CN104735999A - 饲料添加剂组合物 - Google Patents

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Abstract

包含直接饲喂微生物(DFM)与木聚糖酶(例如内切-1,4-β-d-木聚糖酶)和β-葡聚糖酶(及可选的其他纤维降解酶)的组合的饲料添加剂组合物，其中该DFM选自产酶菌株、C5糖发酵菌株、产短链脂肪酸菌株、纤维水解性内源性微生物区系促进菌株或其组合。该DFM可以选自枯草芽孢杆菌AGTP BS3BP5、枯草芽孢杆菌AGTP BS442、枯草芽孢杆菌AGTP BS521、枯草芽孢杆菌AGTP BS918、枯草芽孢杆菌AGTP BS1013、枯草芽孢杆菌AGTP BS1069、枯草芽孢杆菌AGTP 944、短小芽孢杆菌AGTP BS 1068或短小芽孢杆菌KX11-1、屎肠球菌ID7、丙酸丙酸杆菌P169、鼠李糖乳杆菌CNCM-I-3698、香肠乳杆菌CNCM-I-3699、具有其所有特征的菌株、其任意衍生物或变体、及其组合，该其他纤维降解酶可以选自纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.176和E.C.3.2.1.91)、β-葡糖苷酶(E.C.3.2.1.21)、β-木糖苷酶(E.C.3.2.1.37)、阿魏酸酯酶(E.C.3.1.1.73)、α-阿拉伯呋喃糖苷酶(E.C.3.2.1.55)、果胶酶(例如内聚半乳糖醛酸酶(E.C.3.2.1.15)、聚半乳糖醛酸外切酶(E.C.3.2.1.67)或果胶酸裂合酶(E.C.4.2.2.2))，或其组合。

Description

饲料添加剂组合物
技术领域
本发明涉及用特定直接饲喂微生物与木聚糖酶和β-葡聚糖酶的组合改善饲料组合物的方法，以及包含直接饲喂微生物与木聚糖酶和β-葡聚糖酶的组合的饲料添加剂组合物。本发明进一步涉及用途和试剂盒。
背景技术
作为改善营养物利用和生产表现特征的手段，用补充酶作为动物饲料，尤其是家禽饲料和猪饲料的添加剂。可获得酶混合物来改善包含谷物谷粒、大豆粉、动物蛋白粉或高纤维食物和工业副产物的饲粮的营养价值。
直接饲喂微生物(DFM)的概念涉及对动物(如鸡或猪)饲喂活的有益微生物，使得在以充足的量施用时赋予宿主健康益处。益生菌剂(probiotics)是用于此类饲料添加剂的另一术语。已在受控研究中显示益生菌剂或DFM改善动物表现。DFM包括直接饲喂的基于细菌和/或酵母的产品。
虽然已考虑了DFM与一些酶的组合，但从未充分了解DFM和酶之间的相互作用。本发明涉及新的具体组合，其惊人地显著改善动物的生产表现特征。
全球饲料谷物市场的持续压力已导致猪和家禽产业寻求替代的低成本成分选择(如来自生物燃料和碾磨产业的共同产物(副产物))的趋势。但是，替代成分的特征是高含量的非淀粉多糖(NSP；纤维)，其对非反刍动物而言营养价值低，因为它们不可消化，限制了动物的营养物摄取，并负面影响能量和营养物利用。由此可见，替代纤维成分在单胃动物饲粮中的成功应用将依赖于用于有效利用包含在膳食纤维中的能量、减轻与它们的抗营养特性相关的风险的技术的可获得性及正确配制入饲粮时潜在的经济利益。
发明概述
本发明的开创性发现是，在将木聚糖酶和β-葡聚糖酶与针对其能力选择的一种或多种具体的直接饲喂微生物(DFM)组合时，可以优化木聚糖酶对源自植物细胞壁颗粒的非淀粉多糖(NSP)含量高的膳食材料的降解，来改善动物表现，所述木聚糖酶和β-葡聚糖酶的能力是其消化植物细胞壁结构糖类的能力，和/或其在厌氧条件下从包含在成分的NSP级分中的戊糖(例如阿拉伯木聚糖)产生短链脂肪酸(SCFA)的能力。
此组合改善表现的原因是，来自饲粮的纤维(特别是半纤维素)在动物胃肠道(GIT)中的溶解最大化。半纤维素的此溶解并非总是足以提高表现，因为所释放的C5-糖在它们被吸收时对动物而言不是有效的能量来源(Savory C.,J.Br.J.Nut.1992,67:103-114)，但它们在由GIT中的微生物或由DFM转化为短链脂肪酸(SCFA)时是更有效的能量来源。
因此，通过组合木聚糖酶和β-葡聚糖酶及具体DFM可以优化来自植物产品(例如，小麦、玉米、燕麦、大麦和谷物共同产物(副产物)或单胃动物易得到的混合谷物饲粮)的能量值，所述具体DFM可以在厌氧条件下从NSP级分戊糖产生SCFA或可以调节GIT中的微生物群体来增加来自所释放的糖的SCFA产生。DFM可以使其代谢适应于与木聚糖酶和β-葡聚糖酶组合协同增加纤维水解。使用具有纤维水解酶的DFM可以提供附加的益处，并最大化糖类的益处。
针对其酶活性选择的具体DFM可以视为聚糖驱动的细菌食物链。本文教导的特别选择的DFM可以优先利用膳食纤维，这是允许它们进行最初的聚糖消化步骤来释放更短、更可溶的多糖用于其他细菌(例如其他内源性GIT微生物区系)的性状。针对其代谢选择具体DFM，与只使用酶的组合或只使用一种或多种DFM相比，该代谢根据由酶(例如木聚糖酶和β-葡聚糖酶)释放的聚糖调整，以改善本文教导的酶和DFM组合的功效。
不希望受限于理论，在本发明中，源自植物细胞壁颗粒的富含来源特异性聚糖(如纤维素、半纤维素和果胶(植物材料))或糖胺聚糖的膳食材料以颗粒形式进入远端肠道，能够直接结合这些不溶性颗粒并消化它们的聚糖成分的具体DFM聚糖降解者攻击该颗粒形式。在含聚糖颗粒的此初始降解之后，存在于盲肠中的次级聚糖降解者消化更可溶的聚糖片段，这促成源自两类降解者的短链脂肪酸(SCFA)发酵产物释放库。由于SCFA产生于GIT中的土著厌氧微生物区系的糖类发酵和/或蛋白质发酵和脱氨作用，SCFA浓度可以是厌氧生物群体的指数。SCFA实际上可以作为肠、肌肉、肾脏、心脏、肝脏和脑组织的代谢燃料以及提供针对诸如沙门氏菌属(Salmonella)和大肠杆菌(E.coli)的生物的制菌和杀菌特性来为宿主动物提供许多益处。
纤维在非反刍动物中的营养价值主要可以通过经有效的纤维降解酶(例如木聚糖酶和β-葡聚糖酶，适宜地与其他纤维降解酶组合)对溶解或降解的纤维的发酵而产生的短链脂肪酸(SCFA)来得到。饲料木聚糖酶单独不足以使用动物(尤其是非反刍动物)饲粮中的纤维成分。基于植物的饲料成分中存在一系列化学特征。酶应用取决于植物(饲料)材料的特征。仅作为实例，在小麦谷粒中，阿拉伯聚糖占主导，但在小麦粗粉(小麦碾磨的共同产物或副产物)中，β-葡聚糖的含量从8g-1DM(谷粒中)提高至超过26g kg-1DM。
SCFA具有不同的能量值，一些可以作为葡萄糖的前体，一些可以有助于维持肠完整性和健康。发明人已发现，本文教导的具体组合优先将动物GIT中的发酵过程移向产生更有价值/有用的SCFA，如丁酸和/或丙酸。
在一方面，本发明提供包含直接饲喂微生物(DFM)与木聚糖和β-葡聚糖的组合的饲料添加剂组合物，其中该DFM选自产酶菌株、C5糖发酵菌株、产短链脂肪酸菌株、纤维水解性内源性微生物区系促进菌株或其组合。
本发明进一步提供用于以下的方法：
i)用于改善个体的表现；或
ii)用于改善饲料中的原料的消化率(digestibility,例如营养物消化率，如氨基酸消化率)；或
iii)用于改善氮保留；或
iv)用于改善饲料转化率(FCR)；或
v)用于改善个体中的增重；或
vi)用于改善个体中的饲料效率；或
vii)用于使个体胃肠道中的发酵过程移向产生丁酸和/或丙酸；
该方法包括对个体施用直接饲喂微生物(DFM)与木聚糖酶和β-葡聚糖酶的组合，其中该DFM选自产酶菌株、C5糖发酵菌株、产短链脂肪酸菌株、纤维水解性(fibrolytic)内源性微生物区系促进菌株或其组合。
本发明还进一步提供包含本发明的饲料添加剂组合物或直接饲喂微生物(DFM)、木聚糖酶和β-葡聚糖酶及至少一种维生素和/或至少一种矿物质的预混物，其中该DFM选自产酶菌株、C5糖发酵菌株、产短链脂肪酸菌株、纤维水解性内源性微生物区系促进菌株或其组合。
还在另一方面，本发明提供包含本发明的饲料添加剂组合物或本发明的预混物的饲料。
本发明还进一步提供包含直接饲喂微生物(DFM)与木聚糖酶和β-葡聚糖酶的组合的饲料，其中该DFM选自产酶菌株、C5糖发酵菌株、产短链脂肪酸菌株、纤维水解性内源性微生物区系促进菌株或其组合。
在另一方面，提供制备饲料的方法，其包括将饲料成分与本发明的饲料添加剂组合物或本发明的预混物混合。
本发明的另一方面是制备饲料的方法，其包括将饲料成分与直接饲喂微生物(DFM)与木聚糖酶和β-葡聚糖酶的组合混合，其中该DFM选自产酶菌株、C5糖发酵菌株、产短链脂肪酸菌株、纤维水解性内源性微生物区系促进菌株或其组合。
本发明还进一步提供直接饲喂微生物(DFM)与木聚糖酶和β-葡聚糖酶的组合的用途，其中该DFM选自产酶菌株、C5糖发酵菌株、产短链脂肪酸菌株、纤维水解性内源性微生物区系促进菌株或其组合：
i)用于改善个体的表现；或
ii)用于改善饲料中的原料的消化率(例如营养物消化率，如氨基酸消化率)；或
iii)用于改善氮保留；或
iv)用于改善饲料转化率(FCR)；或
v)用于改善个体中的增重；或
vi)用于改善个体中的饲料效率；或
vii)用于使个体胃肠道中的发酵过程移向产生丁酸和/或丙酸。
另一方面涉及包含直接饲喂微生物(DFM)、木聚糖酶和β-葡聚糖酶及施用说明的试剂盒，其中该DFM选自产酶菌株、C5糖发酵菌株、产短链脂肪酸菌株、纤维水解性内源性微生物区系促进菌株或其组合(及可选的至少一种维生素和/或可选的至少一种矿物质)。
附图简述
图1显示不含或含芽孢杆菌属(Bacillus)直接饲喂微生物(DFM)的木聚糖酶和β-葡聚糖酶对粪便乳酸杆菌和大肠杆菌计数(对数转化的集落形成单位/粪便克数，Log10cfu/g)的影响。
发明详述
优选地，用于本发明的一种或多种酶对于DFM而言是外源性的。换言之，优选将一种或多种酶添加至DFM中或与DFM混合。
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有本公开所属领域普通技术人员通常理解的含义。Singleton,等,DICTIONARY OFMICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY,第20版,John Wileyand Sons,New York(1994)及Hale&Marham,THE HARPERCOLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY,Harper Perennial,NY(1991)为本领域技术人员提供了本公开中所用的许多术语的一般性词典。
本公开并不受限于本文公开的示例性方法和材料，任何与本文所述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料都可用于本公开的实施方案的实施或测试。数值范围包括限定该范围的数字。除非另外指明，否则分别是，任何核酸序列从左至右以5'至3'方向写出；氨基酸序列从左至右以氨基至羧基方向写出。
本文提供的标题并非是对本公开的多种方面或实施方案的限制，这些方面或实施方案可通过将说明书作为一个整体来参考而得到。相应地，下文要定义的术语通过将说明书作为一个整体来参考而得到更完全的定义。
氨基酸在本文中用氨基酸名称、三字母缩写或单字母缩写来指代。
本文所用的术语“蛋白质”包括蛋白质、多肽和肽。
本文所用的术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”同义。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”同义。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“酶”同义。
术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用。在本公开和权利要求书中，可使用氨基酸残基的常规一字母和三字母代码。氨基酸的3字母代码遵照IUPACIUB生物化学命名联合委员会(Joint Commission onBiochemical Nomenclature,JCBN)的定义。还应理解，由于遗传密码的简并性，多肽可由不止一种核苷酸序列编码。
本文提到的所有E.C.酶分类涉及Enzyme Nomenclature–Recommendations(1992)of the nomenclature committee of theInternational Union of Biochemistry and Molecular Biology–ISBN0-12-226164-3中提供的分类。
术语的其他定义可在整个本说明书中出现。在更详细地描述示例性实施方案之前，应理解本公开并不限于所描述的具体实施方案，因为这些实施方案当然是可变的。还应理解，本文所用的术语仅出于描述具体实施方案的目的，并不意在具有限制意义，因为本发明的范围将仅受所附权利要求限制。
在提供数值范围时，应理解，除非文中另有明确说明，也明确公开该范围的上限和下限之间的每个中间数值(至下限的个位(unit)的十分之一)。所述范围中的任意所述值或中间值与所述范围中的任意其他所述值或中间值之间的每个较小范围也为本公开所涵盖。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在该范围内或排除在该范围外，且其中任一个、没有一个或两个界限包括在较小范围中的每个范围也为本公开所涵盖，依据所述范围中的任意明确排除的界限而定。在所述范围包括界限中的一个或两个的情况下，排除这些所包括的界限中的任一个或两个的范围也包括在本公开中。
必须指出，除非文中另有明确说明，本文和所附权利要求中所用的单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指代物。因此，例如，提到“酶”则包括多个这种候选物质，而提到“饲料”则包括提到一种或多种饲料以及本领域技术人员已知的它们的等同物，以此类推。
本文讨论的出版物只是为了它们在本申请的提交日之前的公开内容而提供。本文的任何内容都不解释为承认这些出版物构成本文所附权利要求的现有技术。
用于本发明的酶可通过固体培养或深层培养来产生，包括分批方法、补料分批方法和连续流方法。培养在培养基中完成，该培养基包含水性矿物盐培养基、有机生长因子、碳和能源物质、分子氧以及当然还有待使用的一种或多种具体的微生物物种的起始接种物。
用于本发明的DFM可以是产酶菌株。
用于本发明的DFM可以是C5糖发酵菌株。
用于本发明的DFM可以是产短链脂肪酸菌株。
用于本发明的DFM可以是纤维水解性内源性微生物区系促进菌株。
本发明的产酶菌株和/或C5糖发酵菌株和/或产短链脂肪酸菌株和/或纤维水解性内源性微生物区系促进菌株可以选自以下属：芽孢杆菌属、肠球菌属(Enterococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)及其组合。
本发明的产酶菌株和/或C5糖发酵菌株和/或产短链脂肪酸菌株和/或纤维水解性内源性微生物区系促进菌株可以是至少一种选自芽孢杆菌属的菌株，尤其是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)或短小芽孢杆菌(B.pumilus)。
本发明的产酶菌株和/或C5糖发酵菌株和/或产短链脂肪酸菌株和/或纤维水解性内源性微生物区系促进菌株可以是至少一种选自肠球菌属的菌株，尤其是屎肠球菌(Enterococcus faecium)。
本发明的产酶菌株和/或C5糖发酵菌株和/或产短链脂肪酸菌株和/或纤维水解性内源性微生物区系促进菌株可以选自以下：枯草芽孢杆菌AGTP BS3BP5、枯草芽孢杆菌AGTP BS442、枯草芽孢杆菌AGTP BS521、枯草芽孢杆菌AGTP BS918、枯草芽孢杆菌AGTP BS1013、枯草芽孢杆菌AGTP BS1069、枯草芽孢杆菌AGTP 944、枯草芽孢杆菌BS 2084(NRRLB-50013)、枯草芽孢杆菌LSSAO1(NRRL B-50104)、枯草芽孢杆菌3A-P4(PTA-6506)、枯草芽孢杆菌22C-P1(PTA-6508)、地衣芽孢杆菌BL21(NRRL B-50134)、枯草芽孢杆菌BS-27(NRRL B-50105)、枯草芽孢杆菌BS18(NRRL B-50633)、枯草芽孢杆菌15A-P4(PTA-6507)、枯草芽孢杆菌BS278(NRRL B-50634)、地衣芽孢杆菌BL842(NRRL B-50516)、短小芽孢杆菌AGTP BS 1068、短小芽孢杆菌KX11-1、屎肠球菌ID7、丙酸丙酸杆菌(Propionibacterium acidipropionici)P169、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CNCM-I-3698、香肠乳杆菌(Lactobacillusfarciminis)CNCM-I-3699，或具有其所有特征的菌株、其任意衍生物或变体、及其组合。
用于本发明的产酶菌株和/或C5糖发酵菌株和/或产短链脂肪酸菌株和/或纤维水解性内源性微生物区系促进菌株优选是活细菌。
用于本发明的产酶菌株和/或C5糖发酵菌株和/或产短链脂肪酸菌株和/或纤维水解性内源性微生物区系促进菌株可以是内生孢子的形式。
用于本发明的的木聚糖酶优选是内切-1,4-β-d-木聚糖酶(E.C.3.2.1.8)。
在一些实施方案中，优选将木聚糖酶和β-葡聚糖酶与至少一种其他纤维降解酶组合使用。该(其他)纤维降解酶可以选自纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.176和E.C.3.2.1.91)、β-葡糖苷酶(E.C.3.2.1.21)、β-木糖苷酶(E.C.3.2.1.37)、阿魏酸酯酶(E.C.3.1.1.73)、α-阿拉伯呋喃糖苷酶(E.C.3.2.1.55)、果胶酶(例如内聚半乳糖醛酸酶(E.C.3.2.1.15)、聚半乳糖醛酸外切酶(E.C.3.2.1.67)或果胶酸裂合酶(E.C.4.2.2.2))，或其组合。
适宜地，可以存在一种以上其他纤维降解酶，适宜地两种以上，适宜地三种以上，适宜地四种以上，适宜地五种以上。
适宜地，本发明的饲料添加剂组合物或包含DFM与木聚糖酶、β-葡聚糖酶和至少一种其他降解酶的组合的组合物使个体胃肠道中的发酵过程移向产生丁酸和/或丙酸。
直接饲喂微生物(DFM)
本文中的术语“微生物(microbial)”可与“微生物体(microorganism)”互换使用。
用于本发明的DFM可以是任意适宜的DFM，该DFM是“产酶菌株”，如产酶芽孢杆菌属菌株。为了确定DFM是否是“产酶菌株”，可以使用本文定义为“产酶DFM测定”的DFM测定。如果用本文教导的“产酶DFM测定”将DFM分类为产酶DFM，则认为它是产酶DFM。
用于本发明的DFM可以是任意适宜的DFM，该DFM是“C5糖发酵菌株”。为了确定DFM是否是“C5糖发酵菌株”，可以使用本文定义为“C5糖发酵DFM测定”的DFM测定。如果用本文教导的“C5糖发酵DFM测定”将DFM分类为C5糖发酵，则认为它是C5糖发酵DFM。
用于本发明的DFM可以是任意适宜的DFM，该DFM是“产短脂肪酸(SCFA)菌株”。为了确定DFM是否是“产SCFA菌株”，可以使用本文定义为“产SCFA DFM测定”的DFM测定。如果用本文教导的“产SCFADFM测定”将DFM分类为产SCFA，则认为它是产SCFA DFM。
用于本发明的DFM可以是任意适宜的DFM，该DFM是“纤维水解性内源性微生物区系促进菌株”。为了确定DFM是否是“纤维水解性内源性微生物区系促进菌株”，可以使用本文定义为“纤维水解性内源性微生物区系促进DFM测定”的DFM测定。如果用本文教导的测定确定DFM促进或刺激内源性纤维水解性微生物区系，则认为它是纤维水解性内源性微生物区系促进DFM。
用于本发明的DFM可以是任意适宜的DFM，该DFM是“产酶菌株”、“C5糖发酵菌株”、“产SCFA菌株”、“纤维水解性内源性微生物区系促进菌株”或其组合。
适宜地，用于本发明的DFM可以是这样的DFM，该DFM是将被分类为“产酶菌株”和/或“C5糖发酵菌株”和/或“产SCFA菌株”和/或“纤维水解性内源性微生物区系促进菌株”的菌株。适宜地，该DFM可以是分类为具有超过一类活性的菌株，例如至少2类、适宜地至少3类、适宜地全部4类活性，例如产酶活性、C5糖发酵活性、产SCFA活性和/或纤维水解性内源性微生物区系促进活性。
本发明的DFM为饲喂高水平的高纤维植物副产物(如含可溶物的干酒糟(DDGS))的动物提供益处。
产酶DFM测定：
通过将2微升液体培养物重复斑点接种在100x100x15mm多孔板中的15ml多种目的底物培养基类型上来进行这些测试菌株的高通量筛选。根据单个菌株具体的底物利用来测定纤维素酶、α-淀粉酶、玉米醇溶蛋白酶、大豆蛋白酶、酯酶、脂肪酶和木聚糖酶活性。表1中描述用于从环境衍生菌株的酶活性测定底物利用特性的培养基成分。应用培养物后使测定板干燥30分钟，然后在32℃孵育24小时。通过测量菌落生长的周围边缘的透明所示的以毫米表示的底物降解带来测定各菌株的酶活性。记录来自重复板的平均值。
表1-用于测定环境衍生的芽孢杆菌的底物利用特性所示的酶活性的培养基成分。
在一个实施方案中，该产酶菌株产生一种或多种以下酶活性：纤维素酶活性、α-淀粉酶活性、木聚糖酶活性、酯酶活性、脂肪酶活性、β-甘露聚糖酶活性、蛋白酶活性(例如玉米醇溶蛋白酶活性或大豆蛋白酶)及其组合。
在一个实施方案中，优选地，该产酶菌株产生一种或多种以下酶活性：纤维素酶活性、木聚糖酶活性、β-甘露聚糖酶活性或其组合。
在一个实施方案中，该产酶DFM是选自以下物种的菌株：枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌或其混合物。
在一个实施方案中，优选地，该产酶DFM菌株选自：
枯草芽孢杆菌AGTP BS3BP5(NRRL B-50510)，
枯草芽孢杆菌AGTP BS442(NRRL B-50542)，
枯草芽孢杆菌AGTP BS521(NRRL B-50545)，
枯草芽孢杆菌AGTP BS918(NRRL B-50508)，
枯草芽孢杆菌AGTP BS1013(NRRL B-50509)，
短小芽孢杆菌AGTP BS 1068(NRRL B-50543)，
枯草芽孢杆菌AGTP BS1069(NRRL B-50544)，
枯草芽孢杆菌AGTP 944(NRRL B-50548)，
短小芽孢杆菌AGTP KXII-1(NRRL B-50546)，
枯草芽孢杆菌15A-P4(PTA-6507)，
枯草芽孢杆菌BS 2084(NRRL B-50013)，
枯草芽孢杆菌LSSAO1(NRRL B-50104)，
枯草芽孢杆菌3A-P4(PTA-6506)，
枯草芽孢杆菌22C-P1(PTA-6508)，
地衣芽孢杆菌BL21(NRRL B-50134)，
枯草芽孢杆菌BS-27(NRRL B-50105)，
枯草芽孢杆菌BS18(NRRL B-50633)，
枯草芽孢杆菌BS278(NRRL B-50634)，
地衣芽孢杆菌BL842(NRRL B-50516)。
或其任意衍生物或变体，
及其组合。
DFM的产酶菌株可以是US 61/527,371和US61/526,881中教导的一个或多个菌株，这两个专利在此引入作为参考。
C5糖发酵DFM测定：
芽孢杆菌属菌株在胰胨豆胨琼脂(Difco)的平板上32℃过夜培养，乳酸细菌在MRS琼脂(Difco)上在厌氧条件下37℃过夜培养。用纯的培养物DFM(分别为芽孢杆菌属或乳酸细菌)接种API 50CHB和API 50CHL培养基(bioMerieux,Marcy l'Etoile,法国)，并按厂家的说明应用至 试条。32℃(芽孢杆菌属)或厌氧条件下37℃(乳酸细菌)孵育试条，并在24和48小时时监测比色变化。
本文所用的术语“C5糖”意指任意具有5个碳的糖。C5糖在本文中可以称为戊糖。
C5糖包括D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-核糖、D-木糖和L-木糖。
在一个实施方案中，DFM的C5糖发酵菌株选自：
枯草芽孢杆菌15A-P4(PTA-6507)
枯草芽孢杆菌AGTP BS918(NRRL B-50508)
枯草芽孢杆菌BS 2084(NRRL B-50013)
枯草芽孢杆菌LSSAO1(NRRL B-50104)
屎肠球菌ID7
乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)DJ6(PTA 6102)
乳酸乳杆菌ID7(PTA 6103)，
或其组合。
产短链脂肪酸(SCFA)DFM测定：
用DFM的48小时培养物的1％体积/体积接种物来接种10ml管的改进的乳酸钠培养基(NLB)(1％乳酸钠，Sigma-Aldrich,St Louis,MO；1％胰蛋白胨，Oxoid Ltd.,Hampshire,英格兰；0.5％酵母提取物，Oxoid Ltd；及0.5％KH2PO4)，该改进的乳酸钠培养基缺乏乳酸钠，用等同量(1％重量/体积)的九种不同糖类(乳酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、蔗糖、淀粉、木糖、纤维二糖、果糖；Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)中的一种补充。培养物在厌氧条件下32℃培养，孵育0、24、48和72小时后，5000x g离心重复管10分钟，从各培养物收集用过的培养基。通过高效液相层析(HPLC)测量用过的培养基中短链脂肪酸的产生。从各取样管取出用过的培养基的重复的1ml样品，并与10ml 0.005M H2SO4混合。将3ml的各稀释样品通过0.2微米滤器滤入HPLC小瓶并盖上。使用300X 7.8mm Bio-Rad(Hercules,CA)Aminex HPX-87H柱，用Waters 2695分离模块(Milford,Ma)分析样品的乙酸、乳酸、丙酸和丁酸。所有分析物都用Waters 2410RI检测器检测。
在一个实施方案中，该产短链脂肪酸(SCFA)菌株可以是丙酸丙酸杆菌P169。
在另一个实施方案中，该产短链脂肪酸(SCFA)菌株可以是屎肠球菌ID7。
本文所用的术语“短链脂肪酸”包括挥发性脂肪酸以及乳酸。
在一个实施方案中，该SCFA可以选自：乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸、2-甲基丁酸和乳酸。
在一个实施方案中，该SCFA可以是丁酸。
纤维水解性内源性微生物区系促进DFM测定：
