserj Citrobacter murlini- g ae, Citrobacter rodentium, Citrobacter sed/akii, Citrobacter werkmanil, Ci- . 15 trobacter youngae, Citrobacter ou variantes dos mesmos. Em uma modalidade, a fitase pode ser uma fitase de Citrobac- teg por exemplo, de Citrobacter freundii, como a(s) enzima(s) fitase ensina- da(s) em WO2006/038128, cuja referência está aqui incorporada, a título de referência. 20 Em modalidades preferenciais, a fitase é, de preferência, a fi- tase de E. co/i comercializada sob o nome Phyzyme XP® pela Danisco NS. Alternativamente, a fitase pode ser uma fitase de Buttiauxel/a, por exemplo, uma fitase de Buttiauxe//a agrestis, por exemplo, as enzimas fitase ensinadas em WO 2006/043178, WO 2008/097619, WO2009/129489, 25 WO2008/092901, PCT/US2009/41011 ou PCT/IB2010/051804, todos OS quais estão aqui incorporados a título de referência. Em uma modalidade, a fitase pode ser uma fitase de Hafnia, por exemplo, de Hafnia a/vei, como a(s) enzima(s) fitase ensinada(s) em US2008263688, cuja referência está aqui incorporada, a título de referência. 30 Em uma modalidade, a fitase pode ser uma fitase de Asper- gi//us, por exemplo, de Apergi//us orzyae. Em uma modalidade, a fitase pode ser uma fitase de Penicil-
T+ _F t: .+ ' 26/78 ¶ .
¥ lium, por exemplo, de Penici//ium funicu/osum. . De preferência, a fitase está presente na ração em uma faixa r .' de cerca de 200 FTU/kg a cerca de 1.000 FTU/kg de ração, com mais prefe- .. rência, cerca de 300 FTU/kg de ração a cerca de 750 FTU/kg de ração, com ' 5 mais preferência, cerca de 400 FTU/kg de ração a cerca de 500 FTU/kg de ração. 7 Em uma modalidade, a fitase está 'presente na ração a mais que cerca de 200 FTU/kg de ração, adequadamente, mais que cerca de 300 FTU/kg de ração, adequadamente, mais que cerca de 400 FTU/kg de ração. 10 Em uma modalidade, a fitase está presente na ração a menos que cerca de 1.000 FTU/kg de ração, adequadamente, menos que cerca de
P " k 750 FTUlkg de ração. , m u
W ~ · De preferência, a fitase está presente na composição de aditivo ' de ração em uma faixa de cerca de 40 FTU/g a cerca de 40.000 FTU/g de m 15 composição, com mais preferência, cerca de 80 FTU/g de composição a cerca de 20.000 FTU/g de composição, e com mais preferência ainda cerca de 100 FTU/g de composição a cerca de 10,000 FTU/g de composição, e com mais preferência ainda cerca de 200 FTU/g de composição a cerca de
10.000 FTU/g de composição. 20 Em uma modalidade, a fitase está presente na composição de aditivo de ração a mais que cerca de 40 FTU/g de composição, adequada- mente, mais que cerca de 60 FTU/g de composição, adequadamente, mais que cerca de 100 FTU/g de .composição, adequadamente, mais que cerca de 150 FTU/g de composição, adequadamente, mais que cerca de 200 25 FTU/g de composição. .. . Em uma modalidade, a fitase está presente na composição de aditivo de ração a menos que cerca de 40.000 FTU/g de composição, ade- quadamente, menos que cerca de 20.000 FTU/g de composição, adequa- damente, menos que cerca de 15.000 FTU/g de composição, adequadamen- 30 te, menos que cerca de 10.000 FTU/g de composição. Será compreendido"que, para uso na presente invenção, 1 FTU (unidade de fitase) é definida como a quantidade de enzima necessária para
, »
A r
H 29/78 g á- das enzimas ou elas podem ser encapsuladas separadamente, por exemplo, como enzimas individuais. Em uma modalidade preferencial, ambas as en- .. , zimas podem ser revestidas, por exemplo, encapsuladas, juntas. Em uma modalidade, o revestimento protege as enzimas do ' 5 calor e pode ser considerado um protetor térmico. Em uma modalidade, a composição de aditivo de ração é for- mulada para um pó seco ou grânulos, conforme descrito em WO2007/044968 (chamada de grânulos TPT) ou WO1997/016076 ou WO1992/012645 (cada um dos quais está aqui incorporado, a título de refe- lO rência). Em uma modalidade, a composição de aditivo de ração pode >m 8 ser formulada como um grânulo para composições de ração que compreen- . t dem: um núcleo; um agente ativo; e pelo menos um revestimento, o agente _*' 'ã ativo do grânulo retendo pelo menos 50% de atividade, pelo menos 60% de
M 15 atividade, pelo menos 70% de atividade, pelo menos 8Ó°/o de atividade após condições selecionadas a partir de uma ou mais de a) um processo de pele- tização de ração, b) um processo de pré-tratamento da ração aquecida com vapor d'água, c) armazenamento, d) armazenamento como um ingrediente em uma mistura não peletizada, e e) armazenamento como um ingrediente 20 em uma mistura-base de ração ou uma pré-mistura de ração que compreen- de pelo menos um composto selecionado a partir de minerais traço, ácidos orgânicos, açúcares redutores, vitaminas, cloreto de colina, e compostos que resultam em uma mistura-base de ração ou pré-mistura de ração ácida ou básica. 25 Com relação ao grânulo, pelo menos um revestimento pode compreender um material de hidratação por umidade que constitui pelo me- nos 55% p/p do grânulo; e/ou pelo menos um revestimento pode compreen- der dois revestimentos. Os dois revestimentos podem ser um revestimento de hidratação com umidade e um revestimento de barreira à umidade. Em 30 algumas modalidades, o revestimento de hidratação com umidade pode re- presentar entre 25% e 60% p/p do grânulo e o revestimento de barreira à umidade pode representar entre 2°/0 e 15% p/p do grânulo. O revestimento
L .
A m 30/78 é de hidratação com umidade pode ser selecionado a partir de sais inorgâni- cos, sacarose, amido, e maltodextrina e o revestimento de barreira à umida- s.
, de pode ser selecionado a partir de polimeros, gomas, soro de leite e amido. O grânulo pode ser produzido usando um processo de peleti- ' 5 zação de ração e o processo de pré-tratamento da ração pode ser conduzido ' entre 70°C e 95"C por até vários minutos, como entre 85°C e 95°C. Em uma modalidade, a composição de aditivo de ração pode ser formulada em um grânulo para ração animal que compreende: um nú- cleo; um agente ativo, o agente ativo do grânulo retendo pelo menos 80°6 de 10 atividade após armazenamento e após um processo de peletização aqueci- do com vapor d"água onde o grânulo é um ingrediente; um revestimento de & ¥ barreira à umidade; e um revestimento de hidratação com umidade que re- . *- , presenta pelo menos 25% p/p do grânulo, o grânulo tendo uma atividade de
D ' água menor que 0,5 antes do processo de peletização aquecido com vapor " 15 d'água. O grânulo pode ter um revestimento de barreira à umidade se- lecionado a partir de polímeros e gomas e o material de hidratação por umi- dade pode ser um sal inorgânico. O revestimento de hidratação com umida- de pode representar entre 25% e 45% p/p do grânulo e o revestimento de 20 barreira à umidade pode representar entre 2% e 1O°/o p/p do grânulo. O grânulo pode ser produzido usando um processo de peleti- zação aquecido com vapor d'água que pode ser conduzido entre 85°C e 95°C por até vários minutos. Em algumas modalidades, o DFM (por exemplo, endósporos 25 de DFM) pode ser diluído usando um diluente, como pó de amido, calcário ou similares. Em uma modalidade, a composição está em uma formulação líquida adequada para consumo, de preferência, tal líquido para consumo contém um ou mais dos seguintes: um tampão, sal, sorbitol e/ou glicerol. 30 Em uma outra modalidade, a composição de aditivo de ração pode ser formulada pela aplicação, por exemplo, aspersão, da(s) enzima(s) sobre um substrato de velculo, como trigo triturado, por exemplo.
m 4' s " 31/78 *, . £. Em uma modalidade, a composição de aditivo de ração de acordo com a presente invenção pode ser formuíada como uma pré-mistura. s * Apenas a título de exemplo, a pré-mistura pode compreender um ou mais componentes de ração, como um ou mais minerais e/ou uma ou mais vita- '"' 5 minas. Em uma modalidade, o DFM elou as enzimas para uso na pre- sente invenção são formulados com pelo menos um veículo fisiologicamente aceitável selecionado a partir de ao menos um dentre maltodextrina, calcário (carbonato de cálcio), ciclodextrina, trigo ou um componente de trigo, saca- lO rose, amido, Na2SO4, talco, PVA, sorbitol, benzoato, sorbiato, glicerol, saca- rose, propileno glicol, 1,3-propano diol, glicose, parabenos, cloreto de sódio, Sb.
citrato, nitrato, fosfato, cálcio, metabissulfito, formato e misturas dos mes-
M k " mos. q $ Embalagem *' 15 ' Em uma modalidade, a composição de aditivo de ração e/ou pré-mistura e/ou ração ou comida para animais de acordo com a presente invenção é embalada.
Em uma modaiidade preferencial, a composição de aditivo de ração e/ou pré-mistura e/ou ração ou comida para animais é embalada em 20 um saco, como um saco de papel. Em uma modalidade alternatiúa, a composição de aditivo de ração e/ou pré-mistura e/ou ração ou comida para animais pode ser lacrada em um recipiente. Qualquer recipiente adequado pode ser usado.
Ração 25 A composição de aditivo de ração da presente invenção pode ser usada como - ou na preparação de - uma ração. O termo "ração" é usado como sinônimo de "comida para ani- mais". A ração pode estar sob a forma de uma solução ou como um 30 sólido - dependendo do uso elou modo de aplicação e/ou modo de adminis- tração. Quando usada como - ou na preparação de - uma ração -
K- » 0 m )" 32/78 ¶ e. como uma ração funcional - a composição da presente invenção pode ser usada em conjunto com um ou mais de: um veículo nutricionalmente aceitá- 3 , vel, um diluente nutricionalmente aceitável, um excipiente nutricionalmente aceitável, um adjuvante nutricionalmente aceitável, um ingrediente nutricio- " 5 nalmente ativo. Em uma modalidade preferencial, a composição de aditivo de ração da presente invenção é misturada com um componente de ração para formar uma ração. O termo "componente de ração" para uso na presente inven- lO ção, significa a totalidade ou parte da ração. Parte da ração pode significar um constituinte da ração ou mais do que um constituinte da ração, por 4 d exemplo, 2 ou 3 ou 4. Em uma modalidade, o termo "componente de ração" 0
W abrange uma pré-mistura ou constituintes de pré-mistura. 'K e pd De preferência, a alimentação pode ser uma forragem, ou uma 4 15 pré-mistura da mesma, uma ração composta, ou uma pré-mistura da mes- ma. Em uma modalidade, a composição de aditivo de ração de acordo com a presente invenção pode ser misturada com uma ração composta, um componente de alimentação composto ou a uma pré-mistura de uma ração composta ou a uma forragem, componente de forragem, ou uma pré-mistura 20 de uma forragem. O termo forragem, para uso na presente invenção, significa qualquer alimento que seja fornecida a um animal (ao invés de o animal ter que buscar a comida sozinho). A forragem abrange plantas que foram corta- das.
25 O termo forragem inclui feno, palha, silagem, rações compac- tadas e peletizadas, óleos e rações misturadas e também grãos germinados e legumes. A forragem pode ser obtida a partir de uma ou mais das plantas selecionadas a partir de: alfalfa (luzerna), cevada, cornichão, brassicas, 30 Chau moellier, couve, colza (canola), rutabaga (couve nabo da suécia), na- bo, trevo, trevo hibrido, cravo vermelho, trevo subterrâneo, trevo branco, grama, balanquinho, festuca, gramíneas do grupo Bermuda, brome, grama
~ & t: 4'
K |1 " 33/78 q' .
£" comum, gramas de campinas de relvados de pastos naturalmente mistura- dos, capim dos pomares, grama de centeio, grama Timothy, milho (maís), # ©" painço, aveias, sorgo, soja, árvores (brotos de árvore de poda para feno), trigo, e legumes. ' 5 O termo "ração composta" significa uma ração comercial sob a forma de uma farinha, um pélete, anéis, bolo ou um farelo- As rações com- postas podem ser misturadas a partir de várias matérias primas e aditivos. Estas misturas são formuladas de acordo com os requisitos específicos do animal aivo. 10 As rações compostas podem ser rações completas que forne- cem todos os nutrientes necessários diariamente, concentrados que forne- ã cem uma parte da porção (proteína, energia) ou suplementos que fornecem
M ê u apenas micronutrientes adicionais, como minerais e vitaminas. q » W Os ingredientes principais usados na ração composta são os @ 15 grãos de ração, que incluem milho, soja, sorgo, aveia e cevada. Adequadamente, uma pré-mistura, conforme chamado aqui, pode ser uma composição composta por microingredientes como vitaminas, minerais, conservantes químicos, antibióticos, produtos de fermentação, e outros ingredientes essenciais. As pré-misturas são, geralmente, composi- ' 20 ções adequadas para misturar em rações comerciais. Qualquer ração da presente invenção pode compreender um ou mais matériais de ração selecionados a partir do grupo que compreende a) cereais, como grãos pequenos (por exemplo, trigo, cevada, centeio, aveia e combinações dos mesmos) e/ou grãos grandes, como milho ou sorgo; b) 25 subprodutos de cereais, como farinha de glúten de milho, solúveis de grão seco de destilaria (DDGS), fibra de trigo, farelo de trigo, cortes de trigo, fare- lo de arroz, cascas de arroz, cascas de aveia, caroço de palma, e polpa de frutas cítricas; C) proteína obtida a partir de fontes como soja, girassol, amendoim, tremoço, ervilhas, favas, algodão, canola, farinha de peixe, prote- 30 ina plasmática seca, farinha de carne e ossos, proteína de batata, soro de leite, copra, gergelim; d) óleos e gorduras obtidas a partir de fontes vegetais e animais; e) minerais e vitaminas.
