MX2015001260A

MX2015001260A - Composicion de aditivo alimenticio.

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Publication number: MX2015001260A
Application number: MX2015001260A
Authority: MX
Inventors: Mai Faurschou Isaksen; Marion Bernardeau; Luis Fernando Romero Millán; Elijah Gituanjah Kiarie; Susan Arent Lund; Päivi Helena Nurminen; Sofia Forssten; Mari Ellen Davis; Daniel Petri; Elizabeth Ann Galbraith
Original assignee: Dupont Nutrition Biosci Aps
Priority date: 2012-08-03
Filing date: 2013-08-02
Publication date: 2015-05-08
Also published as: BR112015002449A2; CN112806471B; CA2880485A1; US20150216203A1; EP2879511B1; CN112806471A; KR20150038587A; CA2880485C; EP2879511A1; US20190117706A1; US11931385B2; CN104735999A; US20220040241A1; ES2929858T3; JP2015528705A; WO2014020141A1; BR112015002449B1; PH12015500137A1; DK2879511T3

Abstract

La presente invención se relaciona con una composición de aditivo alimenticio que comprende un microbiano de alimentación directa (DFM), en combinación con una xilanasa (por ejemplo, endo-1,4-ß-d-xilanasa) y una ß-glucanasa (y opcionalmente, una enzima degradante de fibra adicional), en donde el DFM se selecciona del grupo que consiste de una cepa que produce una enzima; una cepa de fermentación de azúcar C5; una cepa que produce un ácido graso de cadena corta; una cepa que promueve la microflora endógena, fibrolítica; o combinaciones de las mismas. El DFM puede seleccionarse del grupo que consiste de: Bacillus subtilis AGTP BS3BP5, Bacillus subtilis AGTP BS442, B. subtilis AGTP BS521, B. subtilis AGTP BS918, Bacillus subtilis AGTP BS1013, B. subtilis AGTP BS1069, B. subtilis AGTP 944, B. pumilus AGTP BS 1068 o B. pumilus KX11-1, Enterococcus faecium ID7, Propionibacterium acidipropionici P169, Lactobacillus rhamnosus CNCM-I-3698, Lactobacillus farciminis CNCM-I-3699, una cepa que tiene todas las características de las mismas, cualquier derivado o variante de las mismas, y combinaciones de las mismas y una enzima degradante de fibra adicional puede seleccionarse del grupo que consiste de una celobiohidrolasa (E.C. 3.2.1.176 y E.C. 3.2.1.91), una ß-glucosidasa (E.C. 3.2.1.21), una ß-xilosidasa (E.C. 3.2.1.37), una feruloil esterasa (E.C. 3.1.1.73), una a-arabinofuranosidasa (E.C. 3.2.1.55), una pectinasa (por ejemplo, una endopoligalacturonasa (E.C. 3.2.1.15), una exopoligalacturonasa (E.C. 3.2.1.67) o una pectato liasa (E.C. 4.2.2.2)), o combinaciones de las mismas.

Description

COMPOSICIÓN DE ADITIVO ALIMENTICIO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con métodos para mejorar las composiciones alimenticias usando un microbiano de alimentación directa en combinación con una xilanasa y una b-glucanasa, y con una composición de aditivo alimenticio que comprende un microbiano de alimentación directa en combinación con una xilanasa y una b-glucanasa. La presente invención además se relaciona con los usos y kits.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los suplementos de enzimas se usan como aditivos para la alimentación animal, especialmente alimentos para aves y cerdos, como un medio para mejorar el uso de los nutrientes y las características de rendimiento de producción. Las mezclas de enzimas están disponibles para mejorar el valor nutrimental de las dietas que contienen granos de cereales, harina de soja, harinas de proteína animal o el alimento alto en fibra y los subproductos industriales.

El concepto de microbianos de alimentación directa (DFM, por sus siglas en inglés) involucra la alimentación de los microbios benéficos vivos a los animales, como pollos o cerdos, de tal manera que cuando se administran en cantidades adecuadas confieren un beneficio de salud al hospedero. Los probióticos es otro término para esta categoría de aditivos REF.: 253519 alimenticios. Los probióticos o DFM se han demostrado que mejoran el rendimiento de los animales en estudios controlados. DFM incluye bacterias de alimentación directa y/o productos a base de levadura.

Aunque se han contemplado las combinaciones de DFMs con algunas enzimas, la interacción entre DFMs y las enzimas nunca se ha entendido completamente. La presente invención se relaciona con nuevas combinaciones específicas que, sorprendentemente, mejoran notablemente las características de rendimiento de producción de los animales.

La presión continua en los mercados mundiales de cereales forrajeros se ha traducido en las tendencias para las industrias porcina y de aves de corral a buscar opciones alternativas rentables de ingredientes, tales como co-productos (subproductos) de las industrias de biocombustibles y molienda. Sin embargo, una característica de los ingredientes alternativos es el alto contenido de polisacáridos sin almidón (NSP; fibra) que para los no rumiantes, son de bajo valor nutritivo, ya que son indigestos, limitan la ingesta de nutrientes de un animal e influyen negativamente en la energía y el uso de nutrientes. De ello se desprende que la aplicación exitosa de los ingredientes fibrosos alternativos en las dietas de monogástricos será dependiente de la disponibilidad de las teenologías para usar eficientemente la energía contenida en la fibra dietética, mitigar los riesgos asociados con sus propiedades anti-nutricionales y beneficios económicos potenciales cuando se formulan correctamente en las dietas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Un hallazgo seminal de la presente invención es que la degradación de material dietético derivado de partículas de la pared celular vegetal, la cual es alta en polisacáridos no amiláceos (NSP, por sus siglas en inglés) por las xilanasas, se puede optimizar para mejorar el rendimiento de los animales cuando se combinan xilanasa y una b-glucanasa con uno o más microbianos de alimentación directa (DFMs) más específicos, seleccionados por su capacidad para digerir los carbohidratos estructurales de la pared celular de plantas y/o su capacidad de producción de ácidos grasos de cadena corta (SCFA, por sus siglas en inglés) de pentosas (por ejemplo, arabinoxilanos) contenidas en la fracción NSP de ingredientes en condiciones anaeróbicas.

La razón por la que esta combinación mejora el rendimiento es que la solubilización de la fibra, específicamente hemicelulosa, de la dieta se maximiza en el tracto gastrointestinal (GIT, por sus siglas en inglés) de los animales. Esta solubilización de hemicelulosa no siempre sería suficiente para aumentar el rendimiento, ya que los azúcares C5 liberados no son una fuente eficiente de energía para los animales cuando son absorbidos (Savory C., J. Br J.

Nut. 1992, 6677:: 103-114), sino que son una fuente más eficiente de energía cuando se convierten en ácidos grasos de cadena corta (AGCC), ya sea por microorganismos en el GIT o por DFMs.

Por lo tanto el valor energético de los productos vegetales (por ejemplo, trigo, maíz, avena, cebada y co-productos de cereales (subproductos) o la dieta de grano mezclado fácilmente accesible para monogástricos) se puede optimizar combinando de xilanasa y una b-glucanasa y DFMs específicos que pueden producir SCFAs de pentosas de fracción NSP en condiciones anaeróbicas o que pueden modular las poblaciones microbianas en el GIT para aumentar la producción de SCFA de los azúcares liberados. Los DFMs pueden adaptar su metabolismo para aumentar sinérgicamente la hidrólisis de fibras en combinación con xilanasa y b-glucanasa. Usando los DFMs con enzimas fibrolíticas puede proporcionar beneficios adicionales y maximizar los beneficios de las carbohidrasas.

Los DFMs específicos seleccionados por sus actividades enzimáticas pueden considerarse como una cadena alimenticia bacteriana accionada por glicano. Los DFMs seleccionados específicamente mostrados en la presente pueden usar preferentemente fibras dietéticas, un rasgo que les permite llevar a cabo las etapas de digestión de glicano para liberar polisacáridos más cortos, más solubles para otras bacterias, por ejemplo, otras microfloras de GIT endógeno. Los DFMs específicos se han seleccionado para su metabolismo el cual se ajusta de acuerdo con los glucanos liberados por las enzimas (por ejemplo, xilanasa y b-glucanasa) para mejorar la eficacia de las enzimas mostradas en la presente y la combinación de los DFM(s) en comparación con el uso de una combinación de enzimas solo o solo el uso de DFM(s).

Sin desear estar ligado por la teoría, en la presente invención el material dietético derivado de partículas de la pared celular vegetal que es rico en glicanos de fuente específica, tales como celulosa, hemicelulosa y pectina (material vegetal) o glucosaminoglicanos entran en el intestino distal en formas particuladas que son atacados por los degradadores de glicanos de DFMs específicos que son capaces de unir directamente a estas partículas insolubles y digerir sus componentes de glicano. Después de esta degradación inicial de partículas que contienen glicanos, pueden digerirse fragmentos de glicano más solubles por microorganismos degradadores de glicano secundarios presentes en el ciego, que contribuyen a la piscina liberada de productos de fermentación de ácidos grasos de cadena corta (SCFA, por sus siglas en inglés) que se deriva de ambos tipos de microorganismos degradadores. A medida que surgen SCFA partir de la fermentación de carbohidratos y/o la fermentación de proteínas y la desaminación por la microflora anaerobia indígena en el GIT, la concentración de SCFA puede ser un índice de la población de organismos anaerobios. En realidad SCFA puede proporcionar una serie de beneficios para el animal hospedero, actuando como combustible metabólico para el tejido del intestino, músculo, riñón, corazón, hígado y cerebro, y también proporcionando propiedades bacteriostáticas y bactericidas contra organismos, tales como Salmonella y E. coli .

El valor nutrimental de la fibra en los no rumiantes, se puede derivar principalmente a través de la producción de los ácidos grasos de cadena corta (SCFA) por fermentación de fibras solubilizadas o degradadas por las enzimas degradantes de fibra efectivas (por ejemplo, una xilanasa y una b-glucanasa, adecuadamente en combinación con una mayor enzima degradante de fibra). La xilanasa de alimentación por sí sola no es suficiente para usar los ingredientes fibrosos en las dietas de los animales (especialmente los no rumiantes). Existe una gran variedad de características químicas entre los ingredientes de los alimentos de origen vegetal. Una aplicación de la enzima depende de las características del material vegetal (alimento). A modo solamente de ejemplo, en el grano de trigo predominan los arabinoxilanos, sin embargo, en los acemites de trigo (un co-producto o subproducto de la molienda de trigo), el contenido de b-glucano aumenta de 8 g_1 DM (en grano) a un exceso de 26 g kg_1 DM.

Los SCFA tienen diferentes valores de energía y algunos pueden servir como precursores de glucosa y algunos pueden contribuir al mantenimiento de la integridad intestinal y la salud. Los inventores han encontrado que las combinaciones específicas mostradas en la presente se mueven preferentemente el proceso de fermentación en el GIT del animal hacia la producción de SCFA más valioso/útil, tales como el ácido butírico y/o los ácidos propiónicos.

En un aspecto, la presente invención proporciona una composición de aditivo alimenticio que comprende un microbiano de alimentación directa (DFM, por sus siglas en inglés), en combinación con una xilanasa y una b-glucanasa, en donde el DFM se selecciona del grupo que consiste de una cepa que produce una enzima; una cepa de fermentación de azúcar C5; una cepa que produce un ácido graso de cadena corta; un fibrolítico, una cepa que promueve la microflora endógena; o sus combinaciones.

La presente invención además proporciona un método para: i) mejorar el desempeño de un individuo, o ii) mejorar la digestibilidad de una materia prima en un alimento (por ejemplo, digestibilidad de nutrientes, tales como la digestibilidad de aminoácidos), o iii) mejorar la retención de nitrógeno, o iv) mejorar la tasa de conversión alimenticia (FCR, por sus siglas en inglés) o v) mejorar la ganancia de peso en un individuo, o vi) mejorar la eficiencia de la alimentación en un individuo, o vii) cambiar el proceso de fermentación, en el tracto gastrointestinal del individuo hacia la producción de ácido butírico y/o ácido propiónico, cuyo método comprende administrar a un individuo un microbiano de alimentación directa (DFM), en combinación con una xilanasa y una b-glucanasa, en donde el DFM se selecciona del grupo que consiste de una cepa que produce una enzima; una cepa de fermentación de azúcar C5; una cepa de producción de un ácido graso de cadena corta; un fibrolítico, cepa que promueve la producción de microflora endógena; o sus combinaciones.

La presente invención proporciona además una premezcla que comprende una composición de aditivo alimenticio de acuerdo con la presente invención, o un microbiano de alimentación directa (DFM), una xilanasa y una b-glucanasa, en la que el DFM se selecciona del grupo que consiste de una cepa que produce una enzima; una cepa de fermentación de azúcar C5; una cepa de producción de ácido graso de cadena corta; un fibrolítico, cepa que promueve la microflora endógena; o combinaciones de los mismos, y por lo menos una vitamina y/o por lo menos un mineral.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una alimentación que comprende una composición de aditivo alimenticio, de acuerdo con la presente invención o una premezcla de acuerdo con la presente invención.

La presente invención además proporciona una alimentación que comprende un microbiano de alimentación directa (DFM), en combinación con una xilanasa y una b-glucanasa, en el que el DFM se selecciona del grupo que consiste de una cepa que produce una enzima; una cepa de fermentación de azúcar C5; una cepa de producción de ácido graso de cadena corta; un fibrolítico, cepa que promueve la microflora endógena; o sus combinaciones.

En otro aspecto, se proporciona un método de preparación de un pienso, que comprende mezclar un componente alimenticio con una composición de aditivo alimenticio, de acuerdo con la presente invención o una premezcla de acuerdo con la presente invención.

Un aspecto adicional de la presente invención es un método de preparación de un pienso que comprende mezclar un componente de alimentación con un microbiano de alimentación directa (DFM), en combinación con una xilanasa y una b-glucanasa, en el que el DFM se selecciona del grupo que consiste de una cepa que produce la enzima; una cepa de fermentación de azúcar C5; una cepa de producción de ácido graso de cadena corta; un fibrolítico, cepa que promueve la microflora endógena; o combinaciones de los mismos.

La presente invención proporciona además el uso de un microbiano de alimentación directa (DFM), en combinación con una xilanasa y una b-glucanasa, en el que el DFM se selecciona del grupo que consiste de una cepa que produce una enzima; una cepa de fermentación de azúcar C5; una cepa de producción de ácido graso de cadena corta; un fibrolítico, cepa que promueve la microflora endógena; o combinaciones de los mismos: i) para mejorar el rendimiento de un individuo, o ii) para mejorar la digestibilidad de la materia prima en un alimento (por ejemplo, digestibilidad de los nutrientes, tales como la digestibilidad de aminoácidos), o iii) para mejorar la retención de nitrógeno, o iv) para mejorar la tasa de conversión alimenticia (FCR), o v) para mejorar la ganancia de peso en un individuo, o vi) para mejorar la eficiencia de la alimentación en un individuo, o vii) para separar el proceso de fermentación en el tracto gastrointestinal del individuo hacia la producción de ácido butírico y/o ácido propiónico.

Un aspecto adicional se refiere a un kit que comprende un microbiano de alimentación directa (DFM), una xilanasa y una b-glucanasa, en el que el DFM se selecciona del grupo que consiste de una cepa que produce una enzima; una cepa de fermentación de azúcar C5; una cepa de producción de ácido graso de cadena corta; un fibrolítico, cepa que promueve la microflora endógena; o combinaciones de los mismos (y opcionalmente, por lo menos una vitamina y/o opcionalmente por lo menos un mineral) y las instrucciones para la administración.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 muestra los efectos de la xilanasa y b-glucanasa sin o con el microbiano de alimentación directa (DFM) de Bacillus en lactobacillus fecal y los conteos de E. coli (logaritmo de la unidad de formación de colonia transformada/gramo de heces, loglO cfu/g).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN De preferencia, la(s) enzima(s) usada(s) en la presente invención son exógenas al DFM. En otras palabras, las enzimas se añaden preferiblemente a, o mezcla con el DFM.

A menos que se defina lo contrario, todos los términos téenicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado como se entiende comúnmente por un experimentado en la técnica a la que pertenece esta descripción. Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 20 ED., John Wilcy and Sons, Nueva York (1994), and Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991) proporcionan una habilidad con un diccionario general de muchos de los términos usados en esta descripción.

Esta descripción no se limita por los métodos y materiales ejemplares descritos en la presente, y cualquiera de los métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento se puede usar en la práctica o prueba de las modalidades de esta descripción. Los intervalos numéricos incluyen los números que definen el intervalo. A menos que se indique lo contrario, ninguna de las secuencias de ácidos nucleicos se escriben de izquierda a derecha en la orientación 5' a 3'; las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha en la orientación de amino a carboxi, respectivamente.

Los encabezados proporcionados en la presente no son limitaciones de los diversos aspectos o modalidades de esta descripción, los cuales pueden ser hechos por referencia a la descripción como una totalidad. En consecuencia, los términos definidos inmediatamente a continuación se definen más completamente por referencia a la descripción como un todo.

Los aminoácidos se denominan en este documento usando el nombre del aminoácido, la abreviatura de tres letras o la abreviatura de una sola letra.

El término "proteína", como se usa en la presente, incluye proteínas, polipéptidos y péptidos.

Tal como se usa en la presente, el término "secuencia de aminoácidos" es sinónimo del término "polipéptido" y/o el término "proteína". En algunos casos, el término "secuencia de aminoácidos" es sinónimo del término "péptido". En algunos casos, el término "secuencia de aminoácidos" es sinónimo del término "enzima".

Los términos "proteína" y "polipéptido" se usan indistintamente en la presente. En la presente descripción y las reivindicaciones, se pueden usar los códigos de una letra y de tres letras convencionales para los residuos de aminoácidos. El código de 3 letras para los aminoácidos, como se define de acuerdo con la IUPACIUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN). También se entiende que un polipéptido puede estar codificado por más de una secuencia nucleotídica debido a la degeneración del código genético.

Todas las clasificaciones de la enzima de la C.E. mencionadas en la presente se refieren a las clasificaciones previstas en la Enzyme Nomenclature - Recommendations (1992) of the nomenclature committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology - ISBN 0-12-226164-3.

Otras definiciones de los términos pueden aparecer en toda la descripción. Antes de describir las modalidades ejemplares en más detalle, se entiende que esta descripción no se limita a las modalidades particulares descritas, como tal, puede, por supuesto, variar. También se entenderá que la terminología usada en la presente es para el propósito de describir solamente las modalidades particulares, y no se pretende que sea limitante, ya que el alcance de la presente descripción se limitará sólo por las reivindicaciones adjuntas.

Cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor intermedio, hasta la décima de la unidad del límite inferior a menos que el contexto indique claramente lo contrario, entre los límites superior e inferior de este intervalo también se describe específicamente. Cada intervalo más pequeño entre cualquier valor establecido o valor que interviene en un intervalo establecido y cualquier otro valor establecido o intermedio en tal intervalo establecido, está englobado dentro de esta descripción. Los límites superior e inferior de estos intervalos más pequeños pueden incluirse o excluirse independientemente en el intervalo, y cada intervalo, en donde cualquiera, ninguno o ambos límites se incluyen en los intervalos más pequeños también se incluyen dentro de esta descripción, sujeto a cualquier límite excluido específicamente en el intervalo establecido. Cuando el intervalo establecido incluye uno o ambos de los límites, los intervalos que excluyen cualquiera o ambos de esos límites incluidos también se incluyen en esta descripción.

Debe tenerse en cuenta que, como se usa en la presente y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el, la" incluyen las referencias en plural, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. De esta manera, por ejemplo, la referencia a "una enzima" incluye una pluralidad de tales agentes candidatos y la referencia a "el alimento" incluye la referencia a uno o más alimentos y equivalentes de los mismos conocidos por los experimentados en la téenica, y así sucesivamente.

Las publicaciones descritas en la presente se proporcionan únicamente para su descripción antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada en este documento debe interpretarse como una admisión de que tales publicaciones constituyen la técnica anterior para las reivindicaciones adjuntas.

Las enzimas para uso en la presente invención pueden producirse ya sea por cultivo sólido o sumergido, incluyendo procesos por lotes, alimentación por lotes y de flujo continuo. El cultivo se lleva a cabo en un medio de crecimiento que comprende un medio acuoso de sales minerales, factores de crecimiento orgánico, el material de fuente de carbono y energía, oxígeno molecular, y, por supuesto, un inoculo de partida de una o más especies de microorganismos particulares a emplear.

El DFM para el uso en la presente invención, puede ser una cepa que produce una enzima.

El DFM para el uso en la presente invención puede ser una cepa de fermentación de azúcar C5.

El DFM para su uso en la presente invención puede ser una cepa productora de ácido graso de cadena corta.

El DFM para su uso en la presente invención puede ser una cepa de promoción de microflora, endógena, fibrolítica.

La cepa que produce la enzima y/o la cepa de fermentación de azúcar C-5 y/o las cepas de producción de ácidos grasos de cadena corta y/o la cepa de promoción de microflora endógena, fibrolítica, de acuerdo con la presente invención, se pueden seleccionar del grupo que consiste de los siguientes géneros: Bacillus, Enterococcus , Lactobacillus , Propionibacterium y combinaciones de los mismos. La cepa que produce una enzima y/o la cepa de fermentación de azúcar C-5 y/o las cepas de producción de ácidos grasos de cadena corta y/o la cepa de promoción de microflora endógena, fibrolítica, de acuerdo con la presente invención puede ser por lo menos una cepa seleccionada del género Bacillus , en particular Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens o B. pumilus.

La cepa que produce una enzima y/o la cepa de fermentación de azúcar C-5 y/o cepa de producción de ácido graso de cadena corta y/o cepa de promoción de microflora endógena, fibrolítica de acuerdo con la presente invención, puede ser por lo menos una cepa seleccionada del género Enterococcus, en particular Enterococcus faecium.

La cepa que produce una enzima y/o la cepa de fermentación de azúcar C-5 y/o la cepa de producción de ácido graso de cadena corta y/o la cepa de promoción de microflora endógena, fibrolítica, de acuerdo con la presente invención, se pueden seleccionar del grupo que consiste de: Bacillus subtilis AGTP BS3BP5, Bacillus subtilis AGTP BS442, B. subtilis AGTP BS521, B. subtilis AGTP BS918, Bacillus subtilis AGTP BS1013, B. subtilis AGTP BS1069, B. subtilis AGTP 944, Bacillus subtilis BS 2084 (NRRL B-50013), Bacillus subtilis LSSA01 (NRRL B-50104), Bacillus subtilis 3A-P4 (PTA-6506), Bacillus subtilis 22C-P1 (PTA-6508), Bacillus licheniformis BL21 (NRRL B-50134), Bacillus subtilis BS-27 (NRRL B-50105), Bacillus subtilis BS18 (NRRL B-50633), Bacillus subtilis 15A-P4 (PTA-6507), Bacillus subtilis BS278 (NRRL B-50634), Bacillus licheniformis BL842 (NRRL B-50516), B. pumilus AGTP BS 1068, B. pumilus KX11-1, Enterococcus faecium ID7, Propionibacterium acidipropionici P169, Lactobacillus rhamnosus CNC -I-3698, Lactobacillus farciminis CNCM-I-3699, o una cepa que tiene todas las características de la misma, cualquier derivado o variante de la misma, y sus combinaciones.

La cepa que produce una enzima y/o la cepa de fermentación de azúcar C-5 y/o las cepas productoras de ácido grasos de cadena corta y/o la cepa de promoción de microflora endógena, fibrolítica para su uso en la presente invención es preferentemente una bacteria viable.

La cepa de la enzima que produce y/o de la cepa de fermentación de azúcar C-5 y/o cepa de producción de ácido graso de cadena corta y/o la cepa de promoción de microflora endógena, fibrolítica para su uso en la presente invención puede estar en la forma de una endóspora.

La xilanasa para su uso en la presente invención es preferentemente una endo-1, 4-D-xilanasa (EC 3.2.1.8).

En algunas modalidades, de preferencia, la xilanasa y la b-glucanasa se usan en combinación con por lo menos otra enzima degradante de la fibra. La enzima degradante de la fibra (adicional) puede seleccionarse del grupo que consiste de una celobiohidrolasa (E.C.3.2.1.176 y E.C.3.2.1.91), una b-glucosidasa (E.C. 3.2.1.21), una b-xilosidasa (E.C. 3.2.1.37), una feruloil esterasa (C.E. 3.1.1.73), una a-arabinofuranosidasa (C.E. 3.2.1.55), una pectinasa (por ejemplo, una endopoligalacturonasa (EC 3.2.1.15), una exopoligalacturonasa (C.E. 3.2.1.67) o una pectato liasa (C.E. 4.2.2.2)), o combinaciones de las mismas.

Convenientemente, puede haber más de una enzima degradante de fibra adicional, adecuadamente más de dos, adecuadamente más de tres, de manera adecuada más de cuatro, adecuadamente más de cinco.

Convenientemente, la composición de aditivo alimenticio de acuerdo con la presente invención o la composición que comprende un DFM en combinación con una xilanasa, una b-glucanasa y por lo menos otra enzima degradante, mueven el proceso de fermentación en el tracto gastrointestinal del individuo hacia la producción de ácido butírico y/o ácido propiónico.

MICROBIANO DE ALIMENTACIÓN DIRECTA (DFM) El término "microbiano" en la presente se usa de forma intercambiable con "microorganismo".

El DFM para el uso en la presente invención, puede ser cualquier DFM adecuado que es una "cepa productora de enzima" - tal como una cepa de Bacillus que produce una enzima. Para determinar si un DFM es una "cepa de producción de enzima" puede usarse la prueba DFM definida en este documento como "la prueba DFM de producción de la enzima" . Un DFM se considera que es un DFM que produce una enzima si se clasifica como un DFM que produce una enzima usando la "prueba de DFM de producción de enzima" mostrada en la presente.

El DFM para su uso en la presente invención, puede ser cualquier DFM adecuado que es una "cepa de fermentación de azúcar C-5". Para determinar si un DFM es un "cepa de fermentación de azúcar C-5" puede usarse la prueba DFM definida en la presente como "prueba DFM de fermentación de azúcar C5". Un DFM se considera que es un DFM de fermentación de azúcar C5 si se clasifica como la fermentación de azúcar C5 usando el "la prueba DFM de fermentación de azúcar C5" mostrada en la presente.

El DFM para su uso en la presente invención, puede ser cualquier DFM adecuado que es un "cepa de producción de ácido graso de cadena corta (SCFA)". Para determinar si un DFM es un "cepa productora de SCFA" puede usarse la prueba DFM se define en la presente como "prueba DFM de producción de SCFA". Un DFM se considera que es un DFM de producción de SCFA si se clasifica como que produce SCFA usando la "prueba de DFM de producción de SCFA" mostrada en la presente.

El DFM para uso en la en la presente invención puede ser cualquier DFM adecuado que es una "cepa que promueve la microflora endógena, fibrolítica". Para determinar si un DFM es una "cepa que promueve la microflora endógena, fibrolítica" , puede usarse la prueba DFM definida en la presente como "prueba DFM que promueve la microflora endógena, fibrolítica" . Un DFM se considera que es un DFM de promoción de microflora endógena, fibrolítica si promueve o estimula la microflora fibrolítica endógena usando la prueba mostrada en la presente.

El DFM para su uso en la presente invención puede ser cualquier DFM adecuado que es una "cepa que produce una enzima", una "cepa de azúcar fermentación C5", una "cepa productora de SCFA", una "cepa de promoción de microflora endógena, fibrolítica" o combinaciones de las mismas .

Convenientemente, el DFM para su uso en la presente invención puede ser un DFM que es una cepa que se clasificaría como una "cepa de producción de enzima" y/o "cepa de fermentación de azúcar C5" y/o "cepa productora de SCFA" y/o una "cepa de promoción de microflora endógena, fibrolítica" . Convenientemente, el DFM puede ser una cepa que se clasifica por tener más de un tipo de actividad, por ejemplo, por lo menos 2, convenientemente por lo menos 3, de forma adecuada todas las 4 actividades, por ejemplo, la actividad que produce la enzima, la actividad de fermentación de azúcar C5 , la actividad de producción de SCFA y/o la actividad de promoción de la microflora endógena, fibrolítica.

Los DFMs, acuerdo con la presente invención, proporcionan beneficios a los animales alimentados con altos niveles de subproductos de plantas de alto contenido de fibra, tales como granos secos de destilería con solubles (DDGS).

PRUEBA DFM DE PRODUCCIÓN DE ENZIMAS El cribado de alto rendimiento de estas cepas de prueba se realizó por electrochapeado por manchado replicado de 2 microlitros de cultivo líquido sobre 15.0 mL de varios tipos de medios sustrato de interés en placas de rejilla de 100x100x15 mm. La celulasa, a-amilasa, zeinasa, proteasa de soja, esterasa, lipasa y las actividades de xilanasa se determinaron con base al uso de los sustratos específicos por las cepas individuales. Componentes de los medios usados para probar las propiedades de uso del sustrato de la actividad enzimática de las cepas derivadas del medio ambiente se describen en la Tabla 1. Las placas de prueba se dejaron secar durante 30 minutos después de la aplicación del cultivo, y luego se incubaron a 32°C durante 24 horas. Las actividades enzimáticas de cada cepa se determinaron mediante la medición de la zona de la degradación del sustrato en milímetros, como se indica en la limpieza del borde circundante de crecimiento de la colonia. Se registraron los valores medios de las placas replicadas .

Tabla 1 - Componentes de medios usados para analizar las actividades enzimáticas ilustradas por propiedades de uso de sustrato de Bacillus derivados del medio ambiente.

En una modalidad, la cepa que produce una enzima produce una o más de las siguientes actividades enzimáticas: la actividad de celulasa, actividad de a-amilasa, la actividad de xilanasa, actividad de esterasa, actividad de lipasa, la actividad de b-mananasa, actividad de proteasa (por ejemplo, actividad de zeinasa o proteasa de soja) y combinaciones de las mismas.

En una modalidad, de preferencia de la cepa productora de la enzima produce una o más de las siguientes actividades enzimáticas: la actividad de celulosa, la actividad de xilanasa, la actividad de b-mananasa, o combinaciones de las mismas.

En una modalidad, el DMF que produce la enzima es una cepa seleccionada del grupo que consiste de las especies Bacillus subtilis, Bacillus pumilus, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens o mezclas de las mismas.

En una modalidad, se selecciona de preferencia la cepa de DFM que produce la enzima a partir del grupo que consiste de: Bacillus subtilis AGTP BS3BP5 (NRRL B-50510), Bacillus subtilis AGTP BS442 (NRRL B-50542), Bacillus subtilis AGTP BS521 (NRRL B-50545), Bacillus subtilis AGTP BS918 (NRRL B-50508), Bacillus subtilis AGTP BS1013 (NRRL B-50509), Bacillus pumilus AGTP BS 1068 (NRRL B-50543), Bacillus subtilis AGTP BS1069 (NRRL B-50544), Bacillus subtilis AGTP 944 (NRRL B-50548), Bacillus pumilus AGTP KXII-1 (NRRL B-50546), Bacillus subtilis 15A-P4 (PTA-6507), Bacillus subtilis BS 2084 (NRRL B-50013), Bacillus subtilis LSSA01 (NRRL B-50104), Bacillus subtilis 3A-P4 (PTA-6506), Bacillus subtilis 22C-P1 (PTA-6508), Bacillus licheniformis BL21 (NRRL B-50134)f Bacillus subtilis BS-27 (NRRL B-50105), Bacillus subtilis BS18 (NRRL B-50633), Bacillus subtilis BS278 (NRRL B-50634), Bacillus licheniformis BL842 (NRRL B-50516), o cualquier derivado o variante del mismo, y sus combinaciones.

La cepa que produce una enzima de DFM puede ser uno o más de las cepas que se muestran en US 61/527,371 y US 61/526,881, ambas de las cuales se incorporan en la presente por referencia.

PRUEBA DFM DE FERMENTACIÓN DE AZÚCAR C5: Las cepas de Bacillus se cultivan durante la noche en placas de agar de soja tríptico (Difeo) a 32°C, y se cultivan bacterias del ácido láctico durante la noche en agar MRS (Difeo) bajo condiciones anaerobias a 37°C. Los medios API 50 CHB y API 50 CHL (bioMerieux, Marcy l'Etoile, Francia) se inoculan con DFM de un cultivo puro (ya sea Bacillus o bacterias de ácido láctico, respectivamente) y se aplican a las tiras de API 50CH® de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las tiras se incubaron a 32°C ( Bacillus o 37°C bajo condiciones anaerobias (bacterias de ácido láctico) y se monitorean a 24 y 48 horas para los cambios colorimétricos.

El término "azúcar C5", como se usa en la presente, significa cualquier azúcar que tiene 5 carbonos. Los azúcares C5 pueden ser referidos en la presente como pentosas.

Los azúcares C5 incluyen D-arabinosa, L-arabinosa, D-ribosa, D-xilosa y L-xilosa.

En una modalidad, se selecciona la cepa de fermentación de azúcar C5 de DFM del grupo que consiste de: Bacillus subtilis 15A-P4 (PTA-6507) Bacillus subtilis AGTP BS918 (NRRL B-50508) Bacillus subtilis BS 2084 (NRRL B-50013) Bacillus subtilis LSSA01 (NRRL B-50104) Enterococcus faecium ID7 Lactobacillus lactis DJ6 (PTA 6102) Lactococcus lactis ID7 (PTA 6103), o sus combinaciones.

PRUEBA DE DFM DE PRODUCCIÓN DE ÁCIDOS GRASOS DE CADENA CORTA (SCFA): Un inoculo al 1% vol/vol de un cultivo de 48 h de un DFM se usa para inocular 10 mi de tubos de caldo de lactato de sodio modificado (NLB) (1% de lactato de sodio; Sigma-Aldrich, St Louis, MO; 1% de triptona; Oxoid Ltd., Hampshire, England, extracto de levadura al 0.5%; Oxoid Ltd. y KH2PO4 al 0.5%) desprovisto de lactato de sodio y complementado con una cantidad proporcional (1% peso/vol) de uno de los nueve carbohidratos diferentes (lactato, glucosa, galactosa, arabinosa, sacarosa, almidón, xilosa, celobiosa, fructosa; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Los cultivos se cultivaron en condiciones anaerobias a 32°C, y después de 0, 24, 48, y 72 horas de incubación, los tubos duplicados se centrifugan a 5,000 x g durante 10 minutos y el caldo agotado se colecta de cada cultivo. La producción de ácidos grasos de cadena corta en el caldo agotado se midió mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC). Las muestras de 1 mi duplicadas del caldo de cultivo gastado se retiran de cada tubo de muestreo y se mezcla con 10 mi de H2SO40.005 M. Tres mL de cada muestra diluida se filtran a través de un filtro de 0.2 micrómetros en ampolletas de HPLC y se tapa. Las muestras se analizan para el acetato, lactato, ácido propiónico y ácido butírico con un módulo de separación Waters 2695 (Milford, MA) usando una columna Aminex HPX-87H de 300 x 7.8 mm Bio-Rad (Hercules, CA). Todos los analitos se detectan con un detector Waters 2410 RI.