进行了笼舍试验来确定与不含DFM的对照相比，DFM对肉鸡的影响。在试验的第11和42天收集样品。在每个取样日期，从每种处理总计八只鸡的每个笼舍收集一只鸡。对鸡实施安乐死，并从每只鸡收集从砂囊以下至回肠-盲肠连接的总胃肠道(GIT)。切开来自每只鸡的盲肠样品，将消化物和盲肠组织收集在whirl-pak采样袋中，并在99ml 0.1％蛋白胨中按7.0次冲击/秒粉碎60秒，以从盲肠组织释放黏膜结合的细菌细胞。将包含来自盲肠黏膜和消化物的细菌的粉碎溶液的整分试样快速冷冻在液氮中，并保存在-20℃，直至进一步分析。通过酚氯仿提取从250μl各样品分离基因组DNA，并用Roche Applied Science的高纯度PCR模板纯化试剂盒(RocheDiagnostics Corp.,Indianapolis,IN)纯化。将来自每种处理的两只鸡的DNA样品等量混合，作为单个样品进行焦磷酸测序，产生来自每个年龄的每种处理四个样品。按之前所述(Dowd等BMC Microbiol.2008 Jul24；8:125)进行细菌标记编码的FLX扩增子焦磷酸测序。用引物28F(5’-GAGTTTGATCNTGGCTCAG)和519R(5’-GTNTTACNGCGGCKGCTG)扩增每个混合样品中的16S rRNA基因的V1-V3区。用Qiime v.1.4.0.软件流水线处理和分析焦磷酸测序数据。简言之，筛选原始序列数据，并根据质量修剪。将所有序列修剪至350bp。根据条形码序列按单个样品保存序列。从序列去除条形码标记和引物，并去除非细菌核糖体序列。用uclust按97％相似性将序列聚类为操作分类单位(OTU)。然后用PyNAST比对来自每个OTU的代表性序列，通过用RDP分类器与SILVA数据库中已知的细菌16S rRNA基因序列进行序列比较来分配分类学。进行序列的随机再抽样来归一化每个样品，使得相同数量的序列得到分析。用方差分析(ANOVA)来确定处理是否显著影响任何纤维水解性微生物区系(分类单位)。
本文所用的术语“纤维水解性微生物区系”意指由于其合成纤维素水解酶和半纤维素水解酶的能力而能够处理复杂的植物多糖的一组微生物。
本文所用的术语“内源性”意指存在于(或源于)个体(例如动物)的GIT中。换言之，纤维水解性内源性微生物区系不是DFM。
优选地，用与本发明的产酶菌株和/或C5糖发酵菌株和/或产短链脂肪酸菌株和/或纤维水解性内源性微生物区系促进菌株包含活微生物。优选地，该产酶菌株和/或C5糖发酵菌株和/或产短链脂肪酸菌株和/或纤维水解性内源性微生物区系促进菌株包含活细菌或活酵母或活真菌。
在一个优选实施方案中，该产酶菌株和/或C5糖发酵菌株和/或产短链脂肪酸菌株和/或纤维水解性内源性微生物区系促进菌株包含活细菌。
术语“活微生物”意指具有代谢活性或能够分化的微生物。
在一个实施方案中，该产酶菌株和/或C5糖发酵菌株和/或产短链脂肪酸菌株和/或纤维水解性内源性微生物区系促进菌株可以是孢子形成细菌，因此术语DFM可由孢子，例如细菌孢子组成，或含有孢子，例如细菌孢子。因此，在一个实施方案中，本文所用的术语“活微生物”可以包括微生物孢子，如内生孢子或分生孢子。
在另一个实施方案中，本发明的饲料添加剂组合物中的产酶菌株和/或C5糖发酵菌株和/或产短链脂肪酸菌株和/或纤维水解性内源性微生物区系促进菌株不由微生物孢子，例如内生孢子或分生孢子组成，或不含有微生物孢子，例如内生孢子或分生孢子。
微生物可为天然存在的微生物或其可以是转化微生物。微生物也可以是适宜的微生物的组合。
在一些方面，本发明的产酶菌株和/或C5糖发酵菌株和/或产短链脂肪酸菌株和/或纤维水解性内源性微生物区系促进菌株可以是以下中的一种或多种：细菌、酵母或真菌。
优选地，本发明的产酶菌株和/或C5糖发酵菌株和/或产短链脂肪酸菌株和/或纤维水解性内源性微生物区系促进菌株是益生微生物。
在本发明中，术语直接饲喂微生物(DFM)涵盖直接饲喂细菌、直接饲喂酵母、直接饲喂真菌及其组合。
优选地，该产酶菌株和/或C5糖发酵菌株和/或产短链脂肪酸菌株和/或纤维水解性内源性微生物区系促进菌株是直接饲喂细菌。
适宜地，该产酶菌株和/或C5糖发酵菌株和/或产短链脂肪酸菌株和/或纤维水解性内源性微生物区系促进菌株可以包含来自以下属中的一个或多个的细菌：芽孢杆菌属、乳杆菌属、丙酸杆菌属及其组合。
在一个实施方案中，该产酶菌株和/或C5糖发酵菌株和/或产短链脂肪酸菌株和/或纤维水解性内源性微生物区系促进菌株可以是选自芽孢杆菌属的菌株。
在一个实施方案中，该产酶菌株和/或C5糖发酵菌株和/或产短链脂肪酸菌株和/或纤维水解性内源性微生物区系促进菌株可以选自以下芽孢杆菌属物种：枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、解淀粉芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、耐盐芽孢杆菌(B.halodurans)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)和迟缓芽孢杆菌(B.lentus)菌株。
在至少一些实施方案中，该枯草芽孢杆菌菌株是枯草芽孢杆菌AGTPBS3BP5、枯草芽孢杆菌AGTP BS442、枯草芽孢杆菌AGTP BS521、枯草芽孢杆菌AGTP BS918、枯草芽孢杆菌AGTP BS1013、枯草芽孢杆菌AGTPBS1069、枯草芽孢杆菌AGTP 944。
在至少一些实施方案中，该枯草芽孢杆菌菌株是枯草芽孢杆菌15A-P4(PTA-6507)、LSSAO1(NRRL B-50104)。
在至少一些实施方案中，该短小芽孢杆菌菌株是短小芽孢杆菌AGTPBS 1068或短小芽孢杆菌KX11-1。
菌株3A-P4(PTA-6506)、15A-P4(PTA-6507)和22C-P1(PTA-6508)可从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)公开获得。菌株2084(NRRL B-500130)、LSSA01(NRRL-B-50104)、BS27(NRRL B-50105)可从美国农业研究机构保藏中心(Agricultural ResearchService Culture Collection,NRRL)公开获得。菌株枯草芽孢杆菌LSSA01有时称为枯草芽孢杆菌8。这些菌株在US 7,754,469 B2中教导。
丹尼斯克美国公司(Danisco USA Inc.)(Waukesha,Wisconsin,USA)按照布达佩斯条约(Budapest Treaty)将以下生物保藏物保藏于美国农业研究机构保藏中心(NRRL)，下文详述原始保藏物的保藏日期和保藏号：
保藏物 保藏号 保藏日期
枯草芽孢杆菌AGTP BS3BP5 NRRL B-50510 2011年5月13日
枯草芽孢杆菌AGTP BS442 NRRL B-50542 2011年8月4日
枯草芽孢杆菌AGTP BS521 NRRL B-50545 2011年8月4日
枯草芽孢杆菌AGTP BS918 NRRL B-50508 2011年5月13日
枯草芽孢杆菌AGTP BS1013 NRRL B-50509 2011年5月13日
枯草芽孢杆菌AGTP BS1069 NRRL B-50544 2011年8月4日
枯草芽孢杆菌AGTP 944 NRRL B-50548 2011年8月11日
短小芽孢杆菌AGTP BS1068 NRRL B-50543 2011年8月4日
短小芽孢杆菌AGTP KXII-1 NRRL B-50546 2011年8月5日
枯草芽孢杆菌BS18 NRRL B-50633 2012年1月9日
枯草芽孢杆菌BS278 NRRL B-50634 2012年1月9日
地衣芽孢杆菌BL842 NRRL B-50516 2011年5月20日
丹尼斯克美国公司(Danisco USA Inc.)(Waukesha,Wisconsin,USA)授权杜邦营养生物科学有限公司(DuPont Nutrition Biosciences ApS)(Langebrogade 1,PO Box 17,DK-1001,Copenhagen K,丹麦)在本专利申请中参考这些保藏的生物材料，并且无保留地且不可撤销地同意公众可获得所保藏的材料。
AgTech Products,Inc.(W227N752Westmound Drive,Waukesha,WI53186,USA)按照布达佩斯条约(Budapest Treaty)将以下生物保藏物保藏于美国农业研究机构保藏中心(NRRL)，下文详述原始保藏物的保藏日期和保藏号：
地衣芽孢杆菌BL21 NRRL B-50134 2008年4月15日
AgTech Products,Inc授权杜邦营养生物科学有限公司(DuPontNutrition Biosciences ApS)(Langebrogade 1,PO Box 17,DK-1001,Copenhagen K,丹麦)在本专利申请中参考此保藏的生物材料，并且无保留地且不可撤销地同意公众可获得所保藏的材料。
下表总结用以上“产酶DFM测定”选择的菌株的产酶能力。
直接饲喂微生物候选菌株酶活性总结。a
表2.芽孢杆菌属菌株的纤维素酶、木聚糖酶和β-甘露聚糖酶活性。
分离菌名称 CMC酶(纤维素酶) 木聚糖酶 β-甘露聚糖酶1
BS27 0.0 4.0 3.0
BL21 3.0 0.0 2.5
BL842 1.0 0.0 2.5
BS18 3.0 3.0 3.5
15AP4 4.0 2.0 2.5
22CP1 3.0 5.0 2.0
3AP4 4.0 2.5 1.5
BS278 4.0 3.0 1.0
LSSAO1 3.5 4.0 3.3
BS2084 4.0 3.0 1.0
BS3BP5 3.3 3.0 N/A
BS442 1.8 2.5 2.0
BS521 6.0 4.0 2.0
BS918 4.0 5.5 3.3
BS1013 6.5 4.0 2.5
BP1068 3.0 6.0 4.5
BS1069 4.0 4.0 2.5
944 6.5 3.5 1.0
KXII-1 2.5 5.0 N/A
1甘露聚糖酶(例如β-甘露聚糖酶)是对这样的一类酶的命名，这类酶可以将β-甘露聚糖、半乳甘露聚糖和葡甘露聚糖的1,4-β-D-糖苷键水解为甘露聚糖寡糖和甘露糖，从而分解含有甘露聚糖的半纤维素(植物细胞壁的主要成分之一)。β-甘露聚糖酶是内切-1,4-β-D-甘露聚糖酶(E.C.3.2.1.78)。
适宜地，用于本发明的产酶菌株和/或C5糖发酵菌株和/或产短链脂肪酸菌株和/或纤维水解性内源性微生物区系促进菌株可以是选自丙酸杆菌属的菌株。在一个实施方案中，用于本发明的DFM可以选自物种丙酸丙酸杆菌。
在一个实施方案中，用于本发明的DFM是丙酸丙酸杆菌P169。
AgTech Products,Inc.(W227N752Westmound Dr.Waukesha,WI53186,USA)于2003年7月28日按照布达佩斯条约(Budapest Treaty)将丙酸丙酸杆菌P169保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，保藏号为PTA-5271。丙酸丙酸杆菌P169在已授权的专利US6,951,643B2中参考，且可从ATCC公开获得。
在一个实施方案中，用于本发明的产酶菌株和/或C5糖发酵菌株和/或产短链脂肪酸菌株和/或纤维水解性内源性微生物区系促进菌株可以是来自肠球菌属的菌株。
在一个实施方案中，用于本发明的DFM可以选自物种屎肠球菌。
在一个实施方案中，用于本发明的DFM可以是屎肠球菌ID7。
乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)ID7(其随后重新分类为屎肠球菌ID7)于2004年6月22日按照布达佩斯条约(Budapest Treaty)作为乳酸乳球菌ID7保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)(Manassas,VA 20110-2209,USA)，保藏号为PTA-6103。乳酸乳球菌ID7(其随后重新分类为屎肠球菌ID7)在已授权的专利US7,384,628中参考，且可从ATCC公开获得。在本文中使用“屎肠球菌ID7”时，它将理解为，此生物的名称可与保藏为保藏号PTA-6103的“乳酸乳球菌ID7”互换。屎肠球菌ID7也可从丹麦丹尼斯克动物营养公司(Danisco Animal Nutrition,Denmark)公开获得。
在一个实施方案中，用于本发明的产酶菌株和/或C5糖发酵菌株和/或产短链脂肪酸菌株和/或纤维水解性内源性微生物区系促进菌株可以是来自乳杆菌属的菌株。
在一个实施方案中，该产酶菌株和/或C5糖发酵菌株和/或产短链脂肪酸菌株和/或纤维水解性内源性微生物区系促进菌株可以选自以下乳杆菌属物种：布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、开菲尔乳杆菌(Lactobacilluskefiri)、双岐乳杆菌(Lactobacillus bifidus)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、类干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)、鼠李糖乳杆菌、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)、路氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、香肠乳杆菌、乳酸乳杆菌、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbreuckii)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、类植物乳杆菌(Lactobacillus paraplantarum)、香肠乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、约氏乳杆菌和詹氏乳杆菌(Lactobacillus jensenii)及其任意组合。
在一个实施方案中，DFM可以选自以下菌株中的一个或多个：鼠李糖乳杆菌CNCM-I-3698和香肠乳杆菌CNCM-I-3699。这些菌株由Sorbial(Route de Spay 72700Allonnes,法国)于2006年12月8日保藏在法国微生物保藏中心(Collection Nationale de Cultures de Microorganims,CNCM)(25,Rue due Docteur Roux,F75724Paris Cedex 15,法国)，保藏物的所有权利、所有权和利益随后转移至Danisco France SAS(20,Rue deBrunel,75017Paris,法国)。
Danisco France SAS授权杜邦营养生物科学有限公司(Langebrogade1,PO Box 17,DK-1001,Copenhagen K,丹麦)在本专利申请中参考这些保藏的生物材料，并且无保留地且不可撤销地同意公众可获得所保藏的材料。
在至少一些实施方案中，该DFM可以选自乳酸乳杆菌DJ6(PTA 6102)和/或乳酸乳杆菌ID7(PTA 6103)。
AgTech Products,Inc.(W227 N752 Westmound Drive,Waukesha,WI53186,USA)按照布达佩斯条约(Budapest Treaty)将以下生物保藏物保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)(Manassas,VA 20110-2209,USA)，下文详述原始保藏物的保藏日期和保藏号：
乳酸乳杆菌DJ6 PTA 6102 2004年6月22日
乳酸乳杆菌ID7 PTA 6103 2004年6月22日
AgTech Products,Inc.授权杜邦营养生物科学有限公司(Langebrogade 1,PO Box 17,DK-1001,Copenhagen K,丹麦)在本专利申请中参考这些保藏的生物材料，并且无保留地且不可撤销地同意公众可获得所保藏的材料。
在至少一个实施方案中，组合本文所述的一种以上菌株。
因此，用于本发明的产酶菌株和/或C5糖发酵菌株和/或产短链脂肪酸菌株和/或纤维水解性内源性微生物区系促进菌株可以是至少两种、适宜地至少三种、适宜地至少四种本文所述的DFM菌株的组合，例如选自枯草芽孢杆菌AGTP BS3BP5、枯草芽孢杆菌AGTP BS442、枯草芽孢杆菌AGTP BS521、枯草芽孢杆菌AGTP BS918、枯草芽孢杆菌AGTP BS1013、枯草芽孢杆菌AGTP BS1069、枯草芽孢杆菌AGTP 944、短小芽孢杆菌AGTP BS 1068、短小芽孢杆菌KX11-1、丙酸杆菌P169、鼠李糖乳杆菌CNCM-I-3698或香肠乳杆菌CNCM-I-3699的DFM菌株。
在一个实施方案中，该DFM可以是枯草芽孢杆菌AGTP BS3BP5、枯草芽孢杆菌AGTP BS442、枯草芽孢杆菌AGTP BS521、枯草芽孢杆菌AGTP BS918、枯草芽孢杆菌AGTP BS1013、枯草芽孢杆菌AGTP BS1069、枯草芽孢杆菌AGTP 944、短小芽孢杆菌AGTP BS 1068、短小芽孢杆菌KX11-1及其组合中的一种或多种。
任意芽孢杆菌属、乳杆菌属或丙酸杆菌属衍生物或变体也包括于并用于本文所描述和要求的方法。
在一些实施方案中，具有枯草芽孢杆菌AGTP BS3BP5、枯草芽孢杆菌AGTP BS442、枯草芽孢杆菌AGTP BS521、枯草芽孢杆菌AGTP BS918、枯草芽孢杆菌AGTP BS1013、枯草芽孢杆菌AGTP BS1069、枯草芽孢杆菌AGTP 944、短小芽孢杆菌AGTP BS 1068或短小芽孢杆菌KX11-1的所有特征的芽孢杆菌属变体菌株也包括于并用于本文所描述和要求的方法。
使用随机扩增多态DNA聚合酶链反应(RAPD-PCR)分析，本文所用的“变体”与所公开的菌株具有至少80％遗传序列同一性。遗传序列的同一性程度可以不同。在一些实施方案中，使用RAPD-PCR分析，该变体与所公开的菌株具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％遗传序列同一性。
可以用于RAPD-PCR分析的六条引物包括以下：
引物1(5’-GGTGCGGGAA-3’)、引物2(5’-GTTTCGCTCC-3’)、引物3(5’-GTAGACCCGT-3’)、引物4(5’-AAGAGCCCGT-3’)、引物5(5’-AACGCGCAAC-3’)、引物6(5’-CCCGTCAGCA-3’)。RAPD分析可以用Ready-to-GoTMRAPD Analysis Beads(Amersham Biosciences,Sweden)进行，其设计为用于进行RAPD分析的预混合、预分装反应。
用于本发明的直接饲喂细菌可以属于相同类型(属、种和菌株)或可以包含属、种和/或菌株的混合物。
优选地，待按照本发明使用的DFM是通常认为安全且优选经GRAS批准的微生物。
本领域技术人员将容易地认识到来自用于食品和/或农业及通常认为适于动物食用的本文所述属内的微生物的具体物种和/或菌株。
优选地，根据本发明使用的DFM是适于动物食用的DFM。
有利地，若产品是饲料或饲料添加剂组合物，则活的DFM应在零售商提供饲料或饲料添加剂组合物用于销售的整个产品的正常“保质”或“有效”日期期间保持有效。所期望的时间长度以及正常的货架期将因饲料不同而不同，并且本领域技术人员应认识到货架期将取决于饲料类型、饲料尺寸、储存温度、处理条件、包装材料和包装设备而不同。
在一些实施方案中，重要的是，DFM能耐受热，即是耐热的。在将饲料制丸(pelleted)的情形下尤其如此。因此，在一个实施方案中，DFM可以是耐热微生物，例如耐热细菌，包括例如芽孢杆菌属物种。
在一些实施方案中，可以优选的是，DFM是产孢子细菌，如芽孢杆菌，例如芽孢杆菌属物种。在生长条件不利时，芽孢杆菌能够形成稳定的内生孢子，并且其对热、pH、水分和消毒剂具有极强抗性。
适宜地，该DFM不是灭活微生物。
在一个实施方案中，该DFM可以是以分离或半分离的形式使用的活的或死的微生物。DFM可以与在其中培养它的生长培养基组合或不组合使用。
在一个实施方案中，在培养在适当介质上时，DFM能够产生集落形成单位。该适当介质可以包含饲料或饲料组分(或由其组成)。
在一个实施方案中，在适当介质上培养时，DFM不能产生集落形成单位。该适当介质可以包含饲料或饲料组分(或由其组成)。
无论DFM在适当介质上培养时是否能够或不能够产生集落形成单位——细胞仍可以具有代谢活性(例如，即使它们不能分裂)。
在一个实施方案中，DFM可以作为死细胞施用。
在一个实施方案中，DFM可以作为活微生物施用。
可适当地加入DFM。
适宜地，饲料中DFM的剂量可介于约1×103CFU/g饲料至约1×109CFU/g饲料之间，适宜地介于约1×104CFU/g饲料至约1×108CFU/g饲料之间，适宜地介于约7.5×104CFU/g饲料至约1×107CFU/g饲料之间。
在一个实施方案中，DFM是按超过约1×103CFU/g饲料、适宜地超过约1×104CFU/g饲料、适宜地超过约7.5×104CFU/g饲料加入饲料中。
适宜地，饲料添加剂组合物中DFM的剂量可介于约1x105CFU/g组合物至约1x1013CFU/g组合物之间，适宜地介于约1x106CFU/g组合物至约1x1012CFU/g组合物之间，适宜地介于约3.75x107CFU/g组合物至约1x1011CFU/g组合物之间。
在一个实施方案中，DFM是按超过约1×105CFU/g组合物、适宜地超过约1×106CFU/g组合物、适宜地超过约3.75×107CFU/g组合物加入饲料添加剂组合物中。
在优选实施方案中，DFM可以按介于约5x107至约1x109CFU/g组合之间、适宜地按介于约1x108至约5x108CFU/g组合之间加入饲料添加剂组合物中。
在另一优选实施方案中，DFM可以按介于约5x103至约5x105U/g组合之间、适宜地按介于约1x104至约1x105CFU/g组合之间加入饲料添加剂组合物中。
纤维降解酶
本文教导的DFM可以与至少一种木聚糖酶和至少一种β-葡聚糖酶(及可选的至少一种其他纤维降解酶)组合使用。
β-葡聚糖酶或内切-葡聚糖酶是对这样的一类酶的命名，这类酶可以将(1,4)-β-葡聚糖、(1,3；1,4)-β-葡聚糖和纤维素的(1,3)-β-D-糖苷键和/或(1,4)-β-D-糖苷键水解为葡萄糖寡糖和葡萄糖，从而分解植物细胞壁的主要成分纤维素和半纤维素。
用于本发明的β-葡聚糖酶可以是任意市售β-葡聚糖酶。
在一个实施方案中，该β-葡聚糖酶是内切葡聚糖酶，例如内切-1,4-β-D-葡聚糖酶(分类为E.C.3.2.1.4)。
适宜地，用于本发明的β-葡聚糖酶可以是来自芽孢杆菌属、木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)、Thermomyces、镰孢属(Fusarium)和青霉属(Penicillium)的β-葡聚糖酶。
在一个实施方案中，该纤维降解酶可以是产生自选自以下的一种或多种表达宿主的β-葡聚糖酶：迟缓芽孢杆菌、黑曲霉(Aspergillus niger)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、绳状青霉(Penicillium funiculosum)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、特异腐质霉(Humicola insolens)、解淀粉芽孢杆菌、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)。
在一个实施方案中，该纤维降解酶可以是以下包含至少一种β-葡聚糖酶纤维降解酶的市售产品中的一种或多种：
GT或BG(可获自AB Vista)；Rovabio(可获自Adisseo)；DC和(可获自Andres PintalubaS.A.)；XG10(来自Aveve)； TS或TS/L(可获自BASF)；1210、SX、GP、GV、8100、9102、tp100、XB、1100、1110、1202、sf或SP(可获自Danisco AnimalNutrition)；Bio-FeedRonozymeRonozyme或Roxazyme(可获自DSM)；Hostazym(可获自Huvepharma)；Kemzyme W干粉或Kemzyme W液体(可获自Kemin)；Biogalactosidase BL(可获自Kerry Ingredients)；Safizyme G(可获自Le Saffre)；或Feedlyve AGL(可获自Lyven)。
在一个实施方案中，该β-葡聚糖酶可以获自
β-葡聚糖酶可以按任意适宜的量加入。
在一个实施方案中，用于本发明的β-葡聚糖酶可以按约50BGU/kg饲料至约50000BGU/kg饲料、适宜地约100BGU/kg饲料至约1000BGU/kg饲料的范围存在于饲料中。
用于本发明的β-葡聚糖酶可以按约75BGU/kg饲料至约400BGU/kg饲料、适宜地约150BGU/kg饲料至约200BGU/kg饲料的范围存在于饲料中。
在一个实施方案中，β-葡聚糖酶按少于1000BGU/kg饲料、适宜地少于约500BGU/kg饲料、适宜地少于250BGU/kg饲料存在于饲料中。
在一个实施方案中，β-葡聚糖酶按超过75BGU/kg饲料、适宜地超过100BGU/kg饲料存在于饲料中。
适宜地，β-葡聚糖酶按约150BGU/g组合物至约3000BGU/g组合物的范围、适宜地按约300BGU/g组合物至约1500BGU/g组合物的范围存在于饲料添加剂组合物中。
在一个实施方案中，β-葡聚糖酶按少于5000BGU/g组合物、适宜地按少于4000BGU/g组合物、适宜地按少于3000BGU/g组合物、适宜地按少于2000BGU/g组合物存在于饲料添加剂组合物中。
在一个实施方案中，β-葡聚糖酶按超过50BGU/g组合物、适宜地按超过100BGU/g组合物、适宜地按超过125BGU/g组合物存在于饲料添加剂组合物中。
在一些实施方案中，可以用本文教导的“β-葡聚糖酶活性测定(BGU)”计算β-葡聚糖酶的活性。
在一个实施方案中，用于本发明的β-葡聚糖酶可以具有用本文教导的“β-葡聚糖酶活性测定(CMC U/g)”测定的β-葡聚糖酶活性。