Ê 4 - 34/78 € Uma ração da presente invenção pode conter pelo .menos 3O°/,, pelo menos 40%, pelo menos 5Ó°/o ou ao menos 6O°/j, em peso de milho e
F " farelo de soja ou milho e soja integral, ou farelo de trigo ou farelo de girassol. ^ Além disso ou alternativamente, uma ração da presente inven- ^ 5 ção pode compreender pelo menos um material de ração com alto teor de fibras e/ou pelo menos um subproduto do pelo menos um material de ração com alto teor de fibras para fornecer uma ração com alto teor de fibras. Exemplos de materiais de ração com alto teor de fibras incluem: trigo, ceva- da, centeio, aveia, subprodutos de cereais, como farinha de glúten de milho, 10 solúveis de grão seco de destilaria (DDGS), fibra de trigo, farelo de trigo, cor- tes de trigo, farelo de arroz, cascas de arroz, cascas de aveia, caroço de Èb
W , palma, e polpa de frutas cÍtricas. Algumas fontes de proteína podem, tam- : -6 bém, ser consideradas como tendo alto teor de fibras: proteína obtida a partir s de fontes como girassol, tremoço, favas e algodão. á 15 Na presente invenção, a ração pode ser uma ou mais das se- guintes: uma ração composta e pré-mistura, incluindo péletes, anéis ou bolo (bovino); uma cultura ou resíduo de cultura: milho, feijões soja, sorgo, aveia, cevada, forragem de milho, copra, palha, moinha, desejo de beterraba açu- careira; farinha de peixe; grama cortada fresca e outras plantas de forragem; 20 farinha de carne e ossos; melado; residuo sólido de oleaginosas e torta prensada; oligossacarídeos; plantas de forragem conservadas: feno e sila- gem; aiga marinha; sementes e grãos, inteiros ou preparados por esmaga- mento, moagem etc.; grãos germinados e legumes; extrato de levedura. O termo ração na presente invenção também abrange, em al- 25 gumas modalidades, alimento para animais de estimação. Um alimento para animais de estimação é um material vegetal ou animal destinado ao consu- mo por animais de estimação, como alimento para cães ou alimento para gatos. O alimento para animais de estimação, como alimento para cães e gatos, pode estar em uma forma seca, tal como em pedaços para cães, ou 30 sob uma forma úmida em lata. O alimento para gatos pode conter o aminoá- cido taurina. O termo ração na presente invenção também abrange, em al-
%
X . % 35/78 ? g gumas modalidades, alimento para peixes. Um alimento para peixes contém, normalmente, os macronutrientes, elementos traço e vitaminas necessárias
S ,, " para manter os peixes em cativeiro em boa saúde. O alimento para peixes pode estar sob a forma de um floco, pélete ou comprimido. As formas peleti- ' 5 zadas, algumas das quais afundam rapidamente, são frequentemente usa- das para peixes maiores ou espécie com alimentação de fundo. Alguns ali- mentos para peixe também contêm aditivos, como beta caroteno ou hormô- nios sexuais, para melhorar artificialmente a cor do peixe ornamental. O termo ração na presente invenção também abrange, em al- lO gumas modalidades, alimento para pássaroc¶. O alimento para pássaros in- clui o alimento que é usado em alimentadores para pássaros e para alimen- . à tar aves de estimação. Tipicamente, o alimento para pássaros compreende 8 ' uma variedade de sementes, mas podem, também, abranger sebo (gordura s : de carne bovina ou de carneiro). á 15 Para uso na presente invenção, o termo "colocar em contato" se refere à aplicação indireta ou direta da composição da presente invenção ao produto (por exemplo, a ração). Exemplos dos métodos de aplicação que podem ser usados, incluem, mas não se Iimitam a, o tratamento do produto em um material que compreende a composição de aditivo de ração, a apli- 20 cação direta por mistura da composição de aditivo de ração com o produto, aspersão da composição de aditivo de ração sobre a superfície do produto ou imersão do produto em uma preparação da composição dè aditivo de ra- ção. Em uma modalidade, a composição de aditivo de ração da pre- 25 sente invenção é, de preferência, misturada com o produto (por exemplo, ração). Alternativamente, a composição de aditivo de ração pode estar inclu- ida na emulsão ou ingredientes eni bruto de uma ração- Para algumas aplicações, é importante que a composição seja disponibilizada sobre ou na superfície de um produto a ser afetado/tratada.
30 Isto permite que a composição confira uma ou mais das seguintes caracte- risticas favoráveis: benefícios de desempenho. As composições de aditivo de ração da presente invenção po-
,! - f, %
F 36/78 # e dem ser aplicadas para entremear, revestir e/ou impregnar um produto (por exemplo, ração ou ingredientes em bruto de uma ração) com uma quantida- .' de controlada de DFM e enzimas.
O DFM e as enzimas podem ser usados simultaneamente.(por '' 5 exemplo, quando eles estão em mistura juntos ou até mesmo quando eles são liberados por diferentes vias) ou sequencialmente (por exemplo, eles podem ser liberados por diferentes vias). Em uma modalidade, de preferên- cia, o DFM e as enzimas são aplicados simultaneamente. De preferência, o DFM e as enzimas são misturados antes de serem liberados a uma ração ou 10 a um ingrediente em bruto de uma ração. O DFM nas composições de aditivo de ração de acordo com a ", presente °nvenção - pode ser adicionado em concentrações adequadas ' como, por exemplo, em concentrações no produto de ração final.que ofere- . b 8 cem uma dose diária entre cerca de 2x105 UFC a cerca de 2X101' UFC, 15 adequadamente, entre cerca de 2X106 a cerca de 1x10'0, adequadamente, entre cerca de 3,75X1O' UFC a cerca de 1X1O'° UFC.
De preferência, a composição de aditivo de ração da presente invenção será termicamente estável ao tratamento com calor até cerca de 70 °C; até cerca de 85 °C; ou até cerca de 95"C. O tratamento com calor 20 pode ser feito por até cerca de 1 minuto; até cerca de 5 minutos; até cerca de 10 minutos; até cerca de 30 minutos; até cerca de 60 minutos. O termo termicamente estável significa que ao menos cerca de 75% dos componen- tes enzimáticos e/ou DFM que estavam presentes/ativos no aditivo antes do aquecimento até a temperatura especificada ainda estão presentes/ativos 25 após ele resfriar para a temperatura ambiente. De preferência, ao menos cerca de 8Ó°/o dos componentes enzimáticos e/ou DFM que estavam presen- tes e ativos no aditivo antes do aquecer até a temperatura especificada ain- da estão presentes e ativos após ele resfriar para a temperatura ambiente. Em uma modalidade particularmente preferencial, a composi- 30 ção de aditivo de ração é homogeneizada para produzir um pó. Em uma modalidade preferencial alternativa, a composição de aditivo de ração é formulada como grânulos, conforme descrito em e'
U W
P 37/78 q [ WO2007/044968 (chamados de grânulos de TPT) aqui incorporado, a título de referência. $ , Em uma outra modalidade preferencial, quando a composição de aditivo de ração é formulada em grânulos, os grânulos compreendem um ' 5 sal de barreira hidratado aplicado como revestimento sobre o.núcleo de pro- teína. A vantagem de tal revestimento salino é a tolerância térmica aprimo- rada, estabilidade em armazenamento aprimorada e proteção contra outros aditivos de ração que possuem de outro modo efeitos adversos sobre a en- zima e/ou DFM. 10 . De preferência, o sal usado para o revestimento salino tem uma atividade de água maior que 0,25 ou umidade constante maior que > ~ e 60%a20°C.
I ' "i De preferência, o revestimento salino compreende Na2SO4. S O método para preparar uma composição de aditivo de ração á 15 pode compreender também a etapa adicional de peletizar o pó. O pó pode ser misturado com outros componentes conhecidos na técnica. O pó, ou mistura que compreende o pó, pode ser forçado através de uma matriz e as fitas resultante são cortadas em péletes adequados de comprimento variá- vel. 20 . Opcionalmente, a etapa de peletização pode incluir um trata- mento com vapor d'água, ou uma estágio de condicionamento, antes da formação dos péletes. A mistura compreendendo o pó pode ser colocada em um condicionador, por exemplo, um misturador com injeção de vapor .d'água. A mistura é aquecida no condicionador até uma temperatura especi- 25 ficada, tal como a partir de 60 a 1OO°C, as temperaturas tipicas seriam de 70°C, 80°C, 85°C, 90°C ou 95"C. O tempo de permanência pode ser variável de segundos a minutos e até mesmo horas. Como, por exemplo, 5 segundos, 10 segundos, 15 segundos, 30 segundos, 1 minuto, 2 minutos, 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 30 minutos e 1 hora. 30 Será compreendido que a composição de aditivo de ração da presente invenção é adequada para adição a qualquer material de ração adequado.
'""" -
P Como usado aqui, o termo material de ração se refere ao mate- rial básico da ração que será consumido por um"animal. Será ainda compre- q . endido que ele pode compreender, por exemplo, peio menos um ou mais · grãos não procèssados, e/ou material vegetal e/ou animal processado, como " 5 farelo de soja ou farinha de ossos. Como usado aqui, o termo "ração" se refere a um material de ração ao qual uma ou mais composições' de aditivo de ração foram adicio- nadas. b , Será compreendido pelo versado "na técnica 'que diferentes 10 animais exigem diferente rações, e até o mesmo animal pode exigir rações diferente, dependendo do propósito para o qual o animal é criado. %
V 3 De preferência, a ração pode compreender materiais de ração ' q que compreendem milho ou milho, trigo, cevada, triticale, centeio, arroz, ta-
G ' pioca, sorgo, e/ou quaisquer dos subprodutos, assim como componentes ri- 15 cos em proteínas"'como farelo de soja, farelo de semente de colza, farelo de canola, farelo de caroço de algodão, farelo de semente de girassol, farelos de subprodutos animais e misturas dos mesmos. Com mais'preferência, a ração pode compreender gorduras animais e/ou óleos vegetais. Opcionalmente, a ração pode conter, também, minerais adicio- . 20 nais como, por exemplo, cálcio e/ou vitaminas adicionais. De preferência, a ração é uma mistura de farelo de soja e mi- lho. Em uma modalidade, de preferência, a ração não é alimento para animais de estimação- 25 Em um outro aspecto, é apresentado um método para produzir uma ração. A ração é produzida, tipicamente, em moinhos para ração nos quais as matérias primas são primeiro trituradas até um tamanho de partícu- la adequado e, então, são misturadas com aditivos adequados. A ração po- de, então, ser produzida como uma massa ou como péletes; este último en- . 30 volve, tipicamente,,um método pelo qual a temperatura é aumentada i para um nível alvo e, então, a ração é passada através de uma matriz para pro- duzir péletes de um tamanho particular.' Os péletes são resfriados natural-
m L- 4
.k
% 39/78 j f mente.
Subsequentemente, aditivos Iiquidos como gordura e enzima podem ser adicionados.
A produção de ração pode, também, envolver uma etapa g
% adicional que inclui extrusão ou expansão antes da peletização - em particu- lar, por técnicas adequadas que podem incluir pelo menos o uso de vapor ' 5 d"água.
A ração pode ser uma ração para um animal monogástrico, como aves domésticas (por exemplo, frango para alimentação, poedeira, melhoristas de frangos, peru, pato, ganso, aves aquáticas), suínos (todas as categorias de idade), um anima! de estimação (por exemplo, cães, gatos) ou
10 peixe, de preferência, a ração é para aves domésticas.
Em uma modalidade, a ração não é para uma poedeira. b
" % Apenas a título de exemplo, uma ração para galinhas, por *
- %, exemplo, galinhas destinadas à alimentação, pode compreender um ou mais 3 dos ingredientes mencionados na tabela abaixo, por exemplo, nas porcenta- . 15 ges dadas na tabela abaixo: lngredientes lnicial (%) Terminação ("/0) Milho 46,2 46,7 Farelo de trigo 6,7 10,0 DDGS de milho . 7,0 7,0 Farinha de soja 48%cp 32,8 26,2 Mistura de gordura An/Veg 3,0 5,8 L-lisina HCl 0,3 0,3 DL-metionina 0,3 0,3 L-treonina 0,1 0,1 Sal 0,3 0,4 " Calcário 1,1 1,1 Fosfato dicálcico 1,2 1,2 Vitaminas e microminerais para 0,3 0,3 ' aves domésticas Apenas a título de exemplo, a especificação da dieta para gali- nhas, como galinhas destinadas a alimentação pode ser conforme estipulado na tabela abaixo:
da dieta Proteina bruta (°/0) 23,00 20,40
Energia metabolizável pelas aves do- 2950 3100 mésticas (kcal/kg)
Cálcio (°/0) 0,85 - 0,85
Fósforo disponível (°/j) 0,38 0,38
Sódio (°/0) 0,18 0,19
Lisina dig. (°/0) 1,21 1,07
Metionina dig. (°/0) 0,62 0,57
Metionina + Cisteína dig. (°/0) 0,86 0,78
Treonina dig. (°/0) 0,76 0,68 Apenas a titulo de exemplo, uma ração para galinhas poedei-
ras pode compreender um ou mais dos ingredientes mencionados na tabela abaixo, por exemplo, nas °/) dadas na tabela abaixo:
Ingrediente Fase de postura (°/1)
Milho 10,0 b
Trigo 53,6
DDGS de milho 5,0
Farinha de soja 48% cp 14,9
Farelo de trigo 3,0 Óleo de soja 1,8
L-lisina HCl 0,2
DL-metionina 0,2
L-treonina 0,1
Sal 0,3
Fosfato dicálcico 1,6
Calcário 8,9 Vitaminas e microminerais para aves do- 0,6 mésticas Apenas a título de exemplo, a especificacão da dieta para gali- - nhas poedeiras pode ser conforme estipLl|ado na tabela abaixo.