En una modalidad, la cepa de producción de ácido graso de cadena corta (SCFA) puede ser Propionibacterium acidipropionici P169.

En otra modalidad, cepa de producción de ácido graso de cadena corta (SCFA) puede ser Enterococcus faecium ID7.

El término "ácido graso de cadena corta" como se usa en la presente, incluye los ácidos grasos volátiles, así como el ácido láctico.

En una modalidad, el SCFA puede ser seleccionado del grupo que consiste de: ácido acético, ácido propiónico, ácido butírico, ácido isobutírico, ácido valérico, ácido isovalérico, ácido 2-metilbutírico y el ácido láctico.

En una modalidad, el SCFA puede ser ácido butírico. PRUEBA DE DFM DE PROMOCIÓN DE MICROFLORA ENDÓGENA, FIBROLÍTICA: Una prueba de gallinero se lleva a cabo para determinar los efectos de un DFM en pollos de engorde en comparación con un control sin DFM. Las muestras se recogen en los días 11 y 42 de la prueba. En cada fecha de muestreo un ave se recoge de cada gallinero para un total de ocho aves por tratamiento. Las aves se sacrificaron y el tracto gastrointestinal total (GIT, por sus siglas en inglés) desde abajo la molleja a la unión ileal-cecal se obtiene de cada ave. Muestras cecales de cada ave se cortan en rodajas abiertas y la digesta y el tejido cecal se recogen en una bolsa whirl-pak® y se mastican en 99 mi de peptona al 0.1% a 7.0 carreras/s durante 60 segundos, para liberar células bacterianas asociadas a la mucosa del tejido cecal. Las alícuotas de la solución masticada que contienen bacterias de la mucosa cecal y digesta se congelan instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenan a -20°C hasta su posterior análisis. El ADN genómico se aísla de 250 ml de cada muestra por extracción con fenol-cloroformo y se purifica usando el kit de purificación de Roche Applied Science High Puré PCR Témplate (Roche Diagnostics Corp., Indianapolis, IN). El ADN de dos aves por tratamiento se agrupa en cantidades iguales y se presenta para la pirosecuenciación como una sola muestra, resultando en cuatro muestras por tratamiento de cada edad. La pirosecuenciación de amplicón FLX de etiqueta codificada se realiza como se ha descrito previamente (Dowd, et al., BMC Microbiol. 24 de julio de 2008; 8:125). La región V1-V3 del gen 16S ARNr se amplifica en cada muestra combinada usando los cebadores 28 F (5'GAGTTTGATCNTGGCTCAG) y 519R (5'-GTNTTACNGCGGCKGCTG). Lo datos de la pirosecuenciación se procesan y analizan usando los elementos de programación v.1.4.0 Qiime. En forma breve, los datos de la secuencia en bruto se seleccionan y se preparan con base en la calidad. Todas las secuencias se arreglas a 350 pb. Las secuencias se almacenan por muestras individuales basadas en las secuencias de código de barras. Las etiquetas de código de barras y los cebadores se retiran de las secuencias y se eliminan las secuencias ribosómicas no bacterianas. Las secuencias se agrupan en unidades taxonómicas operacionales (OTUs, por sus siglas en inglés) a 97% de similitud usando uclust. Las secuencias representativas de cada OTU después se alinean usando PyNAST y la taxonomía se asigna por la comparación de secuencias a las secuencias de genes conocidos bacterianas 16S ARNr en la base de datos SILVA usando el clasificador RDP. Un submuestreo aleatorio de secuencias se realiza para normalizar cada muestra, de manera que se analiza el mismo número de secuencias. El análisis de Análisis de Varianza (ANOVA) se usa para determinar si cualquier microflora fibrolítica (taxones) se afecta significativamente por el tratamiento.

El término "microflora fibrolítica" como se usa en la presente, significa un grupo de microorganismos que son capaces de procesar polisacáridos de plantas complejas debido a su capacidad de sintetizar enzimas celulolíticas y hemicelulolíticas.

El término "endógeno", como se usa en la presente, significa presente en (o se origina en) el GIT de un individuo (por ejemplo, un animal). En otras palabras, la microflora endógena, fibrolítica no es un DFM. La microflora endógena, fibrolítica no se añade a la alimentación del individuo.

De preferencia, la cepa de producción de la enzima y/o de la cepa de fermentación de azúcar C-5 y/o las cepas productoras de ácido grasos de cadena corta y/o la cepa de promoción de microflora endógena, fibrolítica para su uso en la presente invención, comprende un microorganismo viable. De preferencia, la cepa de producción de la enzima y/o de la cepa de fermentación de azúcar C-5 y/o cepa de producción de ácido graso de cadena corta y/o la cepa que promueve la microflora endógena, fibrolítica, comprende una bacteria viable o una levadura viable o un hongo viable.

En una modalidad preferida, la cepa que produce la enzima y/o la cepa de fermentación de azúcar C-5 y/o las cepas productoras de ácido grasos de cadena corta y/o la cepa que promueve la microflora endógena, fibrolítica comprende una bacteria viable.

El término "microorganismo viable" significa un microorganismo que es metabólicamente activo o capaz de diferenciar.

En una modalidad, la cepa productora y/o de la cepa de fermentación de azúcar C-5 y/o las cepas que producen ácidos grasos de cadena corta y/o la cepa que promueve la microflora endógena, fibrolítica puede ser una bacteria formadora de esporas y por lo tanto, el término DFM puede estar compuesto de, o contener esporas, por ejemplo esporas bacterianas. Por lo tanto, en una modalidad, el término "microorganismo viable" como se usa en la presente, puede incluir esporas microbianas, tales como endósporas o conidios.

En otra modalidad, la cepa productora de la enzima y/o de la cepa de fermentación de azúcar C-5 y/o cepa de producción de ácido graso de cadena corta y/o la cepa de promoción de microflora endógena, fibrolítica en la composición de aditivo alimenticio, de acuerdo con la presente invención, no está compuesta de, o no contiene esporas microbianas, por ejemplo, las endósporas o conidios .

El microorganismo puede ser un microorganismo de origen natural o puede ser un microorganismo transformado.

El microorganismo también puede ser una combinación de microorganismos adecuados. En algunos aspectos, la cepa que produce la enzima y/o de la cepa de fermentación de azúcar C-5 y/o cepa de producción de ácido graso de cadena corta y/o la cepa de promoción de microflora endógena, fibrolítica de acuerdo con la presente invención, puede ser uno o más de los siguientes: una bacteria, una levadura o un hongo.

De preferencia, la cepa de producción de la enzima y/o de la cepa de fermentación de azúcar C-5 y/o las cepas productoras de ácido grasos de cadena corta y/o la cepa que promueve la microflora endógena, fibrolítica de acuerdo con la presente invención, es un microorganismo probiótico.

En la presente invención, el término microbiano de alimentación directa (DFM) abarca las bacterias de alimentación directa, levadura de alimentación directa, hongos de alimentación directa y combinaciones de los mismos.

De preferencia, la cepa de producción de la enzima y/o de la cepa de fermentación de azúcar C-5 y/o las cepas que producen ácidos grasos de cadena corta y/o la cepa que promueve la microflora endógena, fibrolítica es una bacteria de alimentación directa.

Convenientemente, la cepa de producción de la enzima y/o de la cepa de fermentación de azúcar C-5 y/o cepa de producción de ácido graso de cadena corta y/o la cepa de promoción de microflora endógena, fibrolítica puede comprender una bacteria de una o más de las siguientes géneros: Bacillus, Lactobacillus , Propionibacterium y combinaciones de los mismos.

En una modalidad, la cepa productora de la enzima y/o de la cepa de fermentación de azúcar C-5 y/o cepa de producción de ácido graso de cadena corta y/o la cepa de promoción de microflora endógena, fibrolítica puede ser una cepa seleccionada del género Bacillus .

En una modalidad, la cepa de producción de la enzima y/o de la cepa de fermentación de azúcar C-5 y/o las cepas de producción de ácidos grasos de cadena corta y/o la cepa que promueve la microflora endógena, fibrolítica puede seleccionarse de las siguientes cepas de Bacillus spp: Bacillus subtilis , Bacillus cereus, Bacillus licheniformis, B . pumilus , B. coagulans , B . amyloliquefaciens, B. stearothermophilus , B. brevis, B. alkalophilus, B . clausii, B . haiodurans , B. megaterium, B . circulans , B. lautus, B. thuringiensis y B. lentus .

En por lo menos algunas modalidades, la cepa de B. subtilis es de Bacillus subtilis AGTP BS3BP5, Bacillus subtilis AGTP BS442, B . subtilis AGTP BS521, B . subtilis AGTP BS918, Bacillus subtilis AGTP BS1013, B. subtilis AGTP BS1069, B . subtilis AGTP 944.

En por lo menos algunas modalidades, la cepa de B. subtilis es de Bacillus subtilis 15A-P4 (PTA-6507), LSSA01 (NRRL B-50104).

En por lo menos algunas modalidades, la cepa de B. pumilus es B . pumilus AGTP BS 1068 o B . pumilus KX11-1.

Las cepas 3A-P4 (PTA-6506), 15A-P4 (PTA-6507) y 22C-P1 (PTA-6508) están disponibles públicamente en la American Type Culture Collection (ATCC). Las cepas 2084 (NRRL B-500130); LSSA01 (NRRL-B-50104); BS27 (NRRL B-50105) están disponibles para el público en Agricultural Research Service Culture Collection (NRRL). La cepa de Bacillus subtilis LSSA01 se refiere a menudo como B . subtilis 8. Estas cepas se muestran en US 7,754,469 B2.

Danisco USA, Inc. , de Waukesha, Wisconsin, USA depositó bajo el Tratado de Budapest los siguientes depósitos biológicos con la Agricultural Research Service Culture Collection (NRRL) con las fechas de los depósitos originales y los números de acceso que se detallan a continuación: Danisco USA Inc. de Waukesha, Wisconsin USA ha autorizado a DuPont Biosciences Nutrición ApS de Langebrogade 1, PO Box 17, DK-1001, Copenhague K, Dinamarca para hacer referencia a todos estos materiales biológicos depositados en esta solicitud de patente y han dado sin reservas e irrevocable el consentimiento al material depositado que está disponible al público.

Agtech Products, Inc. de W227 N752 Westmound Drive, Waukesha, WI 53186, USA, depositó bajo el Tratado de Budapest el siguiente depósito biológico con la Agricultural Research Service Culture Collection (NRRL) con la fecha del depósito original y el número de acceso que se detalla a continuación: Agtech Products, Inc ha autorizado a DuPont Biosciences Nutrición ApS de Langebrogade 1, PO Box 17, DK-1001, Copenhague K, Dinamarca para hacer referencia a todos estos materiales biológicos depositados en esta solicitud de patente y han dado sin reservas e irrevocable el consentimiento al material depositado que está disponible al público.

La siguiente tabla resume la producción de las capacidades de las cepas seleccionadas usando la "prueba de DFM de producción de enzima" anterior: Resumen de la actividad enzimática de las cepas candidatas microbianas de alimentación directa.3 Tabla 2. Actividades de celulasa, xilanasa, y b-mananasa de las cepas de Bacillus .

!Mananasa (por ejemplo, b-mananasa) es el nombre dado a una clase de enzimas que pueden hidrolizar enlaces 1,4-b-?-glucosídicos de b-manano, galactomanano y glucomanano en oligosacáridos de manano y mañosa, rompiendo así el manano que contiene hemicelulosa, uno de los principales componentes de las paredes celulares de la planta, b-mananasa es endo-1,4-b-D-mananasa (EC 3.2.1.78).

Convenientemente, la cepa de producción de la enzima y/o de la cepa de fermentación de azúcar C-5 y/o cepa de producción de ácido graso de cadena corta y/o la cepa de promoción de microflora endógena, fibrolítica para su uso en la presente invención, puede ser una cepa seleccionada del género Propioníbacterium. En una modalidad, el DFM para su uso en la presente invención se puede seleccionar de la especie Propioníbacterium acidipropionici .

En una modalidad, el DFM para su uso en la presente invención es Propioníbacterium acidipropionici P169.

Agtech Products, Inc . de W227 N752 Westmound Dr. Waukesha, WI 53186, USA depositó el 28 de julio de 2003 bajo el Tratado de Budapest Propioníbacterium acidipropionici P169 con la American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA 20110-2209, USA como acceso No. PTA-5271. Propioníbacterium acidipropionici P169 se hace referencia la patente otorgada US 6,951,643B2 y está a disposición del público de la ATCC.

En una modalidad, la cepa productora de la enzima y/o de la cepa de fermentación de azúcar C-5 y/o cepa de producción de ácido graso de cadena corta y/o la cepa de promoción de microflora endógena, fibrolítica para su uso en la presente invención, puede ser una cepa del género Enterococcus .

En una modalidad, el DFM, para su uso en la presente invención, puede ser seleccionado entre la especie de Enterococcus faecium.

En una modalidad, el DFM para su uso en la presente invención puede ser Enterococcus faecium ID7.

Lactococcus lactis ID7 (que después fue reclasificado como Enterococcus faecium ID7) se depositó el 22 de junio de 2004 bajo el Tratado de Budapest como Lactococcus lactis ID7 en la American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA 20110-2209, USA, como acceso No. PTA-6103. Lactococcus lactis ID7 (que después fue reclasificado como Enterococcus faecium ID7) se hace referencia en la patente otorgada US 7,384,628 y está a disposición del público de la ATCC. Cuando "Enterococcus faecium ID7" se usa en la presente, se entenderá que el nombre de este organismo es intercambiable con "Lactococcus lactis ID7", que se depositó como acceso no. PTA-6103. Enterococcus faecium ID7 también está a disposición del público en Danisco Animal Nutrition, Dinamarca.

En una modalidad, la cepa productora de la enzima y/o de la cepa de fermentación de azúcar C-5 y/o cepa de producción de ácido graso de cadena corta y/o la cepa de promoción de microflora endógena, fibrolítica para su uso en la presente invención, puede ser una cepa del género Lactobacillus .

En una modalidad, la cepa productora y/o de la cepa de fermentación de azúcar C-5 y/o la grasos de cadena corta de la enzima productora de ácido cepas y/o la cepa que promueve la microflora endógena, fibrolítica puede ser seleccionado de la siguiente Lactobacillus spp: Lactobacillus buchneri, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus kefiri Lactobacillus bifidus Lactobacillus brevis, Lactobacillus helveticus , Lactobacillus paracasei , Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus sakei, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus farciminis , Lactobacillus lactis Lactobacillus delbreuckii , Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paraplantarum, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus crispatus , Lactobacillus gasseri, Lactobacillus johnsonii y Lactobacillus jensenii, y combinaciones de cualquiera de las mismas.

En una modalidad, el DF puede seleccionarse de una o más de las siguientes cepas: Lactobacillus rhamnosus CNCM-I-3698 y Lactobacillus farciminis CNCM-I-3699. Estas cepas se depositaron en la Collection National de Cultures de Microorganisms (CNCM) 25, Rué due Docteur Roux, F75724 París Cedex 15, Francia el 8 de diciembre de 2006 por Sorbial, Route de Spay 72700 Allonnes, France y todos los derechos, títulos e intereses en los depósitos, se transfirieron subsecuentemente a Danisco France SAS de 20, Brunei Street, 75017 París, Francia.

Danisco France SAS ha autorizado a DuPont Nutrition Biosciences ApS de Langebrogade 1, PO Box 17, DK-1001, Copenhagen K, Dinamarca consultar estos materiales biológicos depositados en esta solicitud de patente y han dado su consentimiento sin reservas e irrevocable al material depositado de ponerse a disposición al público.

En por lo menos algunas modalidades, el DFM puede seleccionarse de Lactobacillus lactis DJ6 (PTA 6102) y/o Lactococcus lactis ID7 (PTA 6103).

Agtech Products, Inc. de W227 N752 Westmound Drive, Waukesha, WI 53186, USA, depositó bajo el Tratado de Budapest los siguientes depósitos biológicos con la American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA 20110-2209, USA con las fechas de los depósitos originales y los números de acceso que se detallan a continuación: Agtech Products, Inc. ha autorizado a DuPont Nutrition Biosciences ApS de Langebrogade 1, PO Box 17, DK-1001, Copenhague K, Dinamarca para consultar estos materiales biológicos depositados en esta solicitud de patente y ha dado su consentimiento sin reservas e irrevocable de ser el material depositado puesto a disposición del público.

En al menos una modalidad, se combina más de uno de la cepa(s) descritas en la presente.

Por lo tanto, la cepa de producción de enzima y/o la cepa de fermentación de azúcar C-5 y/o la cepa de producción de ácido graso de cadena corta y/o la cepa que promueve la microflora endógena, fibrolítica usada en la presente invención, puede ser una combinación de por lo menos dos, convenientemente por lo menos tres, convenientemente por lo menos cuatro cepas de DFM descritas en la presente, por ejemplo, las cepas de DFM seleccionadas del grupo que consiste de Bacillus subtilis AGTP BS3BP5, Bacillus subtilis AGTP BS442, B. subtilis AGTP BS521, B. subtilis AGTP BS918, Bacillus subtilis AGTP BS1013, B. subtilis AGTP BS1069, B. subtilis AGTP 944, B. pumilus AGTP BS1068, B. pumilus KX11-1, Propionibacterium P169, Lactobacillus rhamnosus CNCM-I-3698 o Lactobacillus farciminis CNCM-1-3699.

En una modalidad, de preferencia el DFM puede ser uno o más del grupo que consiste de Bacillus subtilis AGTP BS3BP5, Bacillus subtilis AGTP BS442, B. subtilis AGTP BS521, B. subtilis AGTP BS918, Bacillus subtilis AGTP BS1013, B. subtilis AGTP BS1069, B. subtilis AGTP 944, B. pumilus AGTP BS1068, B. pumilus KX11-1 y una combinación de los mismos.

Cualquier Bacillus , Lactobacillus o Propionibacterium derivado o variante también está incluido y es útil en los métodos aquí descritos y reivindicados.

En algunas modalidades, las cepas variantes de Bacillus que tienen todas las características de Bacillus subtilis AGTP BS3BP5, Bacillus subtilis AGTP BS442, B. subtilis AGTP BS521, B . subtilis AGTP BS918, Bacillus subtilis AGTP BS1013, B. subtilis AGTP BS1069, y B. subtilis AGTP 944, B. pumilus AGTP BS1068 o B. pumilus KX11-1 también se incluyen y son útiles en los métodos descritos y reivindicados en la presente.

Como se usa en la presente, una "variante" tiene por lo menos 80% de identidad de secuencias genéticas con las cepas descritas usando el análisis de reacción en cadena de la polimerasa de ADN polimórfico amplificado aleatorio (RAPD-PCR). El grado de identidad de secuencias genéticas puede variar. En algunas modalidades, la variante tiene por lo menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% de identidad de secuencias genéticas con las cepas descritas usando el análisis RAPD-PCR.

Seis cebadores que pueden usarse para el análisis de RAPD-PCR incluyen los siguientes: Cebador 1 (5'-GGTGCGGGAA-3'), Cebador 2 (5'-GTTTCGCTCC-3'), Cebador 3 (5'-GTAGACCCGT-3'), Cebador 4 (5'-AAGSCFACGT- 3'), Cebador 5 (5'-AACGCGCAAC-3'), Cebador 6 (5'-CCCGTCAGCA-3'). El análisis RAPD puede realizarse usando Ready-to-Go™ RAPD Analysis Beads (Amersham Biosciences, Suecia), que se designan como las reacciones premezcladas, pre-distribuidas para realizar el análisis RAPD.

La bacteria de alimentación directa usada en la presente invención puede ser del mismo tipo (género, especie y cepa) o puede comprender una mezcla de géneros, especies y/o cepas.

De preferencia, el DFM que se usará de acuerdo con la presente invención es un microorganismo que en general es reconocido como seguro y, que es preferentemente aprobado por GRAS.

Un experimentado en la materia será fácilmente consciente de las especies y cepas de microorganismos dentro de los géneros específicos descritos en la presente, los cuales se usan en las industrias alimenticia y/o agrícola y que generalmente se consideran adecuados para el consumo animal.

De preferencia, el DFM usado de acuerdo con la presente invención es uno que es adecuado para el consumo animal.

De manera ventajosa, cuando el producto es un alimento o composición de aditivo alimenticio, el DFM viable debe seguir siendo efectivo a través de la fecha de "vencimiento" o de "venta" normal del producto durante el cual el alimento o la composición de aditivo alimenticio está a la venta por el minorista. Las duraciones deseadas de tiempo y la vida útil normal variarán de piensos a piensos y los experimentados en la téenica reconocerán que los tiempos de vida útil pueden variar con el tipo de pienso, el tamaño del pienso, las temperaturas de almacenamiento, las condiciones de procesamiento, el material de embalaje y los equipos de envasado.

En algunas modalidades, es importante que el DFM sea tolerante al calor, es decir, sea termotolerante. Este es particularmente el caso en que se granuló el alimento. Por lo tanto, en una modalidad, el DFM puede ser un microorganismo termotolerante, tal como una bacteria termotolerante, que incluye, por ejemplo, Bacillus spp.

En algunas modalidades, puede ser preferido que el DFM sea una bacteria de producción de esporas, tales como Bacilli , por ejemplo Bacillus spp. Los bacilos son capaces de formar endósporas estables cuando las condiciones de crecimiento son desfavorables y son muy resistentes al calor, pH, humedad y desinfectantes.

Convenientemente, el DFM no es un microorganismo inactivado.

En una modalidad el DFM puede ser un microorganismo viable o no viable, el cual se usa en la forma aislada o semi-aislada. El DFM puede usarse en combinación con o sin el medio de crecimiento en el que se cultivó.

En una modalidad, el DFM es capaz de producir unidades formadoras de colonias cuando se cultivan en un medio apropiado. Los medios apropiados pueden comprender (o consistir de) un alimento, o un constituyente de alimentación.

En una modalidad, el DFM es incapaz de producir unidades formadoras de colonias cuando se cultivan en un medio apropiado. Los medios apropiados pueden comprender (o consistir de) un alimento, o un constituyente de alimentación.

Independientemente de si el DFM es capaz o incapaz de producir unidades formadoras de colonias cuando se cultivan en un medio apropiado - las células pueden ser todavía metabólicamente activas (por ejemplo, incluso si son incapaces de dividirse).

En una modalidad, el DFM se puede administrar como células no viables.

En una modalidad, el DFM se puede administrar como un microorganismo viable.

El DFM puede dosificarse apropiadamente.

De manera conveniente, las dosificaciones de DFM en la alimentación pueden ser de entre aproximadamente lxlO3 CFU/g de alimento hasta aproximadamente lxlO9 CFU/g de alimento, adecuadamente entre aproximadamente lxlO4 CFU/g de alimento hasta aproximadamente lxlO8 CFU/g de alimento, adecuadamente entre aproximadamente 7.5xl04 CFU/g de alimento hasta aproximadamente lxlO7 CFU/g de alimento.

En una modalidad, el DFM se dosifica en el pienso en más de aproximadamente lxlO3 CFU/g de alimento, de manera conveniente más de aproximadamente lxlO4 CFU/g de alimento, adecuadamente más de aproximadamente 7.5xl04 CFU/g de alimento. Convenientemente, las dosis de DFM en la composición de aditivo alimenticio pueden estar entre aproximadamente lxlO5 CFU/g de composición a aproximadamente lxlO13 CFU/g de composición, convenientemente entre aproximadamente lxlO6 CFU/g de composición a aproximadamente lxlO12 CFU/g de composición, convenientemente entre aproximadamente 3.75xl07 CFU/g de composición a aproximadamente lxlO11 CFU/g de composición.

En una modalidad, el DFM se dosifica en la composición de aditivo alimenticio en más de aproximadamente lxlO5 CFU/g de composición, de manera adecuada más de aproximadamente lxlO6 CFU/g de composición, de manera adecuada más de alrededor de 3.75xl07 CFU/g de composición.

En una modalidad preferida, el DFM puede dosificarse en la composición de aditivo alimenticio a entre aproximadamente 5xl07 a aproximadamente lxlO9 CFU/g, adecuadamente a entre aproximadamente lxlO8 a aproximadamente 5xl08 CFU/g de composición.

En otra modalidad preferida, el DFM puede dosificarse en la composición de aditivo alimenticio a entre aproximadamente 5xl03 a aproximadamente 5xl05 CFU/g, adecuadamente a entre aproximadamente lxlO4 a aproximadamente lxlO5 CFU/g de composición.

ENZIMAS DEGRADANTES DE FIBRA El DFM tal como se muestra en la presente, se puede usar en combinación con por lo menos una xilanasa y por lo menos una b-glucanasa (y opcionalmente por lo menos otra enzima degradante de la fibra). b-glucanasa o endo-glucanasa es el nombre dado a una clase de enzimas que pueden hidrolizar enlaces (1,3)-b-?-glucosídico y/o (1,4)-b-D-glucosídicos de (1,4)-b-glucano, (1,3;1,4)-b-glucano y la celulosa en glucosa y oligosacáridos de glucosa, rompiendo así la celulosa y la hemicelulosa, los principales componentes de las paredes celulares de las plantas.

La b-glucanasa para el uso en la presente invención puede ser cualquier b-glucanasa comercialmente disponible.

En una modalidad, la b-glucanasa es una endoglucanasa, por ejemplo, una endo-1,4^ -D-glucanasa (clasificadas como EC 3.2.1.4).

Convenientemente, la b-glucanasa para el uso en la presente invención puede ser un b-glucanasa de Bacillus, Trichoderma, Aspergillus, Thermomyces, Fusarium y Penicillium.

En una modalidad, la enzima de degradación de la fibra puede ser una b-glucanasa producida a partir de uno o más de los hospederoes de expresión seleccionados del grupo que consiste de: Bacillus lentus, Aspergillus niger, Trichoderma reesei, Penicillium funiculosum, Trichoderma longibrachiatum, Humicola insolens, Bacillus amyloliquefaciens, Aspergillus aculeatus , Aspergillus aculeatus .

En una modalidad, la enzima degradante de la fibra puede ser uno o más de los siguientes productos comerciales que comprende por lo menos una enzima degradante de fibra de b-glucanasa: Econase® GT o Econase® BG (disponible en AB Vista), Rovabio Excel® (disponible de Adisseo), Endofeed® DC y Amylofeed® (disponible de Andres Pintaluba S.A.), AveMix® XG10 (de Aveve), Natugrain®, Natugrain® TS, o Natugrain® TS/L (disponible en BASF), Avizyme® 1210, Avizyme® SX, Grindazym® GP, Grindazym® GV, Porzyme® 8100, Porzyme® 9102, Porzyme® tplOO, AXTRA® XB, Avizyme® 1100, Avizyme® 1110, Avizyme® 1202, Porzyme® sf o Porzyme® SP (disponible en Danisco Animal Nutrítion), Bio-Feed Plus®, Ronozyme A®, Ronozyme VP® o Roxazyme G2® (disponible en DSM), Hostazym C® (disponible en Huvepharma), Kemzyme W dry o Kemzyme liquid (disponible en Kemin), Biogalactosidase BL (disponible en Kerry Ingrediente), Safizyme G (disponible en Le Saffre), o Feedlyve AGL (disponible en Lyven).

En una modalidad, la b-glucanasa se puede obtener de Axtra®XB. b-glucanasa puede dosificarse en cualquier cantidad adecuada.

En una modalidad, la b-glucanasa para su uso en la presente invención puede estar presente en el pienso en un intervalo de aproximadamente 50 BGU/kg de alimentación hasta aproximadamente 50,000 BGU/kg de alimento, adecuadamente de aproximadamente 100 BGU/kg de alimentación hasta aproximadamente 1,000 BGU/kg alimentación.

La b-glucanasa para su uso en la presente invención puede estar presente en el pienso en un intervalo de aproximadamente 75 BGU/kg de alimentación a aproximadamente 400 BGU/kg de alimento, adecuadamente de aproximadamente 50 BGU/kg de alimento a aproximadamente 200 BGU kg de alimento.

En una modalidad, la b-glucanasa está presente en el pienso en menos de 1,000 BGU/kg de alimento, adecuadamente menos de aproximadamente 500 BGU/kg de alimento, adecuadamente menos de 250 BGU/kg de alimento.

En una modalidad, la b-glucanasa está presente en el pienso en más de 75 BGU/kg de alimento, adecuadamente más de 100 BGU/kg de alimento.

Convenientemente, la b-glucanasa está presente en la composición de aditivo alimenticio en el intervalo de aproximadamente 150 BGU/g de composición a aproximadamente 3,000 BGU/g de composición, adecuadamente en el intervalo de aproximadamente 300 BGU/g a aproximadamente 1,500 composición BGU/g de composición.

En una modalidad, la b-glucanasa está presente en la composición de aditivo alimenticio en menos de 5,000 BGU/g de composición, de forma adecuada a menos de 4,000 BGU/g de composición, de forma adecuada a menos de 3,000 BGU/g de composición, de forma adecuada a menos de 2,000 BGU/g de composición.

En una modalidad, la b-glucanasa está presente en la composición de aditivo alimenticio en más de 50 BGU/g de composición, adecuadamente a más de 100 BGU/g de composición, adecuadamente a más de 125 BGU/g de composición.

En algunas modalidades, la actividad de b-glucanasa se puede calcular usando la "Prueba de actividad de b-glucanasa (BGU)", tal como se muestra en la presente.

En una modalidad, la b-glucanasa para el uso en la presente invención, puede tener actividad b-glucanasa, tal como se determina usando la "Prueba de actividad de b-glucanasa (CMC U/g)" mostrada en la presente.

El término "enzima degradante de fibra" como se usa en la presente, puede incluir uno o más de los siguientes enzimas de degradación de la fibra: una xilanasa (por ejemplo, un endo-1,4^ -D-xilanasa (E.C.3.2.1.8) o una 1,4 b-xilosidasa (E.C. 3.2.1.37)), una b-glucanasa (E.C.3.2.1.4), una celobiohidrolasa (E.C.3.2.1.176 y EC 3.2.1.91), una b-glucosidasa (E.C. 3.2.1.21), una feruloil esterasa (E.C. 3.1.1.73), una a-arabinofuranosidasa (E.C. 3.2.1.55), una pectinasa (por ejemplo, una endopoligalacturonasa (E.C. 3.2.1.15), una exopoligalacturonasa (E.C. 3.2.1.67) o una pectato liasa (E.C.4.2.2.2)), o combinaciones de las mismas.

El término "enzima de degradación de fibra adicional", como se usa en la presente, puede incluir uno o más de las siguientes enzimas de degradación de la fibra: una celobiohidrolasa (E.C. 3.2.1.176 y EC 3.2.1.91), una b-glucosidasa (E.C. 3.2.1.21), una b-xilosidasa (E.C. 3.2.1.37), una feruloil esterasa (E.C. 3.1.1.73), una a-arabinofuranosidasa (E.C. 3.2.1.55), una pectinasa (por ejemplo, una endopoligalacturonasa (E.C. 3.2.1.15), una exopoligalacturonasa (E.C. 3.2.1.67) o una pectato liasa (E.C. 4.2.2.2)), o combinaciones de los mismos.

También se entenderá por una persona experimentada en la téenica que "una más enzima degradante de la fibra" puede abarcar múltiples enzimas degradantes de fibra adicionales.

En una modalidad, el DFM, como se muestra en la presente, puede usarse en combinación con por lo menos una xilanasa, por lo menos una b-glucanasa y por lo menos otra enzima degradante de la fibra.

En otra modalidad, el DFM tal como se muestra en la presente, se puede usar en combinación con por lo menos una xilanasa, por lo menos una b-glucanasa y dos (o al menos dos) enzimas de degradación de la fibra adicionales.

En otra modalidad, el DFM tal como se muestra en la presente, puede usarse en combinación con por lo menos una xilanasa, por lo menos una b-glucanasa y tres (o por lo menos tres) enzimas que degradan la fibra adicionales.

En otra modalidad, el DFM tal como se muestra en la presente, puede usarse en combinación con por lo menos una xilanasa, por lo menos una b-glucanasa y cuatro (o por lo menos cuatro) más enzimas degradantes de fibra.

En una modalidad, el DFM tal como se muestra en la presente, puede usarse en combinación con un caldo o un producto de fermentación en estado sólido que contiene la actividad o actividades de la enzima medible de la presente invención.

En una modalidad, el DFM, tal como se muestra en la presente, se puede usar en combinación con las enzimas de la presente invención, en donde las enzimas se encuentran en forma aislada o purificada.

En una modalidad, el DFM tal como se muestra en la presente, puede usarse en combinación con las enzimas de la presente invención, en donde las enzimas son exógenas al DFM en la composición (por ejemplo, si el DFM es una cepa que produce una enzima).

De preferencia, la enzima(s) de fibra degradante está presente en el pienso en el intervalo de aproximadamente 0.05 a 5 g de proteína enzimática por tonelada métrica (MT) de alimentación (o mg/kg).

Convenientemente, cada enzima degradante de la fibra puede estar presente en el pienso en el intervalo de aproximadamente 0.05 a 5 g de proteína enzimática por tonelada métrica (MT) de alimentación (o mg/kg).

Convenientemente, las enzimas degradantes de la fibra en total están presentes en el pienso en el intervalo de aproximadamente 0.05 a 5 g de proteína enzimática por tonelada métrica (MT) de la alimentación (o mg/kg).

De preferencia, la enzima(s) degradante de fibra está presente en la composición de aditivo alimenticio (o premezcla) en el intervalo de aproximadamente 0.05 a 100 mg de proteína/g de la composición (por ejemplo a una total inclusión en la dieta de 50 a 1,000 g/MT).