本文所用的术语“纤维降解酶”可以包括一种或多种以下纤维降解酶：木聚糖酶(例如内切-1,4-β-D-木聚糖酶(E.C.3.2.1.8)或1,4β-木糖苷酶(E.C.3.2.1.37))、β-葡聚糖酶(E.C.3.2.1.4)、纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.176和E.C.3.2.1.91)、β-葡糖苷酶(E.C.3.2.1.21)、阿魏酸酯酶(E.C.3.1.1.73)、α-阿拉伯呋喃糖苷酶(E.C.3.2.1.55)、果胶酶(例如内聚半乳糖醛酸酶(E.C.3.2.1.15)、聚半乳糖醛酸外切酶(E.C.3.2.1.67)或果胶酸裂合酶(E.C.4.2.2.2))，或其组合。
本文所用的术语“其他纤维降解酶”可以包括一种或多种以下纤维降解酶：纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.176和E.C.3.2.1.91)、β-葡糖苷酶(E.C.3.2.1.21)、β-木糖苷酶(E.C.3.2.1.37)、阿魏酸酯酶(E.C.3.1.1.73)、α-阿拉伯呋喃糖苷酶(E.C.3.2.1.55)、果胶酶(例如内聚半乳糖醛酸酶(E.C.3.2.1.15)、聚半乳糖醛酸外切酶(E.C.3.2.1.67)或果胶酸裂合酶(E.C.4.2.2.2))，或其组合。
本领域技术人员还将理解，“其他纤维降解酶”可以涵盖多种其他纤维降解酶。
在一个实施方案中，本文教导的DFM可以与至少一种木聚糖酶、至少一种β-葡聚糖酶和至少一种其他纤维降解酶组合使用。
在另一个实施方案中，本文教导的DFM可以与至少一种木聚糖酶、至少一种β-葡聚糖酶和两种(或至少两种)其他纤维降解酶组合使用。
在另一个实施方案中，本文教导的DFM可以与至少一种木聚糖酶、至少一种β-葡聚糖酶和三种(或至少三种)其他纤维降解酶组合使用。
在另一个实施方案中，本文教导的DFM可以与至少一种木聚糖酶、至少一种β-葡聚糖酶和四种(或至少四种)其他纤维降解酶组合使用。
在一个实施方案中，本文教导的DFM可以与含有可测量的本发明的一种或多种酶活性的培养基或固态发酵产物组合使用。
在一个实施方案中，本文教导的DFM可以与本发明的酶组合使用，该酶是分离或纯化的形式。
在一个实施方案中，本文教导的DFM可以与本发明的酶组合使用，该酶对组合物中的DFM而言是外源的(例如，如果该DFM是产酶菌株)。
优选地，该一种或多种纤维降解酶按约0.05至5g酶蛋白质/公吨(MT)饲料(或mg/kg)的范围存在于饲料中。
适宜地，每种纤维降解酶可以按约0.05至5g酶蛋白质/公吨(MT)饲料(或mg/kg)的范围存在于饲料中。
适宜地，总的纤维降解酶按约0.05至5g酶蛋白质/公吨(MT)饲料(或mg/kg)的范围存在于饲料中。
优选地，该一种或多种纤维降解酶按约0.05至100mg蛋白质/g组合物的范围存在于饲料添加剂组合物(或预混物)中(例如饲粮中总计包含50至1000g/MT)。
优选地，每种纤维降解酶按约0.05至100mg蛋白质/g组合物的范围存在于饲料添加剂组合物(或预混物)中(例如饲粮中总计包含50至1000g/MT)。
优选地，总的纤维降解酶按约0.05至100mg蛋白质/g组合物的范围存在于饲料添加剂组合物(或预混物)中(例如饲粮中总计包含50至1000g/MT)。
在优选实施方案中，纤维降解酶(例如每种纤维降解酶或总的纤维降解酶)可以按约50至约700g/MT饲料的范围存在于饲料添加剂组合物(或预混物)中。适宜地，纤维降解酶(例如每种纤维降解酶或总的纤维降解酶)可以按约100至约500g/MT饲料的范围存在于饲料添加剂组合物(或预混物)中。
在一个实施方案中，用于本发明的一种或多种其他纤维降解酶可以包含纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.176和E.C.3.2.1.91)(或基本上由其组成，或由其组成)。
在另一个实施方案中，用于本发明的一种或多种其他纤维降解酶可以包含β-葡糖苷酶(E.C.3.2.1.21)(或基本上由其组成，或由其组成)。
适宜地，该一种或多种其他纤维降解酶可以包含纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.176和E.C.3.2.1.91)、β-葡糖苷酶(E.C.3.2.1.21)或其组合(或基本上由其组成，或由其组成)。
在另一个实施方案中，用于本发明的一种或多种其他纤维降解酶可以包含β-木糖苷酶(E.C.3.2.1.37)(或基本上由其组成，或由其组成)。
在一个实施方案中，用于本发明的一种或多种纤维降解酶可以包含阿魏酸酯酶(E.C.3.1.1.73)(或基本上由其组成，或由其组成)。
在另一个实施方案中，用于本发明的一种或多种其他纤维降解酶可以包含α-阿拉伯呋喃糖苷酶(E.C.3.2.1.55)(或基本上由其组成，或由其组成)。
还在另一个实施方案中，用于本发明的一种或多种其他纤维降解酶可以包含果胶酶(例如内聚半乳糖醛酸酶(E.C.3.2.1.15)、聚半乳糖醛酸外切酶(E.C.3.2.1.67)或果胶酸裂合酶(E.C.4.2.2.2))(或基本上由其组成，或由其组成)。
在优选实施方案中，用于本发明的一种或多种其他纤维降解酶可以包含选自内聚半乳糖醛酸酶(E.C.3.2.1.15)、聚半乳糖醛酸外切酶(E.C.3.2.1.67)和果胶酸裂合酶(E.C.4.2.2.2)的一种或多种(适宜地两种或多种、适宜地三种)果胶酶(或基本上由其组成，或由其组成)。
在一个实施方案中，用于本发明的一种或多种其他纤维降解酶可以包含纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.176和E.C.3.2.1.91)、β-葡糖苷酶(E.C.3.2.1.21)、β-木糖苷酶(E.C.3.2.1.37)、阿魏酸酯酶(E.C.3.1.1.73)、α-阿拉伯呋喃糖苷酶(E.C.3.2.1.55)和/或果胶酶(例如内聚半乳糖醛酸酶(E.C.3.2.1.15)、聚半乳糖醛酸外切酶(E.C.3.2.1.67)或果胶酸裂合酶(E.C.4.2.2.2))(或基本上由其组成，或由其组成)。
本发明涉及至少一种木聚糖酶与至少一种β-葡聚糖酶和至少一种本文教导的具体DFM的组合。
在优选实施方案中，至少一种木聚糖酶、至少一种β-葡聚糖酶和至少一种本文教导的具体DFM可以与本文教导的其他纤维水解酶组合。
本发明还涉及至少一种木聚糖酶和至少一种β-葡聚糖酶与至少两种、如至少三种或至少四种或至少五种其他纤维降解酶和至少一种本文教导的具体DFM的组合。
木聚糖酶是对这样的一类酶的命名，这类酶将线性多糖β-1,4-木聚糖降解为木糖，从而分解植物细胞壁主要成分之一的半纤维素。
用于本发明的木聚糖酶可以是任意市售木聚糖酶。
适宜地，该木聚糖酶可以是内切-1,4-β-d-木聚糖酶(分类为E.C.3.2.1.8)。
在一个实施方案中，优选地，该木聚糖酶是内切木聚糖酶，例如内切-1,4-β-d-木聚糖酶。内切-1,4-β-d-木聚糖酶的分类是E.C.3.2.1.8。
在一个实施方案中，本发明涉及DFM与内切木聚糖酶(例如内切-1,4-β-d-木聚糖酶)和另一种酶的组合。
本文提到的所有E.C.酶分类涉及Enzyme Nomenclature–Recommendations(1992)of the nomenclature committee of theInternational Union of Biochemistry and Molecular Biology–ISBN0-12-226164-3中提供的分类。
适宜地，用于本发明的木聚糖酶可以是来自芽孢杆菌属或木霉属的木聚糖酶。
在一个实施方案中，该木聚糖酶可以是包含本文显示为SEQ ID No.1的氨基酸序列(或由其组成)的木聚糖酶、包含本文显示为SEQ ID No.2的氨基酸序列(或由其组成)的木聚糖酶、或包含本文显示为SEQ ID No.3的氨基酸序列(或由其组成)的木聚糖酶(FveXyn4)、来自里氏木霉的木聚糖酶、Econase XTTM或Rovabio ExcelTM。
在一个实施方案中，该木聚糖酶可以是Axtra或Avizyme或AxtraXBTM(二者都是来自Danisco A/S的市售产品)中的木聚糖酶。
在一个优选实施方案中，用于本发明的木聚糖酶可以是一种或多种以下市售产品中的一种或多种木聚糖酶：
在一个实施方案中，该木聚糖酶可以是包含本文显示为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ IDNo.11或SEQ ID No.12的多肽序列(或由其组成)的木聚糖酶；或其与SEQID No.1或SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11或SEQ ID No.12具有至少75％同一性(如至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性)的变体、同源物、片段或衍生物；或包含具有至少一个氨基酸的保守取代的ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ IDNo.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11或SEQ ID No.12的多肽序列。
在一个实施方案中，该木聚糖酶可以包含本文显示为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQ ID No.3的多肽序列，或其与SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2或SEQ ID No.3具有至少98.5％(例如至少98.8或99或99.1或99.5％)同一性的变体、同源物、片段或衍生物。
SEQ ID No.1：
mklssflytaslvaaIPTAIEPRQAADSINKLIKNKGKLYYGTITDPNLLGVAKDTAIIKADFGAVTPENSGKWDATEPSQGKFNFGSFDQVVNFAQQNGLKVRGHTLVWHSQLPQWVKNINDKATLTKVIENHVTQVVGRYKGKIYAWDVVNEIFEWDGTLRKDSHFNNVFGNDDYVGIAFRAARKADPNAKLYINDYSLDSGSASKVTKGMVPSVKKWLSQGVPVDGIGSQTHLDPGAAGQIQGALTALANSGVKEVAITELDIRTAPANDYATVTKACLNVPKCIGITVWGVSDKNSWRKEHDSLLFDANYNPKPAYTAVVNALR
SEQ ID No.2：
IPTAIEPRQAADSINKLIKNKGKLYYGTITDPNLLGVAKDTAIIKADFGAVTPENSGKWDATEPSQGKFNFGSFDQVVNFAQQNGLKVRGHTLVWHSQLPQWVKNINDKATLTKVIENHVTQVVGRYKGKIYAWDVVNEIFEWDGTLRKDSHFNNVFGNDDYVGIAFRAARKADPNAKLYINDYSLDSGSASKVTKGMVPSVKKWLSQGVPVDGIGSQTHLDPGAAGQIQGALTALANSGVKEVAITELDIRTAPANDYATVTKACLNVPKCIGITVWGVSDKNSWRKEHDSLLFDANYNPKPAYTAVVNALR
SEQ ID No.3：
QAADSINKLIKNKGKLYYGTITDPNLLGVAKDTAIIKADFGAVTPENSGKWDATEPSQGKFNFGSFDQVVNFAQQNGLKVRGHTLVWHSQLPQWVKNINDKATLTKVIENHVTQVVGRYKGKIYAWDVVNEIFEWDGTLRKDSHFNNVFGNDDYVGIAFRAARKADPNAKLYINDYSLDSGSASKVTKGMVPSVKKWLSQGVPVDGIGSQTHLDPGAAGQIQGALTALANSGVKEVAITELDIRTAPANDYATVTKACLNVPKCIGITVWGVSDKNSWRKEHDSLLFDANYNPKPAYTAVVNALR
SEQ ID No.4：
mklssflytaslvaaIPTAIEPRQASDSINKLIKNKGKLYYGTITDPNLLGVAKDTAIIKADFGAVTPENSGKWDATEPSQGKFNFGSFDQVVNFAQQNGLKVRGHTLVWHSQLPQWVKNINDKATLTKVIENHVTNVVGRYKGKIYAWDVVNEIFDWDGTLRKDSHFNNVFGNDDYVGIAFRAARKADPNAKLYINDYSLDSGSASKVTKGMVPSVKKWLSQGVPVDGIGSQTHLDPGAAGQIQGALTALANSGVKEVAITELDIRTAPANDYATVTKACLNVPKCIGITVWGVSDKNSWRKEHDSLLFDANYNPKAAYTAVVNALR
SEQ ID No.5：
IPTAIEPRQASDSINKLIKNKGKLYYGTITDPNLLGVAKDTAIIKADFGAVTPENSGKWDATEPSQGKFNFGSFDQVVNFAQQNGLKVRGHTLVWHSQLPQWVKNINDKATLTKVIENHVTNVVGRYKGKIYAWDVVNEIFDWDGTLRKDSHFNNVFGNDDYVGIAFRAARKADPNAKLYINDYSLDSGSASKVTKGMVPSVKKWLSQGVPVDGIGSQTHLDPGAAGQIQGALTALANSGVKEVAITELDIRTAPANDYATVTKACLNVPKCIGITVWGVSDKNSWRKEHDSLLFDANYNPKAAYTAVVNALR
SEQ ID No.6：
QASDSINKLIKNKGKLYYGTITDPNLLGVAKDTAIIKADFGAVTPENSGKWDATEPSQGKFNFGSFDQVVNFAQQNGLKVRGHTLVWHSQLPQWVKNINDKATLTKVIENHVTNVVGRYKGKIYAWDVVNEIFDWDGTLRKDSHFNNVFGNDDYVGIAFRAARKADPNAKLYINDYSLDSGSASKVTKGMVPSVKKWLSQGVPVDGIGSQTHLDPGAAGQIQGALTALANSGVKEVAITELDIRTAPANDYATVTKACLNVPKCIGITVWGVSDKNSWRKEHDSLLFDANYNPKAAYTAVVNALR
SEQ ID No.7：
mvsfkylflaasalgalaAPVEVEESSWFNETALHEFAERAGTPSSTGWNNGYYYSFWTDNGGTVNYQNGNGGSYSVQWKDTGNFVGGKGWNPGSARTINYSGSFNPSGNAYLTVYGWTTNPLVEYYIVENYGTYNPGNGGTYRGSVYSDGANYNIYTATRYNAPSIEGDKTFTQYWSVRQSKRTGGTVTTANHFNAWAQLGMSLGTHNYQIVATEGYQSSGSSSITVY
SEQ ID No.8：
APVEVEESSWFNETALHEFAERAGTPSSTGWNNGYYYSFWTDNGGTVNYQNGNGGSYSVQWKDTGNFVGGKGWNPGSARTINYSGSFNPSGNAYLTVYGWTTNPLVEYYIVENYGTYNPGNGGTYRGSVYSDGANYNIYTATRYNAPSIEGDKTFTQYWSVRQSKRTGGTVTTANHFNAWAQLGMSLGTHNYQIVATEGYQSSGSSSITVY
SEQ ID No.9：
AGTPSSTGWNNGYYYSFWTDNGGTVNYQNGNGGSYSVQWKDTGNFVGGKGWNPGSARTINYSGSFNPSGNAYLTVYGWTTNPLVEYYIVENYGTYNPGNGGTYRGSVYSDGANYNIYTATRYNAPSIEGDKTFTQYWSVRQSKRTGGTVTTANHFNAWAQLGMSLGTHNYQIVATEGYQSSGSSSITVY
SEQ ID No.10：
MVSFTSLLAAVSAVTGVMALPSAQPVDGMSVVERDPPTNVLDKRTQPTTGTSGGYYFSFWTDTPNSVTYTNGNGGQFSMQWSGNGNHVGGKGWMPGTSRTIKYSGSYNPNGNSYLAVYGWTRNPLIEYYIVENFGTYNPSSGGQKKGEVNVDGSVYDIYVSTRVNAPSIDGNKTFQQYWSVRRNKRSSGSVNTGAHFQAWKNVGLNLGTHDYQILAVEGYYSSGSASMTVSQ
SEQ ID No.11：
LPSAQPVDGMSVVERDPPTNVLDKRTQPTTGTSGGYYFSFWTDTPNSVTYTNGNGGQFSMQWSGNGNHVGGKGWMPGTSRTIKYSGSYNPNGNSYLAVYGWTRNPLIEYYIVENFGTYNPSSGGQKKGEVNVDGSVYDIYVSTRVNAPSIDGNKTFQQYWSVRRNKRSSGSVNTGAHFQAWKNVGLNLGTHDYQILAVEGYYSSGSASMTVSQ
SEQ ID No.12：
TQPTTGTSGGYYFSFWTDTPNSVTYTNGNGGQFSMQWSGNGNHVGGKGWMPGTSRTIKYSGSYNPNGNSYLAVYGWTRNPLIEYYIVENFGTYNPSSGGQKKGEVNVDGSVYDIYVSTRVNAPSIDGNKTFQQYWSVRRNKRSSGSVNTGAHFQAWKNVGLNLGTHDYQILAVEGYYSSGSASMTVSQ
优选地，木聚糖酶按约500XU/kg饲料至约16,000XU/kg饲料、更优选约750XU/kg饲料至约8000XU/kg饲料和甚至更优选约1000XU/kg饲料至约4000XU/kg饲料的范围存在于饲料中。
在一个实施方案中，木聚糖酶按超过约500XU/kg饲料、适宜地超过约600XU/kg饲料、适宜地超过约700XU/kg饲料、适宜地超过约800XU/kg饲料、适宜地超过约900XU/kg饲料、适宜地超过约1000XU/kg饲料存在于饲料中。
在一个实施方案中，木聚糖酶按少于约16,000XU/kg饲料、适宜地少于约8000XU/kg饲料、适宜地少于约7000XU/kg饲料、适宜地少于约6000XU/kg饲料、适宜地少于约5000XU/kg饲料、适宜地少于约4000XU/kg饲料存在于饲料中。
优选地，木聚糖酶按约100XU/g组合物至约320,000XU/g组合物、更优选约300XU/g组合物至约160,000XU/g组合物、甚至更优选约500XU/g组合物至约50,000XU/g组合物和甚至更优选500XU/g组合物至约40,000XU/g组合物的范围存在于饲料添加剂组合物中。
在一个实施方案中，木聚糖酶按超过约100XU/g组合物、适宜地超过约200XU/g组合物、适宜地超过约300XU/g组合物、适宜地超过约400XU/g组合物、适宜地超过约500XU/g组合物存在于饲料添加剂组合物中。
在一个实施方案中，木聚糖酶按少于约320,000XU/g组合物、适宜地少于约160,000XU/g组合物、适宜地少于约50,000XU/g组合物、适宜地少于约40,000XU/g组合物、适宜地少于约30000XU/g组合物存在于饲料添加剂组合物中。
木聚糖酶活性可以表示为按本文教导的“木聚糖酶活性测定(XU)”中所教导测量的木聚糖酶单位(XU)。还见Bailey,M.J.Biely,P.和Poutanen,K.,Journal of Biotechnology,23卷,(3),1992年5月,257-270，其所教导的内容在此引入作为参考。
在一个实施方案中，适宜地，采用上述E.C.分类对酶进行分类，并且E.C.分类指示在本文教导的用于测定1XU的“木聚糖酶活性测定(XU)”中测试时具有该活性的酶。
在一个实施方案中，用于本发明的木聚糖酶可以具有用本文教导的“木聚糖酶活性测定(ABX U/g)”测定的木聚糖酶活性。
酶活性和测定
在一个实施方案中，饲料添加剂组合物可以包含DFM与木聚糖酶和β-葡聚糖酶的组合。
在一个实施方案中，可以用本文教导的“木聚糖酶活性测定(XU)”计算木聚糖酶活性。
在另一个实施方案中，可以用本文教导的“β-葡聚糖酶活性测定(BGU)”计算β-葡聚糖酶活性。
适宜地，可以按下表所示加入DFM与木聚糖酶和β-葡聚糖酶的组合：
每克或每千克最终饲料中组分的剂量
木聚糖酶(例如内切-1,4-β-d-木聚糖酶)活性 500-16000XU/kg(优选2500-4000XU/kg)
β-葡聚糖酶活性 50-5000BGU/kg(优选200-400BGU/kg)
DFM 1x104-1x109CFU/g(优选5x104-5x108CFU/g)
可以按前一章节中所教导计算每种酶的以单位显示的酶活性。
在一些实施方案中，饲料添加剂组合物可以包含DFM与本文教导的木聚糖酶、β-葡聚糖酶和其他纤维降解酶的组合。
适宜地，可以按下表中所示加入木聚糖酶、β-葡聚糖酶和其他纤维降解酶：
在一个实施方案中，优选地，饲料包含以下：
至少1000XU/kg至5000XU/kg(适宜地至少2000XU/kg至4500XU/kg)饲料的木聚糖酶；
至少100BGU/kg至4000BGU/kg(适宜地至少150BGU/kg至3000BGU/kg)的β-葡聚糖酶；和
至少50,000CFU/g至200,000CFU/g(适宜地至少70,000CFU/g至175,000CFU/g)饲料的本文教导的DFM。
在另一个实施方案中，优选地，饲料包含以下：
至少1000XU/kg至5000XU/kg(适宜地至少2000XU/kg至4500XU/kg)饲料的木聚糖酶；
至少100BGU/kg至4000BGU/kg(适宜地至少150BGU/kg至3000BGU/kg)的β-葡聚糖酶；和
至少37,500CFU/g至100,000CFU/g(适宜地至少37,500CFU/g至75,000CFU/g)饲料的本文教导的DFM。
在另一个实施方案中，优选地，饲料包含以下：
至少1000XU/kg至5000XU/kg(适宜地至少2000XU/kg至4500XU/kg)饲料的木聚糖酶；
至少200-2000CMC U/kg(适宜地至少500-1500CMC U/kg)饲料的β-葡聚糖酶；
至少50,000CFU/g至200,000CFU/g(适宜地至少70,000CFU/g至175,000CFU/g)饲料的本文教导的DFM；和
包含至少800-3500ABX U/kg(适宜地至少1000-2750ABX U/g)饲料和500-3000pNPG U/kg(适宜地至少600-2000pNPG U/kg)饲料的其他纤维降解酶混合物。
在另一个实施方案中，优选地，饲料包含以下：
至少1000XU/kg至5000XU/kg(适宜地至少2000XU/kg至4500XU/kg)饲料的木聚糖酶；
至少200-2000CMC U/kg(适宜地至少500-1500CMC U/kg)饲料的β-葡聚糖酶；
至少37,500CFU/g至100,000CFU/g(适宜地至少37,500CFU/g至75,000CFU/g)饲料的本文教导的DFM；和
包含至少800-3500ABX U/kg(适宜地至少1000-2750ABX U/g)饲料和500-3000pNPG U/kg(适宜地至少600-2000pNPG U/kg)饲料的其他纤维降解酶混合物。
在一个实施方案中，DFM可以根据存在于组合物中的木聚糖酶的单位数加入。在一个实施方案中，DFM可以按从6.25x101CFU DFM:1XU酶至2x109CFU DFM:1XU酶的范围、优选按从1.88x104CFU DFM:1XU酶至1.0x107CFU DFM:1XU酶的范围加入。本文教导的DFM可以与木聚糖酶和β-葡聚糖酶组合使用。
在另一个实施方案中，本文教导的DFM可以与木聚糖酶、β-葡聚糖酶和其他纤维降解酶组合使用。在优选实施方案中，该其他纤维降解酶可以是β-葡糖苷酶。
在一个实施方案中，用于本发明的木聚糖酶可以具有用本文教导的“木聚糖酶活性测定(ABX U/g)”测定的木聚糖酶活性。
在另一个实施方案中，用于本发明的β-葡聚糖酶可以具有用本文教导的“β-葡聚糖酶活性测定(CMC U/g)”测定的β-葡聚糖酶活性。
还在另一个实施方案中，用于本发明的β-葡糖苷酶可以具有用本文教导的“β-葡糖苷酶活性测定(pNPG U/g)”测定的β-葡糖苷酶活性。
在一个实施方案中，本文教导的DFM可以与木聚糖酶和β-葡聚糖酶组合使用，其中该木聚糖酶和β-葡聚糖酶具有下表中所示的活性：
1一个ABX单位定义为在50℃和pH 5.3下每分钟产生1μmol木糖还原糖当量所需的酶量。
2一个CMC活性单位在50℃和pH 4.8下在1分钟内释放1μmol还原糖(表示为葡萄糖当量)。
在优选实施方案中，本文教导的DFM可以与木聚糖酶、β-葡聚糖酶和β-葡糖苷酶组合使用，其中该木聚糖酶、β-葡聚糖酶和β-葡糖苷酶具有下表中所示的活性：
1一个ABX单位定义为在50℃和pH 5.3下每分钟产生1μmol木糖还原糖当量所需的酶量。
2一个CMC活性单位在50℃和pH 4.8下在1分钟内释放1μmol还原糖(表示为葡萄糖当量)。
3一个pNPG单位表示在50℃和pH 4.8下每分钟从对-硝基苯基-B-D-吡喃葡糖苷释放1μmol硝基-苯酚。
在一个实施方案中，用于本发明的木聚糖酶和β-葡聚糖酶可以分别包含超过约3000ABX u/g木聚糖酶活性和约2000-2600CMC u/gβ-葡聚糖酶活性(或基本上由其组成，或由其组成)。
适宜地，用于本发明的木聚糖酶、β-葡聚糖酶和β-葡糖苷酶可以分别包含超过约3000ABX u/g木聚糖酶活性、约2000-2600CMC u/gβ-葡聚糖酶活性和超过约2000pNPG u/gβ-葡糖苷酶活性(或基本上由其组成，或由其组成)。
在一个实施方案中，用于本发明的木聚糖酶可以包含用“木聚糖酶活性测定(ABX U/g)”测定的至少2000ABX u/g木聚糖酶活性(适宜地至少2500ABX u/g活性、适宜地至少3000ABX u/g活性)(或基本上由其组成，或由其组成)。
适宜地，用于本发明的木聚糖酶可以包含用“木聚糖酶活性测定(ABXU/g)”测定的约2000至约5000ABX u/g木聚糖酶活性(适宜地至少约2500至约4000ABX u/g活性、适宜地至少约3000至约4000ABX u/g活性)(或基本上由其组成，或由其组成)。
