CN101715879B - 一种复合β-甘露聚糖酶及乳酸菌饲料添加剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种复合β-甘露聚糖酶及乳酸菌饲料添加剂，其组成成份及其重量份为：β-甘露聚糖酶2～8，木聚糖酶24～30，β-葡聚糖酶9～15，纤维素酶28～33，果胶酶20～27，屎肠球菌发酵液90～110。本发明还公开了一种屎肠球菌菌株(Enterococcus faecium)Ef1008。本发明饲料添加剂可用于在蛋鸡饲料中应用，其在蛋鸡饲料中的添加比例为0.03％～0.1％。本发明可使蛋鸡产蛋率高，可使动物对其利用率大大提高，降低了饲料成本；本发明中屎肠球菌能够促进肠道的微生态平衡，提高机体免疫力，在应激环境下，降低畜禽死亡率。
Description
技术领域
本发明属于家禽饲料添加剂领域，具体涉及一种复合β-甘露聚糖酶及乳酸菌饲料添加剂，及其在蛋鸡饲料中的应用。
背景技术
目前大多数蛋鸡饲料原料中含有较多的抗营养因子，不但影响动物的消化利用率，还造成饲料资源的浪费及环境的污染。此外，鸡蛋产品还存在药物、激素、有毒有害物质超标，养殖环境的恶化等问题，已成为影响我国蛋鸡养殖业持续发展的瓶颈。研究、开发和利用“绿色”、“安全”、“环保”的饲料应为解决上述问题的有效途径。
中国专利《供成年期肉鸡专用的非常规蛋白复合鸡饲料》(申请号：200910016608.2)公开了含有β-甘露聚糖酶、木聚糖酶和小麦型复合酶等酶制剂组成的肉鸡饲料。中国专利《一种饲用复合阿魏酸酯酶添加剂及其使用方法》(申请号：200810101057.5)公开了由阿魏酸酯酶、纤维素酶、术聚糖酶和葡聚糖酶4种酶组成的酶添加剂。他们都只是单纯酶制剂的混合，没有与乳酸菌的益生效应进行叠加，因此饲养效果受到影响。
β-甘露聚糖酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、纤维素酶及果胶酶的主要作用是降解饲料原料中β-甘露聚糖、木聚糖、β-葡聚糖、纤维素及果胶等的抗营养作用，提高日粮营养物质的消化利用率。屎肠球菌属于乳酸菌，是益生菌制剂的一种，属于肠道共生菌，代谢能产生乳酸及一些抗菌物质。其主要作用是促进动物机体肠道微生态平衡，提高有益菌的数量，降低有害菌的数量，提高机体免疫力。
发明内容
本发明目的在于提供一种复合β-甘露聚糖酶及乳酸菌饲料添加剂，该添加剂能够降解饲料中的抗营养因子，补充内源性消化酶功能的不足，提高蛋禽对日粮营养物质的消化利用率；减少蛋鸡粪中有机物质的排泄量，降低环境污染，改善养殖环境；减少后肠有害微生物的生长繁殖和粘性粪便的发生率，改善鸡只的健康状况，降低脏蛋率，促进蛋鸡肠道微生态平衡，提高机体免疫力；提高料蛋比和蛋鸡产蛋率，降低饲养成本；缩小不同批次原料质量的差异性，稳定饲料产品的质量。
本发明另一目的是提供上述复合β-甘露聚糖酶及乳酸菌饲料添加剂在蛋鸡饲料中的应用。
本发明还一目的是提供一种屎肠球菌菌株。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
一种复合β-甘露聚糖酶及乳酸菌饲料添加剂，其组成成份及其重量份为：
β-甘露聚糖酶 2～8
木聚糖酶 24～30
β-葡聚糖酶 9～15
纤维素酶 28～33
果胶酶 20～27
屎肠球菌发酵液90～110。
上述复合β-甘露聚糖酶及乳酸菌饲料添加剂，其组成成份及其重量份优选为：
β-甘露聚糖酶 4
木聚糖酶 27
β-葡聚糖酶 13
纤维素酶 31
果胶酶 24
屎肠球菌发酵液 101。