Especificação da dieta
Proteina bruta (°/0) 16,10 Energia metabolizável pelas aves domésticas (kca 2700 Lisina (q/o) 0,85 Metionina (O/j) 0,42 Metionina + cisteína (°/0) 0,71 Treonina (°/0) 0,60 Cálc'io (°/0) 3,85 Fósforo disponível (°/0) 0,42 Sódio (°/0) 0,16 Apenas a título de exemplo, uma ração para perus pode com- . mp
· . preender um ou mais dos ingredientes mencionados na tabela abaixo, por 4 exemplo, nas porcentagens dadas na tabela abaixo: è. m
Ingred iente Fase 1 (°/0) Fase 2 (°/0) Fase 3 ('/j) Fase 4 (°/0)
Trigo 33,6 42,3 52,4 61,6 DDGS de milho 7,0 7,0 7,0 7,0 Farinha de soja 48%CP 44,6 36,6 27,2 19,2 Farelo de colza 4,0 4,0 4,0 4,0 ÓIeo de soja 4,4 4,2 3,9 3,6 L-lisina HCl 0,5 0,5 0,4 0,4 DL-metionina 0,4 0,4 0,3 0,2 L-treonina 0,2 0,2 0,1 0,1 Sal 0,3 0,3 0,3 0,3 Calcário 1,0 1,1 1,1 1,0 Fosfato dicálcico 3,5 3,0 27t 2,0 Vitaminas e microminerais 0,4 0,4 0,4 0,4 para aves domésticas Apenas a título de exemplo, a especificação da dieta para pe-
5 rus pode ser conforme estipulado na tabela abaixo:
j; 42/78 Especificação da dieta Proteina bruta (°/0) 29,35 26,37 22,93 20,00 Energia metabolizável pelas aves 2,850 2,900 2,950 3,001 domésticas (kcal/kg) Cálcio (°/0) 1,43 1,33 1,22 1,02 Fósforo disDonÍve| (°/0) 0,80 0,71 0,65 0,53 Sódio ('/0) 0,16 0,17 0,17 0,17 Lisina dig. (°/0) 1,77 1,53 1,27 1,04 Metionina dig. (°/0) -0,79 0,71 0,62 0,48 Metionina + Cisteina dig. (°/0) 1,12 1,02 0,90 0,74 Treonina dig. (°/0) 1,03 0,89 0,73 0,59 « ~ Apenas a título de exemplo, uma ração para Ieitões pode com-
D . " · preender um ou mais dos ingredientes mencionados na tabela abaixo, por 0 . " exemplo, nas porcentagens dadas na tabela abaixo: lngrediente Fase 1 Fase 2 Milho 20,0 7,0 Trigo 25,9 46,6 Centeio 4,0 10,0 Farelo de trigo 4,0 4,0
Ê DDGS de milho 6,0 _ 8,0 Farinha de soja 48°/o cp 25,7 19,9 Soro de leite seco 10,0 0,0 Óleo de soja 1,0 0,7 ' L-lisina HCl 0,4 0,5 DL-metionina 0,2 0,2 L-treonina 0,1 0,2 L-triptofano 0,03 0,04 Calcário 0,6 0,7 Fosfato dicálcico 1,6 1,6 Vitaminas e microminerais para suínos 0,2 0,2 Sal 0,2 0.4
G—. r
4.
¶ Iü 43/78 0 "' . Apenas a título de exemplo, a especificação da dieta para lei- tões pode ser conforme estipulado na tabela abaixo: . R .% ," Especificação da dieta Proteína bruta (°/0) 21,50 20,00 a " Energia digestível pelos su inos (kcal/kg) 3380 3320 Energia iiquida para os suínos (kcal/kg) 2270 2230 Cálcio (°/0) 0,80 0,75 . Fósforo digestível (°/0) 0,40 0,35 Sódio (°/0) 0,20 0,20 Lisina dig. (°/0) 1,23 1,14 Metionina dig. (°/0) 0,49 0,44 e
W à Metionina + Cisteina dig. (°/0) 0,74 0,68 & = - Treonina dig. (°/0) 0,80 0,74
O " Apenas a titulo de exemplo, uma ração para suínos em cresci- . mento/terminação pode compreender um ou mais dos ingredientes mencio- 5 nados na tabela abaixo, por exemplo, nas porcentagens dadas na tabela abaixo: lngrediente Crescimento / Terminaçã Milho 27,5 Farinha de soja 48% cp 15,4 DDGS de milho 20,0 Fibra de trigo 11,1 Farelo de arroz 12,0 Farelo de semente de canola 10,0 Calcário 1,6 Fosfato dicálcico 0.01 Sal 0,4 Vitaminas e microminerais para suínos 1 0,3 Lisina-HCl 0,2 ÓIeo vegetal 0,5 Apenas a titulo de exemplo, a especificação da dieta para suí- nos em crescimento/terminação pode ser conforme estipulado na tabela kq 44/78 abaixo: Especificação da dieta Proteina bruta ('/0) 22,60 Energia metabolizável pelos suínos (kcal/k 3030 Cálcio {°/0) 0,75 Fósforo disponível (°/0) 0,29 Lisina digestível (°/0) 1,01 Metionina + Cisteina dig. (°/0) 0,,73 Treonina digestível (°/0) 0,66 Formas A composição de aditivo de ração da presente invenção e ou- .
W e tros componentes e/ou a ração compreendendo a mesma podem ser usados q " . 5 sob qualquer forma adequada. e
F A composição de aditivo de ração da presente invenção pode 4 ser usada sob a forma de preparações sóIidas ou líquidas ou alternativas das mesmas- Exemplos de preparações sólidas incluem pós, pÍlulas gran- des, cápsulas, péletes, comprimidos, poeiras, e grânulos que podem ser mo- lO lháveis, secados por atomização ou secados por congelamento. Exemplos de preparações liquidas inciuem, mas não se limitam a, soluções, suspen- sões e emulsões aquosas, orgânicas ou aquoso-orgânicas. Em algumas aplicações, o DFM ou as composições de aditivo de ração da presente invenção podem ser misturados com ração ou admi- 15 nistrados na água potável. Em uma modalidade, a faixa de dosagem para inclusão na água é cerca de 1x103 UFC/animal/dia a cerca de 1X10'0 UFC/animal/dia, e com mais preferência, cerca de 1x1O' UFC/animal/dia. Exemplos adequados de formas incluem um ou mais de: pós, pastas, pilulas grandes, péletes, comprimidos, pÍlulas, cápsulas, óvulos, so- 20 luções ou suspensões, que podem conter agentes flavorizantes ou corantes, para aplicações de liberação imediata, retardada, modificada, sustentada, pulsada ou controlada. A título de exemplo, se a composição da presente invenção for usada em um sólido, por exemplo, forma peletizada, ela também pode con-
I £_ O b. q
W i: 45/78 0 i ter um ou mais de: excipientes como celulose microcristalina, lactose, citrato de sódio, carbonato de cálcio, fosfato de cálcio dibásico e glicina; desinte- ? , gradores como amido (de preferência, amido de milho, batata ou tapioca), glicolato de amido de sódio, croscarmelose sódica e certos silicatos comple- " 5 xos; aglutinantes de granulação como polivinil pirrolidona, hidroxipropil metil- celulose (HPMC), hidroxipropil celulose (HPC), sacarose, gelatina e acácia; agentes lubrificantes como estearato de magnésio, ácido esteárico, beenato de glicerila e talco podem estar incluídos. Exemplos de veículos nutricionalmente aceitáveis para uso no 10 preparo das formas incluem, por exemplo, água, soluções salinas, álcool, silicone, ceras, gel de petróleo, óleos vegetais, polietileno glicóis, propileno ê . glicol, lipossomos, açúcares, gelatina, Iactose, amilose, estearato de magné- .- .u sio, talco, tensoativos, ácido silícico, parafina viscosa, óleo essencial, mono- : glicerídeos e diglicerídeos de ácido graxo, ésteres de ácido graxo de petroe- . 15 tral, hidroximetil-celulose, polivinil pirrolidona, e similares. Os excipientes preferenciais para as formas incluem lactose, amido, uma celulose, açúcar de leite ou polietileno glicóis com alto peso mo- lecular. Para suspensões aquosas e/ou elixires! a composição da pre- 20 sente invenção pode ser combinada com vários agentes adoçantes ou sabo- rizantes, matéria de tingimento ou corantes, com agentes de emulsificação e/ou suspensão e com diluentes como água, propileno glicol e glicerina, e combinações dos mesmos. Soro de leite não higroscópico é frequentemente usado como 25 um veículo para DFMS (particularmente, DFMS bacterianos) e é um bom meio para iniciar o crescimento. Pastas contendo DFM bacteriano podem ser formuladas com óleo vegetal e ingredientes de gelificação inertes. Os produtos fúngicos podem ser formulados com subprodutos 30 de grão como veículos. Em uma modalidade, de preferência, a composição de aditivo de ração de acordo com a presente invenção não está sob a forma de um e m * q m E· 46/78 * s sistema de microparticulas, como o sistema de microparticulas ensinado em \NO2005/123034. g ," % Administração O DFM e/ou composição de aditivo de ração de acordo com a " 5 presente invenção pode ser projetado para administração única ou pode ser projetado para alimentação diária. A quantidade ótima da composição (e de cada componente presente nela) a ser usada na combinação da presente invenção dependerá do produto a ser tratado e/ou do método de contato do produto com a com- lO posição e/ou do uso pretendido para a mesma. A quantidade de DFM e das enzimas usadas nas composições ࢠdeve ser uma quantidade suficiente para ser eficaz e permanecer suficien- . ' W temente eficaz no aprimoramento do desempenho dos produtos de ração 2 dados ao animal contendo a dita composição- Este período de tempo para q 15 eficácia deve se estender até pelo menos o tempo de utilização do produto (por exemplo, composição de aditivo de ração ou ração contendo a mesma). A razão entre DFM e cada enzima na ração pode estar nas fai- xas dadas abaixo: DFM: fitase (UFC/FTU): Na faixa de 5,Ox1O' UFC de DFM: , 20 1 FTU de enzima a 5,0X109 UFC:I FTU de enzima; de preferência, na faixa de 7,5x1O' UFC de DFM: 1 FTU de enzima a 2,5x107 UFC:I FTU de enzima. DFM: protease (UFC/PU): Na faixa de 5,OX1O' UFC de DFM: 1 PU de enzima a 1,Ox1O' UFC:I PU de enzima; de preferência, na faixa de 1,25X1O' UFC de DFM: 1 PU de enzima a 5,OX1O' UFC:I PU de enzima.
25 Em uma modalidade, de preferência, a ração compreende o seguinte: uma protease a pelo menos 4.000 PU/kg de ração; uma fitase a pelo menos 500 FTU/kg de ração; e Envivo Pro (DFM) a pelo menos 75.000 UFC/g a 30 150.000 UFC/g de ração. Em uma modalidade, de preferência, a ração compreende o seguinte:
ti uma protease a 4.000 PU/kg de ração; uma fitase a 500 FTU/kg de ração; e Envivo Pro (DFM) a 75.000 UFC/g a 150.000 UFC/g de ração. Em uma modalidade, de preferência, a ração compreende o 5 seguinte: uma protease a 5.000 PU/kg de ração; uma fitase a 625 FTU/kg de ração; e Envivo Pro (DFM) a 75.000 UFC/g a 150.000 UFC/g de ração. Em uma outra modalidade, a ração compreende o seguinte: 10 uma protease a 2.000 PU/kg de ração; uma fitase a 500 FTU/kg de ração; e
G " 4 Envivo Pro (DFM) a 37.500 UFC/g a 75.000 UFC/g de ração.
V * - - m ' Em uma modalidade preferencial, a composição de aditivo de : ração compreende enzima suficiente e DFMS para administrar a ração da
Q · 15 seguinte forma: uma protease a 4.000 PU/kg de ração; uma fitase a 500 FTU/kg de ração; e Envivo Pro (DFM) a 75.000 UFC/g a 150.000 UFC/g de ração- · Em uma modalidade preferencial, a composição de aditivo de 20 ração compreende enzima suficiente e DFMS para administrar a ração da seguinte forma: uma protease a 2.000 PU/kg de ração: uma fitase a 500 FTU/kg de ração; e Envivo Pro (DFM) a 37.500 UFC/g a 75.000 UFC/g de ração.
25 Combinação com outros componentes O DFM e a(s) enzima(s) para uso na presente invenção podem ser usados em combinação com outros componentes, Desta forma, a pre- sente invenção também se refere a combinações. O DFM em combinação com uma protease e fitase pode ser chamado na presente invenção de "a 30 composição de aditivo de ração da presente invenção". A combinação da presente invenção compreende a composi- ção de aditivo de ração da presente invenção (ou um ou mais dos seus
.4 k, 'Ü » '4 48/78 ! ' ' constituintes) e um outro componente que é adequado para consumo animal e é capaz de fornecer um beneficio médico ou fisiológico ao consumidor. ,e Em uma modalidade, de preferência, o "outro componente" não é uma enzima adicional ou um DFM adicional.
. " 5 Os componentes podem ser prebióticos. Os prebióticos são ti- picamente carboidrato não digestível (oligo- ou polissacarídeos) ou um álco- ol de açúcar que não é degradado ou absorvido no trato digestivo superior. Os prebióticos conhecidos usados em produtos comerciais e úteis de acordo com a presente invenção incluem inulina (fruto-oligossacarideo, ou FOS) e 10 transgalacto-oligossacarideos (GOS ou TOS). Os prebióticos adequados in- cluem palatinoseoligossacarídeo, oligossacarídeo de soja, alginato, xantana, 3 , " pectina, goma de alfarrobeira (LBG), inulina, goma guar, galacto- . m « oligossacarideo (GOS), fruto-oligossacarídeo (FOS), amido não degradável, = s lactosacarose, lactulose, lactitol, maltitol, maltodextrina, polidextrose (isto é, - m 15 Litesse®), lactitol, Iactosacarose, oligossacarideos de soja, palatinose, iso- maltooligossacarídeos, gluco-oligossacarÍdeos e xilo-oligossacarÍdeos, fra- gmentos de pectina, fibras dietéticas, manana-oligossacarídeos. As fibras dietéticas podem incluir polissacarideos não amido, . como arabinoxilanos, celulose e muitos outros componentes vegetais, como 20 dextrinas resistentes, inulina, lignina, ceras, qu itinas, pectinas, beta-glucanos e ohgossacarídeos. Em uma modalidade, a presente invenção se refere à combi- nação da composição de aditivo de ração de acordo com a presente inven- ção (ou um ou mais dos seus constituintes) com um prebiótico. Em uma ou- 25 tra modalidade, a presente invenção refere-se a uma composição de aditivo de ração que compreende (ou consiste essencialmente em ou consiste em) um DFM em combinação com uma xilanase, uma protease e um prebiótico. O prebiótico pode ser administrado simultaneamente com (por exemplo, em mistura junto com ou liberado simultaneamente pela mesma 30 via ou por vias diferentes) ou sequencialmente à (por exemplo, pela mesma via ou vias diferentes) composição de aditivo de ração (ou seus constituin- tes) de acordo com a presente invenção.