Convenientemente, cada enzima degradante de la fibra está presente en la composición de aditivo alimenticio (o premezcla) en el intervalo de aproximadamente 0.05 a 100 mg de proteína/g de la composición (por ejemplo a una total inclusión en la dieta de 50 a 1,000 g/MT).

Convenientemente, las enzimas degradantes de la fibra en total están presentes en la composición de aditivo alimenticio (o premezcla) en el intervalo de aproximadamente 0.05 a 100 mg de proteína/g de la composición (por ejemplo a una total inclusión en la dieta de 50 a 1,000 g/MT).

En una modalidad preferida, la enzima degradante de la fibra (por ejemplo, cada enzima degradante de la fibra o enzimas degradantes de fibras en total) puede estar en la composición de aditivo alimenticio (o premezcla) en el intervalo de aproximadamente 50 a aproximadamente 700 g/TM de alimento. Convenientemente, la enzima degradante de la fibra (por ejemplo, cada enzima degradante de la fibra o enzimas degradantes de fibras en total) puede estar en la composición de aditivo alimenticio (o premezcla) a aproximadamente 100 a aproximadamente 500 g/TM de alimento.

En una modalidad, la enzima degradante de fibra adicional(s) para su uso en la presente invención, puede comprender (o consistir esencialmente en, o consistir en) una celobiohidrolasa (E.C.3.2.1.176 y EC 3.2.1.91).

En otra modalidad, la enzima degradante de fibra adicional(s) para su uso en la presente invención, puede comprender (o consistir esencialmente en, o consistir de) una b-glucosidasa (E.C.3.2.1.21).

Convenientemente, la enzima degradante de fibra puede comprender (o consistir esencialmente de, o consistir de) una celobiohidrolasa (E.C. 3.2.1.176 y EC 3.2.1.91), una b-glucosidasa (E.C.3.2.1.21) o combinaciones de las mismas.

En otra una modalidad, la enzima degradante de fibra adicional(s) para su uso en la presente invención, puede comprender (o consistir esencialmente de, o consistir de) una b-xilosidasa (E.C.3.2.1.37).

En una modalidad, la enzima(s) degradante de fibra para su uso en la presente invención, puede comprender (o consistir esencialmente de, o consistir de) una feruloil esterasa (E.C.3.1.1.73).

En otra modalidad, la enzima degradante de fibra adicional para el uso en la presente invención puede comprender (o consistir esencialmente de, o consistir de) una a-arabinofuranosidasa (E.C.3.2.1.55).

En una modalidad adicional, la enzima(s) degradante de fibra adicional, para el uso en la presente invención, puede comprender (o consistir esencialmente de, o consistir de) una pectinasa (por ejemplo, una endopoligalacturonasa (E.C. 3.2.1.15), una exopoligalacturonasa (E.C.3.2. 1.67) o una pectato liasa (E.C.4.2.2.2)).

En una modalidad preferida, la enzima(s) degradantes de fibra adicional(es) para el uso en la presente invención, puede comprender (o consistir esencialmente de, o consistir de) uno o más (adecuadamente dos o dos o más, adecuadamente tres) pectinasa(s) seleccionada del grupo que consiste de: una endopoligalacturonasa (E.C. 3.2.1.15), una exopoligalacturonasa (E.C. 3.2.1.67) y pectato liasa (E.C. 4.2.2.2).

En una modalidad adicional, la enzima(s) degradante de la fibra para el uso en la presente invención, puede comprender (o consistir esencialmente de, o consistir de) una celobiohidrolasa (E.C. 3.2.1.176 y EC 3.2.1.91), una b-glucosidasa (E.C. 3.2.1.21), una b-xilosidasa (E.C. 3.2.1.37), una feruloil esterasa (E.C. 3.1.1.73), una a-arabinofuranosidasa (E.C. 3.2.1.55), y/o una pectinasa (por ejemplo, una endopoligalacturonasa (E.C. 3.2.1.15 ), un exopoligalacturonasa (E.C. 3.2.1.67) o una pectato liasa (E.C. 4.2.2.2).

La presente invención se relaciona con la combinación de por lo menos una xilanasa, por lo menos una b-glucanasa y por lo menos un DFM específico como se muestra en la presente.

En una modalidad preferida, por lo menos una xilanasa, por lo menos una b-glucanasa y por lo menos un DFM específico, como se muestra en la presente, pueden combinarse con una enzima degradantes de fibra adicionales como se muestra en la presente.

La presente invención además se relaciona con la combinación de por lo menos una xilanasa y por lo menos una b-glucanasa, con por lo menos dos, tal como por lo menos tres o por lo menos cuatro o por lo menos cinco, enzimas de degradación fibra adicionales y por lo menos un DFM específico como se muestra en la presente.

La xilanasa es el nombre dado a una clase de enzimas que degradan el polisacárido lineal beta-1,4-xilano en xilosa, rompiendo así la hemicelulosa, uno de los principales componentes de las paredes celulares de las plantas.

La xilanasa para su uso en la presente invención, puede ser cualquier xilanasa comercialmente disponible. Convenientemente, la xilanasa puede ser una endo-1,4-b-d-xilanasa (clasificada como EC 3.2.1.8).

En una modalidad, de preferencia la xilanasa es una endoxilanasa, por ejemplo, una endo-1,4-b-d-xilanasa . La clasificación de una endo-1,4-b-d-xilanasa es E.C.3.2.0.8.

En una modalidad, la presente invención se relaciona con un DFM en combinación con un endoxilanasa, por ejemplo, una endo-1,4-b-d-xilanasa, y otra enzima.

Todas las clasificaciones de la enzima de la E.C. mencionados en la presente se refieren a las clasificaciones previstas en Enzyme Nomenclature Recommendations (1992) of the nomenclature committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology -ISBN 0-12-226164-3.

Convenientemente, la xilanasa para el uso en la presente invención puede ser una xilanasa de Bacillus o Trichoderma .

En una modalidad, la xilanasa puede ser una xilanasa que comprende (o consiste en) una secuencia de aminoácidos mostrada en la presente como SEC ID No. 1, una xilanasa que comprende (o consiste de) una secuencia de aminoácidos mostrada en la presente como SEC ID No. 2 o una xilanasa que comprende (o consiste en) una secuencia de aminoácidos mostrada en el presente documento como SEC ID No. 3 (FveXyn4) , una xilanasa de Trichoderma reesei , Econase XT™ o Rovabio Excel™.

En una modalidad, la xilanasa puede ser la xilanasa en Axtra XAP® o Avizyme 1502® o AxtraXB™, ambos productos disponibles comercialmente en Danisco A/S.

En una modalidad preferida, la xilanasa para el uso en la presente invención, puede ser una o más de las xilanasas en uno o más de los siguientes productos comerciales: En una modalidad, la xilanasa puede ser una xilanasa que comprende (o consiste de) una secuencia polipeptídica mostrada en la presente, como la SEC ID No.1, SEC ID No.2, SEC ID NO. 3, SEC ID No.4, SEC ID No. 5, SEC ID No.6, SEC ID No.7, SEC ID No.8, SEC ID No. 9, SEC ID No.10, SEC ID No. 11, o la SEC ID No. 12; o una variante, homólogo, fragmento o derivado de la misma que tiene por lo menos 75% de identidad (tal como por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ó 99% de identidad) con la SEC ID No.1 o la SEC ID No.2, SEC ID No. 3, SEC ID No.4, SEC ID No.5, SEC ID No.6, SEC ID No. 7, SEC ID No. 8, SEC ID No.9, SEC ID No.10, SEC ID No. 11, o la SEC ID No. 12; o una secuencia polipeptídica que comprende la SEC ID No.1, SEC ID No.2, SEC ID No.3, SEC ID No. 4, SEC ID No.5, SEC ID No.6, SEC ID No.7, SEC ID No. 8, SEC ID No.9, SEC ID No. 10, SEC ID No. 11, o la SEC ID No. 12 con una sustitución conservadora de por lo menos uno de los aminoácidos.

En una modalidad, la xilanasa puede comprender una secuencia polipeptídica mostrada en la presente como la SEC ID No. 1, SEC ID No. 2 o SEC ID No. 3, o una variante, homólogo, fragmento o derivado de la misma, que tiene por lo menos 98.5% (por ejemplo al menos 98.8 o 99 o 99.1 ó 99.5%) de identidad con la SEC ID SEC ID No.2 o la SEC ID No.3.

SEC ID No.1: mklssflvtaslvaalPTAJgPRQAADSINKLIKNKGKLYYGTITDPNLLGVAKDTAIIKA DFGAVTPENSGK DATEPSQGFNFGSFDQWNFAQQNGLKVRGHTLVWHSQLPQWVKNINDK ATLTKVIENHVTQWGRYKGKIYAWDWNEIFEWDGTLRKDSHFNNVFGNDDYVGIAFRAARK ADPNAKLYINDYSLDSGSASKVTKGVPSVKKWLSQGVPVDGIGSQTHLDPGAAGQIQGALT ALANSGVKEVAITELDIRTAPANDYATVTKACLNVPKCIGITVWGVSDKNSWRKEHDSLLF DANYNPKPAYTAWNALR SEC ID No.2: IPTAIEPRQAADSINKLIKNKGKLYYGTITDPNLLGVAKDTAIIKADFGAVTPENSGKWDA TEPSQGKFNFGSFDQWNFAQQNGLKVRGHTLVWHSQLPQWVKNINDKATLTKVIENHVTQW GRYKGKIYAWDWNEIFEWDGTLRKDSHFNNVFGNDDYVGIAFRAARKADPNAKLYINDYSL DSGSASKVTKGMVPSVKKWLSQGVPVDGIGSQTHLDPGAAGQIQGALTALANSGVKEVAIT ELDIRTAPANDYATKACLNVPKCIGITVWGVSDKNSWRKEHDSLLFDANYNPKPAYTAW N ALR SEC ID No.3: QAADSINKLIKNKGKLYYGTITDPNLLGVAKDTAIIKADFGAVTPENSGKWDATEPSQGKF NFGSFDQWNFAQQNGLKVRGHTLVWHSQLPQWVKNINDKATLTKVIENHVTQWGRYKGKIY AWDWNEIFEWDGTLRKDSHFNNVFGNDDYVGlAFPvAARKADPNAKLYINDYSLDSGSASK VTKGMVPSVKKWLSQGVPVDGIGSQTHLDPGAAGQIQGALTALANSGVKEVAITELDIRTA PANDYATVTKACLNVPKCIGITVWGVSDKNSWRKEHDSLLFDANYNPKPAYTA NALR SEC ID No.4: mklssflvtas1vaa IPTA IEPRQASOSINKLIKNKGKLYYGTITDPNLLGVAKDTAHKAD FGAVTPENSGKWDATEPSQGKFNFGSFDQWNFAQQNGLKVRGHTLVWHSQLPQWVKNINDK ATLTKVIENHVTNWGRYKGKIYAWDWNEIFDWDGTLRKDSHFNNVFGNDDYVGIAFRAARK ADPNAKLYINDYSLDSGSASKVTKGMVPSVKKWLSQGVPVDGIGSQTHLDPGAAGQIQGAL TALANSGVKEVAITELDIRTAPANDYATVTKACLVPKC IGITVWGVSDKNSWRKEHDSLL FDANYNPKAAYTAWNALR SEC ID No.5: IPTAIEPRQASOSINKLIKNKGKLYYGTITDPNLLGVAKDTAIIKADFGAVTPENSGWDAT EPSQGKFNFGSFDQWNFAQQNGLKVRGHTLVWHSQLPQWVKNINDKATLTKVIENHVTNWG RYKGKIYAWDWNEIFDWDGTLRKDSHFNNVFGNDDYVGIAFRAARKADPNAKLYINDYSLD SGSASKVTKGMVPSVKKWLSQGVPVDGIGSQTHLDPGAAGQIQGALTALANSGVKEVAITE LDIRTAPANDYATVTKACLNVPKCIGITVWGVSDNSWRKEHDSLLFDANYNPKAAYTAW N ALR SEC ID No.6: QASDSINKLIKNKGKLYYGTITDPNLLGVAKDTAIIKADFGAVTPENSGKWDATEPSQGKF NFGSFDQWNFAQQNGLKVRGHTLVWHSQLPQWVKNINDKATLTKVIENHVTNWGRYKGKIY AWDWNEiFDWDGTLRKDSHFNNVFGNDDYVGIAFRAARKADPNAKLYINDYSLDSGSASKV TKGMVPSVKKWLSQGVPVDGIGSQTHLDPGAAGQIQGALTALANSGVKEVAITELDIRTAP ANDYATVTKACLNVPKCIGITVWGVSDKNS RKEHDSLLFDANYNPKAAYTAWNALR SEC ID No.7: mvsfkylflaasalgalaAPVEVEESSWFNETALHEFAERAGTPSSTGWNNGYYYSFWTDN GGTVNYQNGNGGSYSVQWKDTGNFVGGKGWNPGSART1NYSGSFNPSGNAYLTVYGWTTN PLVEYYIVENYGTYNPGNGGTYRGSVYSDGANYNIYTATRYNAPSIEGDKTFTQYWSVRQS KRTGGTVTTANHFNAWAQLGSLGTHNYQIVATEGYQSSGSSSITVY SEC ID No.8: APVEVEESSWFNETALHEFAERAGTPSSTGWNNGYYYSFWTDNGGTVNYQNGNGGSYSVQW KDTGNFVGGKGWNPGSARTINYSGSFNPSGNAYLTVYGWTTNPLVEYYIVENYGTYNPGNG GTYRGSVYSDGANYNIYTATRYNAPSIEGDKTFTQYWSVRQSKRTGGTVTTANHFNAWAQL GMSLGTHNYQIVATEGYQSSGSSSITVY SEC ID No.9: AGTPSSTGWNNGYYYSFWTDNGGTVNYQNGNGGSYSVQWKDTGNFVGGKGWNPGSARTINY SGSFNPSGNAYLTVYGWTTNPLVEYYIVENYGTYNPGNGGTYRGSVYSDGANYNIYTATRY NAPSIEGDKTFTQYWSVRQSKRTGGTVTTANHFNAWAQLGMSLGTHNYQIVATEGYQSSGS SSITVY SEC ID No.10: MVSFTSLLAAVSAVTGVMALPSAQPVDGMSWERDPPTNVLDKRTQPTTGTS GGYYFSFWTDTPNSVTYTNGNGGQFSMQWSGNGNHVGGKGWMPGTSRTIKY SGSYNPNGNSYLAVYGWTRNPLIEYYIVENFGTYNPSSGGQKKGEVNVDGSVYD IYVSTRVNAPSIDGNKTFQQYWSVRRNKRSSGSV TGAHFQAWKNVGLNLGTHD YQILAVEGYYSSGSASMTVSQ SEC ID No.11: LPSAQPVDGMSW ERDPPTW LDKRQPTTGTSGGYYFSFWTDTPHSVTYTNGNGGQFS MQWSGNGNHVGGKGWMPGTSRTIKYSGSYNPNGNSYLAVYGWTRNPLIEYYIVENFGTY NPSSGGQKKGEVNVDGSVYDIYVSTRVNAPSIDGNKTFQQYWSVRRNKRSSGSVNTGAHF QAWKNVGLNLGTHDYQILAVEGYYSSGSASMTVSQ SEC ID No.12: TQPTTGTSGGYYFSFWTDTPNSVTYTNGNGGQFSMQWSGNGNHVGGKGWMPGTSRTIK YSGSYNPNGNSYLAVYGWTRNPLIEYYIVENFGTYNPSSGGQKKGEVNVDGSVYDIYVSTR V APSIDGNKTFQQYWSVRRNKRSSGSVNTGAHFQAWKNVGLNLGTHDYQILAVEGYYSS GSASMTVSQ De preferencia, la xilanasa está presente en el pienso en el intervalo de aproximadamente de 500 XU/kg a aproximadamente 16,000 XU/kg de alimento, más preferentemente de aproximadamente 750 XU/kg de alimento hasta aproximadamente 8,000 XU/kg de alimento, y aún más preferentemente de aproximadamente 1,000 XU/kg de alimento a aproximadamente 4,000 XU/kg de alimento.

En una modalidad, la xilanasa está presente en el pienso en más de aproximadamente 500 XU/kg de alimento, adecuadamente más de aproximadamente 600 XU/kg de alimento, adecuadamente más de aproximadamente 700 XU/kg de alimento, adecuadamente más de aproximadamente 800 XU/kg de alimento, adecuadamente más de aproximadamente 900 XU/kg de alimento, adecuadamente más de aproximadamente 1,000 XU/kg de alimento.

En una modalidad, la xilanasa está presente en el pienso en menos de aproximadamente 16,000 XU/kg de alimento, adecuadamente menos de aproximadamente 8,000 XU/kg de alimento, adecuadamente menos de aproximadamente 7,000 XU/kg de alimento, adecuadamente menos de aproximadamente 6,000 XU/kg de alimento, adecuadamente menos de aproximadamente 5,000 XU/kg de alimento, adecuadamente menos de aproximadamente 4,000 XU/kg de alimento.

De preferencia, la xilanasa está presente en la composición de aditivo alimenticio en intervalo de aproximadamente 100 XU/g a aproximadamente 320,000 XU/g de composición, más preferentemente de aproximadamente 300 XU/g de composición a aproximadamente 160,000 XU/g de composición, y aún más preferentemente de aproximadamente 500 XU/g de composición a aproximadamente 50,000 XU/g de composición, y aún más preferentemente de aproximadamente 500 XU/g de composición a aproximadamente 40,000 XU/g de composición.

En una modalidad, la xilanasa está presente en la composición de aditivo alimenticio en más de aproximadamente 100 XU/g de composición, adecuadamente más de aproximadamente 200 XU/g de composición, adecuadamente más de aproximadamente 300 XU/g de composición, adecuadamente más de aproximadamente 400 XU/g de composición, más adecuadamente de aproximadamente 500 XU/g de composición.

En una modalidad, la xilanasa está presente en la composición de aditivo alimenticio en menos de aproximadamente 320,000 XU/g de composición, adecuadamente menos de aproximadamente 160,000 XU/g de composición, adecuadamente menos de aproximadamente 50,000 XU/g de composición, adecuadamente menos de aproximadamente 40,000 XU/g de composición, adecuadamente menos de aproximadamente 30,000 XU/g de composición.

La actividad de la xilanasa se puede expresar en unidades de xilanasa (XU) medida como se muestra en la "Prueba de actividad de xilanasa (XU) " mostrad en la presente. Ver también Bailcy, MJ Biely, P. and Poutanen, K., Journal of Biotechnology, Volumen 23, (3), mayo de 1992, 257-270 cuya enseñanza se incorpora en la presente por referencia.

En una modalidad, la enzima se clasifica adecuadamente usando la clasificación de E.C. anterior, y la clasificación de E.C. designa una enzima que tiene actividad cuando se prueba en la "Prueba de actividad de xilanasa (XU) " mostrada en la presente para determinar 1 XU.

En una modalidad, la xilanasa, para su uso en la presente invención, puede tener actividad xilanasa como se determina usando la "Prueba de actividad de xilanasa (ABX U/g) " mostrada en la presente.

ACTIVIDAD Y PRUEBAS ENZIMÁTICAS En una modalidad, la composición de aditivo alimenticio puede comprender un DFM en combinación con una xilanasa y una b-glucanasa.

En una modalidad, la actividad de xilanasa puede calcularse por medio de la "Prueba de la actividad xilanasa (XU) " mostrada en la presente.

En otra modalidad, la actividad de b-glucanasa puede calcularse usando la "Prueba de actividad de b-glucanasa (BGU) " mostrada en la presente.

Convenientemente, el DFM en combinación con una xilanasa y una b-glucanasa puede dosificarse como se establece en la siguiente tabla: La actividad de la enzima presentada en unidades puede calcularse para cada enzima como se muestra en las secciones anteriores.

En algunas modalidades, la composición de aditivo alimenticio puede comprender un DFM en combinación con una xilanasa, una b-glucanasa y una enzima degradante de fibra adicional como se muestra en la presente.

Convenientemente, el DFM, xilanasa, b-glucanasa y la enzima degradante de fibra adicional puede dosificarse como se establece en la siguiente tabla: En una modalidad, de preferencia el pienso comprende lo siguiente: una xilanasa en por lo menos 1,000 XU/kg a 5,000 kg/XU (convenientemente por lo menos 2,000 XU/kg a 4,500 XU/kg) de alimento; una b-glucanasa en por lo menos 100 BGU/kg a 4,000 BGU/kg (de forma adecuada por lo menos 150 BGU/kg a 3,000 BGU/kg); y un DFM, tal como se muestra en la presente, en por lo menos 50,000 CFU/g a 200,000 CFU/g (convenientemente en por menos 70,000 CFU/g a 175,000 CFU/g) de alimento.

En otra modalidad, de preferencia el pienso comprende lo siguiente: una xilanasa en por lo menos 1,000 XU/kg a 5,000 kg/XU (convenientemente en por lo menos 2,000 XU/kg a 4,500 XU/kg) de alimento; la b-glucanasa en por lo menos 100 BGU/kg a 4,000 BGU/kg (convenientemente por lo menos 50 BGU/kg a 3,000 BGU/kg); y un DFM tal como se muestra en la presente, en por lo menos 37,500 CFU/g a 100,000 CFU/g (convenientemente en por lo menos 37,500 CFU/g a 75,000 CFU/g) de alimento.

En otra modalidad, de preferencia, el pienso comprende lo siguiente: una xilanasa en por lo menos 1,000 XU/kg a 5000 kg/XU (convenientemente en por lo menos 2,000 XU/kg a 4,500 XU/kg) de alimento; una b-glucanasa en por lo menos 200-2,000 CMC U/kg (convenientemente por lo menos 500-1500 CMC U/kg) de alimento; un DFM tal como se muestra en la presente, en por lo menos 50,000 CFU/g a 200,000 CFU/g (convenientemente en por menos 70,000 CFU/g a 175,000 CFU/g) de los piensos; y una mezcla de enzimas degradantes de fibra que comprende además por lo menos 800-3500 ABX U/kg (convenientemente por lo menos 1,000-2,750 ABX U/g) de alimento y pNPG 500-3000 U/kg (convenientemente por lo menos 600-2,000 pNPG U/kg) de alimento.

En otra modalidad, de preferencia el pienso comprende lo siguiente: una xilanasa en por lo menos 1,000 XU/kg a 5,000 kg/XU (convenientemente en por lo menos 2,000 XU/kg a 4,500 XU/kg) de alimento; una b-glucanasa en por lo menos 200-2,000 CMC U/kg (convenientemente por lo menos 500-1,500 CMC U/kg) de alimentación; un DFM tal como se muestra en la presente, en por lo menos 37,500 CFU/g a 100,000 CFU/g (convenientemente en por lo menos 37,500 CFU/g a 75,000 CFU/g) de los piensos; y una mezcla de enzimas degradantes de fibra que además comprende por lo menos 800-3,500 ABX U/kg (convenientemente por lo menos 1,000-2,750 ABX U/g) de alimento y pNPG 500- 3,000 U/kg (convenientemente por lo menos 600-2,000 pNPG U/kg) de alimento.

En una modalidad, el DFM puede dosificarse de acuerdo con el número de unidades de xilanasa presentes en la composición. En una modalidad, el DFM puede dosificarse en el intervalo de 6.25x101 CFU DFM: enzima de 1 XU a 2x1O9 CFU DFM: enzima de 1 XU; de preferencia en el intervalo de 1.88xl04 CFU DFM: enzima de 1 XU a l.OxlO7 CFU DFM: enzima de 1 XU. El DFM mostrado en la presente puede usarse en combinación con una xilanasa y una b-glucanasa.

En otra modalidad, el DFM mostrado en la presente se puede usar en combinación con una xilanasa, una b-glucanasa y otra enzima degradante de fibra. En una modalidad preferida, la enzima degradante de fibra adicional puede ser una b-glucosidasa.

En una modalidad, la xilanasa, para su uso en la presente invención, puede tener actividad xilanasa como se determina usando la "Prueba de actividad de xilanasa (ABX U/g)" mostrada en la presente.

En una modalidad adicional, la b-glucanasa, para su uso en la presente invención, puede tener actividad b-glucanasa tal como se determina usando la "Prueba de actividad de b-glucanasa (CMC U/g)" mostrada en la presente.

En una modalidad adicional, la b-glucosidasa para el uso en la presente invención puede tener actividad de b- glucosidasa como se determina usando la "Prueba de actividad de b-glucosidasa (pNPG U/g) " mostrada en la presente.

En una modalidad, el DFM mostrado en la presente puede usarse en combinación con una xilanasa y b-glucanasa, en el que la xilanasa y b-glucanasa tienen las actividades establecidas en las siguientes tablas: xUna unidad de ABX se define como la cantidad de enzima necesaria para generar 1 mmo? de equivalentes de azúcar reductor de xilosa por minuto a 50°C y pH 5.3. 2Una unidad de la actividad CMC libera 1 miho? de azúcares reductores (expresados como equivalentes de glucosa) en un minuto a 50°C y pH 4.8.

En una modalidad preferida, el DFM mostrado en la presente, puede usarse en combinación con una xilanasa, una b-glucanasa y una b-glucosidasa en el que la xilanasa, b-glucanasa y b-glucosidasa tienen las actividades establecidas en las siguientes tablas: 1Una unidad de ABX se define como la cantidad de enzima necesaria para generar 1 pmol de equivalentes de azúcar reductor de xilosa por minuto a 50°C y pH 5.3. 2Una unidad de la actividad CMC libera 1 mmo? de azúcares reductores (expresados como equivalentes de glucosa) en un minuto a 50°C y pH 4.8. 3Una unidad de pNPG representa 1 mmo? de nitro-fenol liberado de para-nitrofenil-BD-glucopiranósido por minuto a 50°C y pH 4.8.

En una modalidad, la xilanasa y b-glucanasa para su uso en la presente invención, pueden comprender (o consistir esencialmente de, o consistir de) más de aproximadamente 3,000 ABX u/g de actividad de xilanasa y aproximadamente 2,000-2,600 CMC u/g de actividad de b-glucanasa, respectivamente.

Convenientemente, la xilanasa, b-glucanasa y b-glucosidasa para el uso en la presente invención, pueden comprender (o consistir esencialmente de, o consistir de) más de aproximadamente 3,000 ABX u/g de actividad de xilanasa, alrededor de 2,000-2,600 CMC u/g de actividad de b-glucanasa y más de aproximadamente 2,000 pNPG u/g de actividad de b-glucosidasa, respectivamente.

En una modalidad, la xilanasa para el uso en la presente invención, puede comprender (o consistir esencialmente en, o consistir en) por lo menos 2,000 ABX u/g de actividad de xilanasa (convenientemente por lo menos 2,500 ABX u/g de actividad, adecuadamente por lo menos 3,000 ABX u/g de actividad) como se determina usando la "Prueba de la actividad de xilanasa (ABX U/g)".

Convenientemente, la xilanasa para el uso en la presente invención, puede comprender (o consistir esencialmente de, o consistir de) aproximadamente 2,000 a aproximadamente 5,000 ABX u/g de actividad de xilanasa (convenientemente de por lo menos aproximadamente 2,500 a aproximadamente 4,000 ABX u/g de actividad, adecuadamente menos de aproximadamente 3,000 a aproximadamente 4,000 ABX u/g de actividad) como se determina usando la "Prueba de actividad de xilanasa (ABX U/g) ".

En otra modalidad, la b-glucanasa para el uso en la presente invención puede comprender (o consistir esencialmente de, o consistir de) por lo menos 1,000 CMC u/g de actividad b-glucanasa (convenientemente por lo menos 1,500 CMC u/g de actividad, adecuadamente por lo menos 2,000 CMC u/g de actividad) como se determina usando la "Prueba de actividad de b-glucanasa (CMC U/g)".

Convenientemente, la b-glucanasa para el uso en la presente invención, puede comprender (o consistir esencialmente de, o consistir de) aproximadamente 600 a aproximadamente 4,000 CMC u/g de actividad b-glucanasa (convenientemente por lo menos aproximadamente 1,000 a aproximadamente 3,000 CMC u/g de actividad, adecuadamente por lo menos aproximadamente 1,500 a aproximadamente 2,600 CMC u/g de actividad) como se determina usando la "Prueba de actividad de b-glucanasa (CMC U/g)".

En una modalidad adicional, la b-glucosidasa para el uso en la presente invención, puede comprender (o consistir esencialmente de o consistir de) por lo menos 300 pNPG u/g de actividad de b-glucosidasa (convenientemente por lo menos 500 pNPG u/g actividad, adecuadamente por lo menos 1,000 pNPG u/g actividad o adecuadamente por lo menos 2,000 pNPG u/g de actividad) como se determina usando la "Prueba de actividad de b-glucosidasa (pNPG U/g)".

Convenientemente, la b-glucosidasa para el uso en la presente invención puede comprender (o consistir esencialmente de, o consistir de) aproximadamente 200 a aproximadamente 4,000 pNPG u/g de actividad de b-glucosidasa (convenientemente por lo menos aproximadamente 300 a aproximadamente 3,000 pNPG u/g de actividad, adecuadamente por lo menos aproximadamente 1,000 a aproximadamente 3,000 pNPG u/g de actividad o adecuadamente por lo menos aproximadamente 2,000 a aproximadamente 3,000 pNPG u/g de actividad) como se determina usando la "Prueba de actividad de b-glucosidasa (pNPG U/g)".

Convenientemente, el DFM mostrado en la presente, se puede usar en combinación con una xilanasa y una b-glucanasa que comprende (o que consiste esencialmente de o que consiste de) por lo menos 2,000 ABX u/g de actividad -de xilanasa (convenientemente por lo menos 2,500 ABX u/g de actividad, adecuadamente por lo menos 3,000 ABX u/g de actividad) como se determina usando la "Prueba de actividad de Xilanasa (ABX U/g); y por lo menos 1,000 CMC u/g de actividad b-glucanasa (convenientemente por lo menos 1,500 CMC u/g de actividad, adecuadamente por lo menos 2,000 CMC u/g de actividad) como se determina usando la "Prueba de actividad de b-glucanasa (CMC U/g) " .

Convenientemente, el DFM mostrado en la presente, se puede usar en combinación con una xilanasa, una b-glucanasa y una b-glucosidasa que comprende (o consiste esencialmente de, o que consiste de) por lo menos 2,000 ABX u/g de actividad de xilanasa (convenientemente de por lo menos 2,500 ABX u/g de actividad, adecuadamente por lo menos 3,000 ABX u/g de actividad) como se determina usando la "Prueba de actividad de xilanasa (ABX U/g) "; y por lo menos 1,000 CMC u/g de actividad de b-glucanasa (convenientemente por lo menos 1,500 CMC u/g de actividad, adecuadamente por lo menos 2,000 CMC u/g de actividad) como se determina usando la "Prueba de actividad de b-glucanasa (CMC U/g)"; y por lo menos 300 pNPG u/g de actividad de b-glucosidasa (convenientemente por lo menos 500 pNPG u/g de actividad, adecuadamente por lo menos 1.000 pNPG u/g de actividad o adecuadamente por lo menos 2.000 pNPG u/g de actividad) como se determina usando la "Prueba de actividad de b-glucosidasa (pNPG U/g) ".

En una modalidad, el DFM mostrado en la presente, se puede usar en combinación con una xilanasa y una b-glucanasa que comprende (o consiste esencialmente de, o que consiste de) aproximadamente 2,000 a aproximadamente 5,000 ABX U/g de actividad de xilanasa (convenientemente de por lo menos aproximadamente 2,500 a aproximadamente 4,000 ABX u/g de actividad, adecuadamente por lo menos aproximadamente 3,000 a aproximadamente 4,000 ABX u/g de actividad) como se determina usando la "Prueba de actividad de xilanasa (ABX U/g) "; y aproximadamente 600 a aproximadamente 4,000 CMC u/g de actividad de b-glucanasa (convenientemente por lo menos aproximadamente 1,000 a aproximadamente 3,000 CMC u/g de actividad, adecuadamente por lo menos aproximadamente 1,500 a aproximadamente 2,600 CMC u/g de actividad) como se determina usando la "Prueba de actividad de b-glucanasa (CMC U/g)".

Convenientemente, el DFM mostrado en la presente, se puede usar en combinación con una xilanasa, una b-glucanasa y una b-glucosidasa que comprende (o que consiste esencialmente de, o que consiste de) aproximadamente 2,000 a aproximadamente 5,000 ABX u/g de actividad de xilanasa (convenientemente de por menos aproximadamente 2,500 a aproximadamente 4,000 ABX u/g de actividad, adecuadamente por lo menos aproximadamente 3,000 a aproximadamente 4000 ABX u/g de actividad) como se determina usando la "Prueba de actividad de xilanasa (ABX U/g) "; aproximadamente 600 a aproximadamente 4,000 CMC u/g de actividad b-glucanasa (convenientemente por lo menos aproximadamente 1,000 a aproximadamente 3,000 CMC u/g actividad, adecuadamente por lo menos aproximadamente 1,500 a aproximadamente 2,600 CMC u/g de actividad) como se determina usando la "Prueba de actividad de b-glucanasa (CMC U/g)"; y aproximadamente 200 a aproximadamente 4,000 pNPG u/g de actividad de b-glucosidasa (convenientemente por lo menos aproximadamente 300 a aproximadamente 3,000 pNPG u/g de actividad, adecuadamente por lo menos aproximadamente 1,000 a aproximadamente 3,000 pNPG u/g de actividad o adecuadamente por lo menos aproximadamente 2,000 a aproximadamente 3,000 pNPG u/g de actividad) como se determina mediante la "Prueba de actividad b-glucosidasa (pNPG U/g)".

"PRUEBA DE ACTIVIDAD DE XILANASA (XU) " La actividad de xilanasa se puede expresar en unidades de xilanasa (XU) medida a pH 5.0 con AZCL-arabinoxilano (arabinoxilano de trigo reticulado con azurina, comprimidos de Xylazyme de 100 mg, Megazyme) como sustrato. La hidrólisis por endo-(1-4)-b-xilanasa (xilanasa) produce fragmentos teñidos solubles en agua, y la velocidad de liberación de éstos (aumento en la absorbancia a 590 nm) puede relacionarse directamente con la actividad enzimática. Las unidades de xilanasa (XU) se determinan relativamente a un estándar de enzima (Danisco Xylanase, disponible de Danisco Animal Nutrition) en condiciones de reacción estándares, que son 40°C, 10 minutos de tiempo de reacción en el amortiguador Mcllvaine, pH 5.0.