上述复合β-甘露聚糖酶及乳酸菌饲料添加剂的制备方法，按照比例将β-甘露聚糖酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、纤维素酶和果胶酶混合均匀，然后按照比例加入屎肠球菌发酵液，混合均匀，再在45℃条件下烘干，使水分含量≤10％，即得复合β-甘露聚糖酶及乳酸菌饲料添加剂。
上述复合β-甘露聚糖酶及乳酸菌饲料添加剂中所述的屎肠球菌发酵液中屎肠球菌的活菌数为≥5×1010CFU/mL。
上述复合β-甘露聚糖酶及乳酸菌饲料添加剂中所述各种酶，其原料酶活分别为：β-甘露聚糖酶的酶活为1700U/g，木聚糖酶的酶活为≥50000U/g；β-葡聚糖酶的酶活性为≥8000U/g，纤维素酶的酶活性为≥10000U/g，果胶酶的酶活性为≥20000U/g。
酶活定义：1个酶活力单位是指在特定条件下，在1分钟内能转化1微摩尔底物的酶量，或是转化底物中1微摩尔的有关基团的酶量。
所述的β-甘露聚糖酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、纤维素酶和果胶酶均可从市场上购买。其中β-甘露聚糖酶也可根据中国专利《一种甘露聚糖酶及其编码基因与应用》(专利号：ZL200510103125.8)所述的方法制备。
上述屎肠球菌发酵液中的屎肠球菌可以是屎肠球菌菌株(Enterococcusfaecium)Ef1008，该菌株已于2009年12月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.3537。
所述的屎肠球菌菌株Ef1008是从蛋鸡肠道中筛选鉴定的，乳酸产量≥6g/L发酵液，对大肠杆菌K88、大肠杆菌K99、沙门氏菌的抑菌圈直径≥18mm。
所述的屎肠球菌发酵液，按照如下方法制备：按照2％的重量百分比将屎肠球菌菌种接种于MRS培养基上，在37℃，160rpm条件下培养9小时，即得屎肠球菌发酵液；所得屎肠球菌发酵液中屎肠球菌的活菌为≥5×1010CFU/mL；其中所述的MRS培养基的组成成分及其含量为：蛋白胨10g/L、牛肉浸膏10g/L、酵母浸膏5g/L、K2HPO4 2g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠5g/L、吐温-80 1mL，MgSO4·7H2O 0.58g/L、MnSO4·4H2O 0.25g/L，用1mol/LNaOH调节pH为7.2，115℃灭菌30min。
上述屎肠球菌菌种可以是Ef1008。
上述复合β-甘露聚糖酶及乳酸菌饲料添加剂可用于在蛋鸡饲料中应用，其在蛋鸡饲料中的添加比例为0.03％～0.1％。
含有上述复合β-甘露聚糖酶及乳酸菌饲料添加剂的蛋鸡饲料，其中复合β-甘露聚糖酶及乳酸菌饲料添加剂的重量百分比为0.03％～0.1％，其中基础饲料的组成成份及预混料及其重量份为：
玉米 30～50
小麦 15～35
豆粕 15～25
菜籽粕 3～8
棉籽粕 3～8
石粉 8～9
磷酸氢钙 1-1.5
赖氨酸盐酸盐 0.05～0.1
蛋氨酸 0.05～0.1
预混料 1～5
所述的基础日粮的制备方法，将上述组分按照重量份混合均匀即可。
所述的预混料的组成为：每千克预混料提供：维生素D3为20～40万IU，维生素E为1300～3000IU，维生素K3为200～400mg，维生素B1为≥160mg，维生素B2为≥700mg，维生素B6为≥300mg/Kg，维生素B12为≥1.8mg，生物素为≥12mg，烟酸为≥2200mg，泛酸为≥900mg，叶酸为≥70mg。预混料可于市场上购买，如可于北京伟嘉人生物技术有限公司购买。
上述蛋鸡饲料中所述的基础日粮组份和预混料均可从市场上购买。