R «
4.
W
È 0 49/78 « W 'Outros componentes das combinações da presente invenção incluem polidextrose, como Litesse®, e/ou uma maltodextrina e/ou lactitol. $£ -X . 4 Estes outros componentes podem ser adicionados, opcionalmente, à com- posição de aditivo de ração para auxiliar o processo de secagem e ajudar a " 5 sobrevivência do DFM. Exemplos adicionais de outros componentes adequados inclu- em um ou mais de: espessantes, agentes gelificantes, emulsificantes, agluti- nantes, modificadores de cristal, adoçantes (incluindo adoçantes artificiais), modificadores de reologia, estabilizadores, antioxidantes, corantes, enzimas, 10 carreadores, veículos, excipientes, diluentes, agentes lubrificantes, agentes saborizantes, matéria de tingimento, agentes de suspensão, desintegrado- &
W res, aglutinantes de granulação etc. Estes outros componentes podem ser naturais. Estes outros componentes podem ser preparados pelo uso de téc- nicas químicas e/ou enzimáticas. á 15 Em uma modalidade, o DFM e/ou as enzimas podem ser en- capsulados. Em uma modalidade, a composição de aditivo de ração e/ou DFM e/ou enzimas é/São formulada(s) como um pó seco ou grânulo, con- forme descrito em WO2007/044968 (chamado de grânulos TPT) - referência aqui incorporada, a título de referência. 20 Em uma modalidade preferencial, o DFM e/ou as enzimas para uso na presente invenção podem ser usados em combinação com um ou mais lipídios. Por exemplo, o DFM e/ou as enzimas para uso na presente in- venção podem ser usados em combinação com uma ou mais micelas de li- 25 pÍdio. A micela de lipidio pode ser uma micela de lipídio simples ou uma mi- cela de lipidio complexa- A micela de iipídio pode ser um agregado de moléculas orien- tadas de substâncias anfipáticas, como um lipidio e/ou um óleo. Para uso na presente invenção, o termo "agente espessante ou 30 gelificante" se refere a um produto que evita a separação por reduzir ou im- pedir o movimento das particulas, gotículas de Iíquidos imisciveis, ar ou sóli- dos insolúveis. O espessamento ocorre quando molécutas hidratadas indivi-
í Q b " 4 50/78 ·' duais causam um aumento na viscosidade, reduzindo a velocidade da sepa- raç'ão. A gelificação ocorre quando as moléculas hidratadas se Iigam para
0. G" formar uma rede tridimensional que aprisiona as particulas, assim imobili- - zando-as. " 5 O termo "estabilizador" como usado aqui, é definido como um ingrediente ou combinação de ingredientes que impede que um produto (por exemplo, um produto de ração) mude com o tempo. O termo "emulsificante", como usado aqui, refere-se a um in- grediente (por exemplo, um ingrediente de ração) que evita a separação das 10 emulsões. As emulsões são duas substâncias imiscíveis, uma presente sob a forma de gotícula, contida dentro da outra. As emulsões podem consistir .&
W em óleo em água, onde a gotícula ou fase dispersa é óIeo e a fase continua
B "- 6 é água; ou água em óleo, onde a água se torna a fase dispersa e a fase con- : tinua é óleo. Espumas, que são gás-em-líquido, e suspensões, que são sóli- ".
O 15 do-em-liguido, também podem ser estabilizadas através do uso de emulsifi- cantes. Para uso na presente invenção, o termo "aglutinante" se refere a um ingrediente (por exemplo, um ingrediente de ração) que liga o'produto junto através de uma reação física ou química. Durante a "gelificação", por 20 exemplo, a água é absorvida, fornecendo um efeito de ligação. Entretanto, aglutinantes podem absorver outros Ilquidos, como óleos, os mantendo den- tro do produto. No contexto da presente invenção, os aglutinantes seriam tipicamente usados em produtos sólidos ou com baixa umidade, por exem- plo, produtos de assamento: bolos, rosquinhas, pão e outros. 25 "Carreadores" ou "veículos" significam materiais adequados pa- ra administração do DFM e/ou enzimas e incluem quaisquer destes materiais conhecidos na técnica como, por exemplo, qualquer líquido, gel, solvente, diluente líquido, solubilizadores, ou similares, que seja não tóxico e que não interaja com nenhum componente da composição de uma forma prejudicial. 30 A presente invenção fornece um método para preparar uma composição de aditivo de ração que compreende misturar um DFM, uma fi- tase e uma protease com pelo menos um veículo fisiologicamente aceitável t qy q
M )' 51/78 0 : selecionado a partir de ao menos um dentre maltodextrina, calcário (carbo- nato de cálcio), ciclodextrina, trigo ou um componente de trigo, sacarose, § , amido, Na2SO4, talco, PVA, sorbitol, benzoato, sorbiato, glicerol, sacarose, propileno glicol, 1,3-propano diol, glicose, parabenos, cloreto de sódio, citra- ' 5 to, nitrato, fosfato, cálcio, metabissulfito, formiato e misturas dos mesmos- Exemplos de excipientes incluem um ou mais de: celulose mi- crocristalina e outras celuloses, lactose, citrato de sódio, carbonato de cálcio, fosfato de cálcio dibásico, glicina, amido, açúcar de leite e polietileno glicóis com alto peso molecular.
10 Exemplos de desintegradores incluem um ou mais de: amido (de preferência amido de milho, batata ou tapioca), glicolato de amido de só- = " dio, croscarmelose sódica e certos silicatos complexos. 'T » wr Exemplos de aglutinantes de granulação incluem um ou mais
E e de: poiivinil pirrolidona, hidróxi-propil-metil celulose (HPMC), h idróxi-propil ® " 15 celulose (HPC), sacarose, maltose, gelatina e acácia. Exemplos de agentes lubrificantes incluem um ou mais de: es- tearato de magnésio, ácido esteárico, beenato de glicerila e talco.
Exemplos de diluentes incluem um ou mais de: água, etanol, propileno glicol e glicerina, e combinações dos mesmos.
20 Os outros componentes podem ser usados simultaneamente (por exemplo, quando eles estão em mistura juntos ou até mesmo quando eles são liberados por diferentes vias) ou sequencialmente (por exemplo, eles podem ser liberados por diferentes vias). De preferência, quando a composição de aditivo de ração da 25 presente invenção é misturada com outro(s) componente(s), o DFM perma- nece viável.
Em uma modalidade, de preferência, a composição de aditivo de ração de acordo com a presente invenção não compreende cromo ou cromo orgânico. 30 Em uma modalidade, de preferência, o aditivo de ração de acordo com a presente invenção"não contém glucanase. Em uma modalidade, de preferência, o aditivo de ração de
P í: ¶ b I" 52/78 q 8" acordo com a presente invenção não contém ácido ascórbico. Concentrados ?.
., Os DFMS para uso na presente invenção podem estar sob a forma de concentrados. Tipicamente, estes concentrados compreendem "" 5 uma concentração substancialmente alta de um DFM. As composições de aditivo de ração de acordo com a presente invenção podem ter um teor de células viáveis (unidades de formação de co- lônia, UFCS) que está na faixa de pelo menos 10' UFC/g (adequadamente, incluindo pelo menos 105 UFC/g, como pelo menos 106 UFC/g, por exemplo, -10 pelo menos 10' UFC/g, pelo menos 108 UFClg) a cerca de 10'° UFC/g (ou mesmo cerca de 10" UFC/g ou em relação a 10" UFC/g).
W ~ Quando o DFM está sob a forma .de um concentrado, as com- b .
X - , posições de aditivo de ração de acordo com a presente mvenção podem ter : um teor de células viáveis na faixa de pelo menos 109 UFC/g a cerca de 101'
S 15 UFC/g, de preferência ao menos 10'° UFC/g a cerca de 10" UFC/g. PÓs, grânulos e composições líquidas sob a forma de concen- trados podem ser diluídas em água ou ressuspensas em água ou outros di- luentes adequados, por exemplo, um meio de crescimento adequado como leite ou óleos minerais ou vegetais, para fornecer composições prontas para 20 uso. O DFM ou a composição de aditivo de ração da presente in- venção ou as combinações da presente invenção sob a forma de concentra- dos podem ser preparadas de acordo com métodos conhecidos na técnica.
Em um aspecto da presente invenção, as enzimas ou a ração é 25 coIocada em contato com uma composição em uma forma concentrada. As composições da presente invenção podem ser secadas por atomização ou secas por congelamento com o uso de métodos conhecidos na técnica. Os processos tipicos para fazer partículas usando um processo 30 de secagem por atomização envolvem um material sólido que é dissolvido em um solvente adequado (por exemplo, uma cultura de um DFM em um meio de fermentação). Alternativamente, o material pode ser suspenso ou
"4 i q.
V
U 53/78 g a & emulsionado em um não solvente para formar uma suspensão ou emulsão. Outros ingredientes (conforme discutido acima) ou componentes, como ? 4 agentes microbicidas, agentes estabilizantes, corantes e agentes que auxili- am o processo de secagem podem, opcionalmente, ser adicionados neste ' 5 estágio. A solução é então a'tomizada para formar uma névoa fina de goticulas. As gotículas entram imediatamente em uma câmara de secagem onde elas entram em contato com um gás de secagem. O solvente é evapo- rado das gotículas entro do gás de secagem para solificar as gotículas, for- 10 mando assim, partículas. As partículas são, então, separadas do gás de se- cagem e coletadas.
W ~
U lndividuo
B W O termo "indivíduo", como usado aqui, significa um animal que
E 0 ¥ será ou foi administrado com uma composição de aditivo de ração de acordo « 15 com a presente invenção ou uma ração que compreende a dita composição de aditivo de ração de acordo com a presente invenção. O termo "individuo", como usado aqui, significa um animal. De preferência, o individuo é um mamífero, pássaro, peixe ou crustáceo que in- clui, por exemplo, gado ou um animal "domesticado (por exemplo, um animal 20 de estimação). Em uma modalidade, o "individuo" é gado. O termo "gado", como usado aqui, refere-se a qualquer animal de criação- De preferência, gado é um ou mais de vacas ou touros (incluin- do, bezerros), aves domésticas, porcos (incluindo, leitões), aves domésticas 25 (incluindo frangos de corte, galinhas e perus), aves, peixe (incluindo, peixe de água doce, como salmão, bacalhau, truta e carpa, por exemplo, carpa chinesa, e peixes marinhos, como perca do mar), crustáceos (como cama- rões, moluscos e vieiras), cavalos (incluindo, cavalos de corrida), ovelha (in- cluindo, cordeiros).' 30 Em uma modalidade, o termo gado e/ou aves domésticas e/ou galinhas não inclui aves poedeiras. Em uma outra modalidade, o "individuo" é um animal domesti-
k . q
G ^% âè' + 54/78 -7 ' cado ou animal de estimação ou um animal mantido em um'zoológico. O termo "animal domesticado ou animal de estimação ou ani- . yr , mal mantido em um zoológico" como usado aqui, refere-se a qualquer ani- mal relevante que inclui caninos (por exemplo, cães), felinos (por exemplo, ' 5 gatos), roedores (por exemplo, cobaias, ratos, camundongos), aves, peixe (incluindo, peixe de água doce e peixes marinhos), e cavalos. Em uma modalidade, o indivíduo pode ser estimulado por um patógeno entérico. A titulo de exemplo, um individuo pode ter um ou mais patóge- lO nos entéricos presentes no seu trato gastrointestinal ou trato digestivo. Por exemplo, um indivíduo pode ter um ou mais patógenos entéricos no seu trato
F g , gastrointestinal ou trato digestivo em um nivel que: " i) resulte em perda de desempenho do animal e/ou '- ^-
M b > - ii) esteja em níveis clinicamente relevantes; ou ' 15 iii) esteja em níveis subclinicos. O patógeno entérico pode ser C/ostridium perfringens, por exemplo. Desempenho Como usado aqui, o "desempenho do animal" pode ser deter- " 20 minado pela eficiência alimentar e/ou ganho de peso do animal e/ou pela ra- zão de conversão alimentar e/ou pela digestibilidade de um nutriente em uma ração (por exemplo, digestibilidade de aminoácidos) e/ou energia diges- tível ou energia metabolizável em uma ração e/ou pela retenção de nitrogê- nio e/ou pela capacidade dos animais em evitarem os éfeitos negativos da 25 enterite necrótica e/ou pela resposta imune do indivíduo. De preferência o "desempenho do animal" é determinado pela eficiência alimentar e/ou ganho de peso do animal e/ou pela razão de con- versão alimentar- Por "desempenho do animal aprimorado" entende-se que há 30 eficiência alimentar aumentada, e/ou ganho de peso aumentado e/ou razão de conversão alimentar reduzida e/ou digestibilidade de nutrientes ou ener- gia aprimorada em uma ração e/ou pela retenção de nitrogênio aprimorada
· e/ou pela capacidade aprimorada de evitar os efeitos negativos da enterite necrótica e/ou por uma resposta imune aprimorada no indivíduo resultante .G ; m do uso da composição de aditivo de ração da presente invenção na ração em comparação à ração que não compreende a dita composição de aditivo " 5 de ração. De preferência, por "desempenho do animal aprimorado" en- tende-se que há eficiência alimentar aumentada e/ou ganho de peso aumen- tado e/ou razão de conversão alimentar reduzida. " Como usado aqui, o termo "eficiência alimentar" se refere à 10 quantidade de ganho de peso em um animal que ocorre quando o animal é alimentado à vontade ou uma quantidade especificada de alimento durante *- d um periodo de tempo. «
P . Por "eficiência alimentar aumentada" entende-se que o uso de
W m E uma composição de aditivo de ração de acordo com a presente invenção na .