在另一个实施方案中，用于本发明的β-葡聚糖酶可以包含用“β-葡聚糖酶活性测定(CMC U/g)”测定的至少1000CMC u/gβ-葡聚糖酶活性(适宜地至少1500CMC u/g活性、适宜地至少2000CMC u/g活性)(或基本上由其组成，或由其组成)。
适宜地，用于本发明的β-葡聚糖酶可以包含用“β-葡聚糖酶活性测定(CMC U/g)”测定的约600至约4000CMC u/gβ-葡聚糖酶活性(适宜地至少约1000至约3000CMC u/g活性、适宜地至少约1500至约2600CMC u/g活性)(或基本上由其组成，或由其组成)。
在另一个实施方案中，用于本发明的β-葡糖苷酶可以包含用“β-葡糖苷酶活性测定(pNPG U/g)”测定的至少300pNPG u/gβ-葡糖苷酶活性(适宜地至少500pNPG u/g活性、适宜地至少1000pNPG u/g活性或适宜地至少2000pNPG u/g活性)(或基本上由其组成，或由其组成)。
适宜地，用于本发明的β-葡糖苷酶可以包含用“β-葡糖苷酶活性测定(pNPG U/g)”测定的至少约200至约4000pNPG u/gβ-葡糖苷酶活性(适宜地至少约300至约3000pNPG u/g活性、适宜地至少约1000至约3000pNPG u/g活性或适宜地至少约2000至约3000pNPG u/g活性)(或基本上由其组成，或由其组成)。
适宜地，本文教导的DFM可以与木聚糖酶和β-葡聚糖酶组合使用，该木聚糖酶和β-葡聚糖酶包含用“木聚糖酶活性测定(ABX U/g)”测定的至少2000ABX u/g木聚糖酶活性(适宜地至少2500ABX u/g活性、适宜地至少3000ABX u/g活性)，及用“β-葡聚糖酶活性测定(CMC U/g)”测定的至少1000CMC u/gβ-葡聚糖酶活性(适宜地至少1500CMC u/g活性、适宜地至少2000CMC u/g活性)(或基本上由其组成，或由其组成)。
适宜地，本文教导的DFM可以与木聚糖酶、β-葡聚糖酶和β-葡糖苷酶组合使用，该木聚糖酶、β-葡聚糖酶和β-葡糖苷酶包含用“木聚糖酶活性测定(ABX U/g)”测定的至少2000ABX u/g木聚糖酶活性(适宜地至少2500ABX u/g活性、适宜地至少3000ABX u/g活性)，用“β-葡聚糖酶活性测定(CMC U/g)”测定的至少1000CMC u/gβ-葡聚糖酶活性(适宜地至少1500CMC u/g活性、适宜地至少2000CMC u/g活性)，及用“β-葡糖苷酶活性测定(pNPG U/g)”测定的至少300pNPG u/gβ-葡糖苷酶活性(适宜地至少500pNPG u/g活性、适宜地至少1000pNPG u/g活性或适宜地至少2000pNPG u/g活性)(或基本上由其组成，或由其组成)。
在一个实施方案中，本文教导的DFM可以与木聚糖酶和β-葡聚糖酶组合使用，该木聚糖酶和β-葡聚糖酶包含用“木聚糖酶活性测定(ABX U/g)”测定的约2000至约5000ABX u/g木聚糖酶活性(适宜地至少约2500至约4000ABX u/g活性、适宜地至少约3000至约4000ABX u/g活性)，及用“β-葡聚糖酶活性测定(CMC U/g)”测定的约600至约4000CMC u/gβ-葡聚糖酶活性(适宜地至少约1000至约3000CMC u/g活性、适宜地至少约1500至约2600CMC u/g活性)(或基本上由其组成，或由其组成)。
适宜地，本文教导的DFM可以与木聚糖酶、β-葡聚糖酶和β-葡糖苷酶组合使用，该木聚糖酶、β-葡聚糖酶和β-葡糖苷酶包含用“木聚糖酶活性测定(ABX U/g)”测定的约2000至约5000ABX u/g木聚糖酶活性(适宜地至少约2500至约4000ABX u/g活性、适宜地至少约3000至约4000ABXu/g活性)，及用“β-葡聚糖酶活性测定(CMC U/g)”测定的约600至约4000CMC u/gβ-葡聚糖酶活性(适宜地至少约1000至约3000CMC u/g活性、适宜地至少约1500至约2600CMC u/g活性)，及用“β-葡糖苷酶活性测定(pNPG U/g)”测定的至少约200至约4000pNPG u/gβ-葡糖苷酶活性(适宜地至少约300至约3000pNPG u/g活性、适宜地至少约1000至约3000pNPG u/g活性或适宜地至少约2000至约3000pNPG u/g活性)(或基本上由其组成，或由其组成)。
“木聚糖酶活性测定(XU)”
木聚糖酶活性可以表示为用AZCL-阿拉伯木聚糖(天青精交联的小麦阿拉伯木聚糖,Xylazyme 100mg片剂,Megazyme)作为底物在pH 5.0下测量的木聚糖酶单位(XU)。内切-(1-4)-β-D-木聚糖酶(木聚糖酶)的水解产生水溶性染色片段，这些片段的释放速率(590nm吸光度的增加)可以直接与酶活性相关。在标准反应条件(在McIlvaine缓冲液pH 5.0中40℃反应10分钟)下相对于酶标准(Danisco Xylanase,可获自丹尼斯克动物营养公司)测定木聚糖酶单位(XU)。
将标准酶的木聚糖酶活性测定为在pH 5.3和50℃下每分钟从燕麦-斯卑尔脱小麦-木聚糖底物释放的还原糖末端基团的量。还原糖末端基团与3,5-二硝基水杨酸反应，反应产物的形成可以测量为540nm吸光度的增加。相对于木糖标准曲线定量酶活性(还原糖当量)。一个木聚糖酶单位(XU)是在pH 5.3和50℃下每分钟释放0.5μmol还原糖当量的标准酶的量。
“木聚糖酶活性测定(ABX U/g)”
木聚糖酶活性可以表示为用桦木4-O甲基葡糖醛酸木聚糖作为底物在pH 5.3下测量的酸性桦木木聚糖酶单位(ABX U)。吸取1.8ml 1％桦木4-O甲基葡糖醛酸木聚糖底物溶液放入每个试管。孵育10-15分钟，使其在50℃平衡。用容积式移液管或等同物吸取0.2ml酶稀释液。涡旋混合。50℃孵育各样品正好5分钟。加入3ml 1％3,5-二硝基水杨酸钠盐(DNS)溶液并混合。用盖子盖上试管口，以防止蒸发。将试管放入沸水浴正好5分钟。在冰/水浴中冷却试管10分钟。室温孵育试管10分钟。将试管内容物转移至比色杯，在540nm对去离子水测量。通过减去对应的酶空白来针对背景颜色校正吸光度。相对于木糖标准曲线定量酶活性(还原糖当量)。
一个ABX单位定义为在50℃和pH 5.3下每分钟产生1μmol木糖还原糖当量所需的酶量。
“β-葡聚糖酶活性测定(CMC U/g)”
β-葡聚糖酶活性可以表示为用羧甲基纤维素钠盐(CMC)作为底物在pH 4.8下测量的CMC单位。吸取1ml 1％羧甲基纤维素钠盐(CMC)溶液(用0.05M乙酸钠缓冲液配制)放入样品管和空白管。在50℃水浴中孵育管10分钟。按15秒间隔吸取1ml酶溶液至样品管。每次加入后混合管。10分钟后，按相同的顺序加入3ml 1％3,5-二硝基水杨酸钠盐(DNS)，并在酶加至样品管时计时。向样品空白管中加入3ml DNS。加入DNS后，将试管移至另一不处于50℃水浴中的试管架。向对应的样品空白中加入1ml稀释的酶。盖上试管，并煮沸正好5分钟。从100℃水浴取出，放入冰浴10分钟。室温放置10-15分钟。转移至3ml比色杯。用试剂空白调零分光光度计，在540nm对去离子水读取每个样品。相对于葡萄糖标准曲线定量酶活性(还原糖当量)。
一个CMC活性单位在50℃和pH 4.8下在一分钟内释放1μmol还原糖(表示为葡萄糖当量)。
“β-葡聚糖酶活性测定(BGU)”
β-葡聚糖酶活性可以表示为用AZCL-葡聚糖(天青精交联的大麦β-葡聚糖,Glucazyme 100mg片剂,Megazyme)作为底物在pH 5.0下测量的β-葡聚糖酶单位(BGU)。β-葡聚糖酶的水解产生可溶性染色片段，这些片段释放的速率(590nm吸光度的增加)可以直接与酶活性相关。在标准反应条件(在0.1M乙酸缓冲液pH 5.0中50℃反应10分钟)下相对于梅标准(Multifect BGL,可获自丹尼斯克动物营养公司)测定β-葡聚糖酶单位(BGU)。
将标准酶的β-葡聚糖酶活性测定为在pH 5.0和50℃下每分钟从大麦葡聚糖底物释放的还原糖末端基团的量。还原糖末端基团与3,5-二硝基水杨酸反应，反应产物的形成可以测量为540nm吸光度的增加。相对于葡萄糖标准曲线定量酶活性(还原糖当量)。一个β-葡聚糖酶单位(BGU)是在pH 5.0和50℃下每分钟释放2.4μmol还原糖当量的标准酶的量。
“β-葡糖苷酶活性测定(pNPG U/g)”
β-葡糖苷酶活性可以表示为用对-硝基苯基-B-D-吡喃葡糖苷(pNPG)作为底物在pH 4.8测量的pNPG单位。吸取1ml 3％硝基苯基-B-D-吡喃葡糖苷(pNPG)溶液(用0.05M乙酸钠缓冲液配制)放入每个样品和对照的重复试管中。放入50℃水浴5分钟。按15-30秒的间隔向它们各自的重复管中加入200μl对照或样品。向试剂空白管中加入200μl乙酸钠缓冲液。加入样品后涡旋各管。孵育管正好10分钟。10分钟孵育后，加入500μl 1M碳酸钠溶液来终止反应。加入后涡旋各管，将管放在水浴外的管架上。向每个管中加入10ml milli-Q水。用试剂空白调零分光光度计，通过在400nm读取各样品来测量4-硝基苯酚的浓度。
一个pNPG单位表示在50℃和pH 4.8下每分钟从对-硝基苯基-B-D-吡喃葡糖苷释放1μmol硝基-苯酚。
优势
DFM与木聚糖酶和β-葡聚糖酶(及可选的至少一种其他纤维降解酶)的相互作用复杂，不希望受限于理论，非常惊人的是，我们可以观察到动物GIT中短链脂肪酸的产生增加。
已发现本文教导的具体DFM与至少一种木聚糖酶和至少一种β-葡聚糖酶(及可选的至少一种其他纤维降解酶)的组合在饲料中和/或在饲喂纤维副产物含量高的饲料(例如来自生物燃料和碾磨产业)的个体中尤其有利。
已惊奇地发现，包含大量(有时为30-60％)纤维副产物(具有高含量的非淀粉多糖，例如纤维)的饲料的营养价值和消化率可以显著改善，饲喂这类饲料的个体的表现和增重也可以显著改善。
本发明的一个优势是通过使用本发明的组合观察到的饲料转化率(FCR)的改善。
不希望受限于理论，在将木聚糖酶(例如内切-1,4-β-d-木聚糖酶)与一种或多种β-葡聚糖酶(且可选地与一种或多种其他纤维降解酶(例如纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.176和E.C.3.2.1.91)、β-葡糖苷酶(E.C.3.2.1.21)、β-木糖苷酶(E.C.3.2.1.37)、阿魏酸酯酶(E.C.3.1.1.73)、α-阿拉伯呋喃糖苷酶(E.C.3.2.1.55)、果胶酶(例如内聚半乳糖醛酸酶(E.C.3.2.1.15)、聚半乳糖醛酸外切酶(E.C.3.2.1.67)或果胶酸裂合酶(E.C.4.2.2.2))，或其组合)组合)及针对其产生酶的能力和/或其在厌氧条件下从NSP级分戊糖产生短链脂肪酸(SCFA)的能力和/或其促进个体GIT中的纤维水解性微生物区系的内源性群体的能力和/或其降解C5糖的能力选择的一种或多种具体的直接饲喂微生物(DFM)组合时，可以优化木聚糖酶对源自植物细胞壁颗粒的非淀粉多糖(NSP)含量高的膳食材料的降解来改善动物表现。
此组合改善表现的原因是，来自饲粮的纤维(特别是半纤维素)在动物胃肠道(GIT)中的溶解最大化。半纤维素的此溶解并非总是足以提高表现，因为所释放的C5-糖在它们被吸收时对动物而言不是有效的能量来源(Savory C.,J.Br.J.Nut.1992,67:103-114)，但它们在由GIT中的微生物或由DFM转化为短链脂肪酸(SCFA)时是更有效的能量来源。
因此，通过组合木聚糖酶(例如内切-1,4-β-d-木聚糖酶)和β-葡聚糖酶(及可选的至少一种其他纤维降解酶(包括但不限于纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.176和E.C.3.2.1.91)、β-葡糖苷酶(E.C.3.2.1.21)、β-木糖苷酶(E.C.3.2.1.37)、阿魏酸酯酶(E.C.3.1.1.73)、α-阿拉伯呋喃糖苷酶(E.C.3.2.1.55)、果胶酶(例如内聚半乳糖醛酸酶(E.C.3.2.1.15)、聚半乳糖醛酸外切酶(E.C.3.2.1.67)或果胶酸裂合酶(E.C.4.2.2.2))，或其组合))及可以在厌氧条件下从NSP级分戊糖产生SCFA和/或可以调节GIT中的微生物群体来增加来自所释放的糖的SCFA产生和/或可以利用C-5糖的具体DFM，可以优化来自植物产品(例如，小麦、玉米、燕麦、大麦和谷物共同产物(副产物)或单胃动物易得到的混合谷物饲粮)的能量值。DFM可以使其代谢适应于与木聚糖酶和β-葡聚糖酶(及可选的至少一种其他纤维降解酶)组合协同增加纤维水解。使用可以产生(纤维水解)酶的DFM可以提供附加的益处，并最大化所加入的酶的益处。
针对其酶活性选择的具体DFM可以视为聚糖驱动的细菌食物链。本文教导的特别选择的DFM可以优先利用膳食纤维，这是允许它们进行最初的聚糖消化步骤来释放更短、更可溶的多糖用于其他细菌(例如其他内源性GIT微生物区系)的性状。针对其代谢选择具体DFM，与只使用酶的组合或只使用一种或多种DFM相比，该代谢根据由酶(例如木聚糖酶和β-葡聚糖酶(及可选的至少一种其他纤维降解酶))释放的聚糖调整，以改善本文教导的酶和DFM组合的功效。
不希望受限于理论，在本发明中，源自植物细胞壁颗粒的富含来源特异性聚糖(如纤维素、半纤维素和果胶(植物材料))或糖胺聚糖的膳食材料以颗粒形式进入远端肠道，能够直接结合这些不溶性颗粒并消化它们的聚糖成分的具体DFM聚糖降解者攻击该颗粒形式。在含聚糖颗粒的此初始降解之后，存在于盲肠中的次级聚糖降解者可以消化更可溶的聚糖片段，这促成源自两类降解者的短链脂肪酸(SCFA)发酵产物释放库。由于SCFA产生于GIT中的土著厌氧微生物区系的糖类发酵和/或蛋白质发酵和脱氨作用，SCFA浓度可以是厌氧生物群体的指数。SCFA实际上可以作为肠、肌肉、肾脏、心脏、肝脏和脑组织的代谢燃料以及提供针对诸如沙门氏菌属和大肠杆菌的生物的制菌和杀菌特性来为宿主动物提供许多益处。
纤维在非反刍动物中的营养价值主要可以通过经有效的纤维降解酶(例如木聚糖酶和β-葡聚糖酶和/或本文教导的其他纤维降解酶)对溶解或降解的纤维的发酵而产生的短链脂肪酸(SCFA)来得到。饲料木聚糖酶单独不足以使用动物(尤其是非反刍动物)饲粮中的纤维成分。基于植物的饲料成分中存在一系列化学特征。酶应用取决于植物(饲料)材料的特征。仅作为实例，在小麦谷粒中，阿拉伯聚糖占主导，但在小麦粗粉(小麦碾磨的共同产物(副产物))中，β-葡聚糖的含量从8g-1DM(谷粒中)提高至超过26g kg-1DM。含有木聚糖酶和β-葡聚糖酶(及可选的至少一种其他纤维降解酶)的复合物的酶基质可以改善基于共同产物(副产物)的饲粮含量高的饲料的营养价值。
SCFA具有不同的能量值，一些可以作为葡萄糖的前体，一些可以有助于维持肠完整性和健康。发明人已发现，本文教导的具体组合优先将动物GIT中的发酵过程移向产生更有价值/有用的SCFA。
不希望受限于理论，本发明人已发现，本发明的DFM与木聚糖酶和β-葡聚糖酶(及可选的至少一种其他纤维降解酶)的组合可以有效降解NSP。此外，已发现，此具体组合释放通常对动物仅具有微小营养价值的C-5糖。但是，使用本文所要求的组合，可能使GIT中的微生物(本发明的DFM或内源性纤维水解性微生物区系(其由本发明的(DFM)的组合刺激))将这些C-5糖转化为有用和有营养价值的成分，即短链脂肪酸。这些短链脂肪酸可以为动物所利用。因此，该系统改善动物饲料的营养价值。
有利地，本文教导的直接饲喂微生物、木聚糖酶和β-葡聚糖酶(及可选的至少一种其他纤维降解酶)的组合令人惊奇地增加饲料添加剂组合物、预混物、饲料中的纤维降解，这导致改善的个体表现。具体而言，本发明的组合改善饲料中的原料的消化率，导致营养物生物利用率(例如营养物消化率)和其中可代谢的能量的增加。
DFM与酶的制剂
可以任意适宜的方式配制本发明的DFM和酶，以确保制剂包含活的DFM和活性酶。
在一个实施方案中，可将DFM和酶配制为干粉或颗粒。
干粉或颗粒可通过本领域技术人员已知的手段(例如，在微成分混合器中)制备。
对于一些实施方案，可涂布(例如囊封)DFM和/或一种或多种酶。适宜地，可将DFM和酶配制于同一涂层内或囊封于同一胶囊中。备选地，可将一种或两种或三种或四种酶配制于同一涂层内或囊封于同一胶囊中，并且可将DFM与一种或多种或全部酶分开配制于涂层中。在一些实施方案中，例如若DFM能够产生内生孢子，则可在无任何涂层的情况下提供DFM。在这些情况下，可简单地将DFM内生孢子与一种或两种或三种或四种酶混合。在后一种情况下，可涂布(例如囊封)酶，例如，可涂布(例如囊封)一种或多种或全部酶。酶可以作为酶的混合物(即包含一种或多种、两种或多种、三种或多种或全部)囊封，或者它们可以分开(例如作为单种酶)囊封。在一个优选实施方案中，可以一起涂布(例如囊封)全部四种酶。
在一个实施方案中，涂层保护该酶免受热影响并且可视为防热剂。
在一个实施方案中，将饲料添加剂组合物配制成干粉或颗粒，如WO2007/044968(在此引入作为参考)中所述(称为TPT颗粒)。
在一些实施方案中，可用稀释剂(例如淀粉粉末、石灰石或诸如此类)稀释DFM(例如DFM内生孢子)。
在另一个实施方案中，可通过将一种或多种酶施加(例如喷涂)于载体基材(例如碾碎的小麦)上来配制饲料添加剂组合物。
在一个实施方案中，本发明的饲料添加剂组合物可配制为预混物。仅作为实例，该预混物可包含一种或多种饲料组分，如一种或多种矿物质和/或一种或多种维生素。
在一个实施方案中，可将用于本发明的DFM和/或酶与至少一种选自如下中的至少一者的生理学上可接受的载体一起配制：麦芽糖糊精、石灰石(碳酸钙)、环糊精、小麦或小麦组分、蔗糖、淀粉、Na2SO4、滑石粉、PVA、山梨醇、苯甲酸盐、山梨酸盐、甘油、蔗糖、丙二醇、1,3-丙二醇、葡萄糖、对羟基苯甲酸酯、氯化钠、柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐、钙、偏亚硫酸氢盐、甲酸盐以及其混合物。
包装
在一个实施方案中，对本发明的饲料添加剂组合物和/或预混物和/或饲料进行包装。
在一个优选实施方案中，将饲料添加剂组合物和/或预混物和/或饲料包装于袋(如纸袋)中。
在备选实施方案中，可将饲料添加剂组合物和/或预混物和/或饲料密封在容器中。可使用任意适宜的容器。
副产物
动物饲料产业已看到增加对动物饲喂例如来自生物燃料加工的副产物(这种形式的动物饲料从0-10％上升至目前30-60％的极限值)。这些饲粮成本节约是该产业节约饲料投入成本的好机会，但也伴随着一系列挑战。副产物通常是高纤维(例如至少约40％纤维)产物。因此，包含高纤维副产物(例如DDGS)可以对动物生长表现和屠体特征具有负面影响。除对动物生长和屠体质量的负面影响外，营养物消化率的改变对粪肥(例如猪粪肥)处理、储存和分解具有影响。
本文所用的术语“副产物”意指任意纤维性植物材料，例如包含至少约20％或30％纤维的植物材料。
在一个实施方案中，术语副产物意指高纤维饲料材料的任意副产物。
在一个实施方案中，本文提到的副产物可以选自以下产物中的一种或多种：玉米胚芽粉、玉米糠、玉米麸、玉米面筋饲料、干酒糟可溶物(DDGS)、干酒糟(DDG)、蛋白粉、小麦次粉、小麦粗粉或其组合。
在一个实施方案中，本发明的饲料包含纤维副产物，如玉米胚芽粉、玉米糠、玉米麸、玉米面筋饲料、干酒糟可溶物(DDGS)、干酒糟(DDG)、蛋白粉、小麦次粉、小麦粗粉或其组合。
在一个实施方案中，还对施用本发明的DFM、木聚糖酶和β-葡聚糖酶(及可选的至少一种其他纤维降解酶)组合或本发明的饲料添加剂组合物的个体饲喂包含纤维性副产物(如玉米胚芽粉、玉米糠、玉米麸、玉米面筋饲料、干酒糟可溶物(DDGS)、干酒糟(DDG)、蛋白粉、小麦次粉、小麦粗粉或其组合)的饲料。
分解或降解
本发明或本文公开的酶(或包含该酶的组合物)可以用来分解(降解)不溶性阿拉伯木聚糖(AXinsol)或可溶性阿拉伯木聚糖(AXsol)或其组合，或AXinsol的降解产物。术语“分解”或“降解”与水解同义。
非淀粉多糖(NSP)
常见植物饲料成分的主要部分由糖类组成，使糖类称为动物生产中的关键因素。除可很好地消化的营养物，如淀粉和糖外，植物来源的糖类级分包括不可消化(纤维性)成分，如纤维素、半纤维素、果胶、β-葡聚糖和木质素。
将所有这些消化差的成分(包括木质素)分类为本文称为非淀粉多糖(NSP)的组。NSP级分因它可以发挥的抗营养作用而众所周知。
在一个实施方案中，术语纤维可以与术语NSP互换使用。
在NSP组内，半纤维素本身是主要由木聚糖、阿拉伯聚糖、半乳聚糖、葡聚糖和甘露聚糖构成的异源亚组。阿拉伯木聚糖是几种最重要的饲料原料(包括小麦和玉米)中主要的NSP级分。
阿拉伯木聚糖(AX)
本文所用的术语“阿拉伯木聚糖”(AX)意指由木聚糖主链(1,4-连接的木糖单位)组成的多糖，L-阿拉伯呋喃糖(处于其5原子环形式的L-阿拉伯糖)在整条链内通过1α→2和/或1α→3连接随机附着于木糖单位。阿拉伯木聚糖是见于植物的初生和次生细胞壁二者中的半纤维素。阿拉伯木聚糖可以见于诸如小麦、玉蜀黍(玉米)、黑麦和大麦的谷物的糠中。
发现阿拉伯木聚糖(AX)与植物细胞壁密切相关，它在植物细胞壁中作为连接植物细胞壁的多种构件和组织的胶，赋予它结构强度和刚性。
由于木糖和阿拉伯糖(阿拉伯木聚糖的组分)都是戊糖，通常将阿拉伯木聚糖分类为戊聚糖。
AX是几种最重要的饲料原料(包括小麦和玉米)中主要的非淀粉多糖(NSP)级分。
AX在植物材料中的的丰度、位置及分子结构导致它对饲料消化率具有剧烈的负面影响，有效降低它所存在于其中的原料的营养价值。这使得AX成为降低动物生产效率的重要的抗营养因子。
AX还可以保持大量的水(可以称为它们的保水能力)，这可以导致可溶性阿拉伯聚糖产生(高)黏度，这在许多应用中是有利的。
水不溶性阿拉伯木聚糖(AXinsol)
水不溶性阿拉伯木聚糖(AXinsol)也称为水不可提取的阿拉伯木聚糖(WU-AX)，构成植物材料的干物质的较大比例。
在小麦中，AXinsol可以占干物质的6.3％。在麦麸和小麦DDGS中，AXinsol可以占干物质的约20.8％或13.4％(w/w)。
在黑麦中，AXinsol可以占干物质的5.5％。
在玉米中，AXinsol可以占干物质的5.1％。在玉米DDGS中，AXinsol可以占干物质的12.6％。
AXinsol导致饲料中的营养物包封。大量可很好地消化的营养物(如淀粉和蛋白质)保持包封在细胞壁材料的团块中，或结合于AX的侧链。这些包封的营养物将不可用于消化及随后在小肠中的吸收。
水溶性阿拉伯木聚糖(AXsol)
水溶性阿拉伯木聚糖(AXsol)也称为水可提取的阿拉伯木聚糖(WE-AX)，可以导致生物燃料产生和/或麦芽制造和/或酿造中和/或饲料中的问题，因为它们可以由于AXsol的水结合能力而导致提高的黏度。
在饲料中，AXsol尤其在单胃动物中可以具有抗营养作用，因为它们导致由AXsol非凡的水结合能力引起的肠内容物黏度的显著提高。提高的黏度可以影响饲料消化和营养物使用，因为它可以阻止饲料与消化酶和胆汁盐的正确混合和/或它减慢营养物利用和吸收和/或它刺激后肠中的发酵。
在小麦中，AXsol可以占干物质的1.8％。在麦麸和小麦DDGS中，AXsol可以占干物质的约1.1％或4.9％(w/w)。
在黑麦中，AXsol可以占干物质的3.4％。
在大麦中，AXsol可以占干物质的0.4-0.8％。
在玉米中，AXsol可以占干物质的0.1％。在玉米DDGS中，AXinsol可以占干物质的0.4％。
但是，除存在于植物材料中的AXsol的量外，在木聚糖酶溶解植物材料中的AXinsol时，这可以释放有助于植物材料的AXsol含量的戊聚糖和/或寡聚物。
本文公开的一些木聚糖酶的一个显著优势是，它们具有溶解AXinsol以及快速和有效地分解所溶解的寡聚物和/或戊聚糖这两种能力，因此该酶能够溶解AXinsol而不提高黏度和/或降低黏度。
AXsol的分解可以降低黏度。
AXsol的分解可以释放营养物。
黏度
本发明可以用于在AXsol的水结合能力导致不希望的黏度提高的许多方法中降低黏度。
本发明涉及通过分解(降解)AXsol或通过分解(降解)通过溶解AXinsol产生的多聚物和/或寡聚物来降低黏度。
在本发明中，可以通过将包含本发明的(或本文教导的)木聚糖酶的一个样品与另一不含本发明的(或本文教导的)木聚糖酶的可比样品相比较来计算黏度的降低。
本发明的木聚糖酶的黏度降低概况与市场基准木聚糖酶的黏度降低概况的比较证明了酶性能。目的是与市场基准相比改善酶性能。下文实施例中提供用于单种应用的基准酶。
在本发明的一个实施方案中，本文教导的木聚糖酶是黏度降低剂。
饲料
本发明的酶或饲料添加剂组合物可用作饲料或用于制备饲料。
术语“饲料(feed)”与“饲料(feedstuff)”在本文中作为同义词使用。
在一个实施方案中，本发明的饲料包含高纤维饲料材料和/或至少一种高纤维饲料材料(如玉米胚芽粉、玉米糠、玉米麸、玉米面筋饲料、干酒糟可溶物(DDGS)、干酒糟(DDG)、蛋白粉、小麦次粉、小麦粗粉或其组合)的至少一种副产物。
在一个实施方案中，还对施用本发明的DFM、木聚糖酶和β-葡聚糖酶组合(且可选地与其他纤维降解酶组合)或本发明的饲料添加剂组合物的个体饲喂包含高纤维饲料材料和/或至少一种高纤维饲料材料(如玉米胚芽粉、玉米糠、玉米麸、玉米面筋饲料、干酒糟可溶物(DDGS)、干酒糟(DDG)、蛋白粉、小麦次粉、小麦粗粉或其组合)的至少一种副产物的饲料。
适宜地，在一个实施方案中，家禽个体饲粮的谷物成分可以是小麦或大麦与黑麦、小麦粗粉、麦麸、燕麦、燕麦壳，而植物成分可以是含或不含其他蛋白质成分(如卡诺拉、油菜籽粉等)的大豆粉，只要该饲粮包含小麦-大麦作为主要成分，并配制为满足所饲喂的家禽的营养物需要。
取决于用途和/或应用模式和/或施用方式，本发明的饲料可呈溶液形式或呈固体形式。
在用作(或用于制备)饲料(如功能性饲料)时，本发明的酶或组合物可以与下列物质中的一种或多种结合使用：营养上可接受的载体、营养上可接受的稀释剂、营养上可接受的赋形剂、营养上可接受的辅助剂、营养活性成分。
在优选实施方案中，将本发明的酶或饲料添加剂组合物与饲料组分混合以形成饲料。
本文所用的术语“饲料组分”意指饲料的全部或部分。饲料的部分可意指饲料的一种成分或饲料的一种以上(例如2种或3种或4种)成分。在一个实施方案中，术语“饲料组分”涵盖预混物或预混物成分。
优选地，饲料可为草料(fodder)或其预混物、复合饲料或其预混物。在一个实施方案中，可将本发明的饲料添加剂组合物与复合饲料、复合饲料组分混合或将其混合至复合饲料的预混物或混合至草料、草料组分或草料的预混物中。
本文所用的术语草料意指提供给动物(而非动物必须自己觅食)的任意食物。草料涵盖经切割的植物。
术语草料包括青贮饲料、压制和制丸的饲料、油和混合日粮以及发芽谷物和豆类。