所述的屎肠球菌Ef1008的筛选及鉴定过程：无菌采集5日龄健康蛋鸡回肠黏膜，用灭菌的载玻片刮取回肠黏液，用灭菌生理盐水稀释104倍，取0.1mL接种于EC培养基(EC培养基的组成成份及其比例为：胰蛋白胨2g，酵母浸膏0.5g，葡萄糖0.2g，Na2HPO40.4g，K2HPO40.4g，琼脂2g，双蒸水100ml，pH7.4，冷至45～50℃。加入NaN3至终浓度为0.4mg/ml，2，3，5-氯化三苯四氮唑(TTC)0.1mg/ml，倒平板。)平板上，37℃厌氧培养24h，挑取紫红色，表面光滑凸起，周边整齐，直径1.0～1.5mm的菌落，传代于EC基础斜面培养基，涂片，革兰氏染色镜检，筛选G+，圆形或卵圆形，单个、成对或短链状排列的菌株。然后将筛选菌株再在MRS平板上划线接种纯培养。
在MRS液体培养基中培养16h，取样测乳酸产量，对大肠杆菌K88做抑菌实验，培养液在80℃水浴10min，取原液0.4mL涂板挑取80℃水浴存活的菌种接到斜面上，选取80℃水浴存活的，乳酸产量≥6g/L发酵液，并且对大肠杆菌K88、大肠杆菌K99、沙门氏菌的抑菌圈直径≥18mm的菌株，筛选得到屎肠球菌菌株Ef1008，冻存，采用40％的甘油作为保护剂。
屎肠球菌Ef1008的形态特征为表面光滑凸起，周边整齐，直径1.0～1.5mm的菌落，并筛选G+，圆形或卵圆形，短链状排列，这些和屎肠球菌的形态特征相符合。屎肠球菌Ef1008为革兰氏阳性菌，能在10℃和45℃生长，发酵葡萄糖产酸，可生长于6.5％NaCl和40％胆汁盐环境中，精氨酸产氨，不分解鼠李糖、松三糖和山梨醇，能分解蔗糖、密二糖、乳糖、麦芽糖和棉子糖，对庆大霉素、卡那霉素、多粘菌素和链霉素不敏感，对青霉素、红霉素、万古霉素，和阿莫西林敏感。这些特性与屎肠球菌的生理生化特征相符合，因此可确定菌株Ef1008为屎肠球菌(Enterococcus faecium)。
对屎肠球菌Ef1008的16S rDNA进行测序(见序列表SEC ID No：1)，并对测得的序列应用BLAST程序与数据库中已发表的屎肠球菌16S rDNA序列(Accession No.AY675247)进行相似性比较，同源性均为99％，说明筛选的菌株Ef1008经16S rDNA鉴定为屎肠球菌，并且和其他菌株不同。
本发明具有的优点：(1)、本发明可使蛋鸡产蛋率高，料蛋比高，主要是其中所含的β-甘露聚糖酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、纤维素酶、果胶酶能降低饲料原料中β-甘露聚糖、木聚糖、β-葡聚糖、纤维素及果胶的抗营养作用，使动物对其利用率大大提高，降低了饲料成本；(2)、本发明屎肠球菌属于肠道共生的乳酸菌，生长速度快，培养保存条件要求小，粘附能力强，乳酸及细菌素等抗菌物质产量高，能够促进肠道的微生态平衡，提高机体免疫力，在应激环境下，降低畜禽死亡率。
具体实施方式
实施例1屎肠球菌发酵液的制备
将屎肠球菌Ef1008(已于2009年12月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.3537)菌种按照2％的接种量接到MRS培养基(MRS培养基的组成成份及其含量为：蛋白胨10g，牛肉浸膏10g，酵母浸膏5g，K2HPO4 2g，柠檬酸氢二铵2g，葡萄糖20g，乙酸钠5g，Tween-80 1mL，MgSO4·7H2O 0.58g，MnSO4·4H2O 0.25g，1000mL蒸馏水，用1mol/LNaOH调节pH为7.2，115℃灭菌30min)中，在37℃，160r/min条件下培养9小时，即得屎肠球菌发酵液；所得发酵液的活菌为≥5×1010CFU/mL。
实施例2复合β-甘露聚糖酶及乳酸菌饲料添加剂的制备
按照如下方法进行：