La actividad xilanasa de la enzima estándar se determina como la cantidad de grupos terminales de azúcar reductor liberados de un sustrato de xilano gastado de avena por minuto a pH 5.3 y 50°C. Los grupos terminales del azúcar reductor reaccionan con el ácido 3,5-dinitrosalicílico y la formación del producto de reacción se puede medir como el aumento de la absorbancia a 540 nm. La actividad enzimática se cuantifica con relación a una curva estándar de xilosa (equivalentes de azúcar reductor). Una unidad xilanasa (XU) es la cantidad de enzima estándar que libera 0.5 pmol de equivalentes de azúcar reductor por minuto a pH 5.3 y 50°C.

"PRUEBA DE ACTIVIDAD DE XILANASA (ABX U/g)lw La actividad de xilanasa se puede expresar en unidades de xilanasa de madera de abedul de ácido (ABX U) medida a pH 5.3 con 4-0 metil glucuronoxilano de madera de abedul como sustrato. Tomar con la pipeta 1.8 mL de solución de sustrato de 4-0 metil glucuronoxilano de madera de abedul al 1% en cada tubo de ensayo. Incubar durante 10-15 minutos, lo que permite equilibrar a 50°C. Tomar con la pipeta 0.2 mL de dilución de enzima usando pipetas de desplazamiento positivo o equivalente. Formar el vórtice para mezclar. Incubar cada muestra a 50°C durante exactamente 5 minutos. Añadir 3 mL de solución de sal sódica del ácido (DNS) 3,5 nitrosalicílico al 1% y mezclar. Cubrir la parte superior de los tubos de ensayo con tapas para evitar la evaporación. Colocar los tubos de ensayo en un baño hirviendo durante exactamente 5 minutos. Enfriar los tubos de ensayo durante 10 minutos en un baño de hielo/agua. Incubar el tubo de ensayo durante 10 minutos a temperatura ambiente. Transferir el contenido del tubo de ensayo a cubetas y medir a 540 nm frente a agua desionizada. Corregir la absorbancia del color de fondo restando el blanco de la enzima correspondiente. La actividad enzimática se cuantifica con relación a una curva estándar de xilosa (equivalentes de azúcar reductor).

Una unidad de ABX se define como la cantidad de enzima necesaria para generar 1 mmo? de equivalentes de azúcar reductor de xilosa por minuto a 50°C y pH 5.3.

"PRUEBA DE ACTIVIDAD DE b-GLUCANASA (CMC U/g) " La actividad b-glucanasa se puede expresar en unidades CMC medida a pH 4.8 con la sal de sodio de carboximetilcelulosa (CMC) como sustrato. Tomar con la pipeta 1 mL de solución al 1% de sal de sodio carboximetilcelulosa (CMC) (preparada con el amortiguador de acetato de sodio 0.05 M) en los tubos de muestra y blanco. Incubar los tubos en un baño de agua a 50°C durante 10 minutos. Tomar con la pipeta 1 mL de dilución de enzima en intervalos de 15 segundos a los tubos de muestra. Mezclar los tubos después de cada adición. Después de 10 minutos, añadir 3 mi de la sal de sodio del ácido 3,5 dinitrosalicílico (DNS) en el mismo orden y el tiempo que la adición de la enzima a los tubos de muestra. Añadir 3 mL de DNS a los tubos de muestra en blanco. Después de adicionar el DNS, retirar los tubos de ensayo a otro bastidor no en el baño de agua a 50°C. Adicionar 1 mi de enzima diluida al blanco de muestra correspondiente. Tapar los tubos y ebullir durante 5 minutos exactamente. Retirar del baño de agua a 100° C y colocar en un baño de hielo durante 10 minutos. Dejar a temperatura ambiente durante 10-15 minutos. Transferir a cubetas de 3 mL. Usando reactivo de blanco a cero del espectrofotómetro, cada muestra se lee a 540 nm contra agua desionizada. La actividad enzimática se cuantifica con relación a una curva estándar de glucosa (equivalentes de azúcar reductor).

Una unidad de la actividad CMC libera 1 pmol de azúcares reductores (expresados como equivalentes de glucosa) en un minuto a 50°C y pH 4.8.

"PRUEBA DE ACTIVIDAD DE b-GLUCANASA (BGU) " La actividad beta-glucanasa puede expresarse en unidades de beta-glucanasa (BGU) medida a pH 5.0 con AZCL-glucano, b-glucano de cebado reticulado de azurina, comprimidos de Glucazyme de 100 mg, Megazyme) como sustrato. La hidrólisis por beta-glucanasa produce fragmentos teñidos solubles, y la velocidad de liberación de éstos (aumento de la absorbancia a 590 nm) puede relacionarse directamente con la actividad enzimática. Las unidades beta-glucanasa (BGU) se determinan relativamente a un estándar de enzima (Multifect BGL, disponible en Danisco Animal Nutrition) en condiciones de reacción estándares, que son 50°C, 10 minutos de tiempo de reacción en amortiguador de acetato 0.1 , pH 5.0.

La actividad beta-glucanasa de la enzima estándar se determina como la cantidad de grupos terminales de azúcar reductor liberados de un sustrato de glucano de cebada por minuto a pH 5.0 y 50°C. Los grupos terminales del azúcar reductor reaccionan con el ácido 3,5-dinitrosalicílico y la formación del producto de reacción puede ser medida como un aumento en la absorbancia a 540 nm. La actividad enzimática se cuantifica con relación a una curva estándar de glucosa (equivalentes de azúcar reductor). Una unidad beta-glucanasa (BGU) es la cantidad de enzima que libera 2.4 mmo? de equivalentes de azúcar reductor por minuto a pH 5.0 y 50°C.

"PRUEBA DE ACTIVIDAD DE b-GLUCOSIDASA (pNPG U/g) " La actividad b-glucosidasa se puede expresar en unidades de pNPG medidas a pH 4.8 con para-nitrofenil-B-D-glucopiranósido (pNPG) como sustrato. Tomar con la pipeta 1 mL de solución de nitrofenil-beta-D-glucopiranósido al 3% (pNPG) (preparada con el amortiguador de acetato de sodio 0.05 M) en tubos de ensayo duplicados para cada muestra y control. Colocar en un baño de agua a 50°C durante 5 minutos. Adicionar 200 ml de control o muestra a sus respectivos tubos por duplicado a intervalos de 15-30 segundos. Al tubo blanco de reactivo, adicionar 200 ml de amortiguador de acetato de sodio. Someter a vórtice cada tubo después de la adición de la muestra. Dejar incubar los tubos durante 10 minutos exactamente. Después de la incubación de 10 minutos, adicionar 500 m? de solución de carbonato de sodio 1 M para detener la reacción. Someter a vórtice cada tubo después de la adición y colocar el tubo en un estante fuera del baño de agua. Adicionar 10 mi de agua Milli-Q a cada tubo y agitar para mezclar. Usando el blanco de reactivo a cero del espectrofotómetro, se mide la concentración de 4-nitrofenol mediante la lectura de cada muestra a 400 nm.

Una unidad pNPG denota 1 mmo? de nitro-fenol liberado de para-nitrofenil-B-D-glucopiranósido por minuto a 50°C y pH 4.8.

VENTAJAS La interacción de DFMs con la xilanasa y la b-glucanasa (y opcionalmente por lo menos otra enzima degradante de la fibra) es complicado y, sin desear estar ligado por la teoría, es muy sorprendente que se pueda ver un aumento en la producción de ácidos grasos de cadena corta en el GIT de animales.

La combinación de los DFMs específicos mostrados en la presente con por lo menos una xilanasa y al menos una b-glucanasa (y opcionalmente al menos otra enzima degradante de la fibra) se ha encontrado que es particularmente ventajoso en los piensos y/o en un individuo que se alimenta de un pienso que es alto en subproductos de fibra (por ejemplo, de las industrias de biocombustibles y molienda).

Se ha encontrado sorprendentemente que el valor nutrimental y la digestibilidad de los piensos que comprenden cantidades sustanciales (algunas veces 30-60%) de subproductos de fibra (que tienen un alto contenido de polisacáridos no amiláceos, por ejemplo, fibra), puede ser mejorado significativamente, al igual que el rendimiento y el aumento de peso de un individuo alimentado con tales piensos.

Una ventaja de la presente invención es el mejoramiento de la tasa de conversión alimenticia (FCR, por sus siglas en inglés) observada usando la combinación de la presente invención.

Sin desear estar ligado en la teoría, la degradación de material dietético derivado de partículas de la pared celular vegetal que es alto en polisacáridos no amiláceos (NSP, por sus siglas en inglés) por xilanasas se puede optimizar para mejorar el rendimiento de los animales cuando se combinan la xilanasa (por ejemplo, endo-1,4-b-d-xilanasa) con uno o más b-glucanasa (y opcionalmente en combinación con uno o más enzimas degradantes de fibra (por ejemplo, una celobiohidrolasa (E.C. 3.2.1.176 y EC 3.2.1.91), una b-glucosidasa (E.C. 3.2.1.21), una b-xilosidasa (E.C. 3.2.1.37), una feruloil esterasa (E.C. 3.1.1.73), una -arabinofuranosidasa (E.C. 3.2.1.55), una pectinasa (por ejemplo, una endopoligalacturonasa (E.C. 3.2.1.15), una exopoligalacturonasa ( EC 3.2.1.67) o una pectato liasa (E.C. 4.2.2.2)), o combinaciones de las mismas)) y uno o más microbianos de alimentación directa (DFMs) seleccionados por su capacidad para producir enzimas y/o su capacidad para producir ácidos grasos de cadena corta (SCFA) de pentosas de fracción NSP en condiciones anaeróbicas y/o su capacidad para promover las poblaciones endógenas de microflora fibrolítica en el GIT de un individuo y/o su capacidad para degradar azúcares C5.

La razón por la que esta combinación mejora el rendimiento es que la solubilización de la fibra, hemicelulosa específicamente, de la dieta se maximiza en el tracto gastrointestinal (GIT) de los animales. Esta solubilización de hemicelulosa no siempre sería suficiente para aumentar el rendimiento, ya que los azúcares C5 liberados no son una fuente eficiente de la energía para los animales cuando se absorben (Savory C.J. Br. J. Nut.1992, 67: 103-114), sino que son una fuente más eficiente de la energía cuando se convierten en ácidos grasos de cadena corta (SCFA), ya sea por microorganismos en el GIT o por DFMs.

Por lo tanto el valor energético de los productos vegetales (por ejemplo, co-productos o (subproductos) de trigo, maíz, avena, cebada y cereales o la dieta grano mezclado fácilmente accesible para monogástricos) se puede optimizar mediante la combinación de xilanasa (por ejemplo, endo-1,4-b-d-xilanasa) y b-glucanasa (y opcionalmente por lo menos otra enzima degradante de la fibra (incluyendo, pero no se limita a, una celobiohidrolasa (E.C. 3.2.1.176 y EC 3.2.1.91), una b-glucosidasa (E.C. 3.2.1.21), una b-xilosidasa (E.C. 3.2.1.37), una feruloil esterasa (E.C. 3.1.1.73), una a-arabinofuranosidasa (E.C. 3.2.1.55), una pectinasa (por ejemplo, una endopoligalacturonasa (E.C. 3.2.1.15), una exopoligalacturonasa (E.C.3.2.1.67 ) o una pectato liasa (E.C. 4.2.2.2)), o combinaciones de las mismas)) y los DFMs específicos que pueden producir SCFAs de pentosas de fracción NSP en condiciones anaeróbicas y/o que pueden modular las poblaciones microbianas en el GIT para aumentar la producción de SCFA a partir de la azúcares liberados y/o que pueden usar azúcares C-5. Los DFMs pueden adaptar su metabolismo para aumentar sinérgicamente la hidrólisis de la fibra en combinación con la xilanasa y b-glucanasa (y opcionalmente, por lo menos otra enzima degradante de la fibra). Usando los DFMs que pueden producir enzimas (fibrolíticas) pueden proporcionar beneficios adicionales y maximizar los beneficios de las enzimas adicionadas.

Los DFMs específicos seleccionados por sus actividades enzimáticas pueden ser considerados como una cadena alimenticia bacteriana accionad por glicano. Los DFMs específicamente seleccionados mostrados en la presente pueden usar, preferentemente, fibras dietéticas, un rasgo que les permite llevar a cabo las etapas de digestión de glicano para liberar polisacáridos más cortos, más solubles por otras bacterias, por ejemplo, otra microflora de GIT endógeno. Los DFMs específicos han sido seleccionados por su metabolismo, lo que se ajusta de acuerdo con los glucanos liberados por las enzimas (por ejemplo, xilanasa y b-glucanasa (y opcionalmente, por lo menos otra enzima degradante de la fibra)) a mejorar la eficacia de las enzimas que se muestran en la presente y la combinación de DFM(s) en comparación con el uso de una combinación solo de enzimas o el uso solo de DFM(s).

Sin desear estar ligado por la teoría, en la presente invención el material alimenticio derivado de partículas de la pared celular vegetal, el cual es rico en glicanos específicos de la fuente, tales como celulosa, hemicelulosa y pectina (material vegetal) o glicosaminoglicanos, entra en el intestino distal en formas de partículas que son atacadas por los degradadores de glicano específicas de DFMs que son capaces de unirse directamente a estas partículas insolubles y digerir sus componentes de glicano. Después de esta degradación inicial de partículas que contienen glicanos, los fragmentos de glicano más solubles pueden ser digeridos por degradadores de glicano secundarios presentes en el ciego, que contribuyen al fondo liberado de productos de fermentación de ácidos grasos de cadena corta (SCFA) que se deriva de ambos tipos de degradadores. A medida que surgen los SCFAs de la fermentación de carbohidratos y/o la fermentación de proteínas y la desaminación por la microflora anaerobia indígena en el GIT, la concentración de SCFA puede ser un índice de la población de organismos anaerobios. Los SCFA en realidad proporcionan una serie de beneficios al animal hospedero, actuando como combustible metabólico para el tejido de intestino, músculo, riñón, corazón, hígado y cerebro, y también proporcionando propiedades bacteriostáticas y bactericidas contra los microorganismos como Salmonella y E. coli .

El valor nutrimental de la fibra en los no rumiantes, se puede derivar principalmente a través de la producción de los ácidos grasos de cadena corta (SCFA) por medio de la fermentación de las fibras solubilizados o degradados por las enzimas que degradan fibra efectivas (por ejemplo, xilanasas y b-glucanasa y/o una enzima degradante de fibra adicional, mostrada en la presente). La xilanasa alimentada sola no es suficiente para usar los ingredientes fibrosos en la dieta de los animales (especialmente los no rumiantes). Existe una gran variedad de características químicas entre los ingredientes de los alimentos de origen vegetal. La aplicación de la enzima depende de las características del material (de alimentación) vegetal. A modo de ejemplo, en el grano de trigo predominan los arabinoxilanos, sin embargo, en los acemites de trigo (un co-producto o subproducto de la molienda de trigo), el contenido de b-glucano aumenta de 8 g-1 DM (en grano) a un exceso de 26 g kg_1 DM. Una matriz de enzima que contiene un complejo de xilanasa y b-glucanasa (y opcionalmente por lo menos otra enzima degradante de la fibra) puede mejorar el valor nutrimental de los piensos con alto contenido de dietas a base de co-producto (s) (subproducto(s)).

Los SCFA tienen diferentes valores energéticos y algunos pueden servir como precursores de glucosa y algunos pueden contribuir al mantenimiento de la integridad intestinal y la salud. Los inventores han encontrado que las combinaciones específicas mostradas en la presente mueven preferentemente el proceso de fermentación en el GIT del animal hacia la producción de SCFA más valioso/útil.

Sin desear estar ligado por la teoría, los presentes inventores han encontrado que los NSPs pueden ser degradados eficazmente por una combinación de un DFM, de acuerdo con la presente invención, y una xilanasa y una b-glucanasa (y opcionalmente por lo menos otra enzima degradante de la fibra). Además, se ha encontrado que esta combinación específica libera azúcares C-5 que normalmente tienen un valor nutrimental sólo marginal para el animal. Sin embargo, usando las combinaciones como se reivindica en la presente, es posible tener microorganismos en el GIT (ya sea el DFM de la presente invención) o microflora endógena fibrolítica (que son estimulados por las combinaciones (de DFM) de la presente invención) convierte estos azúcares C-5 en componentes útiles y nutrimentalmente valiosos, es decir, los ácidos grasos de cadena corta. Estos ácidos grasos de cadena corta pueden ser usados por el animal. De esta manera, el sistema mejora el valor nutrimental de un pienso para un animal.

De manera ventajosa, la combinación de un microbiano de alimentación directa, una xilanasa y una b-glucanasa (y opcionalmente, por lo menos otra enzima degradante de la fibra) como se muestra en la presente, aumenta sorprendentemente la degradación de la fibra en una composición de aditivo alimenticio, premezcla, alimentación o pienso, lo que conduce a mejorar el rendimiento de un individuo. En particular, la combinación de la presente invención mejora la digestibilidad de la materia prima en un alimento, lo que resulta en un aumento de la biodisponibilidad de los nutrientes (por ejemplo, la digestibilidad de nutrientes) y la energía metabolizable en el mismo.

FORMULACIÓN DEL DFM CON LAS ENZIMAS El DFM de la presente invención y las enzimas se pueden formular en cualquier forma conveniente para asegurar que la formulación comprenda DFMs viables y enzimas activas.

En una modalidad, el DFM y las enzimas se pueden formular como un polvo seco o una pelotilla. El polvo seco o pelotillas se pueden preparar por los medios conocidos por los experimentados en la téenica, tal como en un mezclador de microingredientes.

Para algunas modalidades, el DFM y/o la enzima(s) pueden estar recubiertos, por ejemplo, encapsularse. Convenientemente, el DFM y las enzimas se pueden formular dentro del mismo recubrimiento o encapsularse dentro de la misma cápsula. Alternativamente una o dos o tres o cuatro de las enzimas se pueden formular dentro del mismo recubrimiento o encapsularse dentro de la misma cápsula y el DFM podría formularse en un recubrimiento separado para una o más o todas las enzimas. En algunas modalidades, tales como donde el DFM es capaz de producir endósporas, el DFM se puede proporcionar sin ningún recubrimiento. En tales circunstancias, las endósporas de DFM se pueden mezclar simplemente con una o dos o tres o cuatro enzimas. En el último caso, las enzimas se pueden recubrir, por ejemplo, encapsularse, por ejemplo, una o más o todas las enzimas pueden recubrirse, por ejemplo, encapsularse. Las enzimas se pueden encapsular en forma de mezclas (es decir, que comprenden una o más, dos o más, tres o más o todas) de las enzimas o pueden encapsularse por separado, por ejemplo, como enzimas individuales. En una modalidad preferida, todas las cuatro enzimas se pueden recubrir, por ejemplo, encapsularse, juntas.

En una modalidad, el recubrimiento protege las enzimas del calor y puede ser considerado un termoprotector.

En una modalidad, la composición de aditivo alimenticio se formula para un polvo seco o pelotillas como se describe en W02007/044968 (referido como pelotillas TPT) incorporada en la presente por referencia.

En algunas modalidades, el DFM (por ejemplo, las endósporas de DFM, por ejemplo) puede diluirse usando un diluyente, tal como almidón en polvo, piedra caliza o similares.

En otra modalidad, la composición de aditivo alimenticio se puede formular mediante la aplicación de, por ejemplo, la pulverización, la enzima(s) sobre un sustrato portador, tal como, por ejemplo, trigo molido.

En una modalidad, la composición de aditivo alimenticio de acuerdo con la presente invención puede formularse como una premezcla. A manera solamente de ejemplo, la premezcla puede comprender uno o más componentes de la alimentación, tales como uno o más minerales y/o una o más vitaminas.

En una modalidad, el DFM y/o las enzimas para el uso en la presente invención, se formulan con por lo menos un vehículo fisiológicamente aceptable seleccionado de por lo menos uno de maltodextriña, piedra caliza (carbonato de calcio), ciclodextrina, trigo o de un componente de trigo, sacarosa, almidón, Na2SC>4, talco, PVA, sorbitol, benzoato, sorbiato, glicerol, sacarosa, propilenglicol, 1,3-propandiol, glucosa, parabenos, cloruro de sodio, citrato, acetato, fosfato, calcio, metabisulfito, formiato y mezclas de los mismos.

ENVASADO En una modalidad, se envasa la composición de aditivo alimenticio y/o premezcla y/o pienso o alimento de acuerdo con la presente invención.

En una modalidad preferida, la composición de aditivo alimenticio y/o premezcla y/o pienso o alimento se envasa en una bolsa, tal como una bolsa de papel.

En una modalidad alternativa, la composición de aditivo alimenticio y/o premezcla y/o pienso o alimento pueden ser sellados en un recipiente. Puede ser usado cualquier recipiente adecuado.

SUBPRODUCTOS La industria de la alimentación animal se ha visto un aumento en la alimentación de los subproductos, por ejemplo, desde el procesamiento de biocombustibles, a los animales (elevar esta forma de alimentación de 0-10% a los extremos actuales de 30 a 60%). Estos ahorros de costos en la dieta han sido una gran oportunidad para la industria para ahorrar en los costos de los insumos de alimentación, pero también vienen con un conjunto de retos. Los subproductos son a menudo productos ricos en fibra (por ejemplo, por menos aproximadamente 40% de fibra). En consecuencia, la inclusión de subproductos con alto contenido de fibra (por ejemplo, DDGS) puede tener un impacto negativo en el rendimiento del crecimiento del animal y las características del esqueleto. Además de los efectos negativos sobre el crecimiento animal y la calidad del esqueleto, las alteraciones en la digestibilidad de los nutrientes tienen implicaciones para el estiércol (por ejemplo, estiércol de cerdo) de manipulación, almacenamiento y descomposición.

El término "subproducto", como se usa en la presente, significa cualquier material vegetal fibroso, por ejemplo, uno que comprende por lo menos aproximadamente 20% ó 30% de fibra).

En una modalidad, el término subproducto significa cualquier producto derivado de un material de alimentación de alto contenido de fibra. En una modalidad, el subproducto al que se hace referencia en la presente puede seleccionarse de uno o más de los siguientes productos: harina de germen de maíz, salvado de maíz, sémola de maíz para piensos, maíz, piensos de gluten de maíz, destilados solubles de grano seco (DDGS, por sus siglas en inglés), destilados de grano seco (DDG, por sus siglas en inglés), harina de gluten, salvado de trigo, acemites de trigo o combinaciones de los mismos.

En una modalidad, el alimento de la presente invención comprende un subproducto fibroso, como la harina de maíz de germen, salvado de maíz, alimento de sémola de maíz, gluten de maíz, destilados solubles de grano seco (DDGS), destilados de grano seco (DDG), harina de gluten, trigo quebrado, acemites de trigo o sus combinaciones.

En una modalidad, el individuo al que se administra el DFM, xilanasa y b-glucanasa (y opcionalmente por lo menos otra enzima degradante de la fibra) la combinación de la presente invención o la composición de aditivo alimenticio de la presente invención, también se alimenta un pienso que comprende un subproducto de fibra, tal como la harina de germen de maíz, salvado de maíz, alimento de sémola de maíz, piensos de gluten de maíz, destilados solubles de grano seco (DDGS), destilados de grano seco (DDG), harina de gluten, salvado de trigo, salvado de trigo o combinaciones de los mismos.

RUPTURA O DEGRADACIÓN La enzima (o composición que comprende la enzima) de la presente invención o como se describe en la presente, se puede usar para descomponer (degradar) el arabinoxilano insoluble (AXinsol) o arabinoxilano soluble (AXsol) o combinaciones de los mismos, o productos de degradación de AXinsol. El término "ruptura" o "degradar" es sinónimo con hidrólisis.

POLISACÁRIDOS NO AMILÁCEOS (NSP) Una parte importante de los ingredientes de alimentación vegetales comunes consiste de carbohidratos, haciendo a los carbohidratos un factor crucial en la producción animal. Junto Además de los nutrientes digestibles, tales como almidón y azúcares, la fracción de carbohidratos de origen vegetal incluye componentes indigestibles (fibrosos), tales como celulosa, hemicelulosa, pectinas, beta-glucanos y lignina.

Todos estos componentes difíciles de digerir, con exclusión de la lignina, se clasifican como un grupo denominado en la presente como polisacáridos no amiláceos (NSP). La fracción de NSP es bien conocida por los efectos anti-nutrimentales que puede ejercer.

En una modalidad, el término fibra puede usarse de forma intercambiable con el término NSPs.

Dentro del grupo de NSP, la hemicelulosa misma es un subgrupo heterogéneo predominantemente compuesto de xilanos, arabinanos, galatanos, glucanos y mananos. El arabinoxilano es la fracción de NSP principal en varias de las materias primas de alimentación más importantes, incluyendo el trigo y el maíz.

ARABINOXILANO (AX) El término "arabinoxilanos" (AX), como se usa en la presente, significa un polisacárido que consiste en una cadena principal de xilano (unidades de xilosa de enlace 1,4) con L-arabinofuranosa (L-arabinosa en su forma de anillo de 5 átomos) unido al azar por enlaces la 2 y/o la 3 con las unidades de xilosa en toda la cadena. El arabinoxilano es una hemicelulosa encontrada en las paredes celulares primarias y secundarias de las plantas. El arabinoxilano se puede encontrar en el salvado de cereales como el trigo, el maíz (maíz), el centeno y cebada.

El arabinoxilano (AX) se encuentra en estrecha relación con la pared celular de la planta, donde actúa como un pegamento que une diversos bloques de construcción de la pared celular vegetal y el tejido, le da una resistencia estructural y rigidez.

Dado que la xilosa y arabinosa (los constituyentes de los arabinoxilanos) son ambas pentosas, los arabinoxilanos se clasifican generalmente como pentosanos.

AX es la principal fracción de polisacáridos no amiláceos (NSP) en varias de las materias primas de alimentación más importantes, incluyendo el trigo y el maíz.

Su abundancia, ubicación dentro del material vegetal y la estructura molecular causan que AX tenga un impacto grave y negativo sobre la digestibilidad del alimento, reduciendo efectivamente el valor nutritivo de las materias primas en los que está presente. Esto hace la AX un factor anti nutrimental importante, la reducción de la eficiencia de la producción animal.

Los AXs también pueden contener cantidades sustanciales de agua (que se puede hacer referencia como su capacidad de retención de agua) - esto puede causar arabinoxilanos solubles para dar como resultado la viscosidad (alta) - que es una desventaja en muchas aplicaciones.

ARABINOXILANO INSOLUBLE EN AGUA (AXinsol) El arabinoxilano insoluble en agua (AXinsol) también conocido como arabinoxilano-no extraíble de agua (WU-AX) constituye una proporción importante de la materia seca del material vegetal.

En el trigo, el AXinsol puede representar de un 6.3% de la materia seca. En el salvado de trigo y trigo DDGS AXinsol puede representar de aproximadamente 20.8% ó 13.4% de la materia seca (p/p).

En centeno, el AXinsol puede representar 5.5% de la materia seca.

En el maíz, el AXinsol puede represente 5.1% de la materia seca. En el maíz, DDGS AXinsol puede representar 12.6% de la materia seca.

AXinsol causa que se atrapen los nutrientes en la alimentación. Grandes cantidades de nutrientes así digeribles, tales como almidón y proteínas permanecen encerrados en cualquiera de los grupos de material de la pared celular o unidos a las cadenas laterales del AX. Estos nutrientes atrapados no estarán disponibles para la digestión y absorción posterior en el intestino delgado.

ARABINOXILANO SOLUBLE EN AGUA (AXsol) El arabinoxilano soluble en agua (AXsol) también conocido como arabinoxilano extraíble en agua (WE-AX) puede causar problemas en la producción de biocombustibles y/o malteado y/o elaboración de la cerveza y/o en los piensos, ya que pueden causar un aumento de la viscosidad debido a la capacidad de retención de agua de AXsol.

En la alimentación de AXsol puede tener un efecto anti-nutrimental particularmente en monogástricos ya que provocan un aumento considerable de la viscosidad del contenido intestinal, causada por la extraordinaria capacidad de retención de agua de AXsol. El aumento de la viscosidad puede afectar a la digestión de alimento y uso de nutrientes, ya que puede evitar el mezclado adecuado de los piensos con enzimas digestivas y las sales biliares y/o se disminuye la disponibilidad de nutrientes y la absorción y/o estimule la fermentación en el intestino grueso.

En el trigo, AXsol puede representar 1.8% de la materia seca. En el salvado de trigo y DDGS de trigo, AXsol puede representar aproximadamente 1.1% ó 4.9% de la materia seca (P/P)· En el centeno, AXsol puede representar 3.4% de la materia seca.

En la cebada, AXsol puede representar 0.4-0.8% de la materia seca.

En el maíz, AXsol puede representar 0.1% de la materia seca. En el DDGS de maíz, AXinsol puede representar 0.4% de la materia seca.

Además, sin embargo, a la cantidad de AXsol presente en el material vegetal, cuando una xilanasa solubiliza AXinsol en el material vegetal esto puede liberar pentosanos y/u oligómeros que contribuyen al contenido AXsol del material vegetal.

Una ventaja significativa de algunas de las xilanasas descritas en la presente, es que tienen la capacidad de solubilizar tanto AXinsol, así como a la descomposición rápida y eficientemente de los oligómeros solubilizados y/o pentosanos, de esta manera, las enzimas son capaces de solubilizar AXinsol sin aumentar la viscosidad y/o disminuyendo la viscosidad.

Una ruptura de AXsol puede disminuir la viscosidad.

Una ruptura de AXsol puede liberar nutrientes.

VISCOSIDAD La presente invención se puede usar para reducir la viscosidad en cualquier proceso donde la capacidad de unión de agua de AXsol provoca un aumento indeseable de la viscosidad.

La presente invención se relaciona con la reducción de la viscosidad rompiendo (degradar) el AXsol o rompiendo (degradar) los polímeros y/u oligómeros producidos por solubilización de AXinsol.

En la presente invención, una reducción en la viscosidad se puede calcular mediante la comparación de una muestra que comprende la xilanasa de la presente invención (o mostrado en la presente), en comparación con otra muestra comparable sin la xilanasa de la presente invención (o mostrado en la presente).

La comparación de los perfiles de reducción de la viscosidad de la xilanasa de la presente invención con los de las xilanasas de referencia del mercado demuestra el rendimiento de la enzima. El objetivo es mejorar el rendimiento de la enzima en comparación con la referencia del mercado. Las enzimas de referencia para las aplicaciones individuales se proporcionan en los siguientes ejemplos.

En una modalidad de la presente invención, las xilanasas que se muestran en el presente documento son reductoras de la viscosidad.

ALIMENTO O PIENSO La enzima o la composición de aditivo alimenticio de la presente invención se puede usar como - o en la preparación de - un alimento.

El término "alimento" se usa como sinónimo en la presente con "pienso".

En una modalidad, el pienso de la presente invención comprende un material de alimentación de alto contenido de fibra y/o por lo menos un subproducto de por lo menos un material de alimentación alto en fibra, tal como harina de germen de maíz, salvado de maíz, alimento de sémola de maíz, alimento de gluten de maíz, destilados solubles de grano seco (DDGS), destilados de grano seco (DDG), harina de gluten de trigo, trigo quebrado, acemites de trigo o sus combinaciones.

En una modalidad, el individuo al que el DFM, xilanasa y la combinación de b-glucanasa (opcionalmente en combinación una enzima degradante de fibra adicional) de la presente invención o se administra la composición de aditivo alimenticio de la presente invención, también se alimenta un pienso que comprende un material de alimentación alto en fibra y/o por lo menos un subproducto de por lo menos un material de alimentación alto en fibra, tales como harina de germen de maíz, salvado de maíz, alimento de sémola de maíz, alimento de gluten de maíz, destilados seco de grano soluble (DDGS), destilados de grano seco (DDG), harina de gluten, salvado de trigo, salvado de trigo o combinaciones de los mismos.

Convenientemente, en una modalidad, el componente de cereal de la dieta de un aves de corral puede ser ya sea de trigo o de cebada con centeno, acemites de, salvado de trigo, avena, cáscaras de avena, mientras que los componentes vegetales pueden ser harina de soja con o sin otros ingredientes de proteína, tales como cañóla, harina de semilla de colza, etc., siempre que la dieta contenga trigo-cebada como los ingredientes principales y formularse para satisfacer las necesidades de nutrientes de las aves que se alimentan.

La alimentación, de acuerdo con la presente invención, puede estar en la forma de una solución o como un sólido -dependiendo del uso y/o el modo de aplicación y/o el modo de administración. Cuando se usa como - o en la preparación de -una alimentación - tal como alimento funcional - la enzima o composición de la presente invención puede usarse en conjunto con uno o más de; un vehículo nutrimentalmente aceptable, un diluyente nutrimentalmente aceptable, un excipiente nutrimentalmente aceptable, un adyuvante nutrimentalmente aceptable, un ingrediente nutrimentalmente activo.

En una modalidad preferida, la enzima o la composición de aditivo alimenticio de la presente invención se mezcla con un componente de alimentación para formar un pienso.

El término "componente de alimentación", como se usa en la presente, significa la totalidad o parte del pienso. Parte del pienso puede significar un constituyente del alimento o más de un componente del pienso, por ejemplo, 2 ó 3 ó 4. En una modalidad, el término "componente de alimentación" abarca una premezcla o de los componentes de la premezcla.

De preferencia, la alimentación puede ser un pienso, o una premezcla del mismo, un pienso compuesto, o una premezcla de los mismos. En una modalidad, la composición de aditivo alimenticio de acuerdo con la presente invención puede mezclarse con un pienso compuesto, un alimento compuesto o a una premezcla de alimento compuesto o de un pienso, un componente de forraje, o una premezcla de un forraje.

El término forraje, tal como se usa en la presente, significa cualquier alimento que se proporciona a un animal (en lugar del animal que tiene al forraje para ellos mismos). Forraje abarca las plantas que han sido cortadas.

El término forraje incluye ensilado, alimentos comprimidos y pelotillados, aceites y las raciones mixtas, y también cereales y legumbres germinadas.