15 ração resulta em um ganho de peso aumentado por unidade de ingesta de ração em comparação com um animal alimentado sem a dita composição de , aditivo de ração. Razão de conversão alimentar (FCR) Como usado aqui, o termo "razão de conversão alimentar" se 20 refere à quantidade de ração dada a um animal para aumentar o peso do animal por uma quantidade especificada. Uma razão de conversão alimentar aprimorada significa uma - razão de conversão alimentar menor. Por "menor razão de conversão alimentar" ou "razão de con- 25 versão alimentar aprimorada" entende-se que o uso de uma composição de aditivo de ração em uma ração resulta que uma quantidade menor de ração precisa ser dada a um animal para aumentar o peso do animal em uma quantidade especificada em comparação à quantidade de ração necessária para aumentar o peso do animal na mesma quantidade, quando a ração não 30 compreende a dita composição de aditivo de ração. Diqestibilidade de nutrientes A digestibilidade de nutrientes, como usado aqui, significa a q br 2 "' 4 56/78 ' fração de um nutriente que desaparece do trato gastrointestinal ou um seg- mento especificado do trato gastrointestinal, por exemplo, o intestino delga- s è" do. A digestibilidade de nutrientes pode ser medida como a diferença entre o que é administrado ao indivíduo e o que sai nas fezes do individuo, ou entre '" ' 5 o que é administrado ao indivíduo e o que permanece na digestão em um segmento especificado do trato gastrointestinal, por exemplo, o Íleo. A digestibilidade de nutrientes, como usado aqui, pode ser me- dida pela diferença entre a ingestão de um nutriente e o nutriente excretado atravês da coleção total de excrementos durante um período de tempo; ou 10 com o uso de um marcador de inerte que não é absoNido pelo animal, e permite ao pesquisador calcular a quantidade do nutriente que desapareceu *'
W em todo o trato gastrointestinal ou um segmento do trato gastrointestinal. Tal ± ' f marcador inerte pode ser dióxido de titânio, óxido crômico ou cinzas insolú- "P # veis em ácido. A digestibilidade pode ser expressa como uma porcentagem 15 do nutriente na ração, ou como unidades de massa de nutriente digestível por unidades de massa de nutriente na ração. A digestibilidade de nutrientes, como usado aqui, abrange di- gestibilidade de amido, digestibilidade de gordura, digestibilidade de proteína e digestibilidade de aminoácidos. 20 A digestibilidade de energia, como usado aqui, significa a ener-" gia bruta da ração consumida menos a energia bruta das fezes ou a energia bruta da ração consumida menos a energia bruta do material de digestão remanescente em um segmento especificado do trato gastrointestinal do animal, por exemplo, o Íleo. Energia metabolizável, como usado aqui, refere- 25 se à energia metabolizável aparente e significa a energia bruta da ração consumida menos a energia bruta contida nas fezes, urina, e produtos gaso- sos da digestão. A digestibilidade de energia e a energia metabolizável po- dem ser medidas como a diferença entre a ingestão de energia bruta e a energia bruta excretada nas fezes ou no material de digestão presente em 30 um segmento especificado do trato gastrointestinal usando os mesmos mé- todos para medir a digestibilidade de nutrientes, com correções adequadas para a excreção de nitrogênio para calcular a energia metabolizável da ra-
+
A % I' 57/78 4 · ção. Retenção de nitrogênio a i" Retenção de nitrogênio, como usado aqui, significa a capaci- dade de um indivíduo"reter nitrogênio da dieta como massa corporal. Um ' 5 equilíbrio de nitrogênio negativo ocorre quando a excreção de nitrogênio ul- trapassa a ingestão diária e é frequentemente vista quando o músculo está sendo perdido. Um equilíbrio de nitrogênio positivo está frequentemente as- sociado com crescimento muscular, particularmente, em an imais em cresci- mento.
10 A retenção-de nitrogênio pode ser medida como a diferença en- tre a ingestão de nitrogênio e o nitrogênio excretado através da coleta total
Q e de excrementos e urina durante um periodo de tempo. Entende-se que o ni- - ' trogênio excretado inclui proteina não digerida da ração, secreççies proteiná- .- w ; ceas endógenas, proteina microbiana, e nitrogênio urinário. " b 15 Sobrevivência . O termo sobrevivência, como usado aqui, significa o número de indivíduos que permanecem vivos. O termo "sobrevivência aprimorada" pode ser uma outra forma de dizer "mortalidade reduzida". * Rendimento de carcaça e rendimento da carne · - 20 O termo rendimento da carcaça, como usado aqui, significa a quantidade de carcaça como uma proporção do peso corporal vivo, após um processo comercial Olj experimental de abate. O termo carcaça significa o corpo de um animal que foi abatido por aiimento, com a cabeça, tripas, parte dos membros e penas ou pele removidos. O termo rendimento da carne, 25 como usado aqui, significa a quantidade de carne comestivel como uma r proporção do peso corporal vivo, ou a quantidade de uma carnè especificada cortada como uma proporção do peso corporal vivo. 'í Ganho de peso A presente invenção fornece, adicionalmente, um método para 30 aumentar o ganho de peso em um indivíduo, por exemplo, aves domésticas ou suínos, que compreende dar ao dito individuo uma ração que compreen- , de um composição de aditivo de ração de acordo com a presente invenção.
G ¶ y ¥
S 58/78 » W Um "ganho de peso aumentado" se refere a um animal que tem peso corporal aumentado ao ser alirnentado com a ração que compreende a e 4- uma composição de aditivo de ração em comparação a um animal que é alimentado com uma ração sem a dita composição de aditivo de ração. d 5 Enterite necrótica Enterite necrótica é uma enterotoxemia aguda ou crônica vista em galinhas, perus e patos em todo o mundo, causada pelo C/ostn'dium per- fringens. A enterite necrótica é frequentemente caracterizada por uma enteri- te fibrino-necrótica, geralmente, do intestino delgado médio. A mortalidade 10 pode ser de 5 a 50%, geralmente, em torno de 1O°/o. A infecção ocorre por transmissão fecal-oral. Os esporos do organismo causador são altamente S' resistentes. Os fatores predisponentes incluem cocCidiose/coccidiase, dieta » e W (alto teor de proteínas), em patos, possivelmente esforços pesados, dietas *
K
W » de alta viscosidade (frequentemente associadas com grandes inclusões de j 15 centeio e trigo na dieta), ração e/ou água contaminada, outras doenças debi- litantes. A presente invenção se refere ao aumento da resistência do individuo à enterite necrótica. Em outras palavras, a presente invenção se refere ao impedimento ou redução do efeito negativo da enterite necrótica.
20 O termo "resistência a", como usado aqui, pode abranger o termo "tolerância de". Portanto, em uma modalidade, o individuo pode não ser resistente à enterite necrótica, mas o indivíduo pode ser capaz de tolerar a enterite necrótica, isto é, sem os efeitos negativos sobre o desempenho do indivíduo. 25 Em uma modalidade, a presente invenção se refere a uma composição de aditivo de ração de acordo com a presente invenção para tratar ou prevenir enterite necrótica em um indivíduo. Tipicamente, o indiví- duo será um que foi ou será estimulado com as espécies C/ostridium perfrin- gens e/ou Eimeria. Tal estímulo pode vir do ambiente ou da aplicação de mi- 30 cro-organismos vivos na ração ou água potável, por exemplo, quando vaci- nas de coccÍdeos vivos são usadas. Em uma outra modalidade, a presente invenção se refere a
¶ \L· ± I" 59/78 * : uma composição de aditivo de ração para prevenção e/ou tratamento de coccidiose em um indivíduo. ; ,$ . , A presente invenção ainda fornece um método para prevenir e/ou tratar enterite necrótica e/ou coccidiose sendo que uma quantidade efi- ' 5 caz de uma composição de aditivo de ração de acordo com a presente in- venção é administrada a um indivíduo. , Resposta imune Resposta imune, como.usado aqui, significa uma das muitas formas pelas quais os DFMs modulam o sistema imune de animais, incluindo 10 aumento na produção de anticorpos,, regulação positiva da imunidade medi- ada por células, regulação positiva das citoquinas pró-inflamatórias, e au- ' mento da sinalização do receptor do tipo toll. Entende-se que a estimulação » j· imune do trato gastrointestinal por DFMS pode ser vantajosa para proteger o u ¶ hospedeiro contra doença, e que a supressão imune do trato gastrointestinal ' 15 pode ser vantajosa para o hospedeiro porque menos nutrientes e energia são usados para sustentar a função imune. De preferência, a resposta imune é uma resposta imune celu- lar. - De preferência, a resposta imune é medida por observar os 20 marcadores imunes.
Bactérias patoqênicas L O termo bactérias patogênicas, como usado aqui, significa, por exemplo, espécies de clostrídios toxigênicas, por exemplo, C/ostridium per- fringens e/ou E. co/i e/ou Salmone/la spp e/ou Campy/obacter spp. Em uma 25 modalidade, as bactérias patogênicas podem ser espécies de E. co/i pato- ' ! gênicas para aves. + , A presente invenção pode- reduzir as populações de bactérias patogênicas no trato gastrointestinal de um'indivíduo.
Excreção de nutrientes 30 Em uma modalidade, a presente invenção se refere à redução da excreção de nutrientes no esterco. lsto tem efeitos positivos sobre a re- dução dos riscos ambientais. Por exemplo, em uma modaíidade preferencial,
p' 7d "_ L b- $ t7
H $ 60/78 .
£ a presente invenção se refere à redução do teor de nitrogênio e/ou fósforo no esterco do indivíduo. lsto, portanto, reduz a quantidade de nitrogênio e/ou m T.' , fósforo no ambiente, o que pode ser benéfico. Probióticos " 5 Para algumas aplicações, acredita-se que o DFM na composi- ção da presente invenção possa exercer um efeito de cultura probiótica. Também está dentro do escopo da presente invenção adicionar à composi- ção da presente invenção mais probióticos elou prebióticos. Aqui, um prebiótico é: 10 "um ingrediente alimentar não digestlvel que afeta de maneira benéfica o hospedeiro por estimular seletivamente o crescirnento e/ou a ati 3 ¥ vidade de um ou um número limitado de bactérias benéh'cas".
W . - . O termo "cultura probiótica", como usado aqui, define micro- .
W f organismos vivos (incluindo bactérias ou leveduras, por exemplo) que, por à 15 exemplo, quando ingeridas ou aplicadas localmente em quantidades sufici- entes, afeta de maneira benéfica o organismo hospedeiro, isto é, por conferir um ou mais benefícios de saúde demonstráveis ao organismo hospedeiro. Os probióticos podem otimizar o equillbrio microbiano em uma ou mais su- perfícies mucosas. Por exemplo, a superfície mucosa pode ser o intestino, o 20 trato urinário, o trato respiratório ou a pele. O termo "probiótico", como usado aqui, também abrange micro-organismos vivos que podem estimular as ra- mificações benéficas do sis'tema imune e ao mesmo tempo reduzem as rea- ções inflamatórias em uma superfície mucosa, por exemplo, o trato gastroin- testinal. 25 Apesar de não haver limites inferiores ou superiores para a in- gestão de probióticos, foi sugerido que pelo menos 106-1012, de preferência ao menos 10'-10'°, de preferência, 108-10', UFC como uma dose diária será eficaz para se alcançar os efeitos benéficos para a saúde em um indivíduo.
lsolado 30 Em um aspecto, adequadamente, a enzima ou DFM usado na presente invenção pode estar em uma forma isolada. O termo "isolado" sig- nifica que a enzima ou DFM é pelo menos substancialmente isento de pelo â menos um outro componente com o qual a enzima ou DFM está associado naturalmente na natureza e, conforme encontrado na natureza. A enzima ou
S
Y , DFM da presente invenção pode ser fornecido sob uma forma que é subs- tancialmente isenta de um ou mais contaminantes com os quais a substân-' ' 5 cia poderia estar de outro modo associada. Desta forma, por exemplo, ele pode ser substancialmente isento de um ou mais polipeptideos e/ou molécu- las de ácido nucleico potencialmente contaminantes. Purificado Em um aspecto, de preferência, a enzima e/ou DFM de acordo 10 com a presente invenção está em uma forma purificada- O termo "purificado" significa que a enzima e/ou DFM está presente em um nível alto- A enzima £ e/ou o DFM é desejavelmente o componente predominante presente em
S ' ? uma composição. De preferência, ele está presente a um teor de ao menos ? cerca de 90%, ou ao menos cerca de 95% ou ao menos cerca de 98%, o di- ' 15 to nível sendo determinado com base no peso seco/peso seco com relação à composição total sendo considerada. Contempia-se dentro do escopo da presente invenção que as modalidades da invenção podem ser combinadas de modo que combina- ções de quaisquer dos elementos aqui descritos estejam incluidas dentro do 20 escopo da presente invenção. Em particular, contempla-se dentro do escopo da presente invenção que quaisquer dos efeitos terapêuticos das. bactérias podem ser exibidos concomitantemente, Exemplos Exemplo 1 25 Materiais e Métodos Três mil e seiscentos pintos Cobb machos de um dia de idade são comprados de uma chocadeira comercial. No início do estudo, cinquenta machos são alocados a cada galinheiro de tratamento por blocos. O estudo consistiu nos seguintes tmtamentos (Tabela 1): 30 Tabela 1. Desenho experimental do Exemplo 1.