草料可从选自如下的植物中的一种或多种获得：玉米(玉蜀黍)、苜蓿(紫花苜蓿)、大麦、百脉根、芸苔、Chau moellier、羽衣甘蓝、油菜(卡诺拉)、大头菜(芜菁甘蓝)、芜菁、三叶草、杂三叶草、红三叶草、地三叶草、白三叶草、羊茅、雀麦、小米、燕麦、高粱、大豆、树(用于树制干草的截头树枝条)、小麦和豆科植物。
术语“复合饲料”意指粗粉、丸粒、坚果、饼或碎屑形式的商业饲料。复合饲料可由多种原料和添加剂共混而来。根据目标动物的具体需求配制这些共混物。
复合饲料可以是提供所有每日所需营养物的完全饲料、提供日粮(ration)(蛋白质、能量)的一部分的浓缩物或仅提供附加的微量营养物(如矿物质和维生素)的补充剂。
用于复合饲料中的主要成分是饲料谷物，其包括玉米、小麦、麦麸、大豆、高粱、燕麦和大麦。
适宜地，本文所提及的预混物可以是由微量成分组成的组合物，该微量成分是例如维生素、矿物质、化学防腐剂、抗生素、发酵产物和其他必需成分。预混物通常是适合于共混入商业日粮内的组合物。
本发明的任意饲料可包含一种或多种选自如下的饲料材料：a)谷类，例如小粒谷物(例如小麦、大麦、黑麦、燕麦、黑小麦及其组合)和/或大粒谷物如玉蜀黍或高粱；b)来自谷类的副产物，例如玉米胚芽粉、玉米糠、玉米麸、玉米面筋饲料、干酒糟可溶物(DDGS)、干酒糟(DDG)、蛋白粉、小麦次粉、小麦粗粉或其组合；c)获自如下来源的蛋白质：如大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蚕豆、棉花、卡诺拉、鱼粉、干血浆蛋白质、肉和骨粉、马铃薯蛋白、乳清、干椰肉、芝麻；d)获自植物和动物来源的油和脂肪；e)矿物质和维生素。
在一个实施方案中，饲料包含玉米、DDGS(如cDDGS)、小麦、麦麸或其组合，或由其组成。
在一个实施方案中，饲料组分可以是玉米、DDGS(如cDDGS)、小麦、麦麸或其组合。
在一个实施方案中，饲料包含玉米、DDGS(如cDDGS)或其组合，或由其组成。
在一个实施方案中，饲料组分可以是玉米、DDGS(如cDDGS)或其组合。
本发明的饲料可含有至少30wt％、至少40wt％、至少50wt％或至少60wt％的玉米和大豆粉或玉米和全脂大豆，或者小麦粉或向日葵粉。
本发明的饲料可以包含约5％至约40％之间的玉米DDGS。对于家禽，饲料平均可以包含约7％至约15％之间的玉米DDGS。对于猪，饲料平均可以包含5％至40％的玉米DDGS。
本发明的饲料可以包含玉米作为单种谷物，在这种情况下，饲料可以包含约35％至约85％玉米。
在包含混合谷物，例如包含例如玉米和小麦的饲料中，饲料可以包含至少10％玉米。
此外或备选地，本发明的饲料可以包含至少一种高纤维饲料材料和/或该至少一种高纤维饲料材料的至少一种副产物，以提供高纤维饲料。高纤维饲料材料的实例包括：小麦、大麦、黑麦、燕麦、来自谷类的副产物，如玉米蛋白粉、湿饼、干酒糟(DDG)、含可溶物的干酒糟(DDGS)、麦麸、小麦粗粉、小麦次粉、米糠、稻壳、燕麦壳、棕榈仁和柑橘渣。一些蛋白质来源也可以视为高纤维：获自诸如向日葵、羽扇豆、蚕豆和棉花的来源的蛋白质。
在一个实施方案中，本发明的饲料包含至少一种高纤维饲料材料和/或该至少一种高纤维饲料材料的至少一种副产物，该至少一种高纤维材料选自例如含可溶物的干酒糟(DDGS)(尤其是玉米DDGS(cDDGS))、湿饼、干酒糟(DDG)(尤其是玉米DDG(cDDG))、麦麸和小麦。
在一个实施方案中，本发明的饲料包含至少一种高纤维饲料材料和/或该至少一种高纤维饲料材料的至少一种副产物，该至少一种高纤维材料选自例如干酒糟可溶物(DDGS)(尤其是cDDGS)、麦麸和小麦。
在本发明中，饲料可以是如下中的一种或多种：复合饲料和预混物，其包括丸粒、坚果或(家畜用)饼；农作物或农作物残余物：玉米、大豆、高粱、燕麦、大麦、干椰子肉、谷壳、甜菜废料；鱼粉；肉和骨粉；糖蜜；油渣饼和压滤饼；低聚糖；保存的饲料植物：青贮饲料；海藻；种子和谷物，其为整个或通过碾压或研磨等制备；发芽谷物及豆类；酵母提取物。
在一些实施方案中，本发明中的术语饲料也涵盖宠物食品。宠物食品是旨在由宠物食用的植物或动物材料，例如狗食品或猫食品。宠物食品(例如狗和猫食品)可以是干燥形式(如用于狗的磨碎食物)或湿罐装形式。猫食品可含有氨基酸牛磺酸。
在一些实施方案中，本发明中的术语饲料也涵盖鱼食品。鱼食品通常含有使养殖鱼保持健康所需的主要营养物、痕量元素和维生素。鱼食品可以是小片、丸粒或片的形式。压成丸粒的形式(其中的一些快速沉降)经常用于较大的鱼或底饲物种。一些鱼食品还含有诸如β胡萝卜素或性激素之类的添加剂，以人工增强观赏性鱼的颜色。
在一些实施方案中，本发明中的术语饲料也涵盖鸟食品。鸟食品包括用于喂鸟器中以及用于饲喂宠物鸟的食品。通常，鸟食品由多种种子组成，但也可涵盖板油(牛或羊脂肪)。
本文所用的术语“接触”是指将本发明的酶(或包含该酶的组合物)间接或直接施加至产品(例如饲料)中。可使用的施加方法的实例包括但不限于：在包含饲料添加剂组合物的材料中处理产品、通过将饲料添加剂组合物与产品混合而直接施加、将饲料添加剂组合物喷涂至产品表面上或将产品浸入饲料添加剂组合物的制剂中。
在一个实施方案中，优选将本发明的饲料添加剂组合物与产品(例如饲料)混合。备选地，饲料的乳液或原始成分中可包括饲料添加剂组合物。
对于一些应用，重要的是，使组合物在待影响/处理的产品表面上可用或可用于待影响/处理的产品表面。这使得组合物能赋予如下有利特性中的一种或多种：表现益处。
可施加本发明的酶(或包含该酶的组合物)以使产品(例如饲料或饲料的原始成分)散布、涂布和/或浸渍有控制量的该酶。
适宜地，饲料添加剂组合物可以简单地在对动物饲喂饲料的同时施用。
优选地，本发明的酶(或包含该酶的组合物)将对最高约70℃、最高约85℃或最高约95℃的热处理是热稳定的。热处理可以进行最多约1分钟、最多约5分钟、最多约10分钟、最多约30分钟、最多约60分钟。术语热稳定的意指在加热至指定温度之前添加剂中存在/有活性的酶中的至少约75％在冷却至室温后仍存在/有活性。优选地，在加热至指定温度之前添加剂中存在及有活性的酶中的至少约80％在冷却至室温后仍存在及有活性。
在尤其优选的实施方案中，将本发明的酶(或包含该酶的组合物)均质化以产生粉末。
在备选的优选实施方案中，将本发明的酶(或包含该酶的组合物)配制成如WO2007/044968中所述的颗粒(称作TPT颗粒)，该专利在此引入作为参考。
在另一优选实施方案中，在将饲料添加剂组合物配制成颗粒时，这些颗粒包含涂布在蛋白质芯上的水合屏障盐。这种盐涂层的优势是改善耐热性、改善储存稳定性以及保护免受原本对酶具有不利作用的其他饲料添加剂的影响。
优选地，用于盐涂层的盐在20℃下具有大于0.25的水活度或者大于60％的恒定湿度。
优选地，盐涂层包含Na2SO4。
制备本发明的酶(或包含该酶的组合物)的方法还可包括将粉末制丸的另一步骤。粉末可以与本领域已知的其他组分进行混合。可迫使粉末或包含粉末的混合物通过模具，并将所得到的料条切成可变长度的适宜丸粒。
可选地，制丸步骤可包括在形成丸粒之前进行的蒸汽处理或调理阶段。可将包含粉末的混合物置于调理机中，例如带蒸汽喷射的混合机。将混合物在调理机中加热至指定温度，如从60℃至100℃，典型的温度可为70℃、80℃、85℃、90℃或95℃。停留时间不定，可从数秒钟到数分钟甚至数小时。如5秒、10秒、15秒、30秒、1分钟、2分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟和1小时。
应当理解，本发明的酶(或包含该酶的组合物)适于添加至任意适当的饲料材料中。
技术人员会认识到，不同的动物需要不同的饲料，甚至同一种动物也可以需要不同的饲料，这取决于饲养该动物的目的。
可选地，饲料还可含有附加的矿物质(例如钙)和/或附加的维生素。
优选地，饲料为玉米大豆粉混合物。
在一个实施方案中，优选地，饲料不是宠物食品。
在另一方面，提供用于生产饲料的方法。饲料通常在饲料磨机中生产，在磨机中首先将原料研磨成适宜的粒度，然后与适当的添加剂混合。饲料随后可以作为糊料或丸粒制备；后者通常涉及将温度升高至目标水平并随后使饲料通过模具以产生特定尺寸的丸粒的方法。使丸粒冷却。随后，可添加液体添加剂如脂肪和酶。饲料的制备还可涉及附加的步骤，其包括在制丸之前的挤出或膨胀——特别是通过可包括至少使用蒸汽的适宜技术来进行。
饲料可以是用于单胃动物如家禽(例如肉鸡、蛋鸡、肉种鸡、火鸡、鸭、鹅、水禽)、猪(所有年龄类别)、宠物(例如犬、猫)或鱼的饲料，优选饲料用于家禽。
饲料可以是用于单胃动物如家禽(例如肉鸡、蛋鸡、肉种鸡、火鸡、鸭、鹅、水禽)、猪(所有年龄类别)、宠物(例如犬、猫)或鱼的饲料，优选饲料用于家禽。
在一个实施方案中，饲料并非用于蛋鸡。
仅作为实例，用于鸡(例如肉鸡)的饲料可例如按下表中给出的％包含下表中所列成分中的一种或多种：
成分 开食料(％) 育肥料(％)
玉蜀黍 46.2 46.7
小麦粗粉 6.7 10.0
玉蜀黍DDGS 7.0 7.0
大豆粉48％CP 32.8 26.2
动物/植物脂肪共混物 3.0 5.8
L-赖氨酸HCl 0.3 0.3
DL-甲硫氨酸 0.3 0.3
L-苏氨酸 0.1 0.1
盐 0.3 0.4
石灰石 1.1 1.1
磷酸二钙 1.2 1.2
家禽维生素和微量矿物质 0.3 0.3
仅作为实例，用于鸡(例如肉鸡)的饲粮规格可如下表中所示：
仅作为实例，用于蛋鸡的饲料可由下表中所列成分中的一种或多种组成，例如以下表中给出的％：
成分 产蛋期(％)
玉蜀黍 10.0
小麦 53.6
玉蜀黍DDGS 5.0
大豆粉48％CP 14.9
小麦粗粉 3.0
大豆油 1.8
L-赖氨酸HCl 0.2
DL-甲硫氨酸 0.2
L-苏氨酸 0.1
盐 0.3
磷酸二钙 1.6
石灰石 8.9
家禽维生素和微量矿物质 0.6
仅作为实例，用于蛋鸡的饲粮规格可如下表中所示：
饲粮规格
粗蛋白(％) 16.10
家禽代谢能(kcal/kg) 2700
赖氨酸(％) 0.85
甲硫氨酸(％) 0.42
甲硫氨酸+半胱氨酸(％) 0.71
苏氨酸(％) 0.60
钙(％) 3.85
可利用的磷(％) 0.42
钠(％) 0.16
仅作为实例，用于火鸡的饲料可由下表中所列成分中的一种或多种组成，例如以下表中给出的％：
成分 阶段1(％) 阶段2(％) 阶段3(％) 阶段4(％)
小麦 33.6 42.3 52.4 61.6
玉蜀黍DDGS 7.0 7.0 7.0 7.0
大豆粉48％CP 44.6 36.6 27.2 19.2
油菜粉 4.0 4.0 4.0 4.0
大豆油 4.4 4.2 3.9 3.6
L-赖氨酸HCl 0.5 0.5 0.4 0.4
DL-甲硫氨酸 0.4 0.4 0.3 0.2
L-苏氨酸 0.2 0.2 0.1 0.1
盐 0.3 0.3 0.3 0.3
石灰石 1.0 1.1 1.1 1.0
磷酸二钙 3.5 3.0 2.7 2.0
家禽维生素和微量矿物质 0.4 0.4 0.4 0.4
仅作为实例，用于火鸡的饲粮规格可如下表中所示：
饲粮规格
粗蛋白(％) 29.35 26.37 22.93 20.00
家禽代谢能(kcal/kg) 2.850 2.900 2.950 3.001
钙(％) 1.43 1.33 1.22 1.02
可利用的磷(％) 0.80 0.71 0.65 0.53
钠(％) 0.16 0.17 0.17 0.17
可消化的赖氨酸(％) 1.77 1.53 1.27 1.04
可消化的甲硫氨酸(％) 0.79 0.71 0.62 0.48
可消化的甲硫氨酸+半胱氨酸(％) 1.12 1.02 0.90 0.74
可消化的苏氨酸(％) 1.03 0.89 0.73 0.59
仅作为实例，用于仔猪的饲料可由下表中所列成分中的一种或多种组成，例如以下表中给出的％：
成分 阶段1(％) 阶段2(％)
玉蜀黍 20.0 7.0
小麦 25.9 46.6
黑麦 4.0 10.0
小麦粗粉 4.0 4.0
玉蜀黍DDGS 6.0 8.0
大豆粉48％CP 25.7 19.9
干乳清 10.0 0.0
大豆油 1.0 0.7
L-赖氨酸HCl 0.4 0.5
DL-甲硫氨酸 0.2 0.2
L-苏氨酸 0.1 0.2
L-色氨酸 0.03 0.04
石灰石 0.6 0.7
磷酸二钙 1.6 1.6
猪维生素和微量矿物质 0.2 0.2
盐 0.2 0.4
仅作为实例，用于仔猪的饲粮规格可如下表中所示：
饲粮规格
粗蛋白(％) 21.50 20.00
猪可消化能(kcal/kg) 3380 3320
猪净能(kcal/kg) 2270 2230
钙(％) 0.80 0.75
可消化的磷(％) 0.40 0.35
钠(％) 0.20 0.20
可消化的赖氨酸(％) 1.23 1.14
可消化的甲硫氨酸(％) 0.49 0.44
可消化的甲硫氨酸+半胱氨酸(％) 0.74 0.68
可消化的苏氨酸(％) 0.80 0.74
仅作为实例，用于生长猪/肥育猪的饲料可由下表中所列成分中的一种或多种组成，例如以下表中给出的％：
成分 生长料/育肥料(％)
玉蜀黍 27.5
大豆粉48％CP 15.4
玉蜀黍DDGS 20.0
麦麸 11.1
米糠 12.0
卡诺拉籽粉 10.0
石灰石 1.6
磷酸二钙 0.01
盐 0.4
猪维生素和微量矿物质 0.3
赖氨酸-HCl 0.2
植物油 0.5
仅作为实例，用于生长猪/肥育猪的饲粮规格可如下表中所示：
饲粮规格
粗蛋白(％) 22.60
猪代谢能(kcal/kg) 3030
钙(％) 0.75
可利用的磷(％) 0.29
可消化的赖氨酸(％) 1.01
可消化的甲硫氨酸+半胱氨酸(％) 0.73
可消化的苏氨酸(％) 0.66
湿饼、干酒糟(DDG)和干酒糟可溶物(DDGS)
湿饼、干酒糟和含可溶物的干酒糟是在通过谷物蒸馏产业中所利用的方法通过蒸馏来从酵母发酵的谷物或谷物混合物去除乙醇之后获得的产物。
将来自蒸馏的釜馏物(例如包含水、谷物的残留物、酵母细胞等)分为“固体”部分和液体部分。
固体部分称为“湿饼”，且可以就这样用作动物饲料。
液体部分(部分)蒸发为糖浆(可溶物)。
在干燥湿饼时，它是干酒糟(DDG)。
在将湿饼与糖浆(可溶物)一起干燥时，它是含可溶物的干酒糟(DDGS)。
湿饼可以用于奶牛操作和肉牛牧场。
干燥的DDGS可以用于家畜(例如奶牛、肉牛和猪)饲料和家禽饲料。
玉米DDGS对奶牛而言是非常好的蛋白质来源。
玉米蛋白粉
在一方面，玉米的副产物可以是玉米蛋白粉(CGM)。
CGM是玉米碾磨产业的粉状副产物。CGM用于例如动物饲料。它可以用作诸如宠物食品、家畜饲料和家禽饲料的饲料的便宜蛋白质来源。它是氨基酸半胱氨酸的特别好的来源，但必须就赖氨酸与其他蛋白质平衡。
饲料添加剂组合物
本发明的饲料添加剂组合物和/或包含它们的饲料可以任何合适的形式使用。
本发明的饲料添加剂组合物可以固体或液体制剂或其备选形式使用。固体制剂的例子包括散剂、糊剂、大丸剂、胶囊剂、丸剂、片剂、粉剂和颗粒剂，其可以是可润湿的、喷雾干燥的或冷冻干燥的。液体制剂的例子包括但不限于水性、有机或水性-有机溶液剂、混悬剂和乳剂。
在一些应用中，本发明的饲料添加剂组合物可以与饲料混合或施用于饮用水中。
在一方面，本发明涉及制备饲料添加剂组合物的方法，其包括将木聚糖酶、β-葡聚糖酶(及可选的至少一种其他纤维降解酶)和本文教导的DFM与饲料可接受的载体、稀释剂或赋形剂混合，并(可选地)包装。
预混物
可以将饲料和/或饲料添加剂组合物与至少一种矿物质和/或至少一种维生素组合。这样得到的组合物在本文中可称为预混物。
形式
本发明的饲料添加剂组合物及其他组分和/或包含它们的饲料可以任何合适的形式使用。
本发明的饲料添加剂组合物可以固体或液体制剂或其备选形式使用。固体制剂的例子包括散剂、糊剂、大丸剂、胶囊剂、丸剂、片剂、粉剂和颗粒剂，其可以是可润湿的、喷雾干燥的或冷冻干燥的。液体制剂的例子包括但不限于水性、有机或水性-有机溶液剂、混悬剂和乳剂。
在一些应用中，可将本发明的DFM或饲料添加剂组合物与饲料混合或施用于饮用水中。在一个实施方案中，包括进水中的剂量范围为约1×103CFU/动物/天至约1×1010CFU/动物/天，更优选约1×107CFU/动物/天。
合适的形式的例子包括如下中的一种或多种：散剂、糊剂、大丸剂、丸粒、片剂、丸剂、胶囊剂、阴道栓剂、溶液剂或混悬剂，其可含有矫味剂或着色剂，用于即刻释放、延迟释放、调节释放、持续释放、脉冲释放或受控释放应用。
举例而言，如果本发明的组合物以固体(例如丸粒形式)使用，则其也可含有如下中的一种或多种：赋形剂，例如微晶纤维素、乳糖、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸氢钙和甘氨酸；崩解剂，例如淀粉(优选玉米、马铃薯或木薯淀粉)、羟基乙酸淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠及某些复合硅酸盐；制粒粘合剂，例如聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙基纤维素(HPC)、蔗糖、明胶及阿拉伯胶；润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸、甘油山萮酸酯及滑石粉。
用于制备这些形式的营养上可接受的载体的例子包括(例如)水、盐溶液、醇、有机硅(silicone)、蜡、石油凝胶、植物油、聚乙二醇、丙二醇、脂质体、糖、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石粉、表面活性剂、硅酸、粘性石蜡、香水油、脂肪酸甘油单酯和脂肪酸甘油二酯、石油醚(petroethral)脂肪酸酯、羟甲基-纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等等。
用于这些形式的优选赋形剂包括乳糖(lactose)、淀粉、纤维素、乳糖(milk sugar)或高分子量聚乙二醇。
对于水性混悬剂和/或酏剂而言，可将本发明的组合物与多种甜味剂或矫味剂、着色物质或染料、与乳化剂和/或助悬剂以及与稀释剂(例如水、丙二醇和甘油)以及它们的组合进行组合。
非吸水乳清经常用作为DFM(尤其细菌DFM)的载体并且为引发生长的良好介质。
含有细菌DFM的糊剂可与植物油和惰性胶凝成分配制在一起。
真菌产品可与作为载体的谷物副产品配制在一起。
在一个实施方案中，优选地，本发明的饲料添加剂组合物并不是微粒系统(例如WO2005/123034中所教导的微粒系统)形式。
给予
本发明的DFM和/或饲料添加剂组合物可设计用于一次给予或可以设计用于以每日计饲喂。
待用于本发明组合中的组合物(及其中的每种组分)的最佳量将取决于待处理的产品和/或使产品与组合物接触的方法和/或其预期用途。
用于组合物中的DFM和酶的量应为足以有效用于以及足以保持足够有效用于改善饲喂含有该组合物的饲料产品的动物的表现的量。有效性的时间长度应延伸最多至至少利用该产品(例如饲料添加剂组合物或含有其的饲料)的时间。
与其他成分的组合
用于本发明中的DFM和一种或多种酶可与其他成分组合使用。因此，本发明还涉及组合。DFM与木聚糖酶和β-葡聚糖酶(及可选的至少一种其他纤维降解酶)的组合在本文中可称为“本发明的饲料添加剂组合物”。
在优选实施方案中，“本发明的饲料添加剂组合物”可以包含DFM与木聚糖酶和β-葡聚糖酶及本文教导的其他纤维降解酶(例如，适宜地至少两种、适宜地至少三种其他纤维降解酶)的组合(或基本上由其组成，或由其组成)。
在另一个优选实施方案中，“本发明的饲料添加剂组合物”可以包含DFM与木聚糖酶和β-葡聚糖酶及本文教导的其他纤维降解酶(例如，适宜地至少四种、适宜地至少五种其他纤维降解酶)的组合(或基本上由其组成，或由其组成)。
本发明的组合包含本发明的饲料添加剂组合物(或其一种或多种组分)和适于动物食用且能够为食用者提供医学或生理学益处的另一成分。
在一个实施方案中，优选地，该“另一成分”并非其他酶或其他DFM。
这些成分可以是益生菌剂。益生菌剂通常是不在上消化道中降解或吸收的非消化性碳水化合物(低聚糖或多糖)或糖醇。用于商业产品中和用于本发明的已知益生菌剂包括菊粉(低聚果糖或FOS)和低聚反式半乳糖(GOS或TOS)。适宜的益生菌剂包括低聚帕拉金糖、大豆低聚糖、海藻酸盐、黄原胶、果胶、刺槐豆胶(LBG)、菊粉、瓜耳胶、低聚半乳糖(GOS)、低聚果糖(FOS)、不可降解的淀粉、乳蔗糖、乳果糖、乳糖醇、麦芽糖醇、麦芽糖糊精、聚右旋糖(即)、乳糖醇、乳蔗糖、大豆低聚糖、帕拉金糖、低聚异麦芽糖、低聚葡糖糖和低聚木糖。
在一个实施方案中，本发明涉及本发明的饲料添加剂组合物(或其一种或多种组分)与益生菌的组合。在另一实施方案中，本发明涉及包含DFM与木聚糖酶、β-葡聚糖酶、淀粉酶、肌醇六磷酸酶、蛋白酶和益生菌的组合(或基本上由其组成，或由其组成)的饲料添加剂组合物。
益生菌可与本发明的饲料添加剂组合物(或其组分)同时(例如，与其一起的混合物或通过相同或不同途径同时递送)或在其之后(例如通过相同或不同途径)施用。
本发明的组合的其他成分包括聚右旋糖(如)和/或麦芽糖糊精和/或乳糖醇。这些其他成分可以可选地添加至饲料添加剂组合物中以辅助干燥过程以及帮助DFM存活。
其他适宜的成分的其他实例包括以下中的一种或多种：增稠剂、胶凝剂、乳化剂、粘合剂、结晶改良剂、甜味剂(包括人造甜味料)、流变改性剂、稳定剂、抗氧化剂、染料、酶、载体、媒介物、赋形剂、稀释剂、润滑剂、矫味剂、着色物质、助悬剂、崩解剂、制粒粘合剂等。这些其他成分可以是天然的。这些其他的成分可通过使用化学和/或酶学技术来制备。
在一个实施方案中，可以囊封DFM和/或酶。在一个实施方案中，将饲料添加剂组合物和/或DFM和/或酶配制为WO2007/044968中所述的干粉或颗粒(称为TPT颗粒)，该专利在此引入作为参考。
在一个优选实施方案中，用于本发明中的DFM和/或酶可以与一种或多种脂质组合使用。
例如，用于本发明中的DFM和/或酶可以与一种或多种脂质微胶粒组合使用。脂质微胶粒可以是简单脂质微胶粒或复杂脂质微胶粒。
脂质微胶粒可以是两性物质(如脂质和/或油)的取向分子的聚集体。
本文所用的术语“增稠剂或胶凝剂”是指通过减缓或防止粒子(不可混溶液的小滴、空气或不溶性固体)运动而防止分离的产品。在单独的水合分子引起粘度增加，从而减缓分离时，发生增稠。当水合的分子连接而形成可捕获粒子的三维网络，由此使这些粒子固定时发生胶凝。
本文所用的术语“稳定剂”定义为保持产品(例如饲料产品)免于随时间推移而变化的成分或成分的组合。
本文所用的术语“乳化剂”是指防止乳液分离的成分(例如饲料成分)。乳液是两种不混溶的物质，一种以小滴存在，包含于另一者中。乳液可由水包油(其中小滴或分散相是油而连续相是水)或油包水(其中水变成分散相而连续相是油)组成。也可通过使用乳化剂来使泡沫(其是液包气)和混悬液(其为液固混悬液)稳定。
本文所用的术语“粘合剂”是指通过物理或化学反应将产品结合在一起的成分(例如饲料成分)。例如，在“胶凝”期间，水被吸收，从而提供结合效果。然而，粘合剂可吸收其他液体(例如油)，从而将其保持在产品中。在本发明的背景中，粘合剂将通常用于固体或低水分产品(例如烘焙产品：甜点、甜甜圈、面包等等)中。
“载体”或“媒介物”意指适合用于施用DFM和/或酶的材料，且包括本领域已知的任意这种材料，例如任意液体、凝胶、溶剂、液体稀释剂、稳定剂等等，其无毒且不以有害方式与组合物的任意成分相互作用。
在一个实施方案中，本发明的饲料添加剂组合物、预混物、饲料可以与至少一种选自以下中的至少一者的生理学上可接受的载体混合：麦芽糖糊精、石灰石(碳酸钙)、环糊精、小麦或小麦成分、蔗糖、淀粉、Na2SO4、滑石粉、PVA、山梨醇、苯甲酸盐、山梨酸盐、甘油、蔗糖、丙二醇、1,3-丙二醇、葡萄糖、对羟基苯甲酸酯、氯化钠、柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐、钙、偏亚硫酸氢盐、甲酸盐及其混合物。
赋形剂的实例包括以下中的一种或多种：微晶纤维素和其他纤维素、乳糖、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸氢钙、甘氨酸、淀粉、乳糖和高分子量聚乙二醇。
崩解剂的实例包括以下中的一种或多种：淀粉(优选玉米、马铃薯或木薯淀粉)、羟基乙酸淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠和某些复合硅酸盐。
制粒粘合剂的实例包括以下中的一种或多种：聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙基纤维素(HPC)、蔗糖、麦芽糖、明胶和阿拉伯胶。
润滑剂的实例包括以下中的一种或多种：硬脂酸镁、硬脂酸、山嵛酸甘油酯和滑石粉。
稀释剂的实例包括以下中的一种或多种：水、乙醇、丙二醇和丙三醇及其组合。
其他成分可以同时使用(例如当它们混合在一起时或者甚至当它们通过不同途径递送时)或者依序使用(例如它们可通过不同途径递送)。
优选地，在将本发明的饲料添加剂组合物与另外一种或多种成分混合时，DFM保持为活的。
在一个实施方案中，优选地，本发明的饲料添加剂组合物不包含铬或有机铬。
在一个实施方案中，优选地，本发明的饲料添加剂组合物不包含山梨酸。
浓缩物
用于本发明中的DFM可以是浓缩物形式。通常，这些浓缩物包含相当高浓度的DFM。
本发明的饲料添加剂组合物可具有的活细胞的含量(集落形成单位，CFU)在至少104CFU/g(适宜地包括至少105CFU/g，如至少106CFU/g，例如至少107CFU/g，至少108CFU/g，如至少109CFU/g)至约1010CFU/g(或甚至约1011CFU/g或约1012CFU/g)的范围内。
在DFM是浓缩物形式时，本发明的饲料添加剂组合物可具有的活细胞的含量在至少109CFU/g至约1012CFU/g、优选至少1010CFU/g至约1012CFU/g的范围内。
浓缩物形式的散剂、颗粒剂和液体组合物可用水稀释或重悬在水或其他适宜的稀释剂(例如适当的生长培养基，如乳或矿物质或植物油)中，以产生可供使用的组合物。
可按照本领域已知的方法制备浓缩物形式的本发明的DFM或饲料添加剂组合物或本发明的组合。
在本发明的一个方面，以浓缩形式的组合物接触酶或饲料。
可通过本领域已知的方法喷雾干燥或冷冻干燥本发明的组合物。
用喷雾干燥方法制备粒子的典型方法涉及溶解于适当溶剂中的固体材料(例如，发酵培养基中的DFM培养物)。备选地，可将材料悬浮或乳化于非溶剂中以形成混悬液或乳液。可以可选地在该阶段添加其他成分(如上文所论述)或诸如抗微生物剂、稳定剂、染料和辅助干燥过程的物质之类的成分。