El forraje se puede obtener de una o más de las plantas seleccionados de: maíz (clases de maíz), alfalfa (Lucerna), cebada, lotera, brassicas, Chau moellier, col rizada, colza (cañóla), rutabaga (nabo), nabo, trébol, trébol híbrido, trébol rojo, trébol subterráneo, trébol blanco, festuca, bromo, mijo, avena, sorgo, soja, árboles (brotes de árboles heno), trigo y legumbres.

El término "alimento compuesto" significa un alimento comercial en forma de una harina, una pelotilla, nueces, pastel o una migaja. Los alimentos compuestos pueden mezclarse de diversas materias primas y aditivos. Estas mezclas se formulan de acuerdo a los requisitos específicos del animal objetivo.

Los alimentos compuestos pueden ser alimentos completos que proporcionan todos los nutrientes necesarios diariamente, concentrados que proporcionan una parte de la ración (proteínas, energía) o suplementos que sólo proporcionan micronutrientes adicionales, tales como minerales y vitaminas.

Los principales ingredientes usados en el alimento compuesto son los cereales forrajeros, que incluyen maíz, trigo, salvado de trigo, sojas, sorgo, avena y cebada.

De manera conveniente, una premezcla, que se hace referencia en la presente, puede ser una composición compuesta de microingredientes , tales como vitaminas, minerales, conservadores químicos, antibióticos, productos de fermentación, y otros ingredientes esenciales. En general, las premezclas son composiciones adecuadas para mezclarse en raciones comerciales.

Cualquier pienso de la presente invención puede comprender una o varias materias primas seleccionadas del grupo que comprende: a) cereales, tales como granos pequeños (por ejemplo, trigo, cebada, centeno, avena y combinaciones de los mismos) y/o granos grandes, tales como maíz o sorgo; b) productos de cereales, tales como harina de germen de maíz, salvado de maíz, alimento de sémola de maíz, alimento de gluten de maíz, destilados solubles de grano seco (DDGS), destilados de grano seco (DDG), harina de gluten, trigo quebrado, acemites de trigo o combinaciones de los mismos; c) proteína obtenida de fuentes, tales como soja, girasol, cacahuate, altramuces, chícharos, habas, algodón, cañóla, harina de pescado, proteína de plasma seco, harina de carne y hueso, proteína de papa, suero de leche, copra, ajonjolí; d) aceites y grasas obtenidos a partir de fuentes vegetales y animales; e) minerales y vitaminas.

En una modalidad, el pienso comprende o consiste de maíz, DDGS (tal como cDDGS), trigo, salvado de trigo o una combinación de los mismos.

En una modalidad, un componente alimenticio puede ser maíz, DDGS (tal como DDGS de maíz (cDDGS)) o una combinación de los mismos.

Un pienso de la presente invención puede contener por lo menos 30%, por lo menos 40%, por lo menos 50% o por lo menos 60% en peso de maíz y harina de soja o de maíz y de soja de grasa completa, o harina de trigo o harina de girasol.

Un pienso de la presente invención puede contener entre aproximadamente 5 a aproximadamente 40% de DDGS de maíz. Para el pollo - el pienso en promedio puede contener entre aproximadamente 7 a 12% de DDGS de maíz. Para porcino (cerdos) - el pienso puede contener en promedio de 5 a 40% de DDGS de maíz.

Un pienso de la presente invención puede contener maíz como un grano único, en cuyo caso el pienso puede comprender entre aproximadamente 35% a aproximadamente 85% de maíz.

En los piensos que comprenden granos mixtos, por ejemplo, que comprenden por ejemplo, maíz y trigo, el pienso puede comprender por lo menos 10% de maíz.

Además o como alternativa, un pienso de la presente invención puede comprender por lo menos un material de alimentación de alto contenido de fibra y/o por lo menos un subproducto de la por lo menos un material de alimentación de alto contenido de fibra para proporcionar un pienso alto en fibra. Ejemplos de las materias primas para piensos de alto contenido de fibra incluyen: trigo, cebada, centeno, avena, por productos de cereales, tales como maíz, harina de gluten, torta húmeda, destilados d grano seco (DDG), destilados de grano seco con solubles (DDGS), salvado de trigo, acemites de trigo, trigo quebrado, salvado de arroz, cáscaras de arroz, cáscaras de avena, nuez de palma y pulpa de cítricos. Algunas fuentes de proteínas también pueden ser consideradas como de alto contenido de fibra: la proteína obtenida de fuentes como el girasol, altramuces, habas y algodón.

En una modalidad, el alimento de la presente invención comprende por lo menos un material alto en fibra y/o por lo menos un subproducto de por lo menos un material de alimentación alto en fibra seleccionado del grupo que consiste en destilados de grano seco con solubles (DDGS) - en particular DDGS de maíz (cDDGS), torta húmeda, destilados de grano seco (DDG) - particularmente DDG de maíz (cDDG), salvado de trigo, y trigo, por ejemplo.

En una modalidad, el pienso de la presente invención comprende por lo menos un material alto en fibra y/o por lo menos un subproducto de por lo menos el material de alimentación alto en fibra seleccionado del grupo que consiste de destilados de grano seco solubles (DDGS) - en particular cDDGS, salvado de trigo, y trigo, por ejemplo.

En la presente invención, la alimentación puede ser uno o más de los siguientes: un compuesto de alimentación y premezcla, que incluyen pelotillas, frutos secos o torta (ganado); un cultivo o residuo de cultivo: maíz, soja, sorgo, avena, cebada, copra, paja, residuos de la remolacha azucarera; harina de pescado; de carne y huesos; melaza; torta de aceite y torta de prensa; oligosacáridos; plantas forrajeras conservadas: ensilaje; algas; semillas y granos, ya sea enteros o preparados por trituración, molienda, etc.; cereales y legumbres germinadas; extracto de levadura.

El término alimento en la presente invención también abarca algunas modalidades de alimentos para mascotas. Un alimento para mascotas es material vegetal o animal destinado para el consumo por las mascotas, tales como alimentos para perros o gatos. Los alimentos para mascotas, tales como alimentos para perros y gatos, pueden estar en una forma seca, tales como las croquetas para perros, o en la forma húmeda en lata. La comida para gatos puede contener el aminoácido taurina.

El término alimento en la presente invención también abarca las modalidades en algunos alimentos de pescado. Una comida de pescado contiene normalmente macro-nutrientes, elementos traza y vitaminas necesarias para mantener a los peces en cautiverio en buen estado de salud. La comida de pescado puede ser en la forma de una hojuela, pelotillas o tabletas. Las formas pelotillas, algunas de las cuales se hunden rápidamente, a menudo se usan para los peces más grandes o especies de alimentación del fondo. Algunos alimentos de peces también contienen aditivos, tales como beta caroteno o las hormonas sexuales, para mejorar artificialmente el color de peces ornamentales.

El término alimento en la presente invención también abarca, en alguna modalidad, los alimentos para aves. El alimento para aves también incluye alimentos que se usa tanto en alimentadores para aves y para alimentar a las aves de compañía. Típicamente, el alimento para aves también puede abarcar una variedad de semillas, pero también puede abarcar sebo (carne o grasa de cordero).

Como se usa en la presente, el término "contacto" se refiere a la aplicación directa o indirecta de la enzima (o composición que comprende la enzima) de la presente invención al producto (por ejemplo, el alimento). Ejemplos de los métodos de aplicación que se pueden usar, incluyen, pero no se limitan a, el tratamiento del producto en un material que comprende la composición de aditivo alimenticio, la aplicación directa mezclando la composición de aditivo alimenticio con el producto, la pulverización de la composición de aditivo alimenticio sobre la superficie del producto o inmersión del producto en una preparación de la composición de aditivo alimenticio.

En una modalidad, la composición de aditivo alimenticio de la presente invención se mezcla preferentemente con el producto (por ejemplo, pienso) . Alternativamente, la composición de aditivo alimenticio puede ser incluirse en la emulsión o ingredientes en bruto de un pienso.

Para algunas aplicaciones, es importante que la composición esté disponible en o a la superficie de un producto a ser afectada/tratada. Esto permite que la composición imparta una o más de las siguientes características favorables: beneficios de rendimiento.

La enzima (o composición que comprende la enzima) de la presente invención puede aplicarse para intercalar, recubrir e/o impregnar un producto (por ejemplo, piensos o ingredientes de un pienso) con una cantidad controlada de la enzima.

De manera conveniente, la composición de aditivo alimenticio puede administrarse simplemente al individuo al mismo tiempo que la alimentación del animal con un pienso.

De preferencia, la enzima (o composición que comprende la enzima) de la presente invención serán térmicamente estables al tratamiento térmico hasta aproximadamente 70°C; hasta aproximadamente 85°C; o hasta aproximadamente 95°C. El tratamiento térmico puede llevarse a cabo durante hasta aproximadamente 1 minuto; hasta aproximadamente 5 minutos; hasta aproximadamente 10 minutos; hasta aproximadamente 30 minutos; hasta aproximadamente 60 minutos. El término térmicamente estable significa que por lo menos aproximadamente 75% de la enzima que estaba presente/activa en el aditivo antes de calentar a la temperatura especificada está todavía presente/activo después se enfría a temperatura ambiente. De preferencia, por lo menos aproximadamente 80% de la enzima que está presente y activa en el aditivo antes de calentar a la temperatura especificada está aún presente y activa después de enfriarse a temperatura ambiente.

En una modalidad particularmente preferida, la enzima (o composición que comprende la enzima) de la presente invención se homogeneiza para producir un polvo.

En una modalidad preferida alternativa, la enzima (o composición que comprende la enzima) de la presente invención se formula en pelotillas como se describe en W02007/044968 (referidos como pelotillas TPT) incorporados en el presente por referencia.

En otra modalidad preferida, cuando la composición de aditivo alimenticio se formula en pelotillas, las pelotillas comprenden una sal de barrera hidratada recubierta sobre el núcleo de la proteína. La ventaja de tal recubrimiento de la sal es la termo-tolerancia mejorada, la estabilidad de almacenamiento mejorada y la protección contra otros aditivos para piensos, que tienen de otro modo un efecto adverso sobre la enzima.

De preferencia, la sal usada para el recubrimiento de sal tiene una actividad de agua mayor que 0.25 o humedad constante mayor que 60% a 20°C.

De preferencia, el recubrimiento comprende una sal de Na2SC>4.

El método de preparación de una enzima (o composición que comprende la enzima) de la presente invención también puede comprender la etapa adicional de pelotillar el polvo. El polvo puede ser mezclado con otros componentes conocidos en la téenica. El polvo, o de la mezcla que comprende el polvo, puede ser forzado a través de un troquel y las hebras resultantes se cortan en pelotillas adecuadas de longitud variable.

Opcionalmente, la etapa de pelotillar puede incluir un tratamiento con vapor, o una etapa de acondicionamiento, antes de la formación de las pelotillas. La mezcla que comprende el polvo puede colocarse en un acondicionador, por ejemplo, un mezclador con inyección de vapor. La mezcla se calienta en el acondicionador hasta una temperatura especificada, tal como 60-100°C, las temperaturas típicas serían de 70°C, 80°C, 85°C, 90°C ó 95°C. El tiempo de residencia puede ser variable desde segundos hasta minutos e incluso horas. Tal como 5 segundos, 10 segundos, 15 segundos, 30 segundos, 1 minuto, 2 minutos, 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 30 minutos y 1 hora.

Se entenderá que la enzima (o la composición que comprende la enzima) de la presente invención es adecuada para la adición a cualquier material de alimentación apropiado.

Se entenderá por la persona experimentada que los diferentes animales requieren diferentes piensos, e incluso el mismo animal puede requerir diferentes piensos, dependiendo del propósito para el cual se cría el animal.

Opcionalmente, el pienso también puede contener minerales adicionales, tales como, por ejemplo, calcio y/o vitaminas adicionales.

De preferencia, el pienso es una mezcla de harina de soja y maíz.

En una modalidad, de preferencia, el alimento no es alimento para mascotas.

En otro aspecto, se proporciona un método para producir un pienso. El pienso se produce típicamente en los molinos de alimentos, en el que las materias primas se trituran primero a un tamaño de partícula apropiado y luego se mezclan con los aditivos apropiados. El pienso después puede producirse como un puré o pelotillas; las últimas implican típicamente un método mediante el cual la temperatura se eleva a un nivel objetivo y luego el alimento se hace pasar a través de un troquel para producir pelotillas de un tamaño particular. Las pelotillas se dejan enfriar. Subsecuentemente, se pueden adicionar aditivos líquidos, tales como grasa y enzima. La producción de un pienso también puede implicar una etapa adicional que incluye la extrusión o expansión antes de pelotillar - en particular mediante téenicas adecuadas que pueden incluir por lo menos el uso de vapor.

El alimento puede ser un pienso para un animal monogástrico, tales como aves de corral (por ejemplo, pollos, gallina ponedora, pollos de engorde, pavos, patos, gansos, aves acuáticas), cerdos (todas las categorías de edad), un animal doméstico (por ejemplo, perros, gatos) o pescado, de preferencia el pienso es para aves de corral.

En una modalidad, el pienso no es para una gallina ponedora.

A modo de ejemplo, solamente un pienso para pollos, por ejemplo, los pollos de engorde puede comprender uno o más de los ingredientes enumerados en la siguiente tabla, por ejemplo en el % de edades indicadas en la tabla a continuación: A modo de ejemplo, solamente la descripción de la dieta de los pollos, tales como los pollos de engorde, puede ser establecida en la siguiente tabla : A modo de ejemplo, solamente un pienso de gallinas ponedoras puede comprender uno o más de los ingredientes enumerados en la siguiente tabla, por ej emplo en el % de edades indicadas en la siguiente tabla : A modo de ejemplo, solamente la descripción de la dieta las gallinas ponedoras puede establecerse en la siguiente Tabla A modo solamente de ejemplo, un pienso para pavos puede comprender uno o más de los ingredientes listados en la siguiente Tabla, por ejemplo, en el % de edades dado en la siguiente tabla: A manera de ejemplo, solamente la descripción de la dieta para pavos puede establecerse en la siguiente Tabla: A manera de ejemplo, solamente un pienso para cerditos, puede estar comprendido de uno o más de los ingredientes listados en la siguiente tabla, por ejemplo, en % de edades dados en la siguiente tabla: A manera de ejemplo, solamente la dieta de descripción para los cerditos puede establecerse en la siguiente Tabla: A manera de ejemplo, solamente un pienso para cerdos de crecimiento/finalizado, puede estar comprendido de uno o más de los ingredientes listados en la siguiente tabla, por ejemplo, en el % de edades dado en la siguiente tabla: A manera de ejemplo, solamente la dieta de descripción para los cerdos de crecimiento/finalizado puede establecerse en la siguiente Tabla: TORTA HÚMEDA, DESTILADOS DE GRANOS SECOS (PPG) Y DESTILADOS DE GRANOS SECOS SOLUBLES (DDGS) La torta húmeda, destilados de granos secos y destilados de granos secos con solubles son productos obtenidos después de la eliminación de alcohol etílico por destilación a partir de la fermentación de la levadura de un grano o una mezcla de granos por los métodos empleados en la industria de la destilación de granos.

Las flemas procedentes de la destilación (por ejemplo, que comprende agua, restos de grano, células de levadura, etc.) se separan en una parte "sólida" y una parte líquida.

La parte sólida se llama "torta húmeda" y puede usarse como alimento para animales como tal.

La parte líquida es (parcialmente) evaporada en un jarabe (solubles).

Cuando se seca la torta húmeda que es el destilados de granos secos (DDG).

Cuando la torta húmeda se seca junto con el jarabe (solubles) es el destilado de granos secos con solubles (DDGS).

La torta húmeda se puede usar en las operaciones de lácteos y engorde de ganado vacuno.

Los DDGS secos pueden usarse en el ganado, por ejemplo, productos lácteos, carne de res y alimentos para cerdos y alimentos para aves de corral.

El DDGS de maíz es una muy buena fuente de proteínas para las vacas lecheras.

HARINA DE GLUTEN DE MAÍZ En un aspecto, el subproducto de maíz puede ser harina de gluten de maíz (CGM).

La CGM es un subproducto en polvo de la industria de molienda de maíz. La CGM tiene utilidad en, por ejemplo, alimentación animal. Puede ser usada como una fuente de proteína de bajo costo para la alimentación, tales como alimentos para mascotas, alimento para ganado y aves de corral. Es una fuente especialmente buena del aminoácido cisteína, pero debe equilibrarse con otras proteínas de la lisina.

COMPOSICIÓN DE ADITIVO ALIMENTICIO La composición de aditivo alimenticio de la presente invención y/o el pienso que comprende el mismo se puede usar en cualquier forma adecuada.

La composición de aditivo alimenticio de la presente invención se puede usar en forma de preparaciones o alternativas sólidas o líquidas de los mismos. Los ejemplos de preparaciones sólidas incluyen polvos, pastas, bolos, cápsulas, pelotillas, comprimidos, polvos y pelotillas que pueden ser humectables, secarse por pulverización o liofilizarse. Ejemplos de las preparaciones líquidas incluyen, pero no se limitan a, soluciones suspensiones y emulsiones acuosas, orgánicas o acuoso-orgánicas.

En algunas aplicaciones, las composiciones de aditivos para piensos de la presente invención se pueden mezclar con el pienso o se administran en el agua para beber.

En un aspecto, la presente invención se relaciona con un método de preparación de una composición de aditivo alimenticio, que comprende mezclar una xilanasa, una b- glucanasa (y opcionalmente al menos otra enzima degradante de fibra) y un DFM tal como se muestra en la presente, con un vehículo de la alimentación, diluyente o excipiente, y (opcionalmente) de envasado aceptable.

PREMEZCLA El pienso y/o la composición de aditivo alimenticio puede ser combinado con al menos un mineral y/o al manos una vitamina. Las composiciones así derivadas pueden estar referidas en la presente como una premezcla.

FORMAS La composición de aditivo alimenticio de la presente invención y otros componentes y/o el pienso que comprende la misma puede usarse en cualquier forma adecuada.

La composición de aditivo alimenticio de la presente invención se puede usar en la forma de preparaciones o alternativas sólidas o líquidas de las mismas. Los ejemplos de preparaciones sólidas incluyen polvos, pastas, bolos, cápsulas, pelotillas, comprimidos, polvos y pelotillas que pueden ser humeetables, secados por pulverización o secados por congelación. Ejemplos de preparaciones líquidas incluyen, pero no se limitan a, soluciones, suspensiones y emulsiones acuosas, orgánicas o acuoso-orgánicas.

En algunas aplicaciones, DMF o las composiciones de aditivos alimenticios de la presente invención, se pueden mezclar con el pienso o administrarse en el agua para beber.

En una modalidad, el intervalo de dosificación para su inclusión en agua es de aproximadamente lxlO3 CFU/animal/día a aproximadamente lxlO10 CFU/animal/día, y más preferentemente de aproximadamente lxlO7 CFU/animal/día.

Los ejemplos adecuados de las formas incluyen uno o más de: polvos, pastas, bolos, pelotillas, comprimidos, píldoras, cápsulas, óvulos, soluciones o suspensiones, que pueden contener agentes saborizantes o colorantes, para las aplicaciones de liberación inmediata, retardada, modificada, prolongada, por pulsos o controlada.

A modo de ejemplo, si la composición de la presente invención se usa en un sólido, por ejemplo, forma pelotillada, también puede contener uno o más de: excipientes, tales como celulosa microcristalina, lactosa, citrato de sodio, carbonato de calcio, fosfato de calcio dibásico y glicina; desintegrantes, tales como almidón (de preferencia almidón de maíz, almidón de papa o tapioca), glicolato sódico de almidón, croscarmelosa de sodio y ciertos silicatos complejos; aglomerantes de pelotillar, tales como polivinilpirrolidona, hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC), hidroxipropilcelulosa (HPC), sacarosa, gelatina y acacia; agentes lubricantes, tales como estearato de magnesio, ácido esteárico, behenato de glicerilo y puede incluirse el talco.

Ejemplos de los vehículos nutrimentalmente aceptables para el uso en la preparación de las formas incluyen, por ejemplo, agua, soluciones salinas, alcohol, silicona, ceras, vaselina, aceites vegetales, polietilenglicoles, propilenglicol, liposomas, azúcares, gelatina, lactosa, amilosa, magnesio estearato, talco, surfactantes, ácido silícico, parafina viscosa, aceite de perfume, monoglicéridos y diglicéridos de ácidos grasos, ásteres de ácido graso de petroetral, hidroximetilcelulosa, polivinilpirrolidona, y similares.

Los excipientes preferidos para las formas incluyen lactosa, almidón, una celulosa, azúcar de leche o polietilenglicoles de alto peso molecular.

Para las suspensiones acuosas y/o elíxires, la composición de la presente invención se puede combinar con diversos agentes edulcorantes o aromatizantes, materiales colorantes o tintes, con agentes emulsionantes y/o agentes de suspensión y con diluyentes, tales como agua, propilenglicol y glicerina, y combinaciones de los mismos.

A menudo se usa suero no higroscópico como un vehículo para DFMs (particularmente DFMs bacterianos) y es un buen medio para iniciar el crecimiento.

Las pastas que contienen DFM bacteriano pueden formularse con aceite vegetal y los ingredientes inertes de gelificación.

Los productos de hongos se pueden formular con los subproductos de granos como vehículos.

De preferencia, en una modalidad la composición de aditivo alimenticio de acuerdo con la presente invención no está en la forma de un sistema de micropartículas, tales como el sistema de micropartículas mostrado en el documento W02005/123034.

DOSIFICACIÓN El DFM y/o la composición de aditivo alimenticio, de acuerdo con la presente invención, se pueden diseñar para la dosificación de una sola vez o pueden diseñarse para la alimentación sobre una base diaria.

La cantidad óptima de la composición (y cada componente en la misma) para ser usada en la combinación de la presente invención dependerá del producto a ser tratado y/o el método para poner en contacto el producto con la composición y/o el uso destinado para el mismo. La cantidad de DFM y las enzimas que se usa en las composiciones debe ser una cantidad suficiente para ser efectiva y para ser suficientemente efectiva para mejorar el rendimiento de los animales alimentados con los piensos que contienen tal composición. Esta duración de tiempo para la efectividad se debe extender hasta por lo menos el tiempo de uso del producto (por ejemplo, la composición de aditivo alimenticio o el alimento que contiene la misma).

COMBINACIÓN CON OTROS COMPONENTES El DFM y la enzima(s) para el uso en la presente invención se pueden usar en combinación con otros componentes. De esta manera, la presente invención también se relaciona con combinaciones. El DFM en combinación con la xilanasa y una b-glucanasa (y opcionalmente, por lo menos una enzima de degradación de fibra adicional) puede ser denominado en la presente como "la composición de aditivo alimenticio de la presente invención".

En una modalidad preferida "la composición de aditivo alimenticio de la presente invención" puede comprender (o consistir esencialmente de, o consistir de) DFM en combinación con la xilanasa y una b-glucanasa y otra enzima degradante de fibra, tal como se muestra en la presente (por ejemplo, convenientemente por lo menos dos, convenientemente por lo menos tres nuevas enzimas que degradan la fibra).

En una modalidad preferida adicional "la composición de aditivo alimenticio de la presente invención" puede comprender (o consistir esencialmente de, o consistir de) DFM en combinación con la xilanasa y una b-glucanasa y otra enzima degradante de fibra, tal como se muestra en la presente (por ejemplo, convenientemente por lo menos cuatro, convenientemente por lo menos cinco enzimas adicionales de fibra degradantes).

La combinación de la presente invención comprende la composición de aditivo alimenticio de la presente invención (o uno o más de los constituyentes de los mismos) y otro componente que es adecuado para el consumo animal y es capaz de proporcionar un beneficio médico o fisiológico para el consumidor.

De preferencia, en una modalidad el "otro componente" no es una enzima adicional o un DFM adicional.

Los componentes pueden ser prebióticos. Los prebióticos son carbohidratos normalmente no digeribles (oligo- o polisacáridos) o un alcohol de azúcar que no se degrada o se absorbe en el tracto digestivo superior. Los prebióticos conocidos usados en los productos comerciales y útiles de acuerdo con la presente invención incluyen la inulina (fructo-oligosacárido o FOS) y transgalacto-oligosacáridos (GOS o TOS). Los prebióticos adecuados incluyen palatinoseoligosacárido, oligosacárido de soja, alginato, xantana, pectina, goma de algarroba (LBG), inulina, goma guar, galacto-oligosacáridos (GOS), fructo-oligosacárido (FOS), almidón no degradable, lactosacarosa, lactulosa, lactitol, maltitol, maltodextrina, polidextrosa (es decir Litesse®), lactitol, lactosacarosa, oligosacáridos de soja, palatinosa, isomalto-oligosacáridos, gluco-oligosacáridos y xilo-oligosacáridos.

En una modalidad, la presente invención se relaciona con la combinación de la composición de aditivo alimenticio, de acuerdo con la presente invención (o uno o más de los constituyentes del mismo) con un prebiótico. En otra modalidad, la presente invención se relaciona con una composición de aditivo alimenticio que comprende (o consiste esencialmente de, o que consiste de) un DFM en combinación con una xilanasa, una b-glucanasa, una fitasa, una proteasa y un prebiótico.

El prebiótico puede administrarse simultáneamente con (por ejemplo, en mezcla junto con o liberarse simultáneamente por la misma o diferentes rutas) o secuencialmente a (por ejemplo, por las mismas o diferentes rutas) la composición de aditivo alimenticio (o componentes de los mismos) de acuerdo con la presente invención.

Otros componentes de las combinaciones de la presente invención incluyen polidextrosa, tal como Litesse®, y/o una maltodextrina y/o lactitol. Estos otros componentes pueden adicionarse opcionalmente a la composición de aditivo alimenticio para ayudar al proceso de secado y ayudar a la supervivencia de DFM.

Otros ejemplos de otros componentes adecuados incluyen uno o más de: espesadores, gelificantes, emulsificantes, aglomerantes, modificadores de cristalización, edulcorantes (incluyendo edulcorantes artificiales), modificadores de la reología, estabilizadores, antioxidantes, colorantes, enzimas, portadores, vehículos, excipientes, diluyentes, agentes lubricantes, agentes saborizantes, materia colorante, agentes de suspensión, desintegrantes, aglomerantes de pelotillar, etc. Estos otros componentes pueden ser naturales. Estos otros componentes se pueden preparar mediante el uso de productos químicos y/o téenicas enzimáticas.

En una modalidad, el DMF y/o enzimas pueden encapsularse. En una modalidad, la composición de aditivo alimenticio y/o el DMF y/o enzimas se formulan como un polvo seco o pelotilla, como se describe en W02007/044968 (referido como pelotillas de TPT) - incorporada en la presente por referencia.

En una modalidad preferida, el DFM y/o enzimas para el uso en la presente invención se pueden usar en combinación con uno o más lípidos.

Por ejemplo, el DFM y/o enzimas para el uso en la presente invención se pueden usar en combinación con uno o más micelas lipídicas. La micela lipídica puede ser una micela lipídica simple o un complejo de micelas de lípidos.

La micela de lípidos puede ser un agregado de moléculas orientadas de sustancias antipáticas, tales como un lípido y/o un aceite.

Como se usa en la presente, el término "agente espesador o gelificante" se refiere a un producto que evita la separación disminuyendo o evitando el movimiento de partículas, o bien gotitas de líquidos inmiscibles, aire o sólidos insolubles. El espesamiento se produce cuando las moléculas hidratadas individuales causan un aumento en la viscosidad, disminuyendo la separación. La gelificación se produce cuando las moléculas hidratadas se enlazan para formar una red tridimensional que atrapa las partículas, inmovilizándolas de esta manera.

El término "estabilizador", como se usa en la presente, se define como un ingrediente o combinación de ingredientes que mantiene que un producto (por ejemplo, un producto de alimentación) cambie con el tiempo.

El término "emulsificante", como se usa en la presente, se refiere a un ingrediente (por ejemplo, un ingrediente alimenticio) que impide la separación de emulsiones. Las emulsiones son dos sustancias inmiscibles, una presente en la forma de gotas, contenidas dentro de la otra. Las emulsiones pueden consistir de agua en aceite, en donde la gota o la fase dispersa es el aceite y la fase continua es el agua; o agua en aceite, en donde el agua se convierte en la fase dispersa y la fase continua es el aceite. Las espumas, que son suspensiones de gas en líquido, las cuales son sólidos en líquidos, también pueden estabilizarse mediante el uso de emulsificantes.

Tal como se usa en la presente, el término "aglomerante" se refiere a un ingrediente (por ejemplo, un ingrediente de alimentación) que se une al producto a través de una reacción física o química. Durante la "gelificación", por ejemplo, se absorbe agua, proporcionando un efecto aglomerante. Sin embargo, los aglomerantes pueden absorber otros líquidos, tales como aceites, manteniéndolos dentro del producto. En el contexto de los aglomerantes de la presente invención, normalmente se usarían en productos sólidos o de bajo contenido de humedad, por ejemplo, productos de repostería pasteles, rosquillas, pan y otros.

Los "portadores" o "vehículos" significan materiales adecuados para la administración del DFM y/o enzimas e incluyen cualquier material conocido en la téenica, tales como, por ejemplo, cualquier líquido, gel, disolvente, diluyente líquido, solubilizante, o similares, que no es tóxico y que no interactúa con cualquiera de los componentes de la composición de una manera perjudicial.

En una modalidad, la composición de aditivo alimenticio, premezcla, alimento o pienso de la presente invención puede mezclarse con por lo menos un vehículo fisiológicamente aceptable seleccionado de por lo menos uno de maltodextrina, piedra caliza (carbonato de calcio), ciclodextrina, trigo o de un componente de trigo, sacarosa, almidón, Na2SC>4, talco, PVA, sorbitol, benzoato, sorbiato, glicerol, sacarosa, propilenglicol, 1,3-propandiol, glucosa, parabenos, cloruro de sodio, citrato, acetato, fosfato, calcio, metabisulfito, formato y mezclas de los mismos.

Ejemplos de los excipientes incluyen uno o más de: celulosa microcristalina y otras celulosas, lactosa, citrato de sodio, carbonato de calcio, fosfato de calcio dibásico, glicina, almidón, azúcar de leche y polietilenglicoles de alto peso molecular.

Ejemplos de los desintegrantes incluyen uno o más de: almidón (preferiblemente almidón de maíz, almidón de papa o tapioca), glicolato sódico de almidón, croscarmelosa de sodio y ciertos silicatos complejos. Ejemplos de los aglomerantes de pelotillar incluyen uno o más de: polivinilpirrolidona, hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC), hidroxipropilcelulosa (HPC), sacarosa, maltosa, gelatina y acacia.

Ejemplos de agentes lubricantes incluyen uno o más de: estearato de magnesio, ácido esteárico, behenato de glicerilo y talco.

Ejemplos de los diluyentes incluyen uno o más de: agua, etanol, propilenglicol y glicerina, y combinaciones de los mismos.

Los otros componentes pueden usarse simultáneamente (por ejemplo, cuando están en mezcla entre sí o incluso cuando se liberan por diferentes rutas) o secuencialmente (por ejemplo, pueden liberarse por diferentes rutas).

De preferencia, cuando la composición de aditivo alimenticio de la presente invención se mezcla con otro componente (s), el DFM sigue siendo viable.

En una modalidad, de preferencia, la composición de aditivo alimenticio de acuerdo con la presente invención no comprende cromo o cromo orgánico.

CONCENTRADOS Los DFMs para uso en la presente invención pueden estar en forma de concentrados. Típicamente, estos concentrados comprenden una concentración sustancialmente alta de un DFM.

Las composiciones de aditivo alimenticio de acuerdo con la presente invención pueden tener un contenido de células viables (unidades formadoras de colonias, CFU) que está en el intervalo de por lo menos 104 CFU/g (de forma adecuada incluyendo por lo menos 105 CFU/g, tal como por lo menos 106 CFU/g, por ejemplo, por lo menos 107 CFU/g, por lo menos 10® CFU/g, tal como por lo menos 109 CFU/g) a aproximadamente 1010 CFU/g (o incluso aproximadamente 1011 CFU/g o aproximadamente 1012 CFU/g).

Cuando el DFM está en la forma de un concentrado de las composiciones de aditivo alimenticio, de acuerdo con la presente invención, puede tener un contenido de células viables en el intervalo de por lo menos 109 CFU/g a aproximadamente 1012 CFU/g, preferiblemente de por lo menos 1010 CFU/g a aproximadamente 1012 CFU/g.

Los polvos, pelotillas y las composiciones líquidas en forma de concentrados pueden diluirse con agua o resuspenderse en agua u otros diluyentes adecuados, por ejemplo, un medio de crecimiento apropiado, tal como leche o aceites minerales o vegetales, para dar composiciones listas para su uso.

El DFM o la composición de aditivo alimenticio de la presente invención o las combinaciones de la presente invención en forma de concentrados, se pueden preparar de acuerdo con métodos conocidos en la téenica.

En un aspecto de la presente invención, las enzimas o la alimentación se pone en contacto con una composición en una forma concentrada.

Las composiciones de la presente invención pueden secarse por atomización o liofilizarse por los métodos conocidos en la técnica.

Los procesos típicos para la fabricación de partículas que usan un proceso de secado por atomización implican un material sólido que se disuelve en un disolvente apropiado (por ejemplo, un cultivo de un DFM en un medio de fermentación). Alternativamente, el material puede ser suspendido o emulsionado en un no solvente para formar una suspensión o emulsión. Otros ingredientes (como se discutió anteriormente) o componentes, tales como agentes antimicrobianos, agentes estabilizadores, colorantes y agentes que ayudan en el proceso de secado se pueden adicionar opcionalmente en esta etapa.

La solución después se atomiza para formar una niebla fina de gotitas. Las gotas entran inmediatamente una cámara de secado donde contactan un gas de secado. El disolvente se evaporó de las gotitas en el gas de secado para solidificar las gotas, formando así partículas. Las partículas se separan después del gas de secado y se colectan.

INDIVIDUO El término "individuo", como se usa en la presente, significa un animal que va a ser o se ha administrado con una composición de aditivo alimenticio de acuerdo con la presente invención, o un pienso que comprende tal composición de aditivo alimenticio de acuerdo con la presente invención.

El término "individuo", como se usa en la presente, significa un animal. De preferencia, el individuo es un mamífero, ave, pescado o crustáceos, que incluyen, por ejemplo, el ganado o un animal domesticado (por ejemplo, un animal de compañía).