Tratamento Estímulo |Fitase1 nzima adiciona|2 DFM3 com Clostri-j ,dium perj "' _ringens 1 jNão 500 FTUIKÇJ Nenhum nhum 2 jsim 500 FTU/kg Nenhunj nhum 3 |Sim ,500 FTU/kg Protease ' nhum (5.000 u/kg) im 00 FTU/kg Nenhum Znviva Pro 7,5 X 10' UFC/! im FTU/kg Protease Znviva Pro (5.000 ul 7,5 X 10' UFCA ' , 1 Fitase de E. co/i. - ' 2 Protease de Baci//us subti/is. 6 · 3 Enviva Pro ® é uma combinação das cepas BS2084, LSSAOI e 15AP4 de Baci//us subtilis, fornecida pela Danisco NS. 5 Os pesos das aves por galinheiro foram registrados no inicio do estudo, nos dias 23, 35 e no término (dia 42). O galinheiro era a unidade de medida. As dietas dos frangos de corte foram dadas como farelos (iniciais) ou péletes (de crescimento e terminação). As dietas satisfazem ou superam os padrões NRC (Tabela 2). O misturador foi descartado para evitar conta- lO minação cruzada das dietas. Todas as rações de tratamento foram mistura- das usando um misturador Davis S-20 e peletizadas usando um moinho Ca- Íifornia Pellet Mill (temperatura do pélete frio de 65 a 70 C). As amostras fo- ram coletadas de cada dieta de tratamento do início, meio e fim de cada lote e misturadas juntas para confirmar as atividades enzimáticas e a presença 15 de Enviva Pro na ração- Tabela 2. Composição da dieta experimenta! do Exemplo 1.
lngrediente (°/0) lnicial Crescimento Terminação Milho 53,62 57,87 59,82 DDGS de milho 10,00 10,00 10,00 Farinha de soja 49%CP 26,93 23,97 21,36
Ampro 55 5,00 5,00 5,00 Óleo de soja 2,07 0,91 1,74 Lisina 0,24 0,24 0,24 DL-metionina 0,21 0,19 0,18 L-treonina 0,01 0,01 0,01 Sal 0,30 0,34 0,35 Calcário 1,04 1,07 0,94 Fosfato"dicálcico 0,26 0,11 0,02 Pré-mistura de vitaminas e minerais- 0,33 0,33 0,33 traço ComEosi£ão nutricional calculada _f/o «' = CP 22,60 21,50 20,39 ' , Energia, kcal/kg 3060 3025 3100 ' ' Lisina digestível 1,36 1,26 1,21 r yr' Metionina digestível 0,58 0,61 0,53 Treonina digestível 0,83 0,83 0,80 As aves recebem ração à vontade adequada para o tratamento do dia 0 a 42. As enzimas e Enviva Pro são fornecidos pela Danisco nas misturas e níveis adequados para todos os tratamentos experimentais. To- das as dietas continham 500 FTU de fitase de E. coli no plano de fundo. Os 5 galinheiros são dispostos dentro da instalação para evitar o contato direto de modo a evitar contaminação. Uma alteração da dieta inicial para a de cres- cimento ocorreu no dia 21. A dieta de crescimento é substituída pela dieta de terminação no dia 35. Em cada alteração da ração, os alimentadores são removidos dos galinheiros por bloco, pesados de novo, esvaziados e cheios
F 10 novamente com a dieta de tratamento adequada. No dia final do estudo, a ração é pesada- Os galinheiros são verificados diariamente para mortalida- de. Quando uma ave é selecionada para abate ou encontrada morta, a data e o peso da remoção (kg) são registrados. Uma necrópsia grosseira é feita em todas as aves mortas ou selecionadas para abate para determinar o se- 15 xo e a provável causa da morte. Sinais de enterite necrótica são observados.
Todos os galinheiros tinham aproximadamente 10,2 cm
C T4r h &.
9 64/78 .
* (4 polegadas) de leito construido com um revestimento de serragem de pi- nheiro fresco. g Q' Todas as aves são vacinadas por pulverização antes de serem colocadas em galinheiros com uma vacina de coccidiose comercial (Coc- " 5 civac-B). Nos dias 18, 19, e 20, todas as aves, exceto o tratamento 1, são administradas com um caldo de cultura de C. perfringens. Um isolado de campo de C. perfringens conhecido por causar NE e que se origina de uma operação com frangos de corte comercial é utilizado como o organismo es- timulador. O inóculo fresco é usado todo dia. Os níveis de titulação sâo de 10 aproximadamente 1,0 X 10'"9, Cada galinheiro recebe a mesma quantidade de inóculo. O inóculo é administrado por misturá-lo na ração encontrada na ¶ base do tubo alimentador. No dia 21, cinco aves de cada galinheiro são se- & lecionadas, eutanizadas, pesadas em grupo, e examinadas para o grau de 3
G & presença de lesões de enterite necrótica. A pontuação teve por base uma ' 15 pontuação de 0 a 3, com 0 sendo normal e 3 sendo o mais grave (0 = ne- nhum, 1 = leve, 2 = moderado, 3 = acentuado/grave; Hofacre et al., 2003 J. Appl. Poult. Res. 12:60-64). Nenhuma terapia farmacológica concomitante é usada durante o estudo. As médias foram separadas usando testes de t pareados. As 20 diferenças significativas são consideradas a P<O,05. Os galinheiros são usados como a unidade experimental, Resultados A Figura 1 mostra os escores da lesão de enterite necrótica de frangos de corte em um modelo de estímulo de enterite necrótica com base 25 em um sistema de pontuações de 0 a 3. SEM agrupado = 0,15. Conforme esperado, o tratamento de controle estimulado au- mentou os escores da lesão em comparação ao tratamento de controle não estimulado. A adição de DFMS com uma combinação de uma protease e uma fitase reduziu surpreendentemente os escores da lesão em compara- 30 ção a todos os outros tratamentos. A Figura 2 mostra a porcentagem de mortalidade relacionada às Íesões de enterite necrótica (NE) de 20 a 42 dias de idade.
?€ $ I" ' . 65/78 9 e O tratamento de controle estimulado aumentou a mortalidade relacionada à NE em comparação ao tratamento de controle não estimulado. 8 ." A adição de DFMS reduziu a mortalidade por NE em comparação ao controle estimulado, com e sem protease + fitase.
" 5 A Figura 3 mostra o ganho de peso corporal de frangos de cor- te de 0 a 23 dias em um modelo de estímuio de enterite necrótica. Desvio padrão da média (SEM) agrupado = 28,6. A Figura 3 mostra que uma combinação do DFM (Enviva Pro®) com uma combinação de uma protease e uma fitase melhora significativa- lO mente o ganho de peso corporal (ganho de PC) em frangos de corte estimu- lados com C/ostridium perfringens em comparação ao controle estimulado. ' Os dados mostram que o DFM em combinação com a protease e a fitase ' aprimorou surpreendentemente o ganho de PC total para o nível do controle
S g não estimulado + fitase.
W " 15 A Figura 4 mostra o ganho de peso corporal de frangos de cor- te de 0 a 12 dias em um modelo de estímulo de enterite necrótica Desvio padrão da média agrupado (SEM) = 4,86.
A Figura 5 mostra a razão de conversão alimentar em 0 a 12 dias de frangos de corte em um modelo de estímulo de enterite necrótica.
20 Desvio padrão da média (SEM) agrupado = 0,026. A combinação de Enviva Pro (DFM) com uma protease e uma fitase melhorou significativamente (reduziu) a FCR (g de ganho de PC / g de ingesta de ração) de frangos de corte de 0 a 12 dias em comparação ao con- trole estimulado, e às enzimas sozinhas e aos outros tratamentos.
25 A Figura 6 mostra a razão de conversão alimentar (0 a 23 d) de frangos de corte em um modelo de estimulo de enterite necrótica. Desvio padrão da média agrupado = 0,022.
A combinação de Enviva Pro (DFM) com uma protease e uma fitase melhorou significativamente (reduziu) a FCR (g de ganho de PC / g de 30 ingesta de ração) de frangos de corte de 0 a 23 dias em comparação ao con- trole estimulado, e às enzimas sozinhas e aos outros tratamentos.
Exemplo 2
· Materiais e Métodos Um teste de digestibilidade com frangos de corte é conduzido ? , para determinar os efeitos da protease e dos tratamentos com DFMS além da fitase sobre a utilização de nutrientes. As gaiolas são alojadas em salas " 5 com ambiente controlado. As aves recebem 20 horas de iluminação fluores- cente e são deixadas com livre acesso às dietas e à água. No dia 1, uma va- cina viva para coccidiose de frangos de corte é dada a todos os pintos por via oral. O estudo consiste nos seguintes tratamentos (Tabela 3): Tabela 3. Desenho experimental do ExemR|.o 2.
Tratamento Fitase1 Protease DFM' 1 500 FTU/kg Nenhum Nenhum 2 500 FTU/kg Protease 1' (5.000 u/k Nenhum 3 500 FTU/kg Protease 1' (5.000 u/k Nenhum 4 500 FTU/kg Protease 2' (15.000 ul Nenhum 5 500 FTU/kg Nenhum Enviva Pro (1,5x105UF 6 500 FTU/kg Protease 1' (5.000 u/kg) Enviva Pro (1,5X10'UFC/! 7 500 FTU/kg Protease 1' (5.000 u/kg) Enviva Pro (1,5X10'UFC/! 8 500 FTU/kg Protease 2' (15.000 u/kg) Enviva Pro (1,5X10'UFC/! 10 1 Fitase de E. coh' fomecida pela Danisco NS. 2 Enviva Pro® é uma combinação das cepas BS2084, LSSAOI e 15AP4 de Bacil/us subti/is, fornecida pela Danisco NS. 3 Protease de Baci//us subti/is fornecida pela Danisco NS. 4 Protease de Baci//us /ichen/formis.
15 512 aves são pesadas individualmente e distribuídas, com ba- se no peso corporal, a 64 gaiolas (8 avesl gaiola). Os 8 tratamentos dietéti- cos são então atribuídos aleatoriamente a 8 gaiolas cada. As aves recebem à vontade a ração inicial adequada para o tratamento de 0 a 21 dias. As en- zimas e Enviva Pro são fornecidos pela Danisco nas misturas e níveis ade-
" quados para todos os tratamentos experimentais. Todas as dietas contêm 500 FTU de fitase de E. coli no plano de fundo. Os galinheiros são dispostos ? , dentro da instalação para evitar o contato direto de modo a evitar contami- nação. As aves são alimentadas com as dietas iniciais (Tabela 4) em forma ' 5 de purê durante todo o experimento. , Tafela 4. Composição da dieta experimental do Exemplo 2.
lngrediente (°/0) lnicial Milho 50,11 DDGS de milho 10,00 Farinha de soja 48%cp 28,83 Farinha de canola 5,00 2 Mistura de gordura An/Veg 2,16 ' . L-lisina HCI 0,33 ' DL-metionina 0,28
X
LE L-treonina 0,12 Marcador inerte (TiO2) 0,30 Sal 0,33 Calcário 1,09 Fosfato dicálcico 1,15 Vitaminas e microminerais para aves domésticas 0,30 ComEosi£ão nutricional calculada _{°/0 CP 23,00 ME, kcal/kg 2950 Cálcio . 0,85 Fósforo disponivel · 0,38 Sódio 0,18 Lisina digestível 1,21 Metionina digestível 0,62 TSAA digestível 0,86 , Treo,nina digestível , m , 0,76 No dia 21, 8 aves por gaiola são eutanizadas por deslocamento cervica! e os conteúdos do Íleo inferior são expressos por lavagem suave e' q
H ¥b 4 68/78 ? com água destilada Os materiais de digestão das aves dentro de uma gaiola são agrupados, resultando em 8 amostras por tratamento de dieta. As amos- % e tras do material de digestão são congeladas imediatamente após a coleta, liofilizadas e processadas. As amostras do material de digestão e as dietas "' 5 são analisadas quanto a Ti, DM, GE, amido, gordura, N e aminoácidos, ex- cIuindo triptofano e polissacarídeos não amídicos (PNAs) solúveis e insolú- veis, de acordo com procedimentos padrão. O cálculo dos coeficientes de digestibilidade do Íleo é feito conforme relatado por Ravindran et al. (2005), com base na concentração de Ti indigestlvel. 10 As amostras representativas dos excrementos por gaiola são coIetadas ao longo de quatro dias consecutivos (do dia 17 ao 20) para a de- m » terminação da energia metabolizável aparente corrigida para o nitrogênio # W (AMEn) e da retenção de nitrogênio, com base na concentração de Ti nas a
S mc amostras de ração e excrementos. As coletas diárias dos excrementos são ' 15 agrupadas no interior de uma gaiola, misturadas em um misturador e suba- , mostradas. Cada subamostra foi liofilizada, triturada para passar através de uma peneira de 0,5 mm e armazenada em recipientes plásticos herméticos ao ar a - 4 C até a análise. As amostras processadas são analisadas para Ti, DM, GE, N, e PNAs solúveis e insolúveis, de acordo com procedimentos pa- 20 drão. As médias são separadas usando testes de t em pares. As di- ferenças significativas são consideradas a P"O,05. As gaiolas são usadas como a unidade experimental. Resultados 25 Os resultados preliminares mostram que a combinação de pro- tease, fitase e DFMS mostra uma maior digestibilidade de energia, N, amino- ácidos, amido, gordura, e/ou PNA.S solúveis e insolúveis do Íleo em compa- ração ao tratamento de controle negativo + fitase e protease + fitase e/ou DFMs + fitase. A combinação de protease e DFMs além da fitase mostra 30 uma maior AME, retenção de nitrogênio, e desaparecimento total do trato de PNAS solúveis e insolúveis em comparação ao tratamento de controle nega- tivo + fitase e protease + fitase e/ou DFMs + fitase. A resposta à dosagem
Yè7: e ^. - I "' 69/78 e .
' da protease a estes parâmetros mostra um maior coeficiente angular nos tra- tamentos contendo DFMS em comparação aos tratamentos sem DFMS. 8 i' Exemplo 3 , Materiais e Métodos ' 5 Um teste de digestibilidade com frangos de corte é conduzido para determinar os efeitos da fitase + protease e dos tratamentos com DFMs sobre a utilização de nutrientes. As gaiolas são alojadas em salas com am- biente controlado. As aves recebem 20 horas de iluminação fluorescente e são deixadas com livre acesso às dietas e à água. No dia 1, uma vacina viva 10 para coccidiose de frangos de corte é dada a todos os pintos em uma câma- ra de aspersão. O estudo consiste nos seguintes tratamentos (Tabela 5): 0 m Tabela 5- Desenho experimental do Exemplo 3.
Í 5 Tratamento Fitase1 protease2 DFM ? f 1 Nenhum Nenhum 0 - 2 500 FTU/kg 5.000 u/kg 3 Nenhum Nenhum Enviva pro3 (1,5 x 105 UFC/g) 4 500 FTU/Kçj 5.000 u/kg Enviva Pro'(1,5 x 10' UFC/g) 5 Nenhum Nenhum Calsporin' (5,0 x 10' UFC/g) 6 500 FTU/kg 5.000 u/kg Calsporin' (5,0 x 10' UFC/g) 7 Nenhum Nenhum Gallipro Tect' (8,0 x 10' UFC/g) 8 50Ó FTU/Kçj 5.000 u/kg Gallipro Tect' (8,0 x 10' UFC/çj) 1 Fitase de E. co/i.