按照下述重量份取β-甘露聚糖酶(购于中国农业科学院饲料研究所)，酶活为1700U/g)4，木聚糖酶(购于武汉新华扬生物技术有限公司，酶活为≥50000U/g))27，β-葡聚糖酶(购于武汉新华扬生物技术有限公司，酶活性为≥8000U/g)13，纤维素酶(购于武汉新华扬生物技术有限公司，酶活性为≥10000U/g)31，果胶酶(购于武汉新华扬生物技术有限公司，酶活性为≥20000U/g)24，实施例1制备的屎肠球菌发酵液(发酵液活菌为≥5×1010CFU/mL)101；将上述酶混合均匀，然后再将屎肠球菌发酵液与复合β-甘露聚糖酶混合均匀，再在45℃条件下烘干，即得复合β-甘露聚糖酶及乳酸菌饲料添加剂产品，所得产品中每克产品屎肠球菌活菌数为≥1×1010CFU。
实施例3复合β-甘露聚糖酶及乳酸菌制剂的蛋鸡饲料的制备
按表1的基础日粮组分和预混料将各组分混匀，得基础日粮。
表1基础日粮组分及营养成分
预混料(购于北京伟嘉人生物技术有限公司，1％蛋鸡用复合预混合饲料3210)按1％的量添加，其中每千克预混料提供：维生素D3为20～40万IU，维生素E为1300～3000IU，维生素K3为200～400mg，维生素B1为≥160mg，维生素B2为≥700mg，维生素B6为≥300mg/Kg，维生素B12为≥1.8mg，生物素为≥12mg，烟酸为≥2200mg，泛酸为≥900mg，叶酸为≥70mg。
试验组日粮在基础日粮的基础上加入0.05％的复合β-甘露聚糖酶及乳酸菌饲料添加剂，混合均匀即可。
实施例4含有复合β-甘露聚糖酶及乳酸菌饲料添加剂的蛋鸡饲料的饲养试验
本试验采用完全随机试验设计方案。选择30周龄健康海兰灰蛋鸡1890只，随机分成试验I组、试验II组和对照组(见表2)，每处理630只，每个处理设5个重复，每个重复126只鸡，三组基础日粮和预混料相同。
(1)试验I组添加按照0.5g/kg比例复合β-甘露聚糖酶及乳酸菌饲料添加剂。
(2)试验II组按照0.5g/kg比例添加市场上购买的小麦-杂粕日粮专用酶制剂(含有木聚糖酶、β-葡聚糖酶、纤维素酶、果胶酶、植酸酶等)
(3)对照组只喂基础日粮和预混料，进行为期8周的试验。
分别将试验及对照组所述重量的组份粉碎。然后，按照拟定配方准确计量各组分，混匀，放入包装，在阴凉干燥通风处储存，作为饲养试验的日粮。
试验过程中主要考察的指标为：蛋鸡的生长性能、蛋鸡蛋品质、营养物质消化率(AIA法)及肠道微生物的变化(稀释涂布平板法)及发酵粪中氨气和硫化氢释放量(氨用纳氏试剂比色法，硫化氢用滴定法)等。
试验数据在Excel软件中进行初步运算后，用SPSS10.0 For Windows进行统计分析。各指标差异用one-way ANOVA进行分析，用LSD进行多重比较，结果见下表2～6。
表2蛋鸡生长性能试验结果
| 指标 | 对照组 | 试验I组 | 试验II组 |
| 产蛋率(％) | 87.45±0.77A | 92.55±0.26B | 91.01±0.48B |
| 日采食量(g) | 106.66±1.3a | 110.73±0.65a | 107.93±0.95a |
| 料蛋比(％) | 2.05±0.07a | 1.90±0.047b | 1.96±0.08a |
| 平均蛋重(g) | 60.05±0.52a | 61.90±0.46b | 60.96±0.48a |
| 破蛋率(％) | 1.52±0.82a | 0.48±0.19a | 1.12±0.76a |
| 软蛋率(％) | 0.34±0.47a | 0.13±0.19a | 0.15±0.05a |
| 脏蛋率(％) | 0.53±0.43a | 0.19±0.09a | 0.46±0.46a |
| 死淘率(％) | 0.76±0.29a | 0.1±0.23a | 0.32±0.28a |