En una modalidad, el "individuo" es ganado.

El término "ganado", como se usa en la presente, se refiere a cualquier animal de granja. De preferencia, el ganado es uno o más de vacas o toros (incluyendo terneros), aves de corral, cerdos (incluyendo cerditos), aves de corral (que incluyen, pollos de engorde, pollos y pavos), aves, peces (que incluyen peces de agua dulce, tales como salmón, bacalao, trucha y carpa, por ejemplo, la carpa koi, peces marinos, como el róbalo), crustáceos (tales como camarones, mejillones y vieiras), caballos (que incluyen los caballos de carreras), ovejas (incluyendo corderos). En otra modalidad, el término ganado y/o aves de corral y/o pollos no incluye gallinas ponedoras.

En otra modalidad, el "individuo" es un animal domesticado o una mascota o animal mantenido en un ambiente zoológico.

El término "animal domesticado o una mascota o animal mantenido en un ambiente zoológico", tal como se usa en la presente, se refiere a cualquier animal correspondiente, que incluye los caninos (por ejemplo, perros), felinos (por ejemplo, gatos), roedores (por ejemplo, cobayos, ratas, ratones), aves, peces (incluidos los peces de agua dulce y peces marinos), y los caballos.

PRODUCCIÓN DE ÁCIDOS GRASOS DE CADENA CORTA (SCFA) El término "ácido graso de cadena corta", tal como se usa en la presente, incluye los ácidos grasos volátiles, así como el ácido láctico. En una modalidad, el SCFA puede seleccionarse del grupo que consiste de: ácido acético, ácido propiónico, ácido butírico, ácido isobutírico, ácido valérico, ácido isovalérico, ácidos 2-metilbutírico y el ácido láctico, de preferencia el ácido propiónico y/o el ácido butírico.

En una modalidad, el SCFA puede ser ácido butírico y/o ácido propiónico.

Los ácidos grasos de cadena corta (en particular, ácidos grasos volátiles, por ejemplo, ácido propiónico y ácido butírico, y ácido láctico) pueden ser analizados usando el siguiente método: El análisis cromatográfico de ácidos grasos volátiles y el ácido láctico, por ejemplo SCFAs, que se realizará a partir de muestras de simulación con ácido piválico como estándar interno, como se describió anteriormente (Ouwehand et al, febrero de 2009; 101(3): 367-75). Se determinan las concentraciones de los ácidos acético, propiónico, butírico, isobutírico, valérico, isovalérico, ácidos 2-metilbutírico, y el ácido láctico.

RENDIMIENTO Como se usa en la presente, "rendimiento de los animales" puede determinarse por la eficiencia de la alimentación y/o la ganancia de peso del animal y/o por la tasa de conversión alimenticia y/o por la digestibilidad de un nutriente en un alimento (por ejemplo, la digestibilidad de aminoácidos) y/o la energía digerible o la energía metabolizable en un alimento y/o por la retención de nitrógeno.

De preferencia, "rendimiento del animal" está determinado por la eficiencia de alimentación y/o la ganancia de peso del animal y/o por la tasa de conversión alimenticia.

Por "rendimiento mejorado del animal" se entiende que se aumentó la eficiencia de alimentación, y/o la ganancia de peso y/o se redujo la tasa de conversión alimenticia y/o se mejora la digestibilidad de los nutrientes o la energía en un alimento y/o por el mejoramiento de la retención de nitrógeno que resulta del uso de la composición de aditivo alimenticio de la presente invención en el alimento, en comparación con el alimento que no comprende tal composición de aditivo alimenticio.

De preferencia, por "rendimiento mejorado del animal" se entiende que hay un aumento de eficiencia de la alimentación y/o aumento de la ganancia de peso y/o la tasa de conversión alimenticia reducida.

Como se usa en la presente, el término "eficiencia de la alimentación" se refiere a la cantidad de ganancia de peso en un animal que se produce cuando el animal se alimenta ad libitum o una cantidad especificada de alimento durante un periodo de tiempo.

Por "aumento de la eficiencia de la alimentación" se entiende que el uso de una composición de aditivo alimenticio, de acuerdo con la presente invención, en los resultados de los piensos en un mayor aumento de ganancia de peso por unidad de consumo de alimento en comparación con un animal alimentado sin estar presente tal composición de aditivo alimenticio.

TASA DE CONVERSIÓN ALIMENTICIA (FCR) Como se usa en la presente, el término "tasa de conversión alimenticia" se refiere a la cantidad de alimentos suministrados a un animal para aumentar el peso del animal en una cantidad especificada.

Una tasa de conversión mejorada significa una tasa de conversión inferior.

Por "tasa de conversión alimenticia inferior" o "tasa de conversión alimenticia mejorada" se entiende que el uso de una composición de aditivo alimenticio en la alimentación resulta en una menor cantidad de alimentación que se requiere para ser alimentado a un animal para aumentar el peso del animal por una cantidad especificada, en comparación con la cantidad de alimento necesaria para aumentar el peso del animal en la misma cantidad cuando la alimentación no comprende tal composición de aditivo alimenticio. DIGESTIBILIDAD DE NUTRIENTES La digestibilidad de nutrientes, como se usa en la presente, significa la fracción de un nutriente que desaparece en el tracto gastrointestinal o un segmento especificado del tracto gastrointestinal, por ejemplo, el intestino delgado. La digestibilidad de nutrientes se puede medir como la diferencia entre lo que se administra al individuo y lo que sale en las heces del individuo, o entre lo que se administra al individuo y lo que permanece en la digesta en un segmento determinado del tracto gastrointestinal, por ejemplo, el íleo.

La digestibilidad de nutrientes, como se usa en la presente, puede ser medida por la diferencia entre la ingesta de un nutriente y el nutriente excretado por medio de la colección total de los excrementos durante un período de tiempo; o con el uso de un marcador inerte que no es absorbido por el animal, y permite al investigador calcular la cantidad de nutriente que desapareció en todo el tracto gastrointestinal o un segmento del tracto gastrointestinal. Tal marcador inerte puede ser dióxido de titanio, óxido crómico o ceniza insoluble en ácido. La digestibilidad se puede expresar como un porcentaje del nutriente en el alimento, o como unidades de masa de nutrientes digestibles por unidades de masa de nutrientes en la alimentación.

La digestibilidad de nutrientes, como se usa en la presente, abarca la digestibilidad del almidón, la digestibilidad de grasa, la digestibilidad de la proteína y la digestibilidad de aminoácidos.

La digestibilidad de la energía, como se usa en la presente, significa la energía bruta del pienso consumido menos la energía bruta de las heces o la energía bruta del pienso consumido menos la energía bruta de la digesta restante en un segmento determinado del tracto gastrointestinal del animal, por ejemplo, el íleo. La energía metabolizable, como se usa en la presente, se refiere a la energía metabolizable aparente y significa la energía bruta del pienso consumida menos la energía bruta contenida en las heces, la orina y los productos gaseosos de la digestión. Digestibilidad de la energía y la energía metabolizable se pueden medir como la diferencia entre la ingesta de energía bruta y la energía bruta excretada en las heces o la presente digesta en un segmento especificado del tracto gastrointestinal, usando los mismos métodos para medir la digestibilidad de los nutrientes, con correcciones apropiadas para la excreción de nitrógeno para el cálculo de la energía metabolizable del alimento.

RETENCIÓN DE NITRÓGENO La retención de nitrógeno, como se usa en la presente, significa como la capacidad del individuo para retener el nitrógeno de la dieta como la masa corporal. Un balance negativo de nitrógeno se produce cuando la excreción de nitrógeno supera la ingesta diaria y, a menudo se ve cuando se está perdiendo el músculo. Un balance positivo de nitrógeno se asocia a menudo con el crecimiento muscular, sobre todo en animales en crecimiento.

La retención de nitrógeno se puede medir como la diferencia entre la ingesta de nitrógeno y el nitrógeno excretado por medio de la colección total de los excrementos y orina durante un período de tiempo. Se entiende que el nitrógeno excretado incluye la proteína no digerida de la alimentación, las secreciones proteicas endógenas, proteína microbiana, y el nitrógeno urinario.

RENDIMIENTO DEL ESQUELETO Y CARNE El rendimiento del esqueleto, tal como se usa en la presente, significa la cantidad del esqueleto como proporción del peso vivo, después de un proceso comercial o experimental de la matanza. El término esqueleto significa el cuerpo de un animal que ha sido sacrificado para alimento, con la cabeza, visceras, parte de las extremidades, y las plumas o piel retirada. El término rendimiento de la carne, tal como se usa en la presente, significa la cantidad de carne comestible como proporción del peso vivo, o la cantidad de una carne especificada cortada como proporción del peso vivo.

GANANCIA DE PESO La presente invención además proporciona un método para aumentar la ganancia de peso en un individuo, por ejemplo, aves de corral o cerdos, que comprende alimentar al individuo un alimento que comprende una composición de aditivo alimenticio de acuerdo con la presente invención.

Un "aumento de la ganancia de peso" se refiere a un animal que tiene el aumento de peso corporal en el que se alimenta con el alimento que comprende una composición de aditivo alimenticio, en comparación con un animal que se alimenta con una alimentación de composición de aditivo alimenticio que está presente.

OTRAS PROPIEDADES En una modalidad, la composición de aditivo alimenticio, alimento, pienso o método de acuerdo con la presente invención pueden no modular (por ejemplo, mejorar) la respuesta inmune del individuo. En una modalidad adicional, la composición de aditivo alimenticio, alimento, pienso o método de acuerdo con la presente invención pueden no mejorar la supervivencia (por ejemplo, reducir la mortalidad) del individuo.

En una modalidad preferida, la composición de aditivo alimenticio, alimento, pienso o método de acuerdo con la presente invención, pueden no modular (por ejemplo, mejorar) la respuesta inmune o mejorar la supervivencia (por ejemplo, reducir la mortalidad) del individuo.

PROBIÓTICO Para algunas aplicaciones, se cree que el DFM en la composición de la presente invención puede ejercer un efecto de cultivo probiótico. También está dentro del alcance de la presente invención añadir a la composición de la presente invención probióticos y/o prebióticos adicionales.

En la presente, un prebiótico es: "Un ingrediente alimentario no digerible que afecta benéficamente al hospedero estimulando selectivamente el crecimiento y/o la actividad de una o un número limitado de bacterias benéficas .

El término "cultivo probiótico" como se usa en la presente, define microorganismos vivos (tales como bacterias o levaduras, por ejemplo) que, cuando, por ejemplo, se ingiere o se aplica localmente en números suficientes, afecta beneficiosamente al organismo hospedero, es decir, al conferir uno o más beneficios para la salud demostrables en el organismo hospedero. Los probióticos pueden mejorar el equilibrio microbiano en una o más superficies de la mucosa. Por ejemplo, la superficie de la mucosa puede ser el intestino grueso, el tracto urinario, el tracto respiratorio o la piel. Si bien no hay límites inferiores o superiores para la ingesta de probióticos, se ha sugerido que por lo menos 106-1012, de preferencia, por lo menos 106-1010, de preferencia 108-109, cfu como una dosis diaria, será eficaz para conseguir los efectos beneficiosos para la salud en un individuo.

AISLADO En un aspecto, de preferencia, la enzima usada en la presente invención, está en una forma aislada. El término "aislado" significa que la enzima está por lo menos sustancialmente libre de por lo menos otro componente con el que la enzima se asocia de forma natural en la naturaleza y como se encuentra en la naturaleza. La enzima de la presente invención se puede proporcionar en una forma que está sustancialmente libre de uno o más contaminantes, con los que la sustancia de otro modo podría estar asociada. Así, por ejemplo, puede ser sustancialmente libre de uno o más polipéptidos potencialmente contaminantes y/o moléculas de ácidos nucleicos.

PURIFICADO En un aspecto, de preferencia, la enzima y/o DFM de acuerdo con la presente invención, está en una forma purificada. El término "purificado" significa que la enzima y/o DFM está presente a un nivel alto. La enzima y/o DFM es deseablemente el componente predominante presente en una composición. De preferencia, está presente a un nivel de por lo menos aproximadamente 90%, o por lo menos aproximadamente 95% o por lo menos aproximadamente 98%, siendo tal nivel determinado sobre una base de peso seco/peso seco con respecto a la composición total bajo consideración.

Se visualiza dentro del alcance de la presente invención, que las modalidades de la invención se pueden combinar de tal manera que las combinaciones de cualquiera de las funciones descritas en el presente documento se incluyen dentro del alcance de la presente invención. En particular, se visualiza dentro del alcance de la presente invención, que cualquiera de los efectos terapéuticos de las bacterias puede ser exhibido de forma concomitante.

SECUENCIAS DE AMINOÁCIDOS El alcance de la presente invención también abarca las secuencias de aminoácidos de enzimas que tienen las propiedades específicas como se define en la presente.

Como se usa en la presente, el término "secuencia de aminoácidos" es sinónimo del término "polipéptido" y/o el término "proteína". En algunos casos, el término "secuencia de aminoácidos" es sinónimo con el término "péptido". En algunos casos, el término "secuencia de aminoácidos" es sinónimo con el término "enzima".

La secuencia de aminoácidos puede prepararse/aislarse de una fuente adecuada, o puede elaborarse sintéticamente o puede prepararse mediante el uso de téenicas de ADN recombinantes.

De preferencia, la secuencia de aminoácidos cuando se relaciona con, y cuando se abarca por el alcance per se de la presente invención, no es una enzima nativa. En este sentido, el término "enzima nativa" significa una enzima entera que está en su ambiente nativo y cuando se ha expresado por su secuencia nucleotídica nativa.

IDENTIDAD DE SECUENCIA U HOMOLOGÍA DE SECUENCIA La presente invención también abarca el uso de secuencias que tienen un grado de identidad de secuencia u homología de secuencia con la secuencia(s) de aminoácidos de un polipéptido que tiene las propiedades específicas definidas en la presente o de cualquier secuencia nucleotídica que codifica tal polipéptido (en lo sucesivo referido como una "secuencia(s) homologa")· En la presente, el término "homólogo" significa una entidad que tiene una cierta homología con las secuencias de aminoácidos objetivo y las secuencias nucleotídicas objetivo. En la presente, el término "homología" puede ser equiparado con "identidad".

La secuencia de aminoácidos homologa y/o la secuencia nucleotídica deben proporcionar y/o codificar un polipéptido que conserva la actividad funcional y/o aumenta la actividad de la enzima.

El término "secuencia nucleotídica" con relación a la presente invención, incluye ADN genómico, ADNc, ADN sintético y ARN. De preferencia, significa ADN, más preferentemente secuencia de ADNc que codifica la presente invención.

En el presente contexto, en algunas modalidades, se toma una secuencia homologa para incluir un aminoácido o una secuencia nucleotídica que puede ser por lo menos 97% idéntica, de preferencia por lo menos 98 ó 99% idéntica a la secuencia objetivo.

En algunas modalidades, se toma una secuencia homologa para incluir un aminoácido o una secuencia nucleotídica que puede ser por lo menos 85% idéntica, de preferencia por lo menos 90 ó 95% idéntica a la secuencia objetivo.

Típicamente, los homólogos comprenderán los mismos sitios activos, etc., que, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos objetivo. Aunque la homología también puede considerarse en términos de similitud (es decir, residuos de aminoácidos que tienen propiedades/funciones químicas similares), en el contexto de la presente invención se prefiere expresar la homología en términos de la identidad de secuencia.

En una modalidad, se toma una secuencia homologa para incluir una secuencia de aminoácidos o secuencia nucleotídica que tiene una o varias adiciones, eliminaciones y/o sustituciones en comparación con la secuencia objetivo.

En una modalidad, la presente invención se relaciona con una proteína cuya secuencia de aminoácidos está representada en la presente o una proteína derivada de esta (padre) de proteína por sustitución, eliminación o adición de uno o varios aminoácidos, tales como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 aminoácidos, o más aminoácidos, tales como 10 o más de 10 aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de la proteína padre y que tienen la actividad de la proteína padre.

Típicamente, los homólogos comprenderán las mismas secuencias que codifican los sitios activos, etc., como la secuencia objetivo. Aunque la homología también puede considerarse en términos de similitud (es decir, residuos de aminoácidos que tienen propiedades/funciones químicas similares), en el contexto de la presente invención se prefiere expresar la homología en términos de la identidad de secuencia.

Las comparaciones de homología pueden llevarse a cabo a simple vista, o más habitualmente, con la ayuda de programas de comparación de secuencias fácilmente disponibles. Estos programas de computadora comercialmente disponibles pueden calcular el % de homología entre dos o más secuencias.

El % de homología puede calcularse en secuencias contiguas, es decir, una secuencia se alinea con la otra secuencia y cada aminoácido en una secuencia se compara directamente con el aminoácido correspondiente en la otra secuencia, un residuo a la vez. Esto se llama una alineación "sin huecos". Típicamente, tales alineaciones sin huecos se realizan sólo sobre un número relativamente corto de residuos.

Aunque este es un método muy simple y consistente, no toma en consideración que, por ejemplo, en un par por lo demás idéntico de secuencias, una inserción o eliminación provocará que los siguientes residuos de aminoácidos sean puestos fuera de la alineación, por lo tanto, resultando potencialmente en una gran reducción en el % de homología cuando se realiza una alineación global. En consecuencia, la mayoría de métodos de comparación de secuencias se diseñan para producir alineaciones óptimas que tengan en consideración las posibles inserciones y eliminaciones sin penalizar indebidamente la puntuación de la homología global. Esto se logra insertando "huecos" en el alineamiento de secuencia para tratar de maximizar la homología local.

Sin embargo, estos métodos más complejos asignan "penalizaciones por hueco" a cada hueco que se produce en la alineación de modo que, para el mismo número de aminoácidos idénticos, una alineación de secuencia con tan pocos huecos como sea posible - que reflejan una mayor relatividad entre las dos secuencias comparadas - logrará una puntuación más alta que una con muchos huecos. "Costos de hueco afines" se suele usar para cargar un costo relativamente alto de la existencia de un hueco y una penalización más pequeña para cada residuo posterior en el hueco. Este es el sistema de puntuación de huecos usado más comúnmente. Por supuesto, altas penalizaciones por hueco producirán alineaciones optimizadas con menos huecos. La mayoría de los programas de alineación permiten que las penalizaciones por hueco sean modificadas. Sin embargo, se prefiere usar los valores por defecto cuando se usa tales elementos de programación (software) para las comparaciones de secuencias.

Por lo tanto, el cálculo del % máximo de homología, requiere en primer lugar la producción de una alineación óptima, teniendo en consideración las penalizaciones por hueco. Un programa de computadora adecuado para llevar a cabo tal alineación es el Vector NTI (Invitrogen Corp.). Ejemplos de los elementos de programación (software) que pueden realizar comparaciones de secuencias incluyen, pero no se limitan a, el paquete BLAST (ver Ausubel et al., 1999 Short Protocols in Molecular Biology, cuarta Edición - Capítulo 18), BLAST 2 (ver FEMS Microbiol Lett 1999 174(2): 247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 177(1): 187-8 y tatiana@ncbi.nlm.nih.gov), FASTA (Altschul et al., 1990 J. Mol. Biol.403-410) y AlignX por ejemplo. Por lo menos BLAST, BLAST 2 y FASTA están disponibles para la búsqueda en línea y fuera de línea (ver Ausubel et al., 1999, páginas 7-58 a 7-60).

Aunque el % de homología final puede medirse en términos de identidad, el propio procedimiento de alineación no se basa típicamente en una comparación del par todo o nada. En vez de esto, en general, se usa una matriz de puntuación de similitud a escala, que asigna puntuaciones a cada comparación por parejas basándose en la similitud química o la distancia evolutiva. Un ejemplo de tal matriz usada comúnmente es la matriz BLOSUM62 - la matriz por defecto para el conjunto de programas BLAST. En general, los programas Vector NTI suelen usar cualquiera de los valores por defecto públicos o una tabla de comparación de símbolos personalizada si es suministrado (consulte el manual del usuario para más detalles adicionales). Para algunas aplicaciones, se prefiere usar los valores por defecto para el paquete Vector NTI.

Alternativamente, las homologías porcentuales pueden calcularse usando la función de alineación múltiple en Vector NTI (Invitrogen Corp.), basado en un algoritmo, análogo a CLUSTAL (Higgins DG & Sharp PM (1988), Gene 73 (1), 237-244).

Una vez que los elementos de programación (software) han producido una alineación óptima, es posible calcular el % de homología, de preferencia el % de identidad de secuencia. Los elementos de programación (software) hacen normalmente esto como parte de la comparación de secuencias y generan un resultado numerico.

Deben usarse penalidades de hueco cuando se determina la identidad de secuencia, entonces, de preferencia, los siguientes parámetros se usan para la alineación de pares: En una modalidad, CLUSTAL puede usarse con la penalización de hueco y la extensión del hueco configurada como se ha definido anteriormente.

Convenientemente, el grado de identidad con respecto a una secuencia de aminoácidos se determina sobre por lo menos 20 residuos de aminoácidos contiguos, de preferencia, sobre por lo menos 30 residuos contiguos, de preferencia sobre por lo menos 40 residuos contiguos, de preferencia sobre por lo menos 50 residuos contiguos, de preferencia sobre por lo menos 60 residuos contiguos, preferentemente sobre por lo menos 100 residuos contiguos.

Convenientemente, el grado de identidad con respecto a la secuencia de aminoácidos puede determinarse sobre toda la secuencia mostrada en la presente.

Las secuencias también pueden tener eliminaciones, inserciones o sustituciones de residuos de aminoácidos que producen un cambio silencioso y resultan en una sustancia funcionalmente equivalente. Las sustituciones de aminoácidos deliberadas pueden realizarse sobre la base de similitud de polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o la naturaleza anfipática de los residuos siempre que se retenga la actividad de unión secundaria de la sustancia. Por ejemplo, con carga negativa aminoácidos incluyen ácido aspártico y ácido glutámico; los aminoácidos cargados positivamente incluyen lisina y arginina; y los aminoácidos con grupos de cabeza polares no cargados que tienen valores de hidrofilicidad similares incluyen leucina, isoleucina, valina, glicina, alanina, asparagina, glutamina, serina, treonina, fenilalanina y tirosina.

Las sustituciones conservadoras se pueden hacer, por ejemplo de acuerdo con la siguiente Tabla. Los aminoácidos en el mismo bloque en la segunda columna y de preferencia, en la misma línea en la tercera columna pueden sustituirse entre sí: La presente invención también abarca la sustitución homologa (sustitución y reemplazamiento se usan ambos en la presente para representar el intercambio de un residuo de aminoácido existente con un residuo alternativo) que se puede presentar, es decir, sustitución similar por similar, tal como la sustitución básico por básico, ácido por ácido, polar por polar, etc. La sustitución no homologa también se puede presentar, es decir, de una clase de residuo a otro o que involuere alternativamente la inclusión de aminoácidos no naturales, tales como ornitina (en lo sucesivo, Z), ornitina de ácido diaminobut írico (en lo sucesivo referida como B), ornitina de norleucina (en lo sucesivo denominado O), pirilalanina, tienilalanina, naf tilalanina y fenilglicina .

Los reemplazos también pueden hacerse por aminoácidos no naturales que incluyen; aminoácidos alfa* y alfa-disustituidos*, aminoácidos de N-alquilo*, ácido láctico*, derivados de haluro de aminoácidos naturales, tales como trifluorotirosina*, p-Cl-fenilalanina*, p-Br-fenilalanina*, pl-fenilalanina*, L-alil-glicina*, b-alanina*, ácido L-a-amino butírico*, L-a-amino butírico*, ácido L-s-amino isobutírico*, ácido L-s-amino caproico*, ácido 7-amino heptanoico*, L-metionina sulfona#*, L-norleucina*, L-norvalina*, p-nitro-L-fenilalanina*, L-hidroxiprolina#, L-tioprolina*, derivados metílicos de fenilalanina (Phe), tales como 4-metil-Phe*, pentametil- Phe*, L-Phe (4-amino)#, L-Tyr (metilo)*, L-Phe (4-isopropilo)*, L-Tic (ácido 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-3-carboxilo)*, ácido L-diaminopropiónico# y L-Phe (4-bencilo)*. La notación * se ha usado con el propósito de la descripción anterior (con relación a la sustitución homologa o no homologa), para indicar la naturaleza hidrofóbica del derivado, mientras que # se ha usado para indicar la naturaleza hidrofílica del derivado, #* indica características anfipáticas.

Las secuencias de aminoácidos variantes pueden incluir grupos espaciadores adecuados que pueden insertarse entre cualquiera de dos residuos de aminoácidos de la secuencia, incluyendo los grupos alquilo, tales como grupos metilo, etilo o propilo, además de espaciadores de aminoácidos, tales como residuos de glicina o b-alanina. Una forma de variación adicional, que implica la presencia de uno o más residuos de aminoácidos en forma peptoide, será bien entendida por los experimentados en la téenica. Para evitar dudas, "la forma peptoide" se usa para referirse a residuos de aminoácidos variantes en los que el grupo de sustituyentes a-carbono es el átomo de nitrógeno del residuo en lugar del carbono a. Los procedimientos para preparar péptidos en forma peptoide son conocidos en la técnica, por ejemplo Simón RJ et al., PNAS (1992) 89(20), 9367-9371 y Horwell DC, Trends Biotechnol . (1995) 13 (4), 132-134.

En una modalidad, la xilanasa para el uso en la presente invención puede comprender una secuencia polipeptídica en la presente con una sustitución conservadora de por lo menos uno de los aminoácidos.

Convenientemente, puede haber por lo menos 2 sustituciones conservadoras, tales como por lo menos 3 o por lo menos 4 o por lo menos 5.

Convenientemente, puede haber menos de 15 sustituciones conservadoras, tales como menos de 12, menos de 10, o menos de 8 o menos de 5.

EJEMPLOS Ejemplo 1: Respuestas de pollos de engorde alimentados a base de dieta de trigo que contienen xilanasa, b-glucanasa microbianos de alimentación directa MATERIAL Y METODOS El uso de animales y el protocolo experimental se aprobó por Institutional Animal Experiment Committee. Se formuló una dieta balanceada en energía y nutrientes para pollos de engorde jóvenes (0-21 días de vida) (Tabla 1, Dieta I). El componente de cereal de la dieta fue trigo, cebada, centeno, acemites de trigo, salvado de trigo o combinaciones de los mismos, mientras que el componente proteínico fue harina de soja y la fuente de grasa fue aceite de semilla de colza. No se incluyeron antimicrobianos sintéticos o medicamentos anti-coccidios, y la dieta se suministró como un puré. La dieta basal se dividió en porciones y las enzimas respectivas y DFMs se adicionaron para constituir las dietas experimentales identificadas en la Tabla 2.

Cada suplemento se proporcionó en una premezcla y se adicionó al mezclador durante la preparación de la dieta. Las dietas que contienen el DFM se mezclaron primero y el mezclador se lavó entre cada dieta para evitar la contaminación cruzada. Se colectaron muestras de cada dieta de tratamiento desde el principio, la mitad y al final de cada lote y se mezclaron para confirmar las actividades enzimáticas y la presencia de DFM en la alimentación antes de comenzar la prueba del animal. Las muestras adicionales de cada dieta de tratamiento se mantuvieron y se almacenaron hasta que se requiera a -20° C ± 2o C para el análisis.

Se obtuvieron pollitos de engorde machos (Ross 308) de un día de edad de una incubadora comercial. Los pollos se pesaron y se asignaron a 32 jaulas criadoras (8 polluelos por jaula), de modo que el peso promedio de las aves por jaula fue similar. Los 4 tratamientos dietéticos (Tabla 2) después se asignaron al azar a 8 jaulas cada una. En el día 12, las aves se trasladaron a jaulas de crecimiento. La asignación del espacio por ave en los criaderos y las jaulas de crecimiento fue de 530 y 640 cm2, respectivamente. Las jaulas criadoras y de crecimiento se alojaron en habitaciones de ambiente controlado. La temperatura se mantuvo a 31°C en la primera semana y después se redujo gradualmente a 22°C para el final de la tercera semana. Las aves recibieron 20 horas de iluminación fluorescente y, se les permitió el libre acceso a las dietas y agua. Las dietas se ofrecieron desde el d 0 a 21. Los pesos corporales se registraron en intervalos semanales durante todo el periodo experimental de 21 días. La mortalidad se registró diariamente. Los datos se analizaron usando el procedimiento GLM de SAS.

Tabla 1: Composición de la dieta de las dietas básales a base de trigo de pollos de engorde (% alimentado) Tabla 2: Identificación de tratamientos 1La enzimas (xilanasa (Danisco Xylanase una endo-1,4-b-?-xilanasa (E.C. 3.2.1.8)) y b-glucanasa Axtra®XB) son productos comerciales suministrados por la Danisco Animal Nutrítion. 2Un microbiano de alimentación directa a base de Bacillus de tres cepas, seleccionado por la capacidad de secretar enzimas, suministrado Danisco Animal Nutrition como proporciones iguales de las cepas AGTP BS918 (NRRL B-50508), AGTP BS3BP5 (NRRL B-50510) y AGTP BS1013 (NRRL B-50509). RESULTADOS Tabla 3: Efectos de la xilanasa, b-glucanasa y microbianos de alimentación directa a base de Bacillus en el desempeño de crecimiento de un pollito de engorde joven.

N.B. Las diferentes letras después de los valores muestran diferentes estadísticas (P£0.10) entre valores en tal columna.

Los pollos alimentados con la combinación de xilanasa, una enzima degradante de fibra (b-glucanasa) y un DFM a base de bacilo crecieron más rápido que el control y numéricamente mejor que los pollos alimentados sólo con dietas de enzimas. El peso corporal a los 21 días y la ganancia de peso corporal fue numéricamente mejor en los pollos alimentados con tres combinaciones posibles de xilanasa, b-glucanasa y DFM con respecto al control.

II. NUTRIENTES Y RETENCIÓN DE ENERGÍA/DIGESTIBILIDAD MATERIAL Y MÉTODOS El uso de animales y el protocolo experimental fue aprobado por el Institutional Animal Experiment Committee. Una dieta a base de trigo-cebada se formuló para estar balanceada en energía y nutrientes para pollos de engorde jóvenes (0-21 días de vida) (Tabla 1, Dieta II). El dióxido de titanio se incubó a 0.30% para permitir la determinación de retención del componente dietético. No se incluyeron antimicrobianos sintéticos o medicamentos anti-coccidios, y la dieta se suministró como un puré. La dieta basal se dividió en porciones y las enzimas respectivas y DFMs se adicionaron para constituir las dietas experimentales identificadas en la Tabla 4. Cada suplemento se pre-mezcló y el mezclador se limpió para evitar la contaminación cruzada de las dietas tratadas. Las muestras se colectaron de cada dieta tratamiento desde el principio, a la mitad y al final de cada lote y se mezclaron para confirmar las actividades enzimáticas y la presencia de DFM en la alimentación antes del comienzo de la prueba animal. Las muestras adicionales de cada dieta de tratamiento se conservan y almacenan hasta que se requiera a -20°C ± 2°C para el análisis.

Tabla 4: Identificación de los tratamientos i-Las enzimas (xilanasa (Danisco Xylanase una eh?o-1,4-b-D-xilanasa (E.C. 3.2.1.8)) y b-glucanasa Axtra®XB) son productos comerciales suministrados por la Danisco Animal Nutrition. 2Un microbiano de alimentación directa a base de Bacillus de tres cepas, seleccionado por la capacidad de secretar enzimas, suministrado Danisco Animal Nutrition como proporciones iguales de las cepas AGTP BS918 (NRRL B-50508) , AGTP BS3BP5 (NRRL B-50510) y AGTP BS1013 (NRRL B-50509) .

El estudio involucró una prueba de jaula, que se llevó a cabo para obtener muestras de excrementos para mediciones de la energía y digestibilidad de nutrientes. Los pollos de engorde machos de un día de edad (Ross 308) se obtuvieron de una incubadora comercial. Los pollos se pesaron individualmente a la llegada y se estratificaron por peso corporal y se asignaron a 30 jaulas (cinco polluelos por jaula), de modo que el peso promedio de las aves por jaula fue similar. Los cuatro tratamientos dieteticos se asignaron al azar a seis jaulas duplicadas. La prueba El ensayo se llevó a cabo desde el día 0 al 21, durante el cual las aves tuvieron libre acceso a sus tratamientos dietéticos asignados y agua. Las temperaturas de la incubadora y ambiente se establecieron a 32 y 29°C, respectivamente, durante la primera semana. Posteriormente, el suministro de calor en la incubadora se apagó y la temperatura ambiente se mantuvo a 29°C durante todo el experimento. La luz se proporcionó durante 24 h a través del experimento. En los días 17, 18, 19 y 20, los excrementos se colectaron y almacenaron congelados a -20°C para la determinación de la energía y nutrientes de retención/digestibilidad de muestras de excrementos. Se tuvo cuidado durante la colección de las muestras de excrementos para evitar la contaminación de las plumas y otros materiales extraños. Las muestras de excrementos se agruparon dentro de una jaula, se mezclaron bien usando un mezclador y se tomaron dos muestras representativas de cada jaula. Las muestras se liofilizaron. Las muestras secadas se molieron para pasar a través de un tamiz de 0.5 mm y se almacenaron en recipientes de plástico hermético a -4°C hasta su análisis químico. Se analizaron las muestras de las dietas y los excrementos de materia seca, proteína cruda (como nitrógeno), energía bruta, grasa (como extractos de hexano) y fibra detergente neutra de acuerdo con los métodos oficiales de análisis de AOAC). Titanio (marcador de digestibilidad) se analizó de acuerdo con los procedimientos descritos por Lomer et al. (2000, Analist 125: 2339-2343). Se calculó la retención/digestibilidad usando los procedimientos estándares (Adeola, 0. 2001.

Digestión and balance teeniques in pigs. Páginas 903-916 in Swine Nutrition, 2da. ed. A.J. Lewis, y L.L. Southern, ed. CRC Press, Washington, DC). Los datos se analizaron usando el procedimiento General Linear Models de SAS (2004) .

RESULTADOS Tabla 5: Efectos de la xilanasa, una enzima degradante de fibra y un bacilo basado en microbianos de alimentación directa sobre nutrientes de retención/digestibilidad y metabolización de energía en un pollo de engorde joven.