然后使溶液雾化以形成小滴的细雾。小滴立即进入干燥室中，在其中其接触干燥气体。溶剂从小滴蒸发进入干燥气体中而固化小滴，从而形成粒子。随后从干燥气体分离粒子并收集。
个体
本文所用的术语“个体”意指待施用或已施用本发明的饲料添加剂组合物或包含该本发明的饲料添加剂组合物的饲料的动物。
本文所用的术语“个体”意指动物。优选地，个体是哺乳动物、鸟、鱼或甲壳类动物，包括例如家畜或驯养动物(例如宠物)。
在一个实施方案中，“个体”是家畜。
本文所用的术语“家畜”是指任意农场动物。优选地，家畜是以下中的一种或多种：奶牛或公牛(包括牛犊)、家禽、猪(包括仔猪)、家禽(包括肉鸡、鸡和火鸡)、鸟、鱼(包括淡水鱼(如鲑鱼、鳕鱼、鳟鱼和鲤鱼，例如锦鲤鱼)和海鱼(如海鲈))、甲壳类动物(如虾、贻贝和扇贝)、马(包括赛马)、绵羊(包括羔羊)。
在一个实施方案中，术语家畜和/或家禽和/或鸡不包括蛋鸡。
在另一实施方案中，“个体”是驯养动物或宠物或维持于动物园环境中的动物。
本文所用的术语“驯养动物或宠物或维持于动物园环境中的动物”是指任意相关动物，包括犬科动物(例如狗)、猫科动物(例如猫)、啮齿类动物(例如豚鼠、大鼠、小鼠)、鸟、鱼(包括淡水鱼和海鱼)和马。
短链脂肪酸(SCFA)产生
本文所用的术语“短链脂肪酸”包括挥发性脂肪酸以及乳酸。在一个实施方案中，SCFA可以选自：乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸、2-甲基丁酸和乳酸，优选丙酸和/或丁酸。
在一个实施方案中，SCFA可以是丁酸和/或丙酸。
可以用以下方法分析短链脂肪酸(尤其是挥发性脂肪酸，例如丙酸和丁酸，及乳酸)：
按之前所述(Ouwehand等,2009年2月；101(3):367-75)用新戊酸作为内部标准从模拟样品进行挥发性脂肪酸和乳酸(例如SCFA)的层析分析。测定了乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸、2-甲基丁酸和乳酸的浓度。
表现
本文所用的“动物表现”可通过饲料效率和/或动物的增重和/或通过饲料转化率和/或通过饲料中的营养物的消化率(例如氨基酸消化率)和/或饲料中的可消化能或代谢能和/或通过氮保留来测定。
优选地，“动物表现”通过饲料效率和/或动物的增重和/或通过饲料转化率来测定。
“改善的动物表现”意指与不包含本发明的饲料添加剂组合物的饲料相比，由于在饲料中使用该饲料添加剂组合物，个体中的饲料效率提高和/或增重增加和/或饲料转化率降低和/或饲料中的营养物或能量的消化率改善和/或氮保留改善。
优选地，“改善的动物表现”意指饲料效率提高和/或增重增加和/或饲料转化率降低。
本文所用的术语“饲料效率”是指在一段时间期间不限量饲喂动物或对其饲喂指定量的食物时动物中发生的增重的量。
“提高的饲料效率”意指与在不存在本发明的饲料添加剂组合物的情况下饲喂的动物相比，在饲料中使用该饲料添加剂组合物导致每单位摄入饲料的增重增加。
饲料转化率(FCR)
本文所用的术语“饲料转化率”是指饲喂给动物来使动物的体重增加规定的量的饲料量。
改善的饲料转化率意指较低的饲料转化率。
“较低的饲料转化率”或“改善的饲料转化率”意指在饲料中使用饲料添加剂组合物导致动物体重增加指定量时所需饲喂给动物的饲料量低于在该饲料不包含该饲料添加剂组合物时使动物体重增加相同量时所需的饲料量。
营养物消化率
本文所用的营养物消化率意指从胃肠道或胃肠道的指定区段(例如小肠)消失的营养物的分数。营养物消化率可测量为施用于个体的与从个体粪便中出来的之间的差值，或施用于个体的与保留在胃肠道指定区段(例如回肠)上的消化物中的之间的差值。
本文所用的营养物消化率可通过在一段时间期间收集总排泄物，测量所摄入营养物与所排泄的营养物之间的差值；或利用不会被动物吸收，并允许研究者计算整个胃肠道或胃肠道区段中所消失的营养物的量的惰性标记来测量。这种惰性标记可以是二氧化钛、氧化铬或酸不溶性灰分。消化率可表示为营养物在饲料中的百分比，或表示为可消化的营养物的质量单位/饲料中的营养物的质量单位。
本文所用的营养物消化率涵盖淀粉消化率、脂肪消化率、蛋白质消化率和氨基酸消化率。
本文所用的能量消化率意指所消耗的饲料总能量减去粪便的总能量，或所消耗的饲料总能量减去动物胃肠道指定区段(例如回肠)上的剩余消化物的总能量。本文所用的代谢能是指表观代谢能，且意指所消耗的饲料总能量减去粪便、尿和消化的气体产物中含有的总能量。能量消化率和代谢能可测量为总能量的摄取与粪便中排泄的或胃肠道指定区段中存在的消化物中的总能量之间的差值，其使用与测量营养物的消化率相同的方法，针对氮排泄进行适当校正以计算饲料的代谢能。
氮保留
本文所用的氮保留意指个体从饲粮保留氮作为体重的能力。在氮的排泄超过每日的摄取时发生负氮平衡并且在损失肌肉时经常观察到该负氮平衡。正氮平衡经常与肌肉生长相关，尤其是与正生长的动物中的肌肉生长相关。
氮保留可借助于在一段时间期间排泄物和尿的总集测量为所摄取的氮与所排泄的氮之间的差值。应理解，所排泄的氮包括来自饲料的未消化蛋白质、内源性蛋白质性排泄物、微生物蛋白质和尿氮。
屠宰率和产肉率
本文所用的术语屠宰率意指在商业或实验的屠宰过程后，作为活体重量的比例的胴体量。术语胴体意指已因食物而屠宰的动物身体，其中头、内脏、四肢的部分和羽毛或皮肤已去除。本文所用的术语产肉率意指作为活体重量的比例的可食用肉的量，或作为活体重量的比例的切割的指定肉的量。
增重
本发明还提供增加个体(例如家禽或猪)中的增重的方法，其包括给该个体饲喂包含本发明的饲料添加剂组合物的饲料。
“增加的增重”指与饲喂不存在饲料添加剂组合物的饲料的动物相比较，在饲喂包含该饲料添加剂组合物的饲料时动物具有增加的体重。
其他特性
在一个实施方案中，本发明的饲料添加剂组合物、饲料或方法可以不调节(例如改善)个体的免疫应答。
在另一实施方案中，本发明的饲料添加剂组合物、饲料或方法可以不改善个体的存活率(例如降低死亡率)。
在优选实施方案中，本发明的饲料添加剂组合物、饲料或方法可以不调节(例如改善)个体的免疫应答或改善个体的存活率(例如降低死亡率)。
益生菌
对于一些应用，认为本发明组合物中的DFM可发挥益生菌培养物效应。向本发明的组合物添加其他益生菌和/或益生菌剂也在本发明的范围之内。
这里，益生菌是：
“非消化性食物成分，其通过选择性刺激一种或有限数量的有益细菌的生长和/或活性而有利地影响宿主”。
本文所用的术语“益生菌培养物”定义活微生物(例如，包括细菌或酵母)，其在例如以足够数量摄入或局部施加时可有利地影响宿主生物体，即通过赋予宿主生物体一种或多种可证实的健康益处。益生菌剂可改善一种或多种粘膜表面的微生物平衡。例如，粘膜表面可为肠、尿道、呼吸道或皮肤。尽管对于益生菌摄取而言，不存在下限或上限，但已提出，至少106-1012、优选至少106-1010、优选108-109cfu作为日剂量将对在个体中达到有益的健康效果有效。
分离的
在一方面，优选地，本发明中所用的酶是分离的形式。术语“分离的”意指酶至少实质上不含该酶在自然界中天然与之相关和见于自然界中的至少一种其他成分。本发明的酶可以实质上不含该物质原本与之相关的一种或多种污染物的形式提供。因此，例如，其可实质上不含一或多种潜在污染性的多肽和/或核酸分子。
纯化的
在一方面，优选地，本发明的酶和/或DFM是纯化的形式。术语“纯化的”意指酶和/或DFM以高水平存在。酶和/或DFM有利地是组合物中存在的主要成分。优选地，它以至少约90％，或至少约95％或至少约98％的水平存在，该水平是相对于所考虑的总组合物以干重/干重为基础来测定。
在本发明的范围内设想，可以组合本发明的实施方案，使得本文所述的任意特征的组合包括在本发明的范围之内。具体而言，在本发明的范围内设想，可以同时展现细菌的治疗效果中的任一种。
氨基酸序列
本发明的范围还涵盖具有本文定义的具体特性的酶的氨基酸序列。
本文所用的术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”同义。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”同义。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“酶”同义。
氨基酸序列可以从适宜的来源制备/分离，或者它可以合成制备，或者它可以通过使用重组DNA技术来制备。
优选地，在涉及本发明的范围本身时及在为本发明的范围本身所涵盖时，氨基酸序列不是天然酶。在这方面，术语“天然酶”意指处于其天然环境中及在已通过其天然核苷酸序列来表达它时的整个酶。
序列同一性或序列同源性
本发明还涵盖与具有本文定义的具体特性的多肽的氨基酸序列或编码这种多肽的任意核苷酸序列具有某种程度的序列同一性或序列同源性的序列(后文称为“同源序列”)的用途。在此，术语“同源的”意指与主题氨基酸序列和主题核苷酸序列具有某同源性的实体。在此，术语“同源性”可以与“同一性”等同。
同源氨基酸序列和/或核苷酸序列应提供和/或编码保持酶的功能活性和/或增强酶的活性的多肽。
与本发明有关的术语“核苷酸序列”包括基因组DNA、cDNA、合成DNA和RNA。优选地，它意指DNA，更优选编码本发明的cDNA序列。
在这种背景中，在一些实施方案中，考虑同源序列包括可以与主题序列至少97％同一、优选至少98％或99％同一的氨基酸或核苷酸序列。
在一些实施方案中，考虑同源序列包括可以与主题序列至少85％同一、优选至少90％或95％同一的氨基酸或核苷酸序列。
通常，同源物将包括与例如主题氨基酸序列相同的活性位点等。虽然同源性也可以根据相似性(即具有相似的化学性质/功能的氨基酸残基)来考虑，但在本发明的背景中，优选根据序列同一性来表示同源性。
在一个实施方案中，考虑同源序列包括与主题序列相比具有一个或若干个添加、缺失和/或取代的氨基酸序列或核苷酸序列。
在一个实施方案中，本发明涉及其氨基酸序列在本文中显示的蛋白质，或通过在亲本蛋白质的氨基酸序列中取代、缺失或添加一个或若干个氨基酸，如2、3、4、5、6、7、8、9个氨基酸，或更多个氨基酸，如10个或超过10个氨基酸而从此(亲本)蛋白质衍生，且具有亲本蛋白质的活性的蛋白质。
通常，同源物将包含与主题序列相同的编码活性位点等的序列。虽然同源性也可以根据相似性(即具有相似的化学性质/功能的氨基酸残基)来考虑，但在本发明的背景中，优选根据序列同一性来表示同源性。
同源性比较可以通过目检，或更通常借助易得到的序列比较程序来进行。这些市售计算机程序可以计算两个或多个序列之间的同源性。
％同源性可以在连续的序列内计算，即一个序列与另一个序列比对，一个序列中的每个氨基酸直接与另一序列中相应的氨基酸比较，每次一个残基。这称为“无缺口”比对。通常，这类无缺口比对仅在相对短数目的残基内进行。
虽然这是非常简单和一致的方法，但它未能考虑到的是，例如，在原本一致的序列对中，一个插入或缺失将导致后面的氨基酸残基在比对之外，从而可能在进行全局比对时导致％同源性的大幅降低。因此，大多数序列比对方法设计用于产生考虑到可能的插入和缺失而不对总体同源性得分进行过度罚分的最佳比对。这通过在序列比对中插入“缺口”来尝试最大化局部同源性而达到。
但是，这些更复杂的方法为比对中出现的每个缺口指定“缺口罚分”，使得对于相同数目的同一氨基酸，具有尽可能少的缺口的序列比对(反映所比较的两个序列之间更高的相关性)将达到比具有许多缺口的比对高的得分。通常使用“仿射缺口成本”，其为缺口的存在赋予相对高的成本，而为缺口中的每个后续残基赋予较小的罚分。这是最常使用的缺口评分系统。高缺口罚分当然将产生具有较少缺口的优化比对。大多数比对程序允许修改缺口罚分。但是，在用这种软件进行序列比较时，优选使用默认值。
因此，最大％同源性的计算首先需要产生考虑到缺口罚分的最佳比对。适合用于进行这种比对的计算机程序是Vector NTI(Invitrogen Corp.)。可以进行序列比较的软件的实例包括但不限于例如BLAST软件包(见Ausubel等1999Short Protocols in Molecular Biology,第4版–第18章)、BLAST 2(见FEMS Microbiol Lett 1999 174(2):247-50；FEMSMicrobiol Lett 1999177(1):187-8；及tatiana@ncbi.nlm.nih.gov)、FASTA(Altschul等1990J.Mol.Biol.403-410)和AlignX。至少BLAST、BLAST 2和FASTA可用于离线和在线检索(见Ausubel等1999,7-58至7-60页)。
虽然最终的％同源性可以根据同一性来测量，但比对方法本身通常不是基于全或无配对比较。相反，通常使用缩放的相似性得分矩阵，其根据化学相似性或进化距离为每个配对比较指定得分。这种常用矩阵的实例是BLOSUM62矩阵，该矩阵是用于BLAST程序包的默认矩阵。Vector NTI程序通常使用公开的默认值或在提供时使用自定义符号比较表(其他详情见用户手册)。对于一些应用，优选使用Vector NTI程序包的默认值。
备选地，可以用Vector NTI(Invitrogen Corp.)中的多重比对特征计算百分比同源性，该多重比对特征基于与CLUSTAL(Higgins DG&SharpPM(1988),Gene 73(1),237-244)类似的算法。
一旦软件产生了最佳比对，即可能计算％同源性，优选％序列同一性。软件通常作为序列比较的一部分来计算，并产生数值结果。
在测定序列同一性时应使用缺口罚分，然后优选用以下参数进行配对比对：
对于BLAST
缺口开放 0
缺口延伸 0
对于CLUSTAL DNA 蛋白质
字长 2 1 K三重
缺口罚分 15 10
缺口延伸 6.66 0.1
在一个实施方案中，CLUSTAL可以按上文定义的缺口罚分和缺口延伸使用。
适宜地，在至少20个连续氨基酸残基上、优选至少30个连续残基上、优选至少40个连续残基上、优选至少50个连续残基上、优选至少60个连续残基上、优选至少100个连续残基上测定就氨基酸序列而言的同一性程度。
适宜地，可以在本文教导的整个序列上测定就氨基酸序列而言的同一性程度。
序列还可以具有产生沉默改变并产生功能上等同的物质的氨基酸残基缺失、插入或取代。可以根据残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性性质进行刻意的氨基酸取代，只要保留该物质的次级结合活性。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；含有具有相似亲水性值的不带电荷的极性首基的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。
可以例如按照下表进行保守取代。第二列的同一格中和优选第三列的同一行中的氨基酸可以相互取代：
本发明还涵盖可以存在的同源取代(取代和替换在本文中都用来指已存在的氨基酸残基与备选残基的交换)，即对等取代，如碱性取代碱性、酸性取代酸性、极性取代极性等。也可以存在非同源取代，即从一类残基至另一类残基，或备选地涉及纳入非天然氨基酸，如鸟氨酸(后文中称为Z)、二氨基丁酸鸟氨酸(后文中称为B)、正亮氨酸鸟氨酸(后文中称为O)、pyriylalanine、噻吩丙氨酸、萘基丙氨酸和苯甘氨酸。
还可以通过非天然氨基酸进行替换，其包括：α*和α-双取代*氨基酸，N-烷基氨基酸*，乳酸*，天然氨基酸的卤代衍生物如三氟酪氨酸*、对-Cl-苯丙氨酸*、对-Br-苯丙氨酸*、对-I-苯丙氨酸*，L-烯丙基-甘氨酸*，β-丙氨酸*，L-α-氨基丁酸*，L-γ-氨基丁酸*，L-α-氨基异丁酸*，L-ε-氨基己酸#，7-氨基庚酸*，L-甲硫氨酸砜#*，L-正亮氨酸*，L-正缬氨酸*，对-硝基-L-苯丙氨酸*，L-羟脯氨酸#，L-硫代脯氨酸*，苯丙氨酸(Phe)的甲基衍生物如4-甲基-Phe*、五甲基-Phe*，L-Phe(4-氨基)#，L-Tyr(甲基)*，L-Phe(4-异丙基)*，L-Tic(1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸)*，L-二氨基丙酸#和L-Phe(4-苄基)*。为了以上讨论(涉及同源或非同源取代)的目的而用注释*来表示衍生物的疏水性质，而用#来表示衍生物的亲水性质，#*表示两亲性性质。
除氨基酸间隔区如甘氨酸或β-丙氨酸残基外，变体氨基酸序列可以包含可插入在序列的任意两个氨基酸残基之间的适宜间隔区基团，包括烷基，如甲基、乙基或丙基。其他形式的变异涉及存在将为本领域技术人员很好地理解的拟肽形式的一个或多个氨基酸残基。为免生疑问，用“拟肽形式”来指α-碳取代基在残基的氮原子上而不是α-碳上的变体氨基酸残基。用于制备拟肽形式的肽的方法为本领域已知，例如Simon RJ等,PNAS(1992)89(20),9367-9371和Horwell DC,Trends Biotechnol.(1995)13(4),132-134。
在一个实施方案中，用于本发明的木聚糖酶可以包含具有至少一个氨基酸的保守取代的本文的多肽序列。
适宜地，可以存在至少2个保守取代，如至少3个或至少4个或至少5个。
适宜地，可以存在少于15个保守取代，如少于12个、少于10个，或少于8个或少于5个。
实施例
实施例1：饲喂含有木聚糖酶、β-葡聚糖酶和直接饲喂微生物的基于小麦的饲粮的肉鸡的反应
材料和方法
动物的使用和实验方案由动物实验委员会(Institutional AnimalExperiment Committee)批准。配制饲粮以平衡雏肉鸡(0-21日龄)的能量和营养物(表1，饲粮1)。饲粮的谷类成分是小麦、大麦、黑麦、小麦粗粉、麦麸或其组合，而蛋白质成分是大豆粉，脂肪来源是油菜籽油。不包含合成的抗微生物或抗球虫药物，饲粮作为糊料提供。将基础饲粮分为多份，加入各自的酶和DFM，以构成表2中所示的实验饲粮。
每种补充剂以预混物提供，并在饲粮制备期间加入混合器中。先混合含有DFM的饲粮，然后在每种饲粮之间冲洗混合器，以防止交叉污染。在每个批次的开始、中间和结束时从每种处理饲粮收集样品，并共混在一起，以确认酶活性和DFM存在于开始动物试验之前的饲料中。保留来自每种处理饲粮的附加样品，并在需要进行分析之前保存在-20℃±2℃。
从商业孵化场获得数日龄雄性肉鸡(Ross 308)。将鸡单独称重，并分配至32个育雏笼(每笼8只鸡)，使得每个笼的平均鸡重相似。然后各随机分配4种饲粮处理(表2)至8个笼。在第12天，将鸡转移至生长笼。育雏笼和生长笼中每只鸡的空间分配分别为530和640cm2。育雏笼和生长笼放在环境受控的房间中。第一周温度维持在31℃，然后在第三周结束时逐渐降低至22℃。鸡接受20小时荧光照明，并允许其自由接近饲粮和水。从第0至21天提供饲粮。在21天的整个实验期内按一周的间隔记录体重。每天记录死亡率。用SAS的GLM程序分析数据。
表1：肉鸡小麦基础饲粮的饲粮组成(饲喂的％)
表2：处理的识别
ID 描述1
1 对照，无添加剂
2 NC+木聚糖酶(2500XU/kg)
3 NC+木聚糖酶(2500XU/kg)+β-葡聚糖酶(200BGU/kg)
4 NC+木聚糖酶(2500XU/kg)+β-葡聚糖酶(200BGU/kg)+DFM2(7.5e+04)
1酶(木聚糖酶(Danisco Xylanase内切-1,4-β-D-木聚糖酶(E.C.3.2.1.8))和β-葡聚糖酶是由丹尼斯克动物营养公司提供的市售产品。
2由丹尼斯克动物营养公司作为等比例的菌株AGTP BS918(NRRLB-50508)、AGTP BS3BP5(NRRL B-50510)和AGTP BS1013(NRRLB-50509)提供的基于针对分泌酶的能力选择的三个芽孢杆菌属菌株的直接饲喂微生物。
结果
表3：木聚糖酶、β-葡聚糖酶和基于芽孢杆菌的直接饲喂微生物对雏肉鸡的生长表现的影响。
第21天的体重，g 增重，g
1 863.8b 827.4b
2 897.0ab 860.4ab
3 899.6ab 863.4ab
4 906.3a 869.6a
标准误 16.98 16.92
注意，值后面的不同字母显示该列中的值之间的统计学差异(P≤0.10)。
饲喂木聚糖酶、纤维降解酶(β-葡聚糖酶)和基于芽孢杆菌的DFM的组合的鸡比对照生长快，在数值上好于饲喂只含酶的饲粮的鸡。相对于对照，饲喂木聚糖酶、β-葡聚糖酶和DFM的三路组合的鸡中第21天的体重和增重在数值上更好。
II.营养物和能量保留/消化率
材料和方法
动物的使用和实验方案由动物实验委员会批准。配制基于小麦-大麦的饲粮以平衡雏肉鸡(0-21日龄)的能量和营养物(表1，饲粮II)。按0.30％包含二氧化钛，以允许测定饲粮成分保留。不包含合成的抗微生物或抗球虫药物，饲粮作为糊料提供。将基础饲粮分为多份，加入各自的酶和DFM，以构成表4中所示的实验饲粮。预先混合各补充剂，并冲洗混合器，以防止所处理的饲粮的交叉污染。在每个批次的开始、中间和结束时从每种处理饲粮收集样品，并共混在一起，以确认酶活性和DFM存在于开始动物试验之前的饲料中。保留来自每种处理饲粮的附加样品，并在需要进行分析之前保存在-20℃±2℃。
表4：处理的识别
ID 描述1
1 对照，无添加剂
2 NC+木聚糖酶(2500XU/kg)
3 NC+木聚糖酶(2500XU/kg)+β-葡聚糖酶(200XBGU/kg)
4 NC+木聚糖酶(2500XU/kg)+β-葡聚糖酶(200BGU/kg)+DFM2((7.5e+04)
1酶(木聚糖酶(Danisco Xylanase内切-1,4-β-D-木聚糖酶(E.C.3.2.1.8))和β-葡聚糖酶是由丹尼斯克动物营养公司提供的市售产品。
2由丹尼斯克动物营养公司作为等比例的菌株AGTP BS918(NRRLB-50508)、AGTP BS3BP5(NRRL B-50510)和AGTP BS1013(NRRLB-50509)提供的基于针对其分泌酶的能力选择的三个芽孢杆菌属菌株的直接饲喂微生物。
研究涉及笼舍试验，进行该笼舍试验来获得用于能量和营养物消化率测量的排泄物样品。从商业孵化场获得数日龄雄性肉鸡(Ross 308)。在到达时将鸡单独称重，按体重分层，并分配至30个笼(每笼5只鸡)，使得每个笼的平均鸡重相似。然后随机分配4种饲粮处理至6个重复笼。从第0至21天进行试验，其间鸡可自由接近它们所分配的饲粮处理和水。在第一周期间将育雏笼和房间温度分别设为32℃和29℃。然后，关闭育雏笼中的供热，并在整个实验中将房间温度保持在29℃。整个实验中提供光照24小时。在第17、18、19和20天，收集排泄物样品，冷冻保存在-20℃用于测定能量和营养物保留/消化率。收集排泄物样品期间多加小心，以避免来自羽毛和其他外来材料的污染。在笼内合并排泄物样品，用混合器混匀，每笼采集两个代表性样品。将样品冷冻干燥。磨碎干燥的样品至通过0.5mm筛网，-4℃保存在气密塑料容器中，直至化学分析。按照AOAC官方分析方法分析饲粮和排泄物样品的干物质、粗蛋白(作为氮)、总能量、脂肪(作为己烷提取物)和中性洗涤剂纤维。按照Lomer等(2000,Analyst125:2339–2343)所述的方法分析钛(消化率标记)。用标准方法(Adeola,O.2001.Digestion and balance techniques in pigs.Swine Nutrition,第2版A.J.Lewis和L.L.Southern编辑CRC Press,Washington,DC中的第903–916页)。用SAS(2004)的一般线性模型分析数据。
结果
表5：木聚糖酶、纤维降解酶和基于芽孢杆菌的直接饲喂微生物对雏肉鸡中营养物保留/消化率和能量可代谢性的影响。
注意，值后面的不同字母显示该列中的值之间的统计学差异(P≤0.10)。
与对照或木聚糖酶单独或木聚糖酶和β-葡聚糖酶的组合相比，木聚糖酶、β-葡聚糖酶和基于芽孢杆菌的直接饲喂微生物的组合改善雏肉鸡的饲粮能量利用(表5)。这可与产能营养物如纤维、脂肪和氮的保留的增加相关联(表5)。由三路组合引起的脂肪保留增强值得注意，且可与饲粮脂肪的消化和吸收以及来自发酵的短链脂肪酸的产生和吸收的增强相关联。还可以推测，所观察到的木聚糖酶、β-葡聚糖酶、芽孢杆菌/丙酸DFM的三路组合在能量和营养物利用上更好的益处与通过主动的小型生物群调节改善的肠健康和功能及肠消化/吸收功能相关联。
III.盲肠中的乳酸产生
材料和方法
鸡盲肠的体外刺激
从早先描述的人结肠体外系统(等2006；Nutrition andCancer 52:94-104,等2009；International Dairy Journal19:675-683)发展了鸡盲肠模型。此盲肠体外模型由接种新鲜盲肠微生物的四个连接容器组成。配制基于小麦-麦麸的基础饲粮以平衡雏肉鸡的能量和营养物(表1，饲粮III)。基础饲粮中不包含合成的抗微生物或抗球虫药物。将基础饲粮分为多份，加入各自的酶和DFM，以构成表6中所示的实验饲粮。不同饲料在进料至体外盲肠系统之前在5小时的模拟中经历模拟的上胃肠道消化。容器模拟鸡的盲肠区室，各具有相同的pH(6.25)。按与之前所述(Ouwehand等2009；The British Journal of Nutrition 101:367-375)相似的方式用新戊酸作为内部标准进行来自盲肠模拟样品的乳酸的层析分析。
表6：处理的识别
ID 描述
1 木聚糖酶1(2500XU/kg)
2 木聚糖酶+FDE混合物2
3 木聚糖酶(2500XU/kg)+FDE混合物2+DFM3
1Danisco xylanase，丹尼斯克动物营养公司
2 TRIOTM酶复合物包含多种酶活性的有效组合，包括β-葡聚糖酶(200CMC U/kg)、木聚糖酶(例如内切木聚糖酶——内切-1,4-β-D-木聚糖酶(E.C.3.2.1.8))(>1200ABX U/kg)和β-葡糖苷酶(>800pNPG U/kg)，由杜邦工业生物科学公司(DuPont Industrial Bioscences)提供。
3由丹尼斯克动物营养公司作为等比例的菌株AGTP BS918(NRRLB-50508)、AGTP BS3BP5(NRRL B-50510)和AGTP BS1013(NRRLB-50509)提供的基于针对其分泌酶的能力选择的三个芽孢杆菌属菌株的直接饲喂微生物。
结果
表7：木聚糖酶、纤维降解酶的混合物和直接饲喂微生物对鸡盲肠中乳酸产生的影响。
处理 乳酸，μmol/ml
1 17.51b
2 19.67b
3 42.23a
SEM 7.525
注意，值后面的不同字母显示该列中的值之间的统计学差异(P≤0.10)。