注：同行标有相同字母表示差异不显著(P＞0.05)，小写字母不同表示差异显著(P＜0.05)，大写字母不同表示差异极显著(P＜0.01)，下表同。
由表2可以看出，饲喂含有本发明的复合β-甘露聚糖酶及乳酸菌饲料添加剂的蛋鸡饲料与基础日粮相比，产蛋率提高了5.83％(P＜0.01)，而且平均蛋的重量也增加了3.08％(P＜0.05)，日采食量增加了3.82％(P＞0.05)，料蛋比减少了7.32％(P＜0.05)。
饲喂含有本发明复合β-甘露聚糖酶及乳酸菌饲料添加剂的蛋鸡饲料与添加市场上的复合酶制剂相比，产蛋率提高了1.69％(P＞0.05)，而且平均蛋的重量也增加了1.54％(P＜0.05)，日采食量增加了1.19％(P＞0.05)，料蛋比减少了1.69％(P＜0.05)。
表3鸡蛋蛋品质试验结果
| 指标 | 对照组 | 试验I组 | 试验II组 |
| 蛋形指数 | 1.28±0.02a | 1.26±0.02a | 1.27±0.02a |
| 蛋黄比例(％) | 27.41±1.11a | 29.63±1.25a | 28.55±0.79a |
| 蛋黄指数(％) | 39.78±1.07a | 43.47±1.77b | 42.28±1.90b |
| 蛋黄颜色 | 7.05±0.42a | 9.09±0.26b | 7.96±0.32a |
| 蛋壳厚度(mm) | 0.33±0.01a | 0.37±0.02b | 0.35±0.01b |
| 蛋壳比例(％) | 11.58±0.53a | 12.47±0.25a | 12.29±0.45a |
| 哈夫单位 | 85.36±2.49a | 91.35±3.19b | 90.20±3.06b |
由表3可以看出，在蛋形指数、蛋黄比例及蛋壳比例等指标上，各处理组差异不显著(P＞0.05)。饲喂含有本发明添加复合β-甘露聚糖酶及乳酸菌的蛋鸡饲料与基础日粮相比，能够显著提高蛋黄的重量，加深蛋黄的颜色，提高蛋壳强度。
表4蛋鸡对能量与粗蛋白的表观利用率结果
| 指标 | 对照组 | 试验I组 | 试验II组 |
| 蛋白质的表观利用率 | 46.90±2.42A | 52.46±2.16B | 50.67±2.35B |
| 能量的表观利用率 | 75.38±2.59A | 80.26±1.05B | 78.33±0.69B |
由表4可以看出，饲喂含有本发明复合β-甘露聚糖酶及乳酸菌饲料添加剂的蛋鸡饲料与基础日粮相比，蛋白质的表观利用率提高了11.85％(P＜0.01)，能量的表观利用率提高了6.47％(P＜0.01)。
饲喂含有本发明复合β-甘露聚糖酶及乳酸菌添加剂饲料添加剂的蛋鸡饲料与添加市场上的复合酶制剂相比，蛋白质的表观利用率提高了3.53％(P＞0.05)，能量的表观利用率提高了2.46％(P＞0.05)。
表5蛋鸡盲肠肠道菌群试验结果(lgCFU/g盲肠内容物)
| 指标 | 对照组 | 试验I组 | 试验II组 |
| 乳酸菌 | 7.24±0.04A | 8.99±0.02B | 7.93±0.02A |
| 大肠杆菌 | 8.56±0.02A | 7.21±0.03B | 8.01±0.03A |
由表5可以看出，饲喂含有本发明复合β-甘露聚糖酶及乳酸菌饲料添加剂的蛋鸡饲料不管是与基础日粮相比还是与添加市场上的复合酶制剂相比均能极显著的提高蛋鸡盲肠中乳酸菌的含量(P＜0.01)，降低其大肠杆菌的含量(P＜0.01)。
表6蛋鸡发酵粪中氨气和硫化氢释放量的试验结果(mg/m3)
| 指标 | 对照组 | 试验I组 | 试验II组 |
| 氨气 | 35.33±2.11A | 21.18±3.02B | 29.34±2.82A |