2 Protease de Baci//us subti/is fornecida pela Danisco A/S.
15 3 Enviva Pro ® é uma combinação das cepas BS2084, LSSAOI e 15AP4 de Bacil/us subti/is, fornecida pela Danisco NS. 4 Calsporin é um produto DFM contendo a cepa de Baci//us subti/is C3102.
5 Gallipro Tect é um produto DFM contendo Baci//us /ichen/formis DSM17236.
384 aves são pesadas individua|mente e distribuidas, com ba- 20 se no peso corporal, a 64 gaiolas (6 avesl gaiola). Os 8 tratamentos dietéti- cos são então atribuldos aleatoriamente a 8 gaiolas cada. As aves recebem à vontade a ração inicial adequada para o tratamento de 0 a 21 dias. As en- zimas e Enviva Pro são fornecidos .pela Danisco nas misturas e níveis ade-
¢ $ I" ' 70/78 #
W ¶.
" quados para todos os tratamentos experimentais. Os galinheiros são dispos- tos dentro da instalação para evitar o contato direto de modo a evitar conta- J. minação. As aves foram alimentadas com as dietas iniciais (Tabela 6) em forma de purê durante todo o experimento. ' 5 Tabela 6. Composição da dieta experimental do Exemplo 3.
lngrediente (°/0) · " lnicial- Milho 50,11 DDGS de milho 10,00 Farinha de soja 48%cp 28,83 Farinha de canola 5,00 Mistura de gordura An/Veg 2,16 0 & L-lisina HCl 0,33 ' W
W DL-metionina ' 0,28 ' L-treonina · ' 0,12 ' Marcador inerte (TiO2) ' ' - ' '" ' · 0,30 Sal . - 0,33 Calcário '" 1,09 Fosfato dicálcico 1,15 Vitaminas e microminerais para aves domésticas " 0,30 ComE!osi£ão nutricional calculada (°/0 cp 23,00 ME, kcal/kg 2950 Cálcio " ' " 0,85 Fósforo disponível '' 0,38 Sódio ·0,18 Lisina digestivel 1,21 Metionina digestível ' . 0,62 TSAA digestível - " 0,86 Treonina, digestível " ., 0,76 . No dia 21, 6 aves por gaiola são eutanizadas por asfixia com CO2 e os conteúdos do Íleo inferior são expressos por Iavagem suave com água destilada Os materiais de digestão das aves dentro de uma gaiola são
4' % e
" 'E 71/78 9 :'
" ' agrupados, resultando em 8 amostras por tratamento de dieta.
As amostras do material de digestão são congeladas imediatamente após a coleta, liofili- . zadas e processadas.
As amostras do material de digestão e as dietas são
. analisadas quanto a Ti, DM, GE, amido, gordura, PNAS solúveis e insolúveis, " 5 de acordo com procedimentos padrão.
O cálculo dos coeficientes de digesti- bilidade do Íleo é feito conforme relatado por Ravindran et al. (2005), com base na concentração de Ti indigestível.
A ingesta de ração e a produção total de excrementos são me- didas quantitativamente por gaiola ao longo de quatro dias consecutivos (do 10 dia 17 ao 20) para a determinação da energia metabolizável aparente corri- gida para o nitrogênio (AMEn) e da retenção de nitrogênio.
As coletas diárias a
" dos excrementos são agrupadas no interior de uma gaiola, misturadas em um misturador e subamostradas.
Cada subamostra é liofilizada, triturada pa- ra passar através de uma peneira de 0,5 mm e armazenada em recipientes 15 plásticos herméticos ao ar a - 4 C até a análise.
As amostras processadas são anaiisadas para DM, GE, N, e PNAS solúveis e insolúveis, de acordo com procedimentos padrão.
As médias são separadas usando testes de t em pares.
As di- ferenças significativas são consideradas a P<O,05. As gaiolas são usadas 20 como a unidade experimental.
Resultados Os resultados preliminares indicam que a combinação de pro- tease + fitase e cada um dos DFMS testados mostra uma maior digestibilida- de de energia, N, amido, gordura, e/ou PNAS solúveis e insolúveis do íleo 25 em comparação ao tratamento de controle negativo e protease + fitase e/ou cada um dos DFMS sozinhos.
A combinação de protease + fitase e cada um dos DFMs testados mostrou uma maior AME, retenção de nitrogênio, e de- saparecimento total do trato de PNAS solúveis e insolúveis em comparação ao tratamento de controle negativo e protease + fitase e/ou cada um dos 30 DFMS sozinhos.
Exemplo 4 Materiais e Métodos
»" ·t.
Y
C q 72/78 Amostras de tecido foram retiradas de pintos de corte do teste ¶ b apresentado no Exemplo 1 aos 23 dias de idade. As especificações dos tra-
E € tamentos são apresentadas na Tabela 1. O jejuno, o pâncreas e o fígado fo- ram removidos de 2 aves de cada galinheiro e a mucosa agrupada resultan- " 5 do em oito amostras por tratamento. As amostras foram enxaguadas em so- lução tampão (PBS) imersa em um reagente de armazenamento de tecido (RNAlater) de acordo com o protocolo do fabricante e armazenadas a -80°C. O RNA total foi isoiado de cada amostra de tecido usando um método de ex- tração com fenol-clorofórmio em uma única etapa, conforme descrito por 10 Chomczynski e Saachi (1987; Anal. Biochem. 162:156-9). A concentração do RNA foi determinada mediante a medição da absorbância a 260 nm (Nano- 6 * drop) e a integridade foi monitorada por eletroforese em gel em géis de aga- í rose a 1,2%. Apenas RNA com pureza suficiente e tendo uma razão entre a u G absorção a 260 nm e a 280 nm maior que 1,87 foram considerados para ' 15 uso. , Microarranjos foram fabricados usando oligonucleotídeos com 70 pares de bases (Opereon Biotechnologies Inc) de acordo com o protocolo descrito por Druyan et al. (2008; Poult. Sci. 87:2418-29). O design experi- mental do arranjo foi um design de laço entrelaçado completo, conforme 20 descrito por Garosi et al. (2005: Br. J. Nutr. 93:425-32) em que cada amostra é comparada diretamente com as outras em múltiplos pares, permitindo a todos os tratamentos serem comparados. As amostras foram marcadas de acordo com o método descrito por Druyan et al. (2008; Poult. Sci. 87:2418- 29) em que metade das amostras seria marcada com Cy3 e metade com 25 Cy5, que são corantes fluorescentes de cianina. A hibridização foi executada usando o kit de hibridização de microarranjo Pronto Plus! antes da adição de sondas de cDNA marcadas com Cy3 e Cy5 e as amostras foram cobertas com uma Iamínula de vidro transparente (Lifterslip) e deixadas para hibridi- zar por 16 horas. Os microarranjos foram então digitalizados em um digitaii- 30 zador de microarranjo Scan Array Gx PLUS ajustado para uma energia de Iaser de 65% para adquirir as imagens. O RNA total das amostras individuais foi transcrito de modo re-
::' " · * ' *
W e' 73/78 *
O b . verso para produzir cDNA que foi, então, usado como um molde para as amplificações de qPCR, conforme descrito por Druyan et al- (2008; Poult. -% ¶É Sci. 87:2418-29). Os parâmetros de termociclagem foram otimizados para cada gene e cada gene foi amplificado independentemente em duplicata I' "" 5 dentro de uma única passagem do instrumento. Os arquivos de dados foram gerados a partir das imagens digi- talizadas dos microarranjos, mas extraindo os dados brutos de intensidade para cada lâmina e a combinação de corantes usando o Software ScanAly- ze. Os arquivos de dados de intensidade foram então analisados usando 10 JMP Genomics que inclui uma transformação log2 inicial. A normalização dos dados foi feita usando regressão localmente ponderada e suavização k primeiro dentro do arranjo e através de todos os arranjos. As intensidades de ~ » log2 normalizadas resultantes foram analisadas usando um modelo ANOVA u b W misto. ' 15 As intensidades médias foram comparadas usando um limite de significância baseado na correção de Bongerroni de +0,05 (Hochberg 1998). Para o arranjo completo, incluindo todas as réplicas, uma intensidade média por grade foi calculada para cada gene usando as 3 sondas lado a lado, resultando em um total de quatro médias replicadas, uma de cada gra- 20 de, por gene. Os dados para a razão Ct das amostras em duplicata (Ct.do gene da amostra: Ct do GAPDH da amostra) dependendo do tratamento fo- ram submetidos 'a ANOVA unidirecional. Resultados Os dados de expressão foram coletados usando a plataforma 25 de microarranjo e um "mapa de calor" foi produzido para visualizar os dados para o jejuno (Figura 7) e pâncreas (Figura 8) aos 23 dias de idade. Os ní- veis de expressão relativos de seis genes de interesse foram convertidos em indicações visuais com base na escala vista na Figura 7. Os genes menos expressos são marcados com um sinal de menos (f'-"), e os genes altamente 30 expressos são marcados com um sinal de mais ("+"); enquanto uma maior intensidade cinza mostra uma diferença maior do nível de expressão médio dos tratamentos. Os genes que foram medidos e suas supostas funções,
e W » 4
B m 74/78 ? W conforme visto na Tabela 7..PCR em tempo real foi usado para validar a ex- pressão gênica mostrada no mapa de calor para sucrase-isomaltase (Sl) e
Z = " ácido graxo sintase (FASN) e elas estavam altamente correlacionadas aos dados do arranjo. -S 5 Tabela 7. Função suposta dos genes medidos, , Gene ldentidade Função ACACA Acetil-GoA carboxilase A Biossíntese de ácido graxo GCK GIucoquinase Etapa inicial no metabolismo de gli- cose Sl Sucrase isomaltase Metabolismo de glicose PEPTI Transportador de oli- Transporte de oligopeptídeo à gopeptídeo 1 ~* 0' ZOl ' Proteína de junção oclu- Formação de junção oclusiva, integri- «
V siva 1 dade intestinal ¥ m ' CD3d CD3 de antígeno de cé- Marcador de célula T lula T FASN Ácido graxo sintase Biossíntese de ácido graxo A Figura 7 mostra um mapa de calor dos perfis de expressão ' dos genes de interesse para todos os tratamentos para o jejuno aos 23 dias de idade. A Figura 8 mostra um um mapa de calor do perfil de expressão 10 dos genes de interesse durante todos os tratamentos no figado aos 23 dias de idade. Nas Figuras 7 e 8, o código é o seguinte: Controle não estimulado = controle não estimulado + fitase CC = Controle estimulado + fitase 15 CC+ Protease = Controle estimulado + fitase + protease CC+ EP = Controle estimulado + fitase + Enviva Pro CC+ EP + Protease = controle estimulado + fitase + protease + Enviva Pro. A expressão de acetil CoA carboxilase A (ACACA) estava regu- lada negativamente no controle estimulado, mas a combinação de protease 20 + fitase e Enviva Pro aumentou isto para um nível comparável com o trata-
W ^ µ ,.
' 75/78 '^ ' mento de controle não estimulado. Enviva Pro com apenas fitase ou uma protease + fitase sem Enviva Pro não teve um efeito tão notável quanto com £ 4 a combinação. ACACA está envolvida na produção de ácidos graxos a partir de acetil COA e é usada como um marcador da lipogênese. " 5 " A expressão de glicoquinase (GCK) foi regulada negativamente pelo controle estimulado, mas a combinação de protease + fitase com Envi- va Pro produziu uma regulação positiva similar ao controle não estimulado. A extensão da regulação positiva foi maior do que quando a protease + fitase foram usadas sem um DFM. Um estrutura similar também foi visto com su- lO crase iso-maltase (SI), quando a combinação de Enviva Pro com protease + fitase aumentou a expressão em comparação ao controle estimulado e não ? estimulado. A GCK é uma enzima chave no metabolismo de glicose e a SI é à - - _ responsável pela hidrólise de sacarose e iso-maltose, e entao, tem um im- . W" 2' portante papel na digestão e absorção de carboidratos em animais.
C " 15 A expressão do transportador de oligopeptídeo 1 (PEPTI) foi aumentada pela protease + fitase sozinha e quando em combinação com Enviva Pro. PEPTI faz parte de um sistema de transporte de peptídeos e é responsável pela absorção de uma ampla gama de di- e tripeptideos. A proteína de junção oclusiva 1 (ZOl) foi a mais altamente ex- 20 pressa no controle estimulado. Uma redução foi vista com protease + fitase, mas uma regulação negativa maior na expressão foi vista com protease + fitase em combinação com Enviva Pro, o que causou uma redução maior do que visto no controle não estimulado. ZOl é uma proteína que está sobre a face citoplasmática das junções oclusivas, há vários papéis para esta protei- 25 na, variando de transdução de sinal para a montagem da junção oclusiva até estabilidade das próprias junções oclusivas. O antígeno de célula T CD3 (CD3D) estava altamente expresso no controle estimulado. O tratamento com protease + fitase teve algum efeito na redução da expressão deste gene, mas um efeito maior foi visto quando a 30 protease + fitase foram"usadas em combinação com Enviva Pro. Os mes- mos resultados foram vistos no jejuno e no fígado para CD3D, o que fortale- ce os resultados. CD3D é uma molécula de superfície encontrada em células
¢í.