N.B. Las letras diferentes después de los valores muestran diferencias estadísticas (P£0.10) entre los valores en tal columna Una combinación de xilanasa, b-glucanasa y un microbiano de alimentación directa a base de bacilo mejoró el uso de pollos de engorde jóvenes de energía dietética en comparación con cualquiera del control o la xilanasa sola o una combinación de xilanasa y b-glucanasa (Tabla 5). Esto podría estar relacionado con un aumento en la retención de nutrientes que producen energía, tales como fibra, grasa y nitrógeno (Tabla 5). La retención de grasa mejorada debido a las tres combinaciones es notable y podría estar relacionada con una mayor digestión y absorción de grasas en la dieta y también la producción y la absorción de los ácidos grasos de cadena corta de la fermentación. Los beneficios observados de la combinación de tres vías de xilanasa, b-glucanasa, bacilo/DFM propiónico, mejor en el uso de energía y nutrientes, también podrían estar especulativamente vinculados con el mejoramiento de la salud y la función intestinal a través de la modulación de la microbiota positiva y la función digestiva/absorción del intestino.

III. PRODUCCIÓN DE ÁCIDO LÁCTICO EN EL CIEGO MATERIALES Y MÉTODOS Simulación in vitro de ciego de pollo Un modelo de ciego de pollo se desarrolló a partir de un colon humano descrito anteriormente en el sistema in vitro (Makivuókko et al 2006; Nutrition and C ncer 52:94-104, Mákeláinen et al 2009; International Dairy Journal 19: 675-683). Este modelo in vitro de ciego está compuesto de cuatro recipientes conectados inoculados con microbios cecales frescos. Una dieta basal a base de trigo-salvado de trigo se formuló para ser balanceada en energía y nutrientes para pollos de engorde jóvenes (Tabla 1, Dieta III). No se incluyeron antimicrobianos sintéticos o fármacos anti-coccidios en la dieta basal. La dieta basal se dividió en porciones y las enzimas respectivas y DFMs adicionados constituyen las dietas experimentales identificadas en la Tabla 6. Las diferentes alimentaciones se sometieron a una digestión simulada del tracto gastrointestinal superior antes de que se alimentaran al sistema ciego in vitro durante una simulación de 5 horas. Los recipientes modelan los compartimentos del ciego de los pollos, cada uno con el mismo pH (6.25). El análisis cromatográfico de ácido láctico a partir de las muestras de simulación cecal se realizó con ácido piválico como un estándar interno en una materia similar a la descrita previamente (Ouwehand et al 2009; The British Journal of Nutrition 101: 367-375).

Tabla 6: Identificación de los tratamientos ^Danisco Xylanase, Danisco Animal Nutrition 2El complejo enzimático ACCELLERASE® TRIO™ contiene una potente combinación de múltiples actividades enzimáticas que incluyen b-glucanasas (200 CMC U/kg), xilanasas (por ejemplo endoxilanasas-endo-1,4- -xilanasa (E.C.3.2.1.8)) (> 1200 ABX U/kg) y b-glucosidasas (> 800 pNPG U/kg) suministrados por DuPont Industrial Bioscences. 3un microbiano de alimentación directa a base de Bacillus de tres cepas seleccionado por su capacidad para secretar enzimas, suministrado por Danisco Animal Nutrition como proporciones iguales de las cepas AGTP BS918 (NRRL B-50508), AGTP BS3BP5 (NRRL B-50510) y AGTP BS1013 (NRRL B-50509).

RESULTADOS Tabla 7: Efectos de la xilanasa, una mezcla de enzimas de degradación de la fibra y un microbiano de alimentación directa en la producción de ácido láctico en un ciego de pollos N.B. Las diferentes letras después de los valores muestran las diferencias estadísticas (P£0.10) entre los valores en tal columna La combinación de xilanasa + una mezcla de otras enzimas degradantes de fibra + microbianos de alimentación directa a base de Bacillus aumentó la producción de ácido láctico cecal en comparación con una sola enzima o combinaciones de enzimas. El ácido láctico se produce por las bacterias del ácido láctico, en el que los lactobacilos y estreptococos predominan; estas bacterias se conocen que tienen propiedades que promueven la salud en el intestino (Walter, 2008; Applied and Environmental Microbiology 74: 4985-4996). El ácido láctico tiene efectos antibacterianos sobre los patógenos, tales como las especies de E. coli y Salmonella (Nout et al 1989; International Journal of Food Microbiology 8, 351-361), y los lactobacilos puede inhibir la adhesión de E. coli a los intestinos (Hillman et al. 1994; Journal of Applied Microbiology 76: 294-300). Por lo tanto, las altas concentraciones de ácido láctico debido a una combinación de tres vías de xilanasa, enzimas que degradan la fibra y microbiano de alimentación directa deben reflejar un aumento de la población y de la actividad de estos microbios relacionados con la salud intestinal.

IV. POBLACIÓN MICROBIANA CECAL MATERIALES Y MÉTODOS Los pollos de engorde se asignan a los corrales con base en el peso corporal inicial y experimental se asignaron al azar usando un diseño experimental reconocido. A las aves se les permite el libre acceso a las dietas experimentales durante un periodo comprendido entre el día 0 a 21.

Las muestras de excrementos se recogen diariamente desde el día dl8 a d20 y se almacenan a -20°C. En el día 21, las aves se sacrificaron por dislocación cervical, y los contenidos de ciegos obtenidos y almacenados se congelaron a -20°C para la determinación de VFA cecal.

Extracción de ADN: 0.2 g de digesta cecal se suspendieron en PBS, y luego se aislaron más mediante etapa de golpeo de cuentas y luego automáticamente con MagMax usando un kit comercial, kit de aislamiento de ácido nucleico total MagMAX™ (Applied Biosystems). La cantidad de ADN aislado se determinó mediante el uso de un espectrofotómetro UV/Vis de espectro completo ND-1000 de Nanodrop (Wilmington, DE, USA). Se usó citometría de flujo como se ha descrito previamente (Apajalahti et al. 2002, Appl Environ Microbiol 68 (10): 4986-4995) para la enumeración de bacterias totales o específicas de las muestras.

Procedimientos de PCR: El ADN aislado se analizó mediante qPCR (reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa) usando un biosistema aplicado. Los cebadores específicos se usan para detectar específicamente el género microbiano interesante como se describe en 3.

Tabla 8: Las referencias donde los cebadores específicos del género se pueden encontrar para la cuantificación de qPCR de la población microbiana de digesta La combinación de xilanasa + (mananasa o b-glucanasa) + DFMs induce un cambio en la población microbiana cecal en favor de Lactobacillus y/u otros grupos específicos conocidos como bacterias fibrolíticas : Ruminococcus , Bacteroides , Roseburia .

Ejemplo 2: Efecto de 2 xilanasas y otras enzimas degradantes de fibra (mezcla FDE) y DFM (microbiano de alimentación directa basado en Bacillus; microbianos de alimentación directa basados en Lactobacillus cuando se alimentan individualmente o en combinación en el rendimiento del crecimiento y ácidos grasos volátiles cecales en pollos de engorde jóvenes alimentados con dietas a base de maíz EXPERIMENTO 1 MATERIAL Y MÉTODOS El uso de animales y el protocolo experimental es aprobado por el Institutional Animal Experiment Committee . La dieta basal, como se alimenta, está formulada para ser balanceada en energía y proteína, y para igualar con los requerimientos para el crecimiento de las aves de esta edad y genotipo (Tabla 9). El componente de cereales de la dieta es el maíz, y el componente de proteína puede ser harina de soja con o sin otros ingredientes proteínicos, tales como cañóla, harina de semilla de colza, etc. Los co-productos de maíz, tales como DDGS o harina de germen de maíz o alimento de gluten de maíz se pueden incluir ya sea individualmente o en combinación, siempre que la dieta sea formulada para satisfacer las necesidades nutrimentales de las aves que se alimentan. No se incluyen antimicrobianos sintéticos o anti-coccidios, y la dieta se suministra como un puré. Un marcador digestibilidad común (dióxido de titanio, óxido de cromo o Celite) se incluye a 3 g/kg para permitir la determinación de la digestibi1idad de los componentes dietéticos. La dieta basal se divide en porciones y las enzimas respectivas y DFMs adicionados para constituir las dietas experimentales identificadas en la Tabla 10. Cada suplemento se pre-mezcla y el mezclador se vacía para prevenir la contaminación cruzada de las dietas tratadas. Las muestras se colectan de cada dieta de tratamiento desde el principio, a la mitad y al final de cada lote y se mezclan para confirmar las actividades enzimáticas y la presencia de DFM en la alimentación antes de comenzar la prueba animal . Las muestras adicionales de cada dieta de tratamiento se conservan y almacenan hasta que se requiera a -20°C ± 2°C para el análisis.

Tabla 9: Composición de la dieta basal de maíz (%, como se alimenta) para pollos de engorde d 0-21 Tabla 10: Identificación de las dietas experimentales ^Xilanasas (por ejemplo, endo-1,4-b-D-xilanasa (E.C.3.2.1.8) de dos diferentes organismos de origen 2DFM de Bacillus seleccionado como una cepa que produce una enzima 3DFM de Lactobacillus se conoce que es una cepa de fermentación de azúcar C5; una cepa que produce ácido graso de cadena corta; una cepa que promueve la microflora endógena, fibrolítica; o combinaciones de los mismos 4 Mezcla de FDE: Combinación de actividades de la enzima degradante de fibra incluyendo beta-glucanasa, beta-glucosidasa, beta-xilosidasa y/o alfa-arabinofuranosidasa.

Los pollos de engorde se asignan a los corrales con base en el peso corporal inicial y las dietas experimentales se asignan al azar usando un diseño experimental reconocido. Se permite a las aves el libre acceso a las dietas experimentales durante un periodo entre el día 0 a 21. El peso corporal (BW, por sus siglas en inglés), el consumo de alimento (FI) y las mortalidades se registran para calcular la ganancia de peso corporal (BWG), la tasa de conversión alimenticia (FCR) y la eficiencia de conversión alimenticia (FCE).

Muestras de excrementos se colectan diariamente desde el día dl8 a d20 y se almacenan a -20°C para la determinación de los nutrientes y la retención de la fibra, y los contenidos de AME y AMEn. En el día 21, las aves se sacrifican por dislocación cervical, y contenido del íleo (de divertículo de Meckel a aproximadamente 1 cm por encima de la unión íleo-cecal) y los ciegos se obtienen y almacenan congelados a -20°C para la determinación de la digestibilidad ileal de los componentes y VFA cecal.

Las muestras de excrementos diarios se reúnen para cada jaula y se secan en el horno a 60°C, mientras que las muestras de digesta ileal se reúnen sobre la base de jaula/corral y se liofilizan. Las muestras de las dietas, los excrementos y digesta ileal se trituran finamente y se mezclan completamente para el análisis. Todas las muestras se analizan para la materia seca, nitrógeno, grasa y energía bruta de acuerdo con los procedimientos de A.O.A.C. (2005). Los polisacáridos sin almidón solubles e insolubles se prueban en las dietas y los excrementos de acuerdo con Englyst et al. (1988), mientras que la fibra detergente neutro, nitrógeno insoluble de detergente neutro se prueban de acuerdo con los métodos de Tillcy and Terry (1962). El marcador de digestibilidad se analiza de acuerdo con el procedimiento estándar del marcador seleccionado.

El análisis cromatográfico de ácidos grasos volátiles y ácido láctico, por ejemplo, SCFA, que se realiza a partir de muestras de simulación con ácido piválico como estándar interno en una manera similar a la descrita previamente (Ouwehand et al, febrero de 2009; 101(3):. 367-75). Se determinan las concentraciones de ácido acético, propiónico, butírico, isobutírico, valérico, isovalérico, ácido 2-metilbutírico, y ácido láctico.

Coeficiente de digestibilidad aparente ileal y el coeficiente de retención aparente de los componentes se calculan de acuerdo con Adeola et al., 2010 (Poult Sci. septiembre de 2010; 89(9): 1947-1954).

La jaula (corral) es la unidad experimental. ANOVA se realiza con los Modelos lineales generales de SAS (SAS Inst. Inc., Cary, NC). Cuando las relaciones F indican significación, se separan los medios de tratamiento.

RESULTADOS Los grupos tratados se alimentan con toda la combinación: xilanasa más una enzima(s) degradante de fibra secundaria y un DFM (Bacillus o LB), tienen mayor BWG (g/ave/dia), y/o una menor FCR (g ganancia de BW/g de entrada de alimento) y/o mejores nutrientes, energía y digestibilidad de la fibra/retención que cualquiera de control, o estos aditivos alimentados solos o en combinación de dos maneras.

La combinación de las xilanasas (xilanasa 1 y/o 2) una mezcla de FDE + DFMs aumenta significativamente el VFA ileal y/o cecal total y la concentración de ácido butírico o ácido propiónico en la digesta ileal y/o cecal de pollos de engorde.

II. DESEMPEÑO DEL CRECIMIENTO EXPERIMENTO I MATERIALES Y MÉTODOS El uso de animales y el protocolo experimental se aprobó por el Institutional Animal Experiment Committee. Una dieta a base de maíz/soja se formuló para ser balanceada en energía y nutrientes para pollos de engorde jóvenes (0-21 días de vida) (Tabla 9, Dieta I). No se incluyeron antimicrobianos sintéticos o fármacos anti-coccidios, y la dieta se suministró como un puré. La dieta basal se dividió en porciones y las enzimas respectivas y DFMs adicionados para constituir las dietas experimentales identificadas en la Tabla 11.

Tabla 11: Identificación de los tratamientos usados en el experimento I aLas enzimas (xilanasa (Danisco Xylanase una endo 1,4- b-D-xilanasa (E.C. 3. 2.1.8)) y b-glucanasa (Axtra® XB) ) son productos comerciales suministrados por Danisco Animal Nutrition bDFM a base de tres cepas de Bacil lus (proporciones iguales de las cepas AGTP BS918 (NRRL B-50508) , AGTP BS3BP5 (NRRL B-50510) y AGTP BS1013 (NRRL B-50509)), seleccionadas por su capacidad para secretar enzimas cxilanasa FveXyn4 (una endo- 1,4 -b-D-xilanasa (E.C. 3.2. 1.8)) se muestra como la SEC ID No. 3 en la presente (también descrita en PCT/CN2 012/079 650 que se incorpora en la presente por referencia), Danisco Animal Nutrition.

Todos los suplementos se proporcionaron en una premezcla, que se adicionó al mezclador durante la preparación de la dieta. Las dietas que contienen el DMF se mezclaron primero y el mezclador se lavó entre cada dieta para evitar la contaminación cruzada. Se colectaron muestras de cada dieta de tratamiento desde el principio, a la mitad y al final de cada lote y se mezclan para confirmar las actividades enzimáticas y la presencia de DFM en la alimentación antes de comenzar la prueba animal . Las muestras adicionales de cada dieta de tratamiento se mantuvieron y se almacenan hasta que se requiera a -20 °C ± 2°C para el análisis. Pollos de engorde machos (Hubbard-Cobb) se obtuvieron como pollitos de un día de una incubadora comercial. En el día 0, los pollos se pesaron y se asignaron a 72 jaulas (8 polluelos por jaula) , de modo que el peso promedio de las aves por jaula fue similar. Los 9 tratamientos dietéticos (Tabla 11) después se asignaron al azar a 8 jaulas cada una. Las jaulas se alojaron en cuartos ambientalmente controladas. La temperatura se mantuvo a 31°C en la primera semana y después se redujo gradualmente a 22°C para el final de la tercera semana. Las aves recibieron 20 horas de iluminación fluorescente y, se les permitió el libre acceso a las dietas y agua durante la duración del estudio. Los pesos corporales y el consumo de alimento se registraron al comienzo y al final del período experimental de 21 d. La mortalidad se registró diariamente. Las relaciones de conversión alimenticia se calculan dividiendo el consumo total de alimento por la ganancia de peso de las aves vivas más las muertas. Los datos se analizaron usando los modelos lineales generales de SAS (SAS Inst. Inc., Cary, NC). Cuando las relaciones F indican significación, se separan los medios de tratamiento.

RESULTADOS, EXPERIMENTO I Tabla 12: Efectos de la xilanasa, b-glucanasa y un microbiano de alimentación directa a base de bacilo sobre el crecimiento de un pollito de engorde joven.

N.B. Las diferentes letras después de los valores muestran las diferencias estadísticas (P£0.10) entre los valores en tal columna.

Los grupos tratados alimentado toda combinación completa: xilanasa + b-glucanasa + combinación de DFM de Bacil lus tuvieron mayor BWG (g/ave/día), y menor FCR (g de ganancia de peso corporal/g consumo de alimento) que el control, o estos aditivos alimentados solos o en combinación de dos maneras (Tabla 12). Este fue el caso cuando se administraron tanto xilanasa 1 y xilanasa 2. EXPERIMENTO II MATERIALES Y MÉTODOS El uso de animales y el protocolo experimental se aprobó por el Inst itutional Animal Experiment Committee. Una dieta a base de maíz/soja se formuló para ser balanceada en energía y nutrientes para pollos de engorde jóvenes (0-21 días de vida) (Tabla 9, Dieta I) . No se incluyeron antimicrobianos sintéticos o fármacos ant i-coccidios , y la dieta se suministró como un puré. La dieta basal se dividió en porciones y las enzimas respectivas y los DFMs se adicionaron para constituir las dietas experimentales identificadas en la Tabla 13.

Tabla 13: Identificación del tratamiento para el Experimento II aLas enzimas (xilanasa (Danisco Xylanase una bh?o-1,4-b-D-xilanasa (E.C. 3.2.1.8)) y b-glucanasa (Axtra® XB)) son productos comerciales suministrados por la Danisco Animal Nutrition bDFM basado en Enterococcus ( Enterococcus faecium ID7 (referido como Lactococcus lactis ID7 en la patente concedida US No. 7,384,628 y depositado en el depósito ATCC como PTA-6103 y más tarde reclasificado como Enterococcus faecium ID7)), cxilanasa FveXyn4 (una endo-1,4^ -D-xilanasa (E.C.3.2.1.8)) se muestra como la SEC ID No. 3 en la presente (también descrita en PCT/CN2012/079650 que se incorpora en la presente por referencia), Danisco Animal Nutrition Todos los suplementos se proporcionaron en una premezcla, la cual se adicionó al mezclador durante la preparación de la dieta. Las dietas que contienen el DFM se mezclaron primero y el mezclador se lavó entre cada dieta para evitar la contaminación cruzada. Se colectaron muestras de cada tratamiento de dieta desde el principio, a la mitad y al final de cada lote y se mezclaron para confirmar las actividades enzimáticas y la presencia de DFM en la alimentación antes de comenzar la prueba animal. Las muestras adicionales de cada dieta de tratamiento se mantuvieron y se almacenaron hasta que se requiera a -20°C ± 2°C para el análisis. Pollitos de engorde machos (Hubbard-Cobb) se obtuvieron como pollitos de un día de una incubadora comercial. En el día 0, los pollitos se pesaron y se asignan a 72 jaulas (8 polluelos por jaula), de modo que el peso promedio de las aves por jaula fue similar. Los 9 tratamientos dietéticos (Tabla 13) se asignaron al azar a 8 jaulas cada uno. Las jaulas se alojaron en cuartos controlados ambientalmente. La temperatura se mantuvo a 31°C en la primera semana y después se redujo gradualmente a 22°C para el final de la tercera semana. Las aves recibieron 20 horas de iluminación fluorescente y se les permitió el libre acceso a las dietas y agua durante la duración del estudio. Los pesos corporales se registraron al comienzo y al final del periodo experimental de 21 d. La mortalidad se registró diariamente. Los datos se analizaron usando el procedimiento GLM de SAS.

RESULTADOS, EXPERIMENTO II Tabla 14: Efectos de la xilanasa, b-glucanasa y un microbiano de alimentación directa a base de Enterococcus sobre el crecimiento de un pollito de engorde joven.

N.B. Las diferentes letras después de los valores muestran las diferencias estadísticas (P<0.10) entre los valores en tal columna.

Hubo un mejoramiento numérico en la ganancia de peso corporal del pollo de engorde, cuando la combinación de xilanasa + b-glucanasa + DFM de Enterococcus se suplemento encima de xilanasa + b-glucanasa o xilanasa + DFM de Enterococcus (Tabla 14) .

III. PRODUCCIÓN DE ÁCIDOS GRASOS VOLÁTILES EN EL CIEGO MATERIALES Y MÉTODOS Una dieta basal a base de harina de maíz-soja y harina de semilla de colza se formuló para ser balanceada en energía y nutrientes para pollos de engorde jóvenes (Tabla 9, la dieta II) . No se incluyeron antimicrobianos sintéticos o fármacos ant i-coccidios en la dieta basal. La dieta basal se dividió en porciones y las enzimas respectivas y los DFMs adicionados para constituir las dietas experimentales identificadas en la Tabla 15. Los procedimientos posteriores fueron similares a los descritos para el Ejemplo 1, parte III. El análisis cromatográf ico de ácidos grasos volátiles a partir de muestras de simulación (ver el Ejemplo 1, parte III) se realizó con ácido piválico como un estándar interno de una manera similar a la descrita previamente (Ouwehand et al., 2009; The Bri tish Journal of Nutrí i on 101: 367-375, la enseñanza de la cual se incorpora en la presente por referencia) . Se determinaron las concentraciones de los ácidos acético, propiónico, butírico, isobutírico, valérico, isovalérico y 2-metilbutír ico.

Tabla 15: Identificación de tratamientos Microbiana de alimentación directa a base de Bacillus de tres cepas (proporciones iguales de las cepas AGTP BS918 (NRRL B-50508), AGTP BS3BP5 (NRRL B-50510) y AGTP BS1013 (NRRL B-50509)), seleccionadas por su capacidad para secretar enzimas, suministrado por Danisco Animal Nutrition.

Las enzimas (xilanasa (Danisco Xylanase una endo-1,4-b-D-xilanasa (E.C. 3.2.1.8)) y b-glucanasa (Axtra® XB)) son productos comerciales suministrados por la Danisco Animal Nutrit RESULTADOS Tabla 16: Efectos de la xilanasa, b-glucanasa y un microbiano de alimentación directa en acético y butírico y producción de los ácidos grasos volátiles totales (VFA) en el ciego de pollos N.B. Las diferentes letras después de los valores muestran las diferencias estadísticas (P£0.10) entre los valores en tal columna.

La combinación de xilanasa + b-glucanasa + microbianos de alimentación directa aumentó el ácido acético cecal, ácido butírico y la producción de ácidos grasos volátiles (VFA) en comparación con el DFM solo, enzimas o combinaciones de enzimas solas (Tabla 16). Los ácidos grasos volátiles pueden proporcionar una cantidad significativa de energía para el pollo. El ácido butírico también se conoce que mejora la salud gastrointestinal y reduce la incidencia de cáncer de colon en los humanos (Brons et al., 2002, Trends For Science and Technology 13:251-261, que se incorpora en la presente por referencia).

Ejemplo 3: Efecto de la xilanasa y otras enzimas fibrolíticas (b-glucanasa o mezcla de enzimas degradantes de fibra (mezcla de FDE)) y DFM (microbiano de alimentación directa a base de Bacillus) cuando se alimentan individualmente o en combinación, en el rendimiento del crecimiento y la digestibilidad de los nutrientes en cerdos (25 a 60 kg) alimentados con dietas a base de granos mixtos MATERIAL Y MÉTODOS El uso de animales y protocolo experimental se aprobó por el Animal Experiment Committee. La dieta basal , como se alimenta, está formulada para ser balanceada en energía y proteína, y para igualar los requerimientos para cerdos en crecimiento de esta edad y el genotipo (Tabla 17) . La composición de los ingredientes principales (tipo y niveles de inclusión) en la dieta basal puede variar como se muestra en la Tabla 17, a condición de que la dieta sea formulada para satisfacer las necesidades de nutrientes de los cerdos que son alimentados. Un marcador digestibil idad común (dióxido de titanio, óxido de cromo o de Celite) se incluye al 3 g/kg para permitir la determinación de la digestibilidad de los componentes de la dieta. No se incluyen antimicrobianos sintéticos o fármacos anti-coccidios, y la dieta se suministra como un puré. La dieta basal se divide en partes que luego se tratan con las enzimas y los DFMs identificados en la Tabla 18. Durante la mezcla de la alimentación, el mezclador se vacía para prevenir la contaminación cruzada de la dieta. Las muestras se colectan de cada dieta de tratamiento desde el principio, a la mitad y al final de cada lote y se mezclan para confirmar las actividades enzimáticas y la presencia de DFM en el alimento. Las muestras de cada dieta de tratamiento se mantienen durante la mezcla y se almacenaron a -20°C hasta su uso.

Tabla 17: Ejemplos de la composición de la dieta basal para cerdos de 20 a 60 kg de peso corporal (%, como se alimentó) Tabla 18: Identificación de las dietas experimentales Mezcla de FDE: Combinación de las actividades de la enzima degradante de fibra incluyendo beta-glucanasa, beta-glucosidasa, beta-xilosidasa y/o alfa-arabinofuranosidasa 2DFM de Bacillus seleccionado como una cepa de producción de enzima.

El experimento se planea y se lleva a cabo para corresponder con la fase de crecimiento (£25 a ~60 kg de peso corporal). Las dietas experimentales se alimentan durante 42 días de 6 semanas. Un grupo de cerdos hembra y macho cerca del cuerpo inicial blanco se obtienen de la misma manada (genética). A su llegada, los cerdos se pesan y asignan a los tratamientos dietéticos usando un diseño experimental reconocido tal que cada tratamiento tiene un mínimo de 8 corrales réplicas. El peso corporal y el consumo de alimento se monitorean semanalmente para el cálculo de la eficiencia de conversión alimenticia de la eficiencia de ganancia corregida para las mortalidades. Las muestras fecales tomadas al azar se recogen en la semana 3 y 6 para permitir el cálculo de la digestibilidad del componente dietético.

Cerdos castrados en crecimiento (peso corporal inicial de 30 kg) se equipan con una cánula T en el íleo distal para el propósito del experimento. Los cerdos se alojan en corrales individuales (1.2 x 1.5 m) en un cuarto ambientalmente controlado. Cada corral se equipó con un alimentador y un bebedor de boquilla y tuvo pisos de concreto completamente de tablas . El experimento se diseñó y se llevó a cabo para dar un mínimo de 6 réplicas por tratamiento. Todos los cerdos se alimentan a un nivel de 3 veces su requerimiento de energía de mantenimiento (106 kcal ME por kg0·75; NRC, 1998), y proporcionan en dos porciones iguales a 0800 y 1700 h. A los animales se les permite el libre acceso al agua a través de un bebedor de tipo tazón. Los pesos del cerdo se registran al principio y al final de cada periodo y se registra la cantidad de alimento suministrado cada día. El periodo experimental duran 15 d. Los 10 días iniciales de cada periodo se consideran un período de adaptación a la dieta. Se colectan las muestras fecales frescas tomadas al azar se colectan en el d 11 a 13 y se colectan las digestas ileal durante 8 h en el día 14 y 15 usando los procedimientos de operación estándares. Para la recolección de digesta ileal, una bolsa de plástico se une al barril de la cánula y se colecta la digesta que fluye en la bolsa. Las bolsas se retiran cada vez que están llenas de digesta -o por lo menos una vez cada 30 minutos e inmediatamente se congelan a -20°C.

Las muestras fecal e ileal se descongelan, se mezclan dentro del animales y la dieta, y se colecta una submuestra para su análisis químico. Una muestra de la dieta basal también se colecta y se analiza. Muestras de digesta se liofilizaron y finamente trituraron antes del análisis químico. Las muestras fecales se secan en un horno y finamente se trituran para su análisis. Se analizaron todas las muestras para la materia seca, marcador de digest ibilidad, energía bruta, proteína cruda, grasa y fibra detergente neutra, de acuerdo con los procedimientos estándares (AOAC, 2005).

Los valores para la digestibilidad ileal y total aparente de la energía y los nutrientes se calculan como se describió previamente (Stein et al, 2007. J. Anim Sci 85: 172-180) . El corral es la unidad experimental. Los datos se someten a los procedimientos MIXED de SAS.

RESULTADOS Grupos tratados alimentados con la combinación total: xilanasa más una enzima degradante de fibra secundaria (b-glucanasa o mezcla FDE) y un DFM (microbiano de alimentación directa a base de Bacillus) , tienen una mayor BWG, y/o una menor FCR (g de ganancia de BW/g de consumo de alimento) y/o alta digestibilidad de nutrientes y/o energía y/o materia seca y/o fibra.

Ejemplo 4: Efectos de la xilanasa, b-glucanasa y una cepa productora de ácido propiónico de microbiano de alimentación directa a base de bacterias sobre los nutrientes de retención/digestibilidad y metabolización de energía en un pollo de engorde joven.

Composición de las dietas experimentales a base de trigo usadas en el Ejemplo 4 Tabla 19: Composición de las dietas básales de trigo de pollos de engorde (% como alimentado) MATERIAL Y METODOS El uso de animales y el protocolo experimental se aprobó por el Institutional Animal Experimental Committee. Una dieta a base de trigo-cebada se formuló para ser balanceada en energía y nutrientes para pollos de engorde jóvenes (0-21 días de vida) (Tabla 19). El dióxido de titanio se incluyó en el 0.30% para permitir la determinación de la retención del componente dietético. No se incluyeron antimicrobianos sintéticos o fármacos anti-coccidios, y la dieta se suministró como un puré. La dieta basal se dividió en porciones y las enzimas respectivas y los DFMs adicionados para constituir las dietas experimentales identificadas en la Tabla 20. Cada suplemento se pre-mezcló y el mezclador se lavó para evitar la contaminación cruzada de las dietas tratadas. Las muestras se colectaron de cada dieta de tratamiento desde el principio, a la mitad y al final de cada lote y se mezclaron para confirmar las actividades enzimáticas y la presencia de DFM en la alimentación antes de comenzar la prueba animal. Las muestras adicionales de cada dieta de tratamiento se conservan y almacenan hasta que se requiera a -20°C + 2°C para el análisis.

Tabla 20: Identificación de los tratamientos Microbianos de alimentación directa a base de cepas de producción de ácido propiónico ( Propionibacterium acidipropionici P169 PTA-5271, Omni-Bos® P169).

Las enzimas (xilanasa (Danisco Xylanase una endo-1,4-p-D-xilanasa (E.C. 3.2.1.8)) y b-glucanasa (Axtra® XB)) son productos comerciales suministrados por Danisco Animal Nutrítion.

El estudio involucró una prueba de jaula, que se llevó a cabo para obtener muestras de excrementos para mediciones de digestibilidad de energía y nutrientes. Los de engorde machos de un día de edad (Ross 308) se obtuvieron de una incubadora comercial. Los pollos se pesaron individualmente a la llegada y se estratificaron por peso corporal y se asignaron a 30 jaulas (cinco pollos por jaula) de modo que el peso promedio de las aves por jaula fue similar. Los cuatro tratamientos se asignaron al azar a seis jaulas replicadas. La prueba se llevó a cabo desde el día 0 al 21, durante el cual las aves tuvieron libre acceso a sus tratamientos dietéticos asignados y agua. Las temperaturas de los criaderos y del cuarto se establecieron a 32 y 29°C, respectivamente, durante la primera semana. Posteriormente, el suministro de calor en la incubadora se apagó y la temperatura ambiente se mantuvo a 29°C durante todo el experimento. La luz se proporcionó durante 24 h todo el experimento. En los días 17, 18, 19 y 20, se colectaron las muestras de excrementos y se almacenaron congeladas a -20°C para la determinación de la energía y retención de nutrientes/digestibilidad. Se tuvo cuidado durante la colecta de las muestras de excrementos para evitar la contaminación de los corrales y otros materiales extraños. Las muestras de excrementos se reunieron dentro de una jaula bien mezclada con un mezclador y se tomaron dos muestras representativas de cada jaula. Las muestras se liofilizaron . Las muestras secas se molieron para pasar a través de un tamiz de 0.5 mm y se almacenaron en recipientes de plástico hermético a -4°C hasta su análisis químico. Se analizaron muestras de las dietas y los excrementos de materia seca, proteína cruda (como nitrógeno) , energía bruta, grasa (como extractos de hexano) y fibra detergente neutra, de acuerdo con los métodos oficiales de AOAC de análisis) . Se analizó titanio (marcador de digestibilidad) de acuerdo con los procedimientos descritos por Lomer et al., (2000, Analyst 125:2339-2343), que se incorpora en la presente por referencia. La retención/digestibilidad se calculó usando los procedimientos estándares (Adeola, O. 2001. Digestión and balance techniques in pigs. Páginas 903-916 en Swine Nutrition, 2da. ed. AJ Lewis, y LL Sur, ed. CRC Press, Washington, DC, que se incorpora en la presente por referencia) . Los datos se analizaron usando el procedimiento de Modelos Lineales Generales de SAS (2004). RESULTADOS Tabla 21: Efectos de la xilanasa, una enzima degradante de fibra y una cepa que produce ácido propiónico de microbianos de alimentación directa a base de bacterias sobre los nutrientes de retención/digestibilidad y metabolización de la energía en un pollito de engorde joven.

Una combinación de xilanasa, b-glucanasa y un microbiano de alimentación directa a base de bacillus mejoró el uso de energía dietética comparado con el control o la xilanasa sola o una combinación de xilanasa y b-glucanasa (Tabla 20). Esto podría estar vinculado con un aumento en la retención de nutrientes energéticos en la materia seca, tal como grasa (Tabla 20). La retención de grasas mejorada debido a las tres combinaciones es notable y podría estar relacionada con una mayor digestión y absorción de grasas en la dieta y también en la producción y la absorción de ácidos grasos de cadena corta de la fermentación. Los beneficios observados de la combinación de tres vías de xilanasa, b-glucanasa, DFM de bacillus/propiónico, mejor en el uso de energía y nutrientes, también podrían estar especulativamente vinculados con la mejoramiento de la salud del intestino y la función a través de la modulación de microbiota positiva y la función intestinal digestiva/de absorción de intestino .