与单种酶或酶组合单独相比，木聚糖酶+其他纤维降解酶的混合物+基于芽孢杆菌的直接饲喂微生物的组合增加了盲肠乳酸产生。乳酸由乳酸细菌产生，其中乳杆菌和链球菌占主导；已知这些细菌在肠道中具有健康促进特性(Walter,2008；Applied and Environmental Microbiology 74:4985-4996)。乳酸对致病菌如大肠杆菌和沙门氏菌属物种具有抗细菌作用(Nout等1989；International Journal of Food Microbiology 8,351–361)，乳杆菌可以抑制大肠杆菌黏附至肠(Hillman等1994；Journal of AppliedMicrobiology 76:294–300)。因此，由木聚糖酶、纤维降解酶和直接饲喂微生物的三路组合引起的高浓度乳酸应反映这些肠健康相关微生物的群体和活性的增加。
IV.盲肠微生物群体
材料和方法
根据初始体重将肉鸡分配至鸡舍，并用认可的实验设计随机分配实验饲粮。使鸡在第0至21天之间的时期可自由接近实验饲粮。
从第18天至第20天每天收集排泄物样品，并保存在-20℃。在第21天，通过颈脱位法对鸡进行安乐死，获得盲肠内容物并冷冻保存在-20℃用于测定盲肠VFA。
DNA提取：将0.2g盲肠消化物悬浮在PBS中，然后通过珠磨步骤进一步分离，然后用市售试剂盒MagMAXTMTotal Nucleic Acid Isolation Kit(Applied biosystems)用MagMax自动化分离。用Nanodrop ND-1000全光谱紫外/可见光分光光度计(Wilmington,DE,USA)测定所分离的DNA的量。按之前所述(Apajalahti等2002,Appl Environ Microbiol 68(10):4986-4995)利用流式细胞术进行来自样品的总细菌或特定细菌的计数。
PCR方法：用applied biosystem通过qPCR(定量聚合酶链反应)分析所分离的DNA。用特异性引物来检测3中所述的特别感兴趣的微生物属。
表8：可在其中找到用于通过qPCR来定量消化物微生物群体的属特异性引物的参考文献。
木聚糖酶+(甘露聚糖酶或β-葡聚糖酶)+DFM的组合诱导盲肠微生物群体向有利于乳杆菌属和/或已知为纤维水解性细菌的其他具体组(瘤胃球菌属、拟杆菌属、罗斯氏菌属)迁移。
实施例2:2种木聚糖酶和其他纤维水解酶(FDE-混合物)及DFM(基于芽孢杆菌属的直接饲喂微生物、基于乳杆菌属的直接饲喂微生物)在单独饲喂或组合饲喂时对饲喂基于玉米的饲粮的雏肉鸡的生长表现和盲肠挥发性脂肪酸的影响
实验1
材料和方法
动物的使用和实验方案由动物实验委员会批准。配制所饲喂的基础饲粮，以平衡能量和蛋白质，及匹配此年龄和基因型的生长中的鸡的需要(表9)。饲粮的谷类成分是玉米，蛋白质成分可以是含或不含其他蛋白质成分如卡诺拉、油菜籽粉等的大豆粉。玉米副产物如DDGS或玉米胚芽粉或玉米蛋白粉可以单独包含或组合包含，只要将饲粮配制为满足所饲喂的鸡的营养物需要。不包含合成的抗微生物或抗球虫药物，饲粮作为糊料提供。按3g/kg包含常见的消化率标记(二氧化钛、氧化铬或硅藻土)，以允许测定饲粮成分的消化率。将基础饲粮分为多份，加入各自的酶和DFM，以构成表10中所示的实验饲粮。预先混合每种补充剂，并冲洗混合器，以防止所处理的饲粮的交叉污染。在每个批次的开始、中间和结束时从每种处理饲粮收集样品，并共混在一起，以确认酶活性和DFM存在于开始动物试验之前的饲料中。保留来自每种处理饲粮的附加样品，并在需要进行分析之前保存在-20℃±2℃。
表9：用于肉鸡第0-21天的玉米基础饲粮的组成(饲喂的％)
饲粮I 饲粮II
玉米 54.7 58.2
玉米DDGS 11.0 -
油菜籽粉 - 16.2
大豆粉 28.9 19.4
脂肪 1.00 -
油菜籽油 - 2.11
L-赖氨酸HCl 0.43 0.50
DL-甲硫氨酸 0.27 0.17
L-苏氨酸 0.11 0.16
碳酸氢钠 0.20 -
盐 0.22 0.35
石灰石 1.53 0.70
磷酸二氢钙 0.56 1.90
维生素/矿物质预混物 1.00 0.40
计算的供给
粗蛋白，％ 21.1 21.1
代谢能，MJ/kg 11.5 11.6
钙 0.89 0.89
可消化的磷，％ 0.28 0.28
可消化的赖氨酸，％ 1.15 1.15
可消化的甲硫氨酸，％ 0.55 0.55
表10：实验饲粮识别
处理 描述
1 对照，基础(NC)
2 NC+木聚糖酶11
3 NC+木聚糖酶1+FDE混合物4
4 NC+木聚糖酶1+芽孢杆菌属DFM2
5 NC+木聚糖酶1+乳杆菌属DFM3
6 NC+木聚糖酶1+FDE混合物4+芽孢杆菌属DFM2
7 NC+木聚糖酶1+FDE混合物4+乳杆菌属DFM3
8 NC+木聚糖酶12
9 NC+木聚糖酶2+FDE混合物4
10 NC+木聚糖酶2+芽孢杆菌属DFM2
11 NC+木聚糖酶2+乳杆菌属DFM3
12 NC+木聚糖酶2+FDE混合物4+芽孢杆菌属DFM2
13 NC+木聚糖酶2+FDE混合物4+乳杆菌属DFM3
1木聚糖酶(例如内切-1,4-β-D-木聚糖酶(E.C.3.2.1.8))来自两种不同来源生物
2选择作为产酶菌株的芽孢杆菌属DFM
3已知为C5糖发酵菌株、产短链脂肪酸菌株、纤维水解性内源性微生物区系促进菌株或其组合的乳杆菌属DFM
4FDE混合物：包括β-葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶和/或α-阿拉伯呋喃糖苷酶的纤维降解酶活性的组合
根据初始体重将肉鸡分配至鸡舍，并用认可的实验设计随机分配实验饲粮。使鸡在第0至21天之间的时期可自由接近实验饲粮。记录体重(BW)、饲料摄取(FI)和死亡率来计算增重(BWG)、饲料转化率(FCR)和饲料转化效率(FCE)。
从第18天至第20天每天收集排泄物样品，并保存在-20℃用于测定营养物和纤维保留及AME和AMEn含量。在第21天，通过颈脱位法对鸡进行安乐死，获得盲肠内容物并冷冻保存在-20℃用于测定盲肠VFA。获得回肠(从麦克尔盲管至回肠-盲肠连接上方约1cm)和盲肠的内容物，并保存在-20℃用于测定成分的回肠消化率和盲肠VFA。
合并每个笼每天的排泄物样品，并在60℃烘箱干燥，而回肠消化物样品以笼/鸡舍为基础合并，并冷冻干燥。对饲粮、排泄物和回肠消化物的样品进行细磨，并彻底混合用于分析。按照A.O.A.C.(2005)方法分析所有样品的干物质、氮、脂肪和总能量。饲粮和排泄物中的可溶和不可溶非淀粉多糖按照Englyst等(1988)测定，而中性洗涤剂纤维、中性洗涤剂不溶性氮按照Tilley和Terry(1962)的方法测定。消化率标记按照所选择的标记的标准方法分析。
按与之前所述(Ouwehand等,2009年2月；101(3):367-75)相似的方式用新戊酸作为内部标准从模拟样品进行挥发性脂肪酸和乳酸(例如SCFA)的层析分析。测定了乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸、2-甲基丁酸和乳酸的浓度。
回肠表观消化率的系数和成分的表观保留的系数按照Adeola等,2010(Poult Sci.2010Sep；89(9):1947-54)计算。
笼(鸡舍)是实验单位。用SAS(SAS Inst.Inc.,Cary,NC)的一般线性模型进行ANOVA。在F比率指示显著性时，处理手段是分开的。
结果
与对照，或单独饲喂这些添加剂或以两路组合饲喂这些添加剂相比，饲喂全组合(木聚糖酶加一种或多种第二纤维降解酶和DFM(芽孢杆菌属或LB))的处理组具有更高的BWG(g/鸡/天)，和/或更低的FCR(g BW增加/g饲料摄取)，和/或更好的营养物、能量和纤维消化率/保留。
木聚糖酶(木聚糖酶1和/或2)+FDE混合物+DFM的组合显著提高肉鸡的回肠和/或盲肠总VFA及回肠和/或盲肠消化物中的丁酸或丙酸的浓度。
II.生长表现
实验I
材料和方法
动物的使用和实验方案由动物实验委员会批准。配制基于玉米/大豆的饲粮以平衡雏肉鸡(0-21日龄)的能量和营养物(表9，饲粮1)。不包含合成的抗微生物或抗球虫药物，饲粮作为糊料提供。将基础饲粮分为多份，加入各自的酶和DFM，以构成表11中所示的实验饲粮。
表11：用于实验I的处理识别
ID 描述
1 阴性对照，无添加剂(NC)
2 NC+木聚糖酶a1
3 NC+木聚糖酶1+B-葡聚糖酶a
4 NC+木聚糖酶1+芽孢杆菌属DFMb
5 NC+木聚糖酶1+B-葡聚糖酶+芽孢杆菌属DFM
6 NC+木聚糖酶2c
7 NC+木聚糖酶2+B-葡聚糖酶
8 NC+木聚糖酶2+芽孢杆菌属DFM
9 NC+木聚糖酶2+B-葡聚糖酶+芽孢杆菌属DFM
a酶(木聚糖酶(Danisco Xylanase内切-1,4-β-D-木聚糖酶(E.C.3.2.1.8))和β-葡聚糖酶是由丹尼斯克动物营养公司提供的市售产品。
b基于针对其分泌酶的能力选择的三个芽孢杆菌属菌株(等比例的菌株AGTP BS918(NRRL B-50508)、AGTP BS3BP5(NRRL B-50510)和AGTPBS1013(NRRL B-50509))的DFM。
c本文中显示为SEQ ID No.3的FveXyn4木聚糖酶(内切-1,4-β-D-木聚糖酶(E.C.3.2.1.8))(还描述于PCT/CN2012/079650中，该专利在此引入作为参考)，丹尼斯克动物营养公司。
每种补充剂以预混物提供，并在饲粮制备期间加入混合器中。先混合含有DFM的饲粮，然后在每种饲粮之间冲洗混合器，以防止交叉污染。在每个批次的开始、中间和结束时从每种处理饲粮收集样品，并共混在一起，以确认酶活性和DFM存在于开始动物试验之前的饲料中。保留来自每种处理饲粮的附加样品，并在需要进行分析之前保存在-20℃±2℃。从商业孵化场获得数日龄雄性肉鸡(Hubbard-Cobb)。在第0天将鸡单独称重，并分配至72个笼(每笼8只鸡)，使得每个笼的平均鸡重相似。然后各随机分配9种饲粮处理(表11)至8个笼。笼放在环境受控的房间中。第一周温度维持在31℃，然后在第三周结束时逐渐降低至22℃。鸡接受20小时荧光照明，并允许其在研究期间自由接近饲粮和水。在21天实验期的开始和结束时记录体重和饲料摄取。通过用总饲料摄取除以活鸡加死鸡的增重来计算饲料转化率。用SAS(SAS Inst.Inc.,Cary,NC)的一般线性模型分析数据。在F比率指示显著性时，处理手段是分开的。
结果，实验I
表12：木聚糖酶、β-葡聚糖酶和基于芽孢杆菌的直接饲喂微生物对雏肉鸡的生长表现的影响。
增重(g) 饲料摄取(g) 饲料转化(g/g)
1 652.5d 980.8 1.498a
2 670.6bc 982.3 1.465bc
3 673.6abc 978.3 1.452cde
4 681.7ab 982.3 1.441def
5 688.2a 977.2 1.420f
6 665.7cd 985.4 1.477ab
7 671.2bc 982.4 1.464bcd
8 677.0abc 979.0 1.446cde
9 684.5ab 981.5 1.430ef
标准误 6.4 11.5 0.009
注意，值后面的不同字母显示该列中的值之间的统计学差异(P≤0.10)。
与对照，或单独饲喂这些添加剂或以两路组合饲喂这些添加剂相比，饲喂全组合(木聚糖酶+β-葡聚糖酶+芽孢杆菌属DFM)的处理组具有更高的BWG(g/鸡/天)和更低的FCR(g BW增加/g饲料摄取)(表12)。施用木聚糖酶1和木聚糖酶2二者是的情况也如此。
实验II
材料和方法
动物的使用和实验方案由动物实验委员会批准。配制基于玉米/大豆的饲粮以平衡雏肉鸡(0-21日龄)的能量和营养物(表9，饲粮I)。不包含合成的抗微生物或抗球虫药物，饲粮作为糊料提供。将基础饲粮分为多份，加入各自的酶和DFM，以构成表13中所示的实验饲粮。
表13：实验II的处理识别
ID 描述
1 阴性对照，无添加剂(NC)
2 NC+木聚糖酶1(2500XU/kg)
3 NC+木聚糖酶1(2500XU/kg)+β-葡聚糖酶(200BGU/kg)
4 NC+木聚糖酶1(2500XU/kg)+肠球菌属DFM
5 NC+木聚糖酶1(2500XU/kg)+β-葡聚糖酶(200BGU/kg)+肠球菌属DFM
6 NC+木聚糖酶2(2500XU/kg)
7 NC+木聚糖酶2(2500XU/kg)+β-葡聚糖酶(200BGU/kg)
8 NC+木聚糖酶2(2500XU/kg)+肠球菌属DFM
9 NC+木聚糖酶2(2500XU/kg)+β-葡聚糖酶(200BGU/kg)+肠球菌属DFM
a酶(木聚糖酶(Danisco Xylanase内切-1,4-β-D-木聚糖酶(E.C.3.2.1.8))和β-葡聚糖酶是由丹尼斯克动物营养公司提供的市售产品。
b基于肠球菌属的DFM(屎肠球菌ID7(在已授权的美国专利号7,384,628中称为乳酸乳球菌ID7，作为PTA-6103保藏于ATCC保藏中心，随后重新分类为屎肠球菌ID7)。
c本文中显示为SEQ ID No.3的FveXyn4木聚糖酶(内切-1,4-β-D-木聚糖酶(E.C.3.2.1.8))(还描述于PCT/CN2012/079650中，该专利在此引入作为参考)，丹尼斯克动物营养公司。
所有补充剂都以预混物提供，并在饲粮制备期间加入混合器中。先混合含有DFM的饲粮，然后在每种饲粮之间冲洗混合器，以防止交叉污染。在每个批次的开始、中间和结束时从每种处理饲粮收集样品，并共混在一起，以确认酶活性和DFM存在于开始动物试验之前的饲料中。保留来自每种处理饲粮的附加样品，并在需要进行分析之前保存在-20℃±2℃。从商业孵化场获得数日龄雄性肉鸡(Hubbard-Cobb)。在第0天将鸡单独称重，并分配至72个笼(每笼8只鸡)，使得每个笼的平均鸡重相似。然后各随机分配9种饲粮处理(表13)至8个笼。笼放在环境受控的房间中。第一周温度维持在31℃，然后在第三周结束时逐渐降低至22℃。鸡接受20小时荧光照明，并允许其在研究期间自由接近饲粮和水。在21天实验期的开始和结束时记录体重。每天记录死亡率。用SAS的GLM程序分析数目。
结果，实验II
表14：木聚糖酶、β-葡聚糖酶和基于肠球菌属的直接饲喂微生物对雏肉鸡的生长表现的影响。
增重(g)
1 652.5c
2 670.6ab
3 673.6ab
4 677.7ab
5 684.4a
6 665.7bc
7 671.2ab
8 673.7ab
9 682.4a
标准误 6.5
注意，值后面的不同字母显示该列中的值之间的统计学差异(P≤0.10)。
在木聚糖酶+β-葡聚糖酶或木聚糖酶+肠球菌属DFM的基础上补充木聚糖酶+β-葡聚糖酶+肠球菌属DFM时，肉鸡增重数值改善。
III.盲肠中的挥发性脂肪酸产生
材料和方法
配制基于玉米-大豆粉-油菜籽粉的基础饲粮以平衡雏肉鸡的能量和营养物(表9，饲粮II)。基础饲粮中不包含合成的抗微生物或抗球虫药物。将基础饲粮分为多份，加入各自的酶和DFM，以构成表15中所示的实验饲粮。随后的流程类似于实施例1第III部分后所述的流程。按与之前所述(Ouwehand等2009；The British Journal of Nutrition 101:367-375，其所教导的内容在此引入作为参考)相似的方式用新戊酸作为内部标准进行来自模拟样品(见实施例1第III部分)的挥发性脂肪酸的层析分析。测定了乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸和2-甲基丁酸的浓度。
表15：处理识别
ID 描述
1 对照
2 木聚糖酶(2500XU/kg)
3 木聚糖酶(2500XU/kg)+β-葡聚糖酶(200BGU/kg)
4 木聚糖酶(2500XU/kg)+β-葡聚糖酶(200BGU/kg)+DFM)7.5e+04)1
1由丹尼斯克动物营养公司提供的基于针对其分泌酶的能力选择的三个芽孢杆菌属菌株(等比例的菌株AGTP BS918(NRRL B-50508)、AGTPBS3BP5(NRRL B-50510)和AGTP BS1013(NRRL B-50509))的直接饲喂微生物。
酶(木聚糖酶(Danisco Xylanase内切-1,4-β-D-木聚糖酶(E.C.3.2.1.8))和β-葡聚糖酶)是由丹尼斯克动物营养公司提供的市售产品。
结果
表16：木聚糖酶、β-葡聚糖酶和直接饲喂微生物对鸡盲肠中乙酸和丁酸及总挥发性脂肪酸(VFA)产生的影响
注意，值后面的不同字母显示该列中的值之间的统计学差异(P≤0.10)。
与只有DFM、酶或酶组合单独相比，木聚糖酶+β-葡聚糖酶+直接饲喂微生物的组合增加了盲肠乳酸、丁酸和挥发性脂肪酸(VFA)产生(表16)。挥发性脂肪酸可以为鸡提供大量能量。还已知丁酸在人类中改善胃肠健康并降低结肠癌的发病率(Brons等,2002,Trends Food Science andTechnology 13:251-261，在此引入作为参考)
实施例3：木聚糖酶和其他纤维降解酶(β-葡聚糖酶或纤维降解酶混合物(FDE-混合物))及DFM(基于芽孢杆菌属的直接饲喂微生物)在单独或组合饲喂时对饲喂基于混合谷物的饲粮的猪(25至60kg)的生长表现和营养物消化率的影响
材料和方法
动物的使用和实验方案由动物实验委员会批准。配制所饲喂的基础饲粮，以平衡能量和蛋白质，及匹配此年龄和基因型的生长中的猪的需要(表17)。基础饲粮中的主要成分组成(类型和包含水平)可按表17中所示改变，只要将饲粮配制为满足所饲喂的猪的营养物需要。按3g/kg包含常见的消化率标记(二氧化钛、氧化铬或硅藻土)，以允许测定饲粮成分的消化率。不包含合成的抗微生物或抗球虫药物，饲粮作为糊料提供。将基础饲粮分为多份，然后用表18中所示的酶和DFM处理。在饲料混合期间，并冲洗混合器，以防止所饲粮的交叉污染。在每个批次的开始、中间和结束时从每种处理饲粮收集样品，并共混在一起，以确认酶活性和DFM存在于饲料中。混合期间保留来自每种处理饲粮的样品，并在需要之前保存在-20℃。
表17：用于20至60kg体重的猪的基础饲粮组合物的实例(饲喂的％)
饲粮I 饲粮II
玉米 45.4 9.50
小麦 - 25.0
大麦 - 25.0
玉米DDGS 25.0 10.0
玉米胚芽粉 15.0 -
小麦粗粉/米糠 - 7.00
大豆粉 10.0 10.0
卡诺拉粉 - 9.00
脂肪 0.56 1.23
糖蜜 - -
L-赖氨酸HCl 0.59 0.47
DL-甲硫氨酸 0.02 0.02
L-苏氨酸 0.13 0.09
L-色氨酸 - 0.01
盐 0.46 0.54
石灰石 1.16 0.63
磷酸二钙 0.39 1.12
维生素和矿物质预混物 1.00 0.10
惰性标记消化率标记 0.30 0.30
粗蛋白，％ 19.1 18.3
可消化能，MJ/kg 13.8 13.6
可消化的赖氨酸，％ 1.03 0.98
钙，％ 0.66 0.66
可消化的磷，％ 0.31 0.31
表18：实验饲粮识别
处理 描述
1 对照，基础(NC)
2 NC+木聚糖酶
3 NC+木聚糖酶+β-葡聚糖酶
4 NC+木聚糖酶+FDE混合物1
5 NC+木聚糖酶+芽孢杆菌属DFM2
6 NC+木聚糖酶+FDE混合物+芽孢杆菌属DFM2
7 NC+木聚糖酶+β-葡聚糖酶+芽孢杆菌属DFM2
1FDE混合物：包括β-葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶和/或α-阿拉伯呋喃糖苷酶的纤维降解酶活性的组合
2选自产酶菌株的芽孢杆菌属DFM
计划实验，并进行至对应于生长期(≤25至60kg体重)。饲喂实验饲粮6周(42天)。从同一群体(遗传学)获得接近目标初始体重的一组雌性和雄性猪。到达时对猪进行称重，并用认可的实验设计分配至饲粮处理，使得每种处理具有最少8个重复圈。每周监测体重和饲料摄取用于计算针对死亡率校正的增重效率的饲料转化率。在第3和6周收集新鲜粪便样品，以允许计算饲粮成分消化率。
为了实验的目的，生长中的阉猪(30kg的初始体重)在远端回肠装有T插管。将猪关在环境受控房间中的单圈(1.2×1.5m)中。每个圈配有饲喂器和乳头饮水器，并具有全漏缝混凝土地板。设计并进行试验，以提供每种处理最少6个重复。所有猪都按3倍于其维持能量需要(106kcal ME/kg0.75；NRC,1998)的水平饲喂，并0800和1700h按两个相等的部分提供。允许动物通过碗式饮水器自由接近水。在每个时期开始时和结束时记录猪重量，并记录每天提供的饲粮量。实验期持续15天。认为每个时期的最初10天是对饲粮的适应期。在第11至13天收集新鲜粪便样品，在第14和15天用标准操作流程收集回肠消化物8小时。对于回肠消化物收集，将塑料袋附着于插管桶，并收集流入袋子中的消化物。在袋子装满消化物时或至少每30分钟一次取下袋子，并立即冷冻在-20℃。
融化粪便和回肠样品，在动物和饲粮内混合，收集子样品用于化学分析。还收集并分析了基础饲粮的样品。在进行化学分析之前，将消化物样品冷冻干燥并细磨。粪便样品在烘箱内干燥，并细磨用于分析。按照标准流程(AOAC,2005)分析所有样品的干物质、消化率标记、总能量、粗蛋白、脂肪和中性洗涤剂纤维。
按之前所述(Stein等,2007.J.Anim.Sci.85:172-180)计算能量和营养物的表观回肠消化率和总消化率的值。对数据进行SAS的MIXED程序。
结果
饲喂全组合(木聚糖酶加第二纤维降解酶(β-葡聚糖酶或FDE-混合物)和DFM(基于芽孢杆菌属的直接饲喂微生物))的处理组具有更高的BWG，和/或更低的FCR(g BW增重/g饲料摄取)，和/或营养物和/或能量和/或干物质和/或纤维的高消化率。
实施例4：木聚糖酶、β-葡聚糖酶和基于细菌产丙酸菌株的直接饲喂微生物对肉鸡中营养物保留/消化率和能量可代谢性的影响。
实施例4中所用的基于小麦的实验饲粮的组成
表19：肉鸡小麦基础饲粮的饲粮组成(饲喂的％)
成分 ％
小麦 43.9
小麦粗粉 2.83
大麦 10.0
黑麦 5.00
大豆粉 29.3
脂肪 4.25
L-赖氨酸HCl 0.32
DL-甲硫氨酸 0.24
L-苏氨酸 0.10
碳酸氢钠 0.20
盐 0.23
石灰石 1.32
磷酸一钙 1.00
微量矿物质/维生素预混物 1.00
二氧化钛 0.30
计算的供给
粗蛋白，％ 21.8
代谢能，MJ/kg 11.60
钙，％ 0.88
可利用的磷，％ 0.38
可消化的赖氨酸，％ 1.15
可消化的甲硫氨酸，％ 0.51
材料和方法
动物的使用和实验方案由动物实验委员会批准。配制基于小麦-大麦的饲粮以平衡雏肉鸡(0-21日龄)的能量和营养物(表19)。按0.30％包含二氧化钛，以允许测定饲粮成分保留。不包含合成的抗微生物或抗球虫药物，饲粮作为糊料提供。将基础饲粮分为多份，加入各自的酶和DFM，以构成表20中所示的实验饲粮。预先混合各补充剂，并冲洗混合器，以防止所处理的饲粮的交叉污染。在每个批次的开始、中间和结束时从每种处理饲粮收集样品，并共混在一起，以确认酶活性和DFM存在于开始动物试验之前的饲料中。保留来自每种处理饲粮的附加样品，并在需要进行分析之前保存在-20℃±2℃。
表20：处理的识别
1基于产丙酸菌株的直接饲喂微生物(丙酸丙酸杆菌P169 PTA-5271,P169)。
酶(木聚糖酶(Danisco Xylanase内切-1,4-β-D-木聚糖酶(E.C.3.2.1.8))和β-葡聚糖酶)是由丹尼斯克动物营养公司提供的市售产品。
研究涉及笼舍试验，进行该笼舍试验来获得用于能量和营养物消化率测量的排泄物样品。从商业孵化场获得数日龄雄性肉鸡(Ross 308)。在到达时将鸡单独称重，按体重分层，并分配至30个笼(每笼5只鸡)，使得每个笼的平均鸡重相似。然后随机分配4种饲粮处理至6个重复笼。从第0至21天进行试验，其间鸡可自由接近它们所分配的饲粮处理和水。在第一周期间将育雏笼和房间温度分别设为32℃和29℃。然后，关闭育雏笼中的供热，并在整个实验中将房间温度保持在29℃。整个实验中提供光照24小时。在第17、18、19和20天，收集排泄物样品，冷冻保存在-20℃用于测定能量和营养物保留/消化率。收集排泄物样品期间多加小心，以避免来自羽毛和其他外来材料的污染。在笼内合并排泄物样品，用混合器混匀，每笼采集两个代表性样品。将样品冷冻干燥。磨碎干燥的样品至通过0.5mm筛网，-4℃保存在气密塑料容器中，直至化学分析。按照AOAC官方分析方法分析饲粮和排泄物样品的干物质、粗蛋白(作为氮)、总能量、脂肪(作为己烷提取物)和中性洗涤剂纤维。按照Lomer等(2000,Analyst125:2339–2343)所述的方法分析钛(消化率标记)。用标准方法(Adeola,O.2001.Digestion and balance techniques in pigs.Swine Nutrition,第2版A.J.Lewis和L.L.Southern编辑CRC Press,Washington,DC中的第903–916页)。用SAS(2004)的一般线性模型分析数据。
结果
表21：木聚糖酶、纤维降解酶和基于细菌产丙酸菌株的直接饲喂微生物对雏肉鸡中营养物保留/消化率和能量可代谢性的影响。
注意，值后面的不同字母显示该列中的值之间的统计学差异(P≤0.10)。
与对照或木聚糖酶单独或木聚糖酶和β-葡聚糖酶的组合相比，木聚糖酶、β-葡聚糖酶和基于芽孢杆菌的直接饲喂微生物的组合改善饲粮能量的利用(表20)。这可与干物质中的产能营养物如脂肪的保留的增加相关联(表20)。由三路组合引起的脂肪保留增强值得注意，且可与饲粮脂肪的消化和吸收以及来自发酵的短链脂肪酸的产生和吸收的增强相关联。还可以推测，所观察到的木聚糖酶、β-葡聚糖酶、芽孢杆菌/丙酸DFM的三路组合在能量和营养物利用上更好的益处与通过主动的小型生物群调节改善的肠健康和功能及肠消化/吸收功能相关联。
实施例5：肉鸡在饲喂含有木聚糖酶、其他纤维降解酶和产丙酸直接饲喂微生物的基于玉米的饲粮时的反应
实施例5中所用的实验饲粮的组成
表22：肉鸡玉米基础饲粮的饲粮组成(饲喂的％)
组成(％)
玉米 54.7
玉米DDGS 11.0
大豆粉 28.9
脂肪 1.00
L-赖氨酸HCl 0.43
DL-甲硫氨酸 0.27
L-苏氨酸 0.11
碳酸氢钠 0.20
盐 0.22
石灰石 1.53
磷酸一钙 0.56
维生素/矿物质预混物 1.00
计算的供给
粗蛋白，％ 21.1
代谢能，MJ/kg 11.5
钙 0.89
可消化的磷，％ 0.28
可消化的赖氨酸，％ 1.15
可消化的甲硫氨酸，％ 0.55
材料和方法
动物的使用和实验方案由动物实验委员会批准。配制基于玉米的饲粮以平衡雏肉鸡(0-21日龄)的能量和营养物(表22)。不包含合成的抗微生物或抗球虫药物，饲粮作为糊料提供。将基础饲粮分为多份，加入各自的酶和DFM，以构成表23中所示的实验饲粮。预先混合各补充剂，并冲洗混合器，以防止所处理的饲粮的交叉污染。在每个批次的开始、中间和结束时从每种处理饲粮收集样品，并共混在一起，以确认酶活性和DFM存在于开始动物试验之前的饲料中。保留来自每种处理饲粮的附加样品，并在需要进行分析之前保存在-20℃±2℃。