V\À. —*-" r £ .E 76/78 T e desempenha um importante papel na transdução de sinal durante o en- gate do receptor de célula T e faz parte do complexo receptor de célula T/CD3. A ácido graxo sintase (FASN) foi regulada negativamente no = 5 controle estimulado, enquanto a protease + fitase, e Enviva Pro regularam positivamente este gene. A combinação de Enviva Pro e protease + fitase a aumentou ainda mais. FASN é uma enzima chave para a sÍntese de ácidos graxos e está envolvida na catálise da produção de ácidos graxos saturados de cadeia longa. 10 Discussão O aumento da expressão de acetil COA carboxilase causado 2 pela adiçâo de Enviva Pro e protease + fitase em comparação ao controle estimulado sugere que houve aumento da lipogênese. lsto ocorreria se a g 3 disponibilidade de carboidratos e digestão fosse maior, o que significa que ' 15 há aumento de energia excedente, que é desviada para o transporte e ar- mazenamento de gorduras. O aumento na expressão de glucoquinase e su- crase isomerase com a combinação de protease + fitase e Enviva Pro suge- re que houve uma absorção aumentada de glicose, e uma disponibilidade aumentada de sacarose e isomaltose na borda em escova, o que indica uma 20 interação positiva entre a enzima e os DFMS para aumentar a absorção de carboidratos no intestino delgado e, assim, aumentar a disponibilidade de energia proveniente da dieta. Adicionalmente, a expressão de glucoquinase reduzida para o controle estimulado sugere que o estímulo com C/ostridium perfringens causou dano à mucosa e que a adição de Enviva Pro e protease 25 + fitase pode ter agido para remediar isto. O aumento na expressão do transportador de oligopeptídeo transportador de peptídeo 1 (PEPTI) quando protease + fitase sozinhas e em combinação com Enviva Pro foram dadas, sugere uma disponibilidade aumentada dos peptídeos e, assim, uma neces- sidade maior para transporte, o que indica um efeito das enzimas e DFMS 30 para aumentar a disponibilidade de peptídeos para o animal, o que permite maior crescimento. A expressão aumentada de ácido graxo sintase (FASN) no fí-
.
4? ± "' 77/78 ' ' gado e o aumento de acetil CoA carboxilase A no jejuno sugerem sintese de ácidos graxos aumentada, devido ao aumento na disponibilidade de carboi- g- 7 ' dratos. As enzimas e Enviva Pro agiram juntas para produzir mais energia disponivel para o animal, o que resultou em mais crescimento. ' " 5 O efeito do Enviva Pro na redução da expressão da proteína de junção oclusiva 1 indica menor necessidade de degradação (turnover) da proteína, o que pode estar relacionado a uma alta integridade intestinal. A expressão aumentada no controle estimulado, entretanto, sugere que a de- gradação/necessidade da proteina foi alta devido à falha da integridade in- lO testinal, possivelmente devido às infecções por coccidios e C/ostridium per- fringens. O efeito de uma combinação de protease + fitase (sem Enviva Pro) e ou o efeito de Enviva Pro com fitase sozinho sobre a regulação negativa de ' W ZOI não é tão evidente quanto a combinação de protease + fitase + Enviva ? Pro. lsto indica que Enviva Pro e protease + fitase em combinação agem
B " 15 aumentando a integridade intestinal e, assim, beneficia a saúde intestinal do animal. O aumento da integridade intestinal e, assim, da capacidade de ab- sorção, parece ser um dos mecanismos pelos quais a eficácia das enzimas exógenas é aumentada quando um DFM está presente. A expressão aumentada do antigeno de célula T CD3 no con- 20 trole estimulado indica aumento da resposta imunológica mediada por célu- las causado pelo estimulo. Nestas condições, as aves estarão sendo subme- tidas a um desempenho abaixo de ótimo porque a resposta imune irá de- mandar energia que poderia ser usada para o crescimento, e porque algu- mas aves sentirão uma resposta à doença sistêmica. A expressão aumenta- 25 da deste marcador imunológico é acentuadamente revertida quando Enviva Pro é usado apenas com fitase ou.em combinação com protease + fitase. A regulação negativa da resposta imune no intestino pode ser um dos meca- nismos pelos quais a eficácia das enzimas exógenas na absorção de nutri- entes e no desempenho é aumentada quando um DFM está presente, parti- 30 cularmente em situações de estímulo com doença entérica. O efeito líquido de uma resposta imune regulada negativamen- te e maior integridade intestinal e uma melhor digestão e absorção de nutri-
t 'W I" . 78/78 ' entes com a combinação de enzimas e DFMs, determina claramente de- sempenho de produção intensificado dos frangos de corte. 2 Todas as publicações mencionadas no relatório descritivo aci- . ma estão aqui incorporados, a título de referência. Várias modificações e va- " 5 riações dos métodos e sistema descritos da invenção ficarão evidentes aos versados na técnica, sem que se desvie do espírito e escopo da invenção.
Embora a presente invenção tenha sido descrita em conexão com modalida- des preferenciais específicas, deve-se compreender que a invenção, tal co- mo reivindicada, não deve ficar indevidamente limitada a essas modalidades 10 específicas. De fato, várias modificações dos modos de realização da inven- ção descritos, que são óbvias para os versados em bioquímica e biotecnolo- . « d gia ou campos relacionados, destinam-se a estar dentro do escopo das rei- ' .N vindicações a seguir. .
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Claims (14)

REIVINDICAÇÕES
1. Composição de aditivo de ração, caracterizada pelo fato de que compreende um micro-organismo de alimentação direta em combinação com uma protease e uma fitase, em que o micro-organismo de alimentação 5 direta é um micro-organismo de alimentação direta antipatógeno, em que o micro-organismo de alimentação direta é um antipatógeno quando o mesmo produz uma densidade óptica reduzida (OD) em comparação com um contrôle no seguinte Ensaio de DFM: i) os tubos são inoculados com um patógeno representativo de um conjunto representativo; ii) o sobrenadante de um potencial DFM cultivado aerobicamente ou anaerobicamente é adicionado aos tubos inoculados e incubados; e iii) após a incubação a DO do contrôle e dos tubos de sobrenadante tratado é medida para cada patógeno.
2. Micro-organismo de alimentação direta em combinação com uma protease e uma fitase, caracterizado pelo fato de que é para uso na melhoria do desempenho de um indivíduo, em que o desempenho é determinado pela eficiência da alimentação e/ou o ganho de peso do animal e/ou por a taxa de conversão alimentar e/ou pela digestibilidade de um nutriente em uma ração (por exemplo, a digestibilidade de aminoácidos) e/ou da energia digerível ou energia metabolizável em uma ração e/ou pela retenção de nitrogênio e/ou pela capacidade para evitar os efeitos negativos da enterite necrótica e/ou pela resposta imune do indivíduo, ou para uso na melhoria da digestibilidade de uma matéria-prima em uma ração (por exemplo, digestibilidade de nutrientes, como digestibilidade de aminoácidos), ou para uso na melhoria da retenção de nitrogênio, ou para uso na melhoria da resistência do indivíduo à enterite necrótica, ou para uso na melhoria da taxa de conversão alimentar (FCR), ou para uso na melhoria do ganho de peso em um indivíduo, ou para uso na melhoria da eficiência alimentar em um indivíduo ou para modular (por exemplo, melhorar) a resposta imune do indivíduo, ou para uso na promoção do crescimento de bactérias benéficas no trato gastrointestinal de um indivíduo, ou para uso na redução de populações de bactérias patogênicas no trato gastrointestinal de um indivíduo, ou para uso na redução da excreção de nutrientes no esterco, em que o micro-organismo de alimentação direta é um antipatógeno de micro- 5 organismo de alimentação direta, em que o micro-organismo de alimentação direta é um antipatógeno quando o mesmo produz uma densidade óptica reduzida (OD) em comparação com um contrôle no seguinte Ensaio de DFM: i) os tubos são inoculados com um patógeno representativo de um conjunto representativo; ii) o sobrenadante de um potencial DFM cultivado aerobicamente ou anaerobicamente é adicionado aos tubos inoculados e incubados; e iii) após a incubação a DO do contrôle e dos tubos de sobrenadante tratado é medida para cada patógeno.
3. Micro-organismo de alimentação direta em combinação com uma protease e uma fitase para uso de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que é usada a composição de aditivo de ração como definida na reivindicação 1.
4. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende um micro- organismo de alimentação direta, uma protease, uma fitase e instruções pa- ra administração, em que o micro-organismo de alimentação direta é um micro-organismo de alimentação direta antipatógeno, em que o micro- organismo de alimentação direta é um antipatógeno quando o mesmo produz uma densidade óptica reduzida (OD) em comparação com um contrôle no seguinte Ensaio de DFM: i) os tubos são inoculados com um patógeno representativo de um conjunto representativo; ii) o sobrenadante de um potencial DFM cultivado aerobicamente ou anaerobicamente é adicionado aos tubos inoculados e incubados; e iii) após a incubação a DO do contrôle e dos tubos de sobrenadante tratado é medida para cada patógeno; e, opcionalmente, compreendendo a composição de aditivo de ração como definida na reivindicação 1.
5. Composição de aditivo de ração de acordo com a 5 reivindicação 1, ou micro-organismo de alimentação direta em combinação com uma protease e uma fitase para uso de acordo com a reivindicação 2, ou 3, ou um kit da acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que: (a) o micro-organismo de alimentação direta é uma bactéria viável; e/ou (b) o micro-organismo de alimentação direta compreende uma bactéria de um ou mais dos seguintes gêneros: Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Bacillus, Pediococcus, Enterococcus, Leuconostoc, Car- nobacterium, Propionibacterium, Bifidobacterium, Clostridium e Megasphae- ra e combinações dos mesmos; e/ou (c) em que o micro-organismo de alimentação direta compre- ende uma bactéria de uma ou mais das seguintes espécies: Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Enterococcus faecium, En- terococcus spp, e Pediococcus spp, Lactobacillus spp, Bifidobacterium spp, Lactobacillus acidophilus, Pediococsus acidilactici, Lactococcus lactis, Bifi- dobacterium bifidum, Propionibacterium thoenii, Lactobacillus farciminus, lactobacillus rhamnosus, Clostridium butyricum, Bifidobacterium animalis ssp. animalis, Lactobacillus reuteri, Bacillus cereus, Lactobacillus salivarius ssp. salivarius, Megasphaera elsdenii, Propionibacteria sp e combinações dos mesmos; e/ou (d) em que o micro-organismo de alimentação direta é uma ou mais das seguintes cepas: Bacillus subtilis cepas 3A-P4 (PTA-6506); 15A-P4 (PTA-6507); 22C-P1 (PTA-6508); 2084 (NRRL B-500130); LSSA01 (NRRL- B-50104); BS27 (NRRL B-50105); BS 18 (NRRL B-50633); e BS 278 (NRRL B-50634); e/ou o micro-organismo de alimentação direta está na forma de um endósporo.
6. Composição de aditivo de ração de acordo com a reivindica- ção 1 ou 5, ou micro-organismo de alimentação direta em combinação com uma protease e uma fitase para uso de acordo com a reivindicação 2, 3, ou 5, um kit da acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizado pelo fato de 5 que: (a) a protease é uma subtilisina, uma bacilolisina, uma protease de serina alcalina ou uma queratinase ou uma protease de Nocardiopsis; e/ou (b) a fitase é uma 6-fitase ou uma 3-fitase, preferivelmente a fi- tase é uma 6-fitase; e/ou (c) a fitase é uma fitase de E. coli ou uma fitase de Buttiauxella ou uma fitase de Hafnia ou uma fitase de Citrobacter ou uma fitase de As- pergillus ou uma fitase de Penicillium ou uma fitase de Trichoderma ou uma fitase de E. coli ou uma fitase de Hansenula.
7. Composição de aditivo de ração de acordo com a reivindica- ção 1, 5 ou 6, caracterizada pelo fato de que a fitase está presente em uma dosagem entre 200 FTU/g de composição de aditivo de ração e 10.000 FTU/g de composição de aditivo de ração; e/ou a protease está presente em uma dosagem de 1.000 PU/g de composição de aditivo de ração e 60.000 PU/g de composição de aditivo de ração; e/ou o DFM está presente em uma dosagem de 3,75x107 UFC/g de composição de aditivo de ração e 1x1011 UFC/g de composição de aditivo de ração.
8. Método para preparar uma composição de aditivo de ração, caracterizado pelo fato de que compreende misturar um micro-organismo de alimentação direta com uma protease e uma fitase e (opcionalmente) emba- lar, em que o micro-organismo de alimentação direta é um antipatógeno quando o mesmo produz uma densidade óptica reduzida (OD) em comparação com um contrôle no seguinte Ensaio de DFM: i) os tubos são inoculados com um patógeno representativo de um conjunto representativo;
ii) o sobrenadante de um potencial DFM cultivado aerobicamente ou anaerobicamente é adicionado aos tubos inoculados e incubados; e iii) após a incubação a DO do contrôle e dos tubos de 5 sobrenadante tratado é medida para cada patógeno.
9. Ração, caracterizada pelo fato de que compreende uma composição de aditivo de ração como definida em qualquer uma das reivin- dicações 1 ou 5 a 7.
10. Ração de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a fitase está presente em uma dosagem entre 400 FTU/kg de ração e 1.000 FTU//kg de ração; e/ou a protease está presente em uma dosagem de 2.000 PU/kg de ração a 6.000 PU/kg de ração; e/ou o DFM está presente em uma dosagem de 7,5x104 UFC/kg de ração e 1x107 UFC/kg de ração.
11. Método para preparar uma ração, caracterizado pelo fato de que compreende misturar um componente alimentar com uma composi- ção de aditivo de ração como definida em qualquer uma das reivindicações 1 ou 5 a 7.
12. Pré-mistura, caracterizada pelo fato de que compreende uma composição de aditivo de ração que compreende um micro-organismo de alimentação direta em combinação com uma protease e uma fitase, e pelo menos um mineral e/ou pelo menos uma vitamina, em que o micro- organismo de alimentação direta é um antipatógeno quando o mesmo produz uma densidade óptica reduzida (OD) em comparação com um contrôle no seguinte Ensaio de DFM: i) os tubos são inoculados com um patógeno representativo de um conjunto representativo; ii) o sobrenadante de um potencial DFM cultivado aerobicamente ou anaerobicamente é adicionado aos tubos inoculados e incubados; e iii) após a incubação a DO do contrôle e dos tubos de sobrenadante tratado é medida para cada patógeno.
13. Pré-mistura, caracterizada pelo fato de que compreende uma composição de aditivo de ração como definida em qualquer uma das reivindicações 1 ou 5 a 7 em combinação com pelo menos um mineral e/ou 5 pelo menos uma vitamina.
14. Composição de aditivo de ração de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 5 a 7, caracterizada pelo fato de que é para prevenção e/ou tratamento de coccidiose e/ou enterite necrótica em um indi- víduo; e/ou para uso na prevenção e/ou tratamento de coccidiose e/ou enterite necrótica em um indivíduo.
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