Ejemplo 5: Respuestas del pollo de engorde cuando se alimenta con dietas a base de maíz que contienen xilanasa, otras enzimas que degradan la fibra y microbiano de alimentación directa que producen ácido propiónico Composición de las dietas experimentales usadas en el Ejemplo 5 Tabla 22: Composición de la dieta de las dietas a base de maíz de pollos de engorde (% como alimentado) MATERIALES Y MÉTODOS El uso de animales y el protocolo experimental se aprobó por el Institutional Animal Experimental Committee. Una dieta a base de maíz se formuló para ser balanceada en energía y nutrientes para pollos de engorde jóvenes (0-21 días de vida) (Tabla 22). No se incluyeron antimicrobianos sintéticos o fármacos anti-coccidios, y la dieta se suministró como un puré. La dieta basal se dividió en porciones y las enzimas respectivas y los DFMs adicionados para constituir las dietas experimentales identificadas en la Tabla 23. Cada suplemento se pre-mezcló y el mezclador se lavó para evitar la contaminación cruzada de las dietas tratadas. Las muestras se colectaron de cada dieta de tratamiento desde el principio, a la mitad y al final de cada lote y se mezclaron para confirmar las actividades enzimáticas y la presencia de DFM en la alimentación antes de comenzar la prueba animal. Las muestras adicionales de cada dieta de tratamiento se conservan y almacenan hasta que se requiera a -20°C ± 2°C para el análisis.

Tabla 23: Identificación de tratamientos xDanisco Xylanase, Danisco Animal Nutrí t ion 2E1 complejo enzimático ACCELLERASE® TRIO™ contiene una potente combinación de múltiples actividades enzimáticas incluyendo b-glucanasas (200 CMC U/kg), xilanasas (por ejemplo, endoxilanasas, endo-1,4^ -D-xilanasa (E.C.3.2.1.8)) (> 1200 ABX U/kg), y b-glucosidasas (> 800 pNPG U/kg) (DuPont Industrial Bioscences).

Microbianos de alimentación directa a base de cepas que producen ácido propiónico ( Propionibacterium acidipropionici P169 PTA-5271, Omni-Bos® P169).

Pollitos de un día de edad se adquirieron de un criadero comercial, y en la llegada las aves se pesaron y se etiquetaron para la identificación y se asignaron en seis bloques por el peso corporal y se asignaron al azar a 4 tratamientos (Tabla 23) dentro de un bloque con diez aves por corral en un diseño de bloque completo al azar. A partir del d 1, también se les permitió acceso ad libitum a agua para beber limpia. Los pollitos se pesaron en los días 0 y 21, y se registraron sus pesos, el consumo de alimento también se monitoreó y documentó en los días de peso del pollo. Los polluelos se controlaron diariamente y se registraron las variaciones en su apariencia o comportamiento. Al final de cada periodo de alimentación, se determinaron los parámetros, tales como aumento de peso, consumo de alimento, tasa de conversión alimenticia, eficiencia de la alimentación, y la mortalidad. Los datos se analizaron como un diseño de bloques completos al azar usando el procedimiento GLM del programa SAS (SAS Institute, Inc.2006).

RESULTADOS Tabla 24 : Efectos de xilanasa, una mezcla de otras enzimas que degradan las fibras y un microbiano de alimentación directa a base de ácido propiónico sobre el crecimiento de un pollito de engorde joven.

N . B . Las diferentes letras despues de los valores muestran las dif erenc ias estadíst icas ( P£ 0 . 10 ) entre los valores en tal columna.

La combinación de alimentación de los pollos de xilanasa, una mezcla de otras enzimas de degradación de fibra y un DFM a base de ácido propiónico, tuvo una mejor que el control y numéricamente mejor que los pollos alimentados sólo con las dietas de enzimas (Tabla 24) .

Ejemplo 6: Efectos de xilanasa y b-glucanasa sin o con composición de aditivo alimenticio a base de cepas de bacillus en el desempeño del crecimiento, conteos microbianos y digestibi 1idad de nutrientes en cerdos de crecimiento terminal Composición de las dietas experimentales usadas en el Ejemplo 6 Tabla 25: Composición de la dieta en el alimento de cerdos de engorde (20-60 kg de peso corporal) (% como alimentado) Se realizaron dos experimentos para evaluar el rendimiento del crecimiento, los conteos microbianos fecales y los efectos de la digestibilidad de una mezcla de enzima de xilanasa y b-glucanasa alimentada sin o con microbiano de alimentación directa a base de cepas de Bacill us en el crecimiento de cerdos de engorde. El Inst itutional Animal Care and Use Committee aprobó el uso de los cerdos y se usaron las guías de bienestar relevantes para el País. Un total de 42 cerdos ([Yorkshire x Landrace ?] x Duroc <*) alojados en grupos de dos se usaron en el experimento 1, y 72 cerdos de la misma raza alojados en grupos de tres se usaron en el experimento 2. Cada corral tuvo lados de plástico transparente lisos y el suelo de hoja metálica cubierta con película de plástico en un cuarto de temperatura controlada (22 ± 2°C).

Las dietas básales respectivas se formularon para satisfacer los requerimientos de nutrientes de NRC para los cerdos (NRC, 1998 Tabla 25, dieta I para el experimento 1 y dieta II para el experimento 2) . En cada experimento, un lote de la dieta basal se manufactura y se divide en dos porciones y cada porción se mezcla posteriormente con los aditivos identificados en la Tabla 26.

Tabla 26: Identificación de Tratamientos :un microbiano de alimentación directa a base de Bacillus de tres cepas (proporciones iguales de las cepas BS918 AGTP (NRRL B-50508), AGTP BS3BP5 (NRRL B-50510) y AGTP BS1013 (NRRL B-50509)), seleccionadas por su capacidad de secretar enzimas suministradas por Danisco Animal Nutrition.

Las enzimas (xilanasa (Danisco Xylanase una endo-1,4-b-D-xilanasa (E.C. 3.2.1.8)) y b-glucanasa (Axtra® XB)) son productos comerciales suministrados por Danisco Animal Nutrition.

Los tratamientos identificados en la Tabla 26, se asignaron a 7 y 8 corrales réplicas en el experimento 1 y 2, respectivamente. La asignación del corral al los tratamientos fue aleatoria, con base en peso corporal del cerdo al inicio del experimento. El peso corporal y el consumo de alimento se registraron en una base semanal y se usan para calcular la tasa de conversión alimenticia. A los cerdos se les ofrecieron las dietas experimentales durante los 42 días en ambos experimentos. El alimento y agua estuvieron disponibles libremente en todo el tiempo durante la experimentación. En el experimento 2, las muestras fecales frescas se colectaron en los días, 38, 39 y 40 para la determinación de nutrientes, energía y digestibilidad de la fibra, así como los conteos microbianos fecales . Un gramo de la muestra fecal compuesta a partir de cada corral, se diluyó con 9 mL de caldo de peptona al 1% (Becton, Dickinson and Co., Franklin Lakes, NJ) y luego se homogeneizó. Los conteos viables de bacterias en las muestras fecales después se llevaron a cabo en placas de diluciones en serie de 10 veces (en solución de peptona al 1%) en placas de agar MacConkey (Difeo Laboratories, Detroit, Mi) y placas de agar de lactobacilos de medio III (Médium 638, DSMZ, Braunschweig, Alemania) para aislar la E. coli y Lactobacillus , respectivamente. Las placas de agar de medio III de lactobacilos se incubaron durante 48 horas a 39°C bajo condiciones anaerobias. Las placas de agar MacConkey se incubaron durante 24 horas a 37°C. Las colonias de E. coli y Lactobacillus se contaron} inmediatamente después de la remoción de la incubadora. Antes del análisis químico, las muestras fecales se descongelaron y se secaron a 60°C durante 72 h, tras lo cual se trituraron finamente a un tamaño que podría pasar a través de un tamiz de 1 mm. Todo el alimento y las muestras después se analizaron para la materia seca, energía bruta y fibra detergente ácida, siguiendo los procedimientos descritos por la AOAC (Official Methods of Analysis) . Se analizó cromo (marcador de digestibilidad) siguiendo el método descrito por Williams et al., 1962, J. Anim. Sci. 59: 381-389, que se incorpora en el presente documento por referencia. La digestibilidad se calcula usando los procedimientos estándares (Adeola, 0. 2001. Digestión and balance techniques in pigs. Páginas 903-916 en Swine Nutrition, 2da. ed. AJ Lewis, y LL Sur, ed. CRC Press, Washington, DC - la enseñanza de la cual se incorpora en la presente por referencia). Los datos de desempeño del crecimiento (BW, CMD, ADG y FCR) se sometieron a los procedimientos GLM de SAS con los tratamientos, experimentos e interacciones como efectos en el modelo. El análisis inicial reveló que las interacciones no fueron significativas y, como tal, se redujo en análisis posteriores, subsecuentemente se presentan los efectos principales de los tratamientos. Los datos del conteo microbiano se transformaron de manera logarítmica y junto con la digestibilidad sometida a un modelo lineal usando los procedimientos GLM de SAS. RESULTADOS Tabla 27: Efectos de la xilanasa y b-glucanasa sin o con microbiano de alimentación directa a base de cepas de bacillus en el desempeño del crecimiento en cerdos de engorde N.B. Las diferentes letras después de los valores muestran las diferencias estadísticas (P£0.10) entre los valores en tal columna.

Tabla 28: Efectos de la xilanasa y b-glucanasa sin o con microbianos de alimentación directa a base de cepas de Bacillus en materia seca, nitrógeno, fibra y digestibilidad de energía (%) en cerdos de engorde N.B. Las diferentes letras después de los valores muestran las diferencias estadísticas (P£0.10) entre los valores en tal columna.

Una combinación de xilanasa, b-glucanasa y microbiano de alimentación directa que contiene ya sea bacillus que mejoró el rendimiento del crecimiento de cerdos de engorde y el uso de nutrientes dietéticos en la energía comparado con el control o sólo la enzima (Tablas 27 y 28). También se observaron tres combinaciones que resultan en más degradación de la fibra y la proliferación promovida de bacterias de ac tobad 1 l us en el intestino (Figura 1) · Ejemplo 7 : Efectos de la xilanasa, otras enzimas degradantes de fibra y microbianos de alimentación directa en la producción de ácidos grasos de cadena corta en el intestino caudal (intestino posterior) Compos icion de las dietas experimentales en el Ejemplo 7 Tabla 29: Composición de la dieta en el alimento de cerdos de engorde (20-60 kg de peso corporal) (% como alimentado ) MATERIALES Y MÉTODOS Para establecer un modelo de intestino caudal de los cerdos, se adaptó un método de (Boisen and Fernandez 1997, Animal Feed Science and Tecnología 68: 277-286 cuya enseñanza se incorpora en la presente por referencia) para generar el efluente ileal porcino in vi tro . En breve, 1.35 kg de puré de alimentación completa (a base de maíz y trigo, ver detalles en la tabla 29) se combinó con 3.00 L de amortiguador de fosfato (0.1 M, pH 6) y 1.20 L de HCl 0.2 M en un cubo de 3 galones con una tapa resellable. El pH se ajustó a 2 usando HCl 10 M o NaOH. Después, se adicionaron 120 mi de una solución de pepsina pre-preparada (250 mg de Pepsina (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO) por mi de agua) . El cubo se selló y se incubó a 39°C durante 2 horas con agitación para simular la digestión del estómago. Para simulación de digestión del intestino delgado, 1.20 L de amortiguador de fosfato (0.2 M, pH 6.8) y 600 mi de NaOH 0.6 M se adicionaron a la solución y el pH se ajustó a 6.8 usando NaOH 10 M o HCl como antes. Después de la neutralización, se adicionaron 120 mL de solución de pancreatina pre preparada (1,000 mg de pancreatina (Sigma-Aldrich) por mi de agua) , el cubo se selló y se incubó a 39°C durante 4 horas con agitación. Después de la incubación, el líquido se separó por filtración usando una doble capa y se dobló dos veces en la bolsa de medio de preparación (Jumbo Nylon Coarse, LD Carlson Company, Kent, OH) . La suspensión restante se homogeneizó y se dividió en porciones de 128 g, cada se pesó en botellas Pyrex de 250 mi separadas. Las botellas se almacenaron posteriormente a -20°C. Como inoculo para microbiota de tazón grande, se colectó el contenido cecal de 12 cerdos de engorde. Los contenidos se homogeneizaron, se mezclaron con glicerol al 10% y alícuotas de 14 g se pesaron en conos de 15 mi. Los conos después se sellaron y almacenaron a -80°C.

Se realizaron experimentos de simulación del intestino caudal en corridas duplicadas, cada una con 1 control y 3 tratamientos (Tabla 30). Cada tratamiento se probó por triplicado. Para cada prueba in vi tro de fermentación del intestino caudal del cerdo, se usaron un total de 24 botellas Pyrex con efluente ileal simulado y un cono de 15 mL con contenido cecal. Las botellas se descongelaron durante la noche y se adicionaron 240 mL de solución estéril amortiguada con fosfato 0.1 M (pH 6) con 4 g/L de mucina (Sigma-Aldrich) a cada botella, similar a los métodos descritos en (Christensen et al., 1999, Journal of t he Science of Food and Agricul ture 79, 755-762) y Aristoteli and Willcox, 2003, Infection and immunity 71: 5565-5575) la enseñanza de estos documentos se incorpora en la presente por referencia. El inoculo se descongeló durante 30 minutos a temperatura ambiente mientras que las botellas Pyrex se pre-calentaron a 39°C durante 30 minutos en un baño de agua con agitación, a continuación, se adicionaron tratamientos en 1 mi de solución de peptona al 1% y 450 mL de amortiguador de fosfato 0.1 M (ver la tabla 30).

Tabla 30: Tratamientos probados para cerdos en fermentación del intestino caudal in vitro# *Los productos de la enzima y microbiano de alimentación directa se incluyeron a una tasa similar a 500 g por tonelada métrica en la inclusión de alimentación, cada experimento se realizó en corridas duplicadas, los tratamientos se midieron por triplicado en cada corrida; #La dieta basal es la dieta de control de maíz (CC) o la dieta de control de trigo (CW), como se describe en la tabla 29; †La xilanasa es Y5 (Danisco Xylanase una endo-1,4-b-D-xilanasa (E.C. 3.2.1.8)) o NGX (FveXyn4 (una endo-1,4-D-xilanasa (E.C. 3.2.1.8)) mostrada como la SEC ID No.3 en la presente (también descrita en PCT/CN2012/079650 que se incorpora en la presente por referencia), Danisco Animal Nutrition) con una actividad garantizada de 4,000 XU/kg de alimento; *La Enzima degradante de fibra es Accel. (Accelerase Trio, el complejo enzimático ACCELLERASE® TRIO™ contiene una combinación de múltiples actividades enzimáticas que incluyen b-glucanasas (CMC 200 U/kg), xilanasas (por ejemplo, endoxilanasas, endo-1,4-b-?-xilanasa (E.C. 3.2.1.8)) (>1,200 ABX U/kg) y b-glucosidasas (> 800 pNPG U/kg) (DuPont Industrial Bioscences) mezcla de enzimas o Axtra® XB b-glucanasa con una actividad garantizada de 360 BGU de b-glucanasa/kg de alimento. +el microbiano de alimentación directa es a base de Bacillus (proporciones iguales de las cepas AGTP BS918 NRRL B-50508, AGTP BS1013 NRRL B-50509 y AGTP BS3BP5 NRRL B-50510) con una actividad garantizada de 3.0x10a cfu por gramo de producto, o Propionibacterium acidipropionici P169 PTA-5271 Omni-Bos® P169 con una actividad garantizada de 2.1xl09 cfu por gramo de producto.

Las botellas se lavan con CO2 gas durante 30 segundos, mientras se adicionan 250 yL de inoculo cecal (basado en Coles et al., 2005, Animal Feed Science and Technology 123: 421-444, la enseñanza de la cual se incorpora en la presente por referencia) y se colectó una muestra de línea base de 10 triL, el pH de la línea base se determinó y la muestra se almacenó a -20°C. Las botellas se taparon, se mezclaron suavemente y se colocaron en un baño de agua con agitación a 39°C y 160 rpm. Después de 12 h, se colectó otra muestra de 10 mi, se determinó el pH y la muestra se almacenó a -20°C. Para la cuantificación de los ácidos grasos volátiles (VFA) por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), las muestras se descongelaron y se centrifugaron a 16.1 rad durante 20 minutos, y el sobrenadante se filtró a través de una membrana de éster de celulosa mezclada de 0.22 mm (Milex-GS, Merck Millipore Corp., Billerica, MA). Del filtrado, 20 UL se inyectaron en un Módulo de Separaciones de Waters Alliance 2695 (Waters Corp., Milford, MA) equipado con una columna de guardia Shodex SH-G (Waters) y la columna Aminex HPX-87H 300 X 7.8 mm (BioRad Laboratories, Inc., Hercules, CA). Un método isocrático se aplicó con una fase móvil que consiste de ácido fosfórico 16.8 mM en agua/acetonitrilo (98:2, v/v) a una velocidad de flujo de 0.525 mL/minuto y temperatura de la columna de 35°C. Los ácidos grasos volátiles se detectaron usando un detector de arreglo de foto diodo (PDA) de Waters 2996 (Waters) a una absorción de 211 nm. El control de instrumento, la adquisición de datos y el procesamiento de los datos se lograron con los elementos de programación (software) Waters Empower 3 (Waters). Los ácidos grasos volátiles se cuantificaron usando curvas estándares generadas de reactivos de alto grado (> 99.9%) (Sigma Aldrich, St. Louis, MO). Diluciones lineales de estándares en ácido fosfórico 16.8 mM en agua/acetonitrilo (98:2, v/v) se prepararon a 6 concentraciones que oscilan desde 0.05% a 2.0%. Se determinaron la concentración de ácido acético, ácido propiónico, ácido butírico, ácido iso-butírico, ácido valérico, ácido iso-valérico (la suma de los cuales se presenta como VFA totales) y el ácido láctico. Se realizó un análisis estadístico para cada experimento como un modelo lineal ANOVA bloqueado por corrida, usando el procedimiento GLM de SPSS (versión 17, SPSS Inc., Chicago, IL). La significación se declaró como P£0.10, las medias de tratamientos se separaron usando la prueba de intervalo múltiple de Duncan.

RESULTADOS En las dietas a base de trigo, un aumento significativo en la producción de VFA totales y ácido láctico después de 12 h, se observó de la simulación del intestino caudal del porcino, cuando se adicionaron xilanasa NGX, mezcla de enzima degradante de fibra Accelerase Trio y un DFM y se compararon con el control sin suplementos (Tabla 31, experimento 1 y 2). El uso de DFM a base de Propionibacterium acidipropionici P169 aumentó más significativamente los niveles de propionato y tuvo una mayor acidificación del contenido colónico simulada en el tratamiento de combinación en comparación con el control (Tabla 31, experimento 1). En las dietas a base de maíz, el tratamiento de combinación de xilanasa Y5, enzima de degradación de fibra Accelerase Trio y DFM aumentó significativamente los niveles de butirato en comparación con el control después de 12 h de fermentación simulada del intestino caudal porcino, con un aumento adicional de VFA totales cuando se usó DFM a base de Propionibacterium acidipropionici P169 (Tabla 31, experimento 3 y 5). La sustitución de la mezcla de enzimas Accelerase Trio con la b-glucanasa Axtra® XB y el uso de DFM a base de Bacillus en la dieta de maíz con Y5 resultó en un aumento significativo de VFA totales y lactato, en comparación con el tratamiento de control (Tabla 31, experimento 4).

Tabla 31: Abundancia media de propionato, butirato y ácidos grasos volátiles totales (VFA) y lactato (% como está), así como las diferencias de pH comparando las muestras de la línea base después de 12 h de fermentación del intestino caudal porcino in vitro a-bLos valores con diferentes superíndices dentro de una columna son significativamente diferentes a P£0.10; NS, no significativo; SE , error estándar de la media; detalles de tratamiento ver la Tabla 26 Ejemplo 8. Efectos de xilanasa, otras enzimas fibrolíticas y microbianos de alimentación directa sobre la degradación de fibra del intestino caudal de porcinos Composición de la dieta experimental usada en el Ejemplo 8 Para demostrar desaparición de materia seca (DM) y la degradación de la fibra, los efluentes ileales se generaron y se estableció la fermentación del intestino caudal, como se describe en el ejemplo 7. En resumen, la dieta a base de trigo (CW, ver la Tabla 32) se usó como un control sin ningún tratamiento, así como CW además de la xilanasa Y5 (Tratamiento 1), CW con Y5 y la mezcla de enzima degradante de fibra Accelerase Trio (Tratamiento 2), CW con Y5, Accelerase en combinación con un microbiano de alimentación directa de tres cepas de Bacillus (Tratamiento 3), para detalles de la enzima y tratamientos DFM ver la Tabla 33 Tabla 33: Identificación de tratamientos* *Los productos de la enzima y microbiano de alimentación directa se incluyeron a una tasa similar a 500 g por tonelada métrica en la inclusión de alimentación, cada experimento se realizó en corridas duplicadas, los tratamientos se midieron por triplicado en cada corrida; #La dieta basal es la dieta de control de trigo (CW), como se describe en la tabla 32; †La xilanasa es Y5 (Danisco Xylanase una endo-1,4-b-D-xilanasa (E.C. 3.2.1.8)) con una actividad garantizada de 4,000 XU/kg de alimento; *La Enzima degradante de fibra es Accel. (Accelerase Trio, el complejo enzimático ACCELLERASE® TRIO™ contiene una combinación de múltiples actividades enzimáticas que incluyen b-glucanasas (CMC 200 U/kg), xilanasas (por ejemplo, endoxilanasas, endo-1,4-b-D-xilanasa (E.C. 3.2.1.8)) (>1,200 ABX U/kg) y b-glucosidasas (> 800 pNPG U/kg) (DuPont Industrial Bioscences) la mezcla de enzimas se dosificó para asegurar una actividad garantizada de 360 BGU de b-glucanasa/kg de alimento. +el microbiano de alimentación directa es a base de Bacillus (proporciones iguales de las cepas AGTP BS918 NRRL B-50508, AGTP BS1013 NRRL B-50509 y AGTP BS3BP5 NRRL B-50510) con una actividad garantizada de 3.0xl08 cfu por gramo de producto, o Propionibacterium acidipropionici P169 PTA-5271 Omni-Bos® P169 con una actividad garantizada de 2.1xl09 cfu por gramo de producto.

Efectos del tratamiento sobre la desaparición de MS y fibra. A las 0 y 48 horas del experimento, el líquido se filtró y los sólidos restantes se colectaron y enviaron para análisis de nutrientes aproximado de materia seca (MS), fibra detergente ácido y neutro (ADF y NDF, respectivamente), el último se generó sobre una base DM, de acuerdo con los métodos descritos en (Association of Analytical Chemist (AOAC) 2007, 18va. edición. AOAC, Washington, D.C). Los datos se calcularon como el porcentaje de desaparición, el análisis estadístico se realizó como ANOVA de una vía bloqueado por corrida usando el procedimiento GLM de SPSS (versión 17, SPSS Inc., Chicago, IL). La significación se declaró para p£0.10, las medias de tratamiento se separaron usando la prueba de intervalo múltiple de Duncan.

RESULTADOS En la dieta a base de trigo probada, el tratamiento de combinación de la mezcla de degradación de enzima de xilanasa Y5, Accelerase Trio y el DFM a base de tres Bacillus tuvo la desaparición más grande de DM, ADF y NDF comparado con CW sin ninguna enzima y el suplemento de DFM (Tabla 34).

Tabla 34: Desaparición porcentual de materia seca, fibra detergente ácida y neutra durante la fermentación in vitro de intestino caudal de 48 h en cerdos a'bLos valores con diferentes superíndices dentro de una columna son significativamente diferentes a P£0.10; SEM, error estándar de la media; para detalles de tratamiento ver la Tabla 7.2.

Todas las publicaciones mencionadas en la descripción anterior se incorporan en la presente por referencia. Diversas modificaciones y variaciones de los métodos y sistemas descritos de la presente invención serán evidentes para los experimentados en la téenica, sin apartarse del alcance y espíritu de la presente invención. Aunque la presente invención ha sido descrita en conexión con modalidades preferidas específicas, debe entenderse que la invención como se reivindica no debe limitarse indebidamente a tales modalidades específicas. De hecho, varias modificaciones de los modos descritos para llevar a cabo la invención que son evidentes para los experimentados en bioquímica y bioteenología o campos relacionados, se pretende que estén dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Composición de aditivo alimenticio que comprende un microbiano de alimentación directa (DFM), en combinación con una xilanasa y una b-glucanasa, caracterizada porque el DFM se selecciona del grupo que consiste de una cepa que produce una enzima; una cepa de fermentación de azúcar C5; una cepa que produce un ácido graso de cadena corta; una cepa que promueve la microflora endógena, fibrolítica; o combinaciones de las mismas.

2. Método para mejorar el desempeño de tal individuo o para mejorar la digestibilidad de una materia prima en un alimento (por ejemplo, digestibilidad de nutrientes, tal como digestibilidad de aminoácidos), o para mejorar la retención de nitrógeno, o para mejorar la tasa de conversión alimenticia (FCR) o para mejorar la ganancia de peso en un individuo, o para mejorar la eficiencia alimenticia en un individuo, o para cambiar el proceso de fermentación en el tracto gastrointestinal del individuo hacia la producción de ácido butírico y/o ácido propiónico, caracterizado porque comprende administrar a un individuo un microbiano de alimentación directa (DFM), en combinación con una xilanasa y una b-glucanasa, en donde el DFM se selecciona del grupo que consiste de una cepa que produce una enzima; una cepa de fermentación de azúcar C5; una cepa que produce un ácido graso de cadena corta; una cepa que promueve la microflora endógena, fibrolítica; o combinaciones de las mismas.

3. Composición de aditivo alimenticio o un método de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el DFM es una cepa que produce una enzima.

4. Composición de aditivo alimenticio o un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el DFM es una cepa de fermentación de azúcar C5.

5. Composición de aditivo alimenticio o un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el DFM es una cepa que produce un ácido graso de cadena corta.

6. Composición de aditivo alimenticio o un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el DFM es una cepa que promueve la microflora endógena, fibrolítica.

7. Composición de aditivo alimenticio o un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el DFM es por lo menos una cepa de bacteria seleccionada del grupo que consiste de los siguientes géneros: Bacillus, Enterococcus , Lactobacillus , Propionibacterium y combinaciones de los mismos.

8. Composición de aditivo alimenticio o un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el DFM es por lo menos una cepa seleccionada del género Bacillus, particularmente Bacillus subtilis , B. licheniformis , B. amyloliquefaciens o B. pumilus.

9. Composición de aditivo alimenticio o un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el DFM se selecciona del grupo que consiste de: Bacillus subtilis AGTP BS3BP5, Bacillus subtilis AGTP BS442, B . subtilis AGTP BS521, B . subtilis AGTP BS918, Bacillus subtilis AGTP BS1013, B. subtilis AGTP BS1069, B. subtilis AGTP 944, B. pumilus AGTP BS 1068 o B. pumilus KX11-1, Enterococcus faecium ID7, Propionibacterium acidipropionici P169, Lactobacillus rhamnosus CNCM-I-3698, Lactobacillus farciminis CNCM-I-3699, una cepa que tiene todas las características de las mismas, cualquier derivado o variante de las mismas, y combinaciones de las mismas.

10. Composición de aditivo alimenticio o un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el DFM es una bacteria viable.

11. Composición de aditivo alimenticio o un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el microbiano de alimentación directa está en la forma de una endóspora.

12. Composición de aditivo alimenticio o un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la xilanasa es una endo-1,4-b-d-xilanasa.

13. Composición de aditivo alimenticio o un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la composición de aditivo alimenticio comprende una enzima degradante de fibra adicional.

14. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-12, caracterizado porque el comprende administrar al individuo un microbiano de alimentación directa (DFM), en combinación con una xilanasa y una b-glucanasa y una enzima degradante de fibra adicional.

15. Composición de aditivo alimenticio o un método de conformidad con la reivindicación 13 o 14, caracterizado porque la enzima degradante de fibra adicional se selecciona del grupo que consiste de una celobiohidrolasa (E.C. 3.2.1.176 y E.C. 3.2.1.91), una b-glucosidasa (E.C. 3.2.1.21), una b-xilosidasa (E.C. 3.2.1.37), una feruloil esterasa (C.E. 3.1.1.73), una a-arabinofuranosidasa (C.E. 3.2.1.55), una pectinasa (por ejemplo, una endopoligalacturonasa (EC 3.2.1.15), una exopoligalacturonasa (C.E. 3.2.1.67) o una pectato liasa (C.E. 4.2.2.2)), o combinaciones de las mismas.

16. Composición de aditivo alimenticio o un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13-15, caracterizado porque la enzima degradante de fibra adicional se selecciona del grupo que consiste de una celobiohidrolasa (E.C. 3.2.1.176 y E.C. 3.2.1.91), una b-glucosidasa (E.C. 3.2.1.21) o combinaciones de las mismas.

17. Premezcla que comprende una composición de aditivo alimenticio de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 3-13 ó 15-16 o que comprende un microbiano de alimentación directa (DFM), una xilanasa y una b-glucanasa (y opcionalmente, una enzima degradante de fibra adicional), caracterizada porque el DFM se selecciona del grupo que consiste de una cepa que produce una enzima; una cepa de fermentación de azúcar C5; una cepa que produce un ácido graso de cadena corta; una cepa que promueve la microflora endógena, fibrolítica; o combinaciones de las mismas, y por lo menos una vitamina y/o por lo menos un mineral.

18. Alimento que comprende una composición de aditivo alimenticio de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 3-13 ó 15-16, o que comprende una premezcla de conformidad con la reivindicación 17, o que comprende un microbiano de alimentación directa (DFM), en combinación con una xilanasa y una b-glucanasa (y opcionalmente, una enzima degradante de fibra adicional), caracterizado porque el DFM se selecciona del grupo que consiste de una cepa que produce una enzima; una cepa de fermentación de azúcar C5; una cepa que produce un ácido graso de cadena corta; una cepa que promueve la microflora endógena, fibrolítica; o combinaciones de las mismas.

19. Método para preparar un pienso, caracterizado porque comprende mezclar un componente alimenticio con una composición de aditivo alimenticio de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 3-13 ó 15-16 o una premezcla de conformidad con la reivindicación 17.

20. Método para preparar un pienso, caracterizado porque comprende mezclar un componente alimenticio con un microbiano de alimentación directa (DFM), en combinación con una xilanasa y b-glucanasa (y opcionalmente, una enzima degradante de fibra adicional), en donde el DFM se selecciona del grupo que consiste de una cepa que produce una enzima; una cepa de fermentación de azúcar C5; una cepa que produce un ácido graso de cadena corta; una cepa que promueve la microflora endógena, fibrolítica; o combinaciones de las mismas.

21. Uso de un microbiano de alimentación directa (DFM), en combinación con una xilanasa y una b-glucanasa (y opcionalmente, una enzima degradante de fibra adicional), en donde el DFM se selecciona del grupo que consiste de una cepa que produce una enzima; una cepa de fermentación de azúcar C5; una cepa que produce un ácido graso de cadena corta; una cepa que promueve la microflora endógena, fibrolítica; o combinaciones de las mismas, para mejorar el desempeño de un individuo o para mejorar la digestibilidad de una materia prima en un alimento (por ejemplo, la digestibilidad de nutrientes, tales como digestibilidad de aminoácidos) o para mejorar la retención de nitrógeno) o para mejorar la tasa de conversión alimenticia (FCR) o para mejorar la ganancia de peso en un individuo o para mejorar la eficiencia de alimentación en un individuo, o para cambiar el proceso de fermentación en tracto gastrointestinal de un individuo hacia la producción de ácido butírico y/o ácido propiónico.

22. Uso de conformidad con la reivindicación 21, en donde se usa la composición de aditivo alimenticio de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 3-13 ó 15-16 o en donde se usa la premezcla de conformidad con la reivindicación 17 o en donde se usa un alimento de conformidad con la reivindicación 18 o se usa un pienso producido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19 ó 20.

23. Kit, caracterizado porque comprende un microbiano de alimentación directa (DFM), una xilanasa y una b-glucanasa (y opcionalmente una enzima degradante de fibra adicional), en donde el DFM se selecciona del grupo que consiste de una cepa que produce una enzima; una cepa de fermentación de azúcar C5; una cepa que produce un ácido graso de cadena corta; una cepa que promueve la microflora endógena, fibrolítica; o combinaciones de las mismas (y opcionalmente, por lo menos una vitamina y/u opcionalmente por lo menos un mineral) y las instrucciones para la administración.

24. Kit de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque comprende la composición de aditivo alimenticio de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 3-13 ó 15-16 o una premezcla de conformidad con la reivindicación 17. RESUMEN DE LA INVENCION La presente invención se relaciona con una composición de aditivo alimenticio que comprende un microbiano de alimentación directa (DFM), en combinación con una xilanasa (por ejemplo, endo-1,4-b-d-xilanasa) y una b-glucanasa (y opcionalmente, una enzima degradante de fibra adicional), en donde el DFM se selecciona del grupo que consiste de una cepa que produce una enzima; una cepa de fermentación de azúcar C5; una cepa que produce un ácido graso de cadena corta; una cepa que promueve la microflora endógena, fibrolítica; o combinaciones de las mismas. El DFM puede seleccionarse del grupo que consiste de: Bacillus subtilis AGTP BS3BP5, Bacillus subtilis AGTP BS442, B . subtilis AGTP BS521, B . subtilis AGTP BS918, Bacillus subtilis AGTP BS1013, B. subtilis AGTP BS1069, B. subtilis AGTP 944, B . pumilus AGTP BS 1068 o B. pumilus KX11-1, Enterococcus faecium ID7, Propionibacterium acidipropionici P169, Lactobacillus rhamnosus CNCM-I-3698, Lactobacillus farciminis CNCM-I-3699, una cepa que tiene todas las características de las mismas, cualquier derivado o variante de las mismas, y combinaciones de las mismas y una enzima degradante de fibra adicional puede seleccionarse del grupo que consiste de una celobiohidrolasa (E.C.3.2.1.176 y E.C. 3.2.1.91), una b-glucosidasa (E.C. 3.2.1.21), una b- xilosidasa (E.C. 3.2.1.37), una feruloil esterasa (E.C. 3.1.1.73), una a-arabinofuranosidasa (E.C. 3.2.1.55), una pectinasa (por ejemplo, una endopoligalacturonasa (E.C. 3.2.1.15), una exopoligalacturonasa (E.C. 3.2.1.67) o una pectato liasa (E.C. 4.2.2.2)), o combinaciones de las mismas.