表23：处理的识别
ID 描述
1 对照
2 木聚糖酶(2500XU/kg)1
3 木聚糖酶+FDE混合物2
4 木聚糖酶(2500XU/kg)+FDE混合物+DFM3(7.5e+04)
1Danisco xylanase，丹尼斯克动物营养公司
2 TRIOTM酶复合物包含多种酶活性的有效组合，包括β-葡聚糖酶(200CMC U/kg)、木聚糖酶(例如内切木聚糖酶——内切-1,4-β-D-木聚糖酶(E.C.3.2.1.8))(>1200ABX U/kg)和β-葡糖苷酶(>800pNPG U/kg)(杜邦工业生物科学公司)。
3基于产丙酸菌株的直接饲喂微生物(丙酸丙酸杆菌P169 PTA-5271,P169)。
从商业养殖场获得数日龄鸡，到达时对鸡进行称重，加上识别标记，按体重分为6个区组，按随机化完全区组设计在每个鸡舍10只鸡的区组内随机分配至4种处理(表23)。从1天起，还允许随意接近清洁饮用水。在第0和21天对鸡进行称重，并记录它们的体重，还在对鸡进行称重的日期监测和记录饲料消耗。每天监测鸡，记录的它们的外观或行为的变化。在每个饲喂期结束时，测定诸如增重、饲料摄取、饲料转化率、饲料效率和死亡率的参数。用SAS软件(SAS Institute,Inc.2006)的GLM程序按随机化完全区组设计分析数据。
结果
表24：木聚糖酶、其他纤维降解酶的混合物和基于丙酸的直接饲喂微生物对雏肉鸡的生长表现的影响。
第21天的体重，g 增重，g 饲料摄取，g 饲料转化效率，g/g
1 830.4 783.5 1006.6 1.284a
2 804.2 757.3 964.0 1.273ab
3 817.6 770.7 983.3 1.275ab
4 813.2 766.4 953.9 1.245b
标准误 12.96 11.82 23.37 0.017
注意，值后面的不同字母显示该列中的值之间的统计学差异(P≤0.10)。
饲喂木聚糖酶、其他纤维降解酶的混合物和基于丙酸的DFM的组合的鸡具有比对照好的FCR，且在数值上好于饲喂只含酶的饲粮的鸡(表24)。
实施例6：不含或含有基于芽孢杆菌属菌株的直接饲喂微生物的木聚糖酶和β-葡聚糖酶对生长育肥猪的生长表现、微生物计数和营养物消化率的影响
实施例6中所用的实验饲粮的组成
表25：生长猪饲料(20-60kg体重)的饲粮组成(饲喂的％)
材料和方法
进行了两个实验来评价不含或含有基于芽孢杆菌属菌株的直接饲喂微生物的木聚糖酶和β-葡聚糖酶共混物对生长育肥猪的生长表现、粪便微生物计数和消化率的影响。动物保护和使用委员会(Institutional Animal Careand Use Committee)批准了猪的使用，并使用了国家的相关福利指导。实验1中使用两头一组关在一起的总计42头猪 实验2中使用三头一组关在一起的相同品种的72头猪。每个圈在温度受控(22℃±2℃)的房间中具有光滑透明的塑料围栏和塑料覆盖的金属网地板。
配制各基础饲粮以满足NRC猪营养物建议(NRC,1998，表25饲粮I用于实验1，饲料II用于实验2)。在每个实验中，制备一批基础饲粮，分为两份，随后将每份与表26中所示的添加剂混合。
表26：处理的识别
1由丹尼斯克动物营养公司提供的基于针对其分泌酶的能力选择的三个芽孢杆菌属菌株(等比例的菌株AGTP BS918(NRRL B-50508)、AGTPBS3BP5(NRRL B-50510)和AGTP BS1013(NRRL B-50509))的直接饲喂微生物。
酶(木聚糖酶(Danisco Xylanase内切-1,4-β-D-木聚糖酶(E.C.3.2.1.8))和β-葡聚糖酶)是由丹尼斯克动物营养公司提供的市售产品。
在实验1和2中分别将表26中所示的处理分配至7个和8个重复圈。在实验开始时根据猪体重随机化处理的圈分配。每周记录体重和饲料摄取，并用来计算饲料转化率。两个实验中都是给猪提供实验饲粮42天。饲料和水在实验期间的所有时间都可自由获得。在实验2中，在第38、39和40天收集新鲜粪便样品用于测定营养物、能量和纤维消化率以及粪便微生物计数。用9ml 1％蛋白胨培养基(Becton,Dickinson and Co.,Franklin Lakes,NJ)稀释来自每个圈的1克混合粪便样品，然后匀化。然后通过将系列10倍稀释液(1％蛋白胨溶液中)接种在MacConkey琼脂平板(DifcoLaboratories,Detroit,MI)和乳杆菌培养基III琼脂平板(培养基638,DSMZ,Braunschweig,德国)上分别分离大肠杆菌和乳杆菌来进行粪便样品的活细菌计数。然后在厌氧条件下39℃孵育乳杆菌培养基III琼脂平板。37℃孵育MacConkey琼脂平板24小时。从培养箱取出后立即计数大肠杆菌和乳杆菌菌落。化学分析之前，融化粪便样品，60℃干燥72小时，然后细磨至可通过1mm筛网的大小。然后按照AOAC(官方分析方法)所列的方法分析所有饲料和粪便样品的干物质、总能量和酸性洗涤剂纤维。按照Williams等1962,J.Anim.Sci.59:381–389(在此引入作为参考)所述的方法分析铬(消化率标记)。用标准方法(Adeola,O.2001.Digestion and balancetechniques in pigs.Swine Nutrition,第2版A.J.Lewis和L.L.Southern编辑CRC Press,Washington,DC中的第903–916页，其所教导的内容在此引入作为参考)。用SAS(2004)的一般线性模型分析数据。以处理、实验和相互作用作为模型中的效应，对生长表现数据(BW、ADFI、ADG和FCR)进行SAS的GLM程序。初始分析揭示相互作用不显著，因此在进一步分析中放弃，随后显示处理主效应。对微生物计数数据进行对数转化，用SAS的GLM程序与消化率一起进行单因素方差分析。
结果
表27：不含或含有基于芽孢杆菌属菌株的直接饲喂微生物的木聚糖酶和β-葡聚糖酶对生长育肥猪的生长表现的影响
处理 初始体重，kg 最终体重，kg 每天增重，克/天 饲料摄取，克/天 饲料转化率，g/g
1 17.4 50.6b 719.4b 1411.1a 1.967
2 17.5 51.7ab 743.9ab 1431.3ab 1.942
3 17.4 52.6a 764.1a 1471.5a 1.922
标准误 0.35 0.81 14.00 19.20 0.041
注意，值后面的不同字母显示该列中的值之间的统计学差异(P≤0.10)。
表28：不含或含有基于芽孢杆菌属菌株的直接饲喂微生物的木聚糖酶和β-葡聚糖酶对生长育肥猪的干物质、氮、纤维和能量消化率(％)的影响
处理 干物质 氮 酸性洗涤剂纤维 能量
1 80.4b 77.4b 44.2b 79.3b
2 80.8b 77.8b 44.6b 78.6b
3 82.0a 79.4a 56.1a 80.5a
标准误 0.41 0.51 1.65 0.47
注意，值后面的不同字母显示该列中的值之间的统计学差异(P≤0.10)。
与对照或仅有酶相比，木聚糖酶、β-葡聚糖酶和包含任一种芽孢杆菌的直接饲喂微生物的组合改善了生长猪的生长表现及饲粮营养物和能量的利用(表27和28)。还观察到三路组合导致更多的纤维降解，并促进乳杆菌细菌在肠道中的增殖(图1)。
实施例7：木聚糖酶、其他纤维降解酶和直接饲喂微生物对猪后肠中短链脂肪酸产生的影响
实施例7中所用的实验饲粮的组成
表29：生长猪饲料(20-60kg体重)的饲粮组成(饲喂的％)
饲粮I 饲粮II
玉米 45.7 9.50
小麦 - 25.3
大麦 - 25.0
玉米DDGS 25.0 10.0
玉米胚芽粉 15.0 -
小麦粗粉/米糠 - 7.00
大豆粉 10.0 10.0
卡诺拉粉 - 9.00
脂肪 0.56 1.23
糖蜜 - -
L-赖氨酸HCl 0.59 0.47
DL-甲硫氨酸 0.02 0.02
L-苏氨酸 0.13 0.09
L-色氨酸 - 0.01
盐 0.46 0.54
石灰石 1.16 0.63
磷酸二钙 0.39 1.12
维生素和矿物质预混物 1.00 0.10
计算的化学浓度
粗蛋白，％ 19.1 18.3
可消化能，MJ/kg 13.8 13.6
可消化的赖氨酸，％ 1.03 0.98
钙，％ 0.66 0.66
可消化的磷，％ 0.31 0.31
中性洗涤剂纤维，％ 23.8 21.8
干物质，％ 89.7 90.8
材料和方法
为了建立猪后肠模型，从(Boisen和Fernandez 1997,Animal FeedScience and Technology 68:277-286，其所教导的内容在此引入作为参考)修改方法来在体外产生猪回肠流出物。简言之，在具有可重密封盖的3加仑桶中将1.35kg全糊料饲料(基于玉米和小麦，详情见表29)与3.00L磷酸盐缓冲液(0.1M,pH 6)和1.20L 0.2M HCl组合。用10M HCl或NaOH调节pH至2。然后加入120mL预先配制的胃蛋白酶溶液(每mL水250mg胰蛋白酶(Sigma-Aldrich,Inc.,St.Louis,MO))。密封桶，并在39℃振荡孵育2小时，以模拟胃消化。对于小肠消化刺激，将1.20L磷酸盐缓冲液(0.2M,pH 6.8)和600mL 0.6M NaOH加至溶液中，并按之前用10M NaOH或HCl调节pH至6.8。中和后，加入120mL预先配制的胰酶溶液(每mL水1000mg胰酶(Sigma-Aldrich))，密封桶，并在39℃振荡孵育4小时。孵育后，用双层和两次对折的酿造袋(Jumbo Nylon Coarse,LD CarlsonCompany,Kent,OH)滤去液体。匀化剩余的浆液，分为128g的多份，各称量入分开的250mL Pyrex瓶中。随后将瓶子保存在-20℃。作为大碗小型生物群的接种物，从12头生长料猪收集盲肠内容物。匀化内容物，与10％甘油混合，称量14g整分试样放入15mL锥形瓶。然后密封锥形瓶，并保存在-80℃。
以各具有1种对照和3种处理(表30)的两个实验进行猪后肠模拟实验。每种处理测试三次。对于每个体外猪后肠发酵试验，使用了总计15个含有模拟的回肠流出物的Pyrex瓶和一个含有盲肠内容物的15mL锥形瓶。过夜融化瓶子，向每个瓶中加入240mL含4g/L黏蛋白(Sigma-Aldrich)的无菌0.1M磷酸盐缓冲液(pH 6)，类似于(Christensen等1999,Journal ofthe Science of Food and Agriculture 79,755-762)及(Aristoteli和Willcox,2003,Infection and immunity 71:5565-5575)中所述的方法，这两篇文献所教导的内容在此引入作为参考。接种物在室温融化30分钟，而Pyrex在振荡水浴中39℃预热30分钟，然后加入1mL 1％蛋白胨溶液和450μL 0.1M磷酸盐缓冲液(见表30)中的处理。
表30：测试猪体外后肠发酵的处理*
*酶和直接饲喂微生物产品按类似于500g/公吨饲料的比例包含，每个实验重复进行两次，每次实验中重复测量处理三次；#基础饲粮是表29中所述的玉米对照饲粮(CC)或小麦对照饲粮(CW)；木聚糖酶是本文中显示为SEQ ID No.3(也描述于PCT/CN2012/079650中，其在此引入作为参考)的Y5(Danisco Xylanase内切-1,4-β-D-木聚糖酶(E.C.3.2.1.8))或NGX(FveXyn4(内切-1,4-β-D-木聚糖酶(E.C.3.2.1.8))(丹尼斯克动物营养公司)，具有4000XU/kg饲料的活性保证；纤维降解酶是Accel.(Accelerase Trio,TRIOTM酶复合物包含多种酶活性的组合，包括β-葡聚糖酶(200CMC U/kg)、木聚糖酶(例如内切木聚糖酶——内切-1,4-β-D-木聚糖酶(E.C.3.2.1.8))(>1200ABX U/kg)和β-葡糖苷酶(>800pNPG U/kg)(杜邦工业生物科学公司))酶混合物，或具有360BGUβ-葡聚糖酶/kg饲料的活性保证的XBβ-葡聚糖酶；+直接饲喂微生物是具有3.0x 108cfu/克产品的活性保证的基于芽孢杆菌属(等比例的菌株AGTP BS918 NRRLB-50508、AGTP BS1013 NRRL B-50509和AGTP BS3BP5NRRL B-50510)的直接饲喂微生物，或具有2.1x 109cfu/克产品的活性保证的丙酸丙酸杆菌P169 PTA-5271P169。
用CO2气体吹瓶子30秒，同时加入250μL回肠接种物(根据Coles等2005,Animal Feed Science and Technology 123:421-444，其所教导的内容在此引入作为参考)，收集10mL基线样品，测定基线pH，将样品保存在-20℃。盖上瓶子，轻轻混合，放入39℃和160转/分钟的振荡水浴。12小时后，收集另外10mL样品，测定pH，将样品保存在-20℃。对于挥发性脂肪酸(VFA)的高效液相色谱(HPLC)定量，融化样品，16.1rad离心20分钟，将上清滤过0.22μm混合纤维素酯膜(Milex-GS,EMD MilliporeCorp.,Billerica,MA)。从滤液中取20μL注入配有Shodex SH-G保护柱(Waters)和300X 7.8mm Aminex HPX-87H柱(Biorad Laboratories,Inc.,Hercules,CA)的Waters Alliance 2695 Separations Module(Waters Corp.,Milford,MA)。按0.525mL/分钟流速和35℃柱温用由含16.8mM磷酸的水/乙腈(98:2,v/v)组成的流动相应用等度法。用Waters 2996光电二极管阵列(PDA)检测器(Waters)以211nm吸光度检测挥发性脂肪酸。用WatersEmpower 3软件(Waters)达到仪器控制、数据获取和数据处理。用从高级别(≥99.9％)试剂(Sigma Aldrich,St.Louis,MO)产生的标准曲线定量挥发性脂肪酸。按从0.05％至2.0％范围内的6个浓度在含16.8mM磷酸的水/乙腈(98:2,v/v)中配制标准品的线性稀释液。测定了乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸(其总和显示为总VFA)和乳酸的浓度。用SPSS(17版,SPSS Inc.,Chicago,IL)的GLM程序作为按实验分区组的单因素ANOVA进行每个实验的统计学分析。P≤0.10时判定显著，用Duncan多范围检验分开处理平均值。
结果
在基于小麦的饲粮中，与无补充的对照相比，在加入NGX木聚糖酶、Accelerase Trio纤维降解酶混合物和DFM时，在猪后肠模拟后12小时观察到总VFA和乳酸产生的显著增加(表31，实验1和实验2)。基于丙酸丙酸杆菌P169的DFM的使用进一步显著提高丙酸水平，与对照相比组合处理中具有模拟结肠内容物的更大酸化(表31，实验1)。在基于玉米的饲粮中，12小时的模拟猪后肠发酵后，与对照相比，Y5木聚糖酶、AcceleraseTrio纤维降解酶和DFM的组合处理显著提高丁酸水平，在使用基于丙酸丙酸杆菌P169的DFM时，总VFA具有附加的增加(表31，实验3和5)。与对照处理相比，用XBβ-葡聚糖酶替换Accelerase Trio酶混合物及在含Y5的玉米饲粮中使用基于芽孢杆菌属的DFM导致总VFA和乳酸显著增加(表31，实验4)。
表31：丙酸、丁酸、总挥发性脂肪酸(VFA)和乳酸(％)的平均丰度，以及12小时的体外猪后肠发酵后与基线样品相比的pH差异。
a,b列内具有不同上标的值在P≤0.10下显著不同；NS，不显著；SEM，平均值的标准误；处理详情见表26。
实施例8：木聚糖酶、其他纤维降解酶和直接饲喂微生物对猪后肠纤维降解的影响
实施例8中所用的实验饲粮的组成
表32：生长猪饲料(20-60kg体重)的饲粮组成(饲喂的％)
饲粮
玉米 9.50
小麦 25.0
大麦 25.0
玉米DDGS 10.0
玉米胚芽粉 -
小麦粗粉 7.00
大豆粉 10.0
卡诺拉粉 9.00
脂肪 1.23
L-赖氨酸HCl 0.47
DL-甲硫氨酸 0.02
L-苏氨酸 0.09
L-色氨酸 0.01
盐 0.54
石灰石 0.63
磷酸二钙 1.12
维生素和矿物质预混物 0.10
惰性标记消化率标记 0.30
计算的化学浓度
粗蛋白，％ 18.3
可消化能，MJ/kg 13.6
可消化的赖氨酸，％ 0.98
钙，％ 0.66
可消化的磷，％ 0.31
中性洗涤剂纤维，％ 21.8
干物质，％ 90.8
为证明干物质(DM)的消失和纤维的降解，按实施例7中所述产生回肠流出物并建立后肠发酵。简言之，用基于小麦的饲粮(CW，见表32)作为无任何处理的对照，以及加入Y5木聚糖酶的CW(处理1)，含Y5和Accelerase Trio纤维降解酶混合物的CW(处理2)，含Y5、Accelerase与基于三种芽孢杆菌属菌株的直接饲喂微生物的组合的CW(处理3)，酶和DFM处理的详情见表33。
表33：处理的识别*
*酶和直接饲喂微生物产品按类似于500g/公吨饲料的比例包含，每个实验重复进行两次，每次实验中重复测量处理三次；#基础饲粮是表32中所述的小麦对照饲粮(CW)；木聚糖酶是具有4000XU/kg饲料的活性保证的Y5(Danisco Xylanase内切-1,4-β-D-木聚糖酶(E.C.3.2.1.8))；纤维降解酶是Accel.(Accelerase Trio,TRIOTM酶复合物包含多种酶活性的有效组合，包括β-葡聚糖酶(200CMC U/kg)、木聚糖酶(例如内切木聚糖酶——内切-1,4-β-D-木聚糖酶(E.C.3.2.1.8))(>1200ABX U/kg)和β-葡糖苷酶(>800pNPG U/kg)(杜邦工业生物科学公司))，加入该酶混合物以确保360BGUβ-葡聚糖酶/kg饲料的活性保证；+直接饲喂微生物是具有3.0x 108cfu/克产品的活性保证的基于芽孢杆菌属(等比例的菌株AGTP BS918 NRRL B-50508、AGTP BS1013 NRRL B-50509和AGTPBS3BP5 NRRL B-50510)的直接饲喂微生物，或具有2.1x 109cfu/克产品的活性保证的丙酸丙酸杆菌P169 PTA-5271P169。
处理对DM和纤维消失有影响。在实验的第0和48小时，滤去液体，收集剩余的固体，送去进行干物质(DM)、酸性和中性洗涤剂纤维(分别为ADF和NDF)的近似营养物分析，后者按照(Association of AnalyticalChemists(AOAC)2007,第18版AOAC,Washington,D.C)中所述的方法在DM基础上产生。将数据计算为百分比消失，用SPSS(17版,SPSS Inc.,Chicago,IL)的GLM作为按实验分区组的单因素ANOVA进行统计学分析。P≤0.10时判定显著，用Duncan多范围检验分开处理平均值。
结果
在所测试的基于小麦的饲粮中，与不含任何酶和DFM补充的CW相比，与Y5、Accelerase Trio纤维降解酶混合物和基于三种芽孢杆菌的DFM的组合具有最大的DM、ADF和NDF消失(表34)。
表34:48小时的猪后肠体外发酵期间干物质、酸性和中性洗涤剂纤维的百分比消失
t# 处理 ΔDM(％) ΔADF(％) ΔNDF(％)
1 小麦对照(CW) 3.95b 2.31b 4.27b
2 CW+Y5 3.97b 3.26ab 5.87ab
3 CW+Y5+Accel. 4.19ab 3.46ab 5.77ab
4 CW+Y5+Accel.+芽孢杆菌属 4.57a 3.66a 7.37a
SEM 0.17 0.31 0.88
a,b列内具有不同上标的值在P≤0.10下显著不同；SEM，平均值的标准误；处理详情见表7.2。
以上说明书中提到的所有出版物在此引入作为参考。对本领域技术人员而言，显而易见的是，可在不背离本发明的范围和精神的情况下对所描述的本发明方法和系统作出多种修改和变化。尽管已结合具体的优选实施方案描述了本发明，但应理解，所要求保护的发明不应不当地受限于这类具体实施方案。实际上，所述用于实施本发明的方式的对生物化学和生物技术或相关领域技术人员而言显而易见的多种修改旨在处于以下权利要求的范围之内。

Claims (25)

1.饲料添加剂组合物，其包含直接饲喂微生物(DFM)与木聚糖酶和β-葡聚糖酶的组合，其中DFM选自产酶菌株、C5糖发酵菌株、产短链脂肪酸菌株、纤维水解性内源性微生物区系促进菌株或其组合。
2.方法，其用于改善个体的表现或用于改善饲料中的原料的消化率(例如营养物消化率，如氨基酸消化率)，或用于改善氮保留，或用于改善饲料转化率(FCR)，或用于改善个体中的增重、或用于改善个体中的饲料效率，或用于使个体胃肠道中的发酵过程移向产生丁酸和/或丙酸，该方法包括对个体施用直接饲喂微生物(DFM)与木聚糖酶和β-葡聚糖酶的组合，其中DFM选自产酶菌株、C5糖发酵菌株、产短链脂肪酸菌株、纤维水解性内源性微生物区系促进菌株或其组合。
3.权利要求1或权利要求2的饲料添加剂组合物或方法，其中DFM是产酶菌株。
4.前述权利要求中任一项的饲料添加剂组合物或方法，其中DFM是C5糖发酵菌株。
5.前述权利要求中任一项的饲料添加剂组合物或方法，其中DFM是产短链脂肪酸菌株。
6.前述权利要求中任一项的饲料添加剂组合物或方法，其中DFM是纤维水解性内源性微生物区系促进菌株。
7.前述权利要求中任一项的饲料添加剂组合物或方法，其中DFM是选自以下属的细菌的至少一个菌株：芽孢杆菌属、肠球菌属、乳杆菌属、丙酸杆菌属及其组合。
8.前述权利要求中任一项的饲料添加剂组合物或方法，其中DFM是选自芽孢杆菌属的至少一个菌株，尤其是枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌或短小芽孢杆菌。
9.前述权利要求中任一项的饲料添加剂组合物或方法，其中DFM选自：枯草芽孢杆菌AGTP BS3BP5、枯草芽孢杆菌AGTP BS442、枯草芽孢杆菌AGTP BS521、枯草芽孢杆菌AGTP BS918、枯草芽孢杆菌AGTPBS1013、枯草芽孢杆菌AGTP BS1069、枯草芽孢杆菌AGTP 944、短小芽孢杆菌AGTP BS 1068或短小芽孢杆菌KX11-1、屎肠球菌ID7、丙酸丙酸杆菌P169、鼠李糖乳杆菌CNCM-I-3698、香肠乳杆菌CNCM-I-3699、具有其所有特征的菌株、其任意衍生物或变体、及其组合。
10.前述权利要求中任一项的饲料添加剂组合物或方法，其中DFM是活细菌。
11.前述权利要求中任一项的饲料添加剂组合物或方法，其中直接饲喂微生物是内生孢子的形式。
12.前述权利要求中任一项的饲料添加剂组合物或方法，其中木聚糖酶是内切-1,4-β-d-木聚糖酶。
13.前述权利要求中任一项的饲料添加剂组合物，其中饲料添加剂组合物包含其他纤维降解酶。
14.权利要求1-12中任一项的方法，其中方法包括对个体施用直接饲喂微生物(DFM)与木聚糖酶和β-葡聚糖酶及其他纤维降解酶的组合。
15.权利要求13或权利要求14的饲料添加剂组合物或方法，其中其他纤维降解酶选自纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.176和E.C.3.2.1.91)、β-葡糖苷酶(E.C.3.2.1.21)、β-木糖苷酶(E.C.3.2.1.37)、阿魏酸酯酶(E.C.3.1.1.73)、α-阿拉伯呋喃糖苷酶(E.C.3.2.1.55)、果胶酶(例如内聚半乳糖醛酸酶(E.C.3.2.1.15)、聚半乳糖醛酸外切酶(E.C.3.2.1.67)或果胶酸裂合酶(E.C.4.2.2.2))或其组合。
16.权利要求13-15中任一项的饲料添加剂组合物或方法，其中其他纤维降解酶选自纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.176和E.C.3.2.1.91)、β-葡糖苷酶(E.C.3.2.1.21)或其组合。
17.预混物，其包含权利要求1、3-13或15-16中任一项的饲料添加剂组合物，或包含直接饲喂微生物(DFM)、木聚糖酶和β-葡聚糖酶(及可选的其他纤维降解酶)，及至少一种维生素和/或至少一种矿物质，其中DFM选自产酶菌株、C5糖发酵菌株、产短链脂肪酸菌株、纤维水解性内源性微生物区系促进菌株或其组合。
18.饲料，其包含权利要求1、3-13或15-16中任一项的饲料添加剂组合物，或包含权利要求17的预混物，或包含直接饲喂微生物(DFM)与木聚糖酶和β-葡聚糖酶(及可选的其他纤维降解酶)的组合，其中DFM选自产酶菌株、C5糖发酵菌株、产短链脂肪酸菌株、纤维水解性内源性微生物区系促进菌株或其组合。
19.制备饲料的方法，其包括将饲料成分与权利要求1、3-13或15-16中任一项的饲料添加剂组合物或权利要求17的预混物混合。
20.制备饲料的方法，其包括将饲料成分与直接饲喂微生物(DFM)与木聚糖酶和β-葡聚糖酶(及可选的其他纤维降解酶)的组合混合，其中DFM选自产酶菌株、C5糖发酵菌株、产短链脂肪酸菌株、纤维水解性内源性微生物区系促进菌株或其组合。
21.直接饲喂微生物(DFM)与木聚糖酶和β-葡聚糖酶(及可选的其他纤维降解酶)的组合的用途，其中DFM选自产酶菌株、C5糖发酵菌株、产短链脂肪酸菌株、纤维水解性内源性微生物区系促进菌株或其组合，用于改善个体的表现，或用于改善饲料中的原料的消化率(例如营养物消化率，如氨基酸消化率)，或用于改善氮保留，或用于改善饲料转化率(FCR)，或用于改善个体中的增重、或用于改善个体中的饲料效率，或用于使个体胃肠道中的发酵过程移向产生丁酸和/或丙酸。
22.权利要求21的用途，其中使用权利要求1、3-13或15-16中任一项的饲料添加剂组合物；或其中使用权利要求17的预混物；或其中使用权利要求18的饲料，或使用按照权利要求19或20中任一项产生的饲料。
23.试剂盒，其包含直接饲喂微生物(DFM)、木聚糖酶和β-葡聚糖酶(及可选的其他纤维降解酶)，其中DFM选自产酶菌株、C5糖发酵菌株、产短链脂肪酸菌株、纤维水解性内源性微生物区系促进菌株或其组合，(及可选的至少一种维生素和/或可选的至少一种矿物质)和施用说明。
24.权利要求23的试剂盒，其中该试剂盒包含权利要求1、3-13或15-16中任一项的饲料添加剂组合物或权利要求17的预混物。
25.饲料添加剂组合物或饲料或试剂盒或方法或用途或预混物，其如本文参考附图和实施例一般性定义。
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