| 硫化氢 | 1257.37±65.71A | 889.00±63.23B | 1088.37±64.59B |
由表6可以看出，饲喂含有本发明复合β-甘露聚糖酶及乳酸菌饲料添加剂的蛋鸡专用饲料与基础日粮相比，氨气逸出量降低了40.05％(P＜0.01)，硫化氢逸出量降低了29.29％P＜0.01)。
饲喂含有本发明复合β-甘露聚糖酶及乳酸菌饲料添加剂的蛋鸡饲料与添加市场上的复合酶制剂相比，氨气逸出量降低了27.81％(P＜0.01)，硫化氢逸出量降低了18.31％(P＞0.05)。
终上所述：复合β-甘露聚糖酶及乳酸菌饲料添加剂可以提高肠道中有益菌的数量，降低有害菌的数量，维持肠道微生态平衡，提高饲料原料的利用率，减少环境污染，进而提高其生产性能及蛋品质。
序列表
<110>北京联合盛邦生物技术有限公司
<120>一种复合β-甘露聚糖酶及乳酸菌饲料添加剂
<160>1
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>1522
<212>DNA
<213>Enterococcus faecium
<400>1
tacggttacc ttgttacttc accccaatca tctatcccac cttaggcggc tggctccaaa 60
aggttacctc accgacttcg ggtgttacaa actctcgtgg tgtgacgggc ggtgtgtaca 120
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tagctaatgc accgcgggtc catccatcag cgacacccga aagcgccttt caaatcaaaa 1320
ccatgcggtt tcgattgtta tacggtatta gcacctgttt ccaagtgtta tccccttctg 1380
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agctccggtg gaaaaagaag cgttcgactt gcatgtatta ggcacgccgc cagcgttcgt 1500
cctgagccag gatcaaactc ta 1522
Claims (6)
1.一种复合β-甘露聚糖酶及乳酸菌饲料添加剂，其特征在于其组成成份及其重量份为：
其中所述的屎肠球菌发酵液中屎肠球菌的活菌数为≥5×1010CFU/mL；其原料酶活分别为：β-甘露聚糖酶的酶活为1700U/g，木聚糖酶的酶活为≥50000U/g；β-葡聚糖酶的酶活性为≥8000U/g，纤维素酶的酶活性为≥10000U/g，果胶酶的酶活性为≥20000U/g；所述的屎肠球菌是屎肠球菌菌株(Enterococcus faecium)Ef1008，已于2009年12月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.3537；
所述的屎肠球菌发酵液按照如下方法制备：按照2％的重量百分比将屎肠球菌菌种接种于MRS培养基上，在37℃，160rpm条件下培养9小时，即得屎肠球菌发酵液；所得屎肠球菌发酵液中屎肠球菌的活菌为≥5×1010CFU/mL；其中所述的MRS培养基的组成成分及其含量为：蛋白胨10g/L、牛肉浸膏10g/L、酵母浸膏5g/L、K2HPO42g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠5g/L、吐温-801mL，MgSO4·7H2O 0.58g/L、MnSO4·4H2O 0.25g/L，用1mol/LNaOH调节pH为7.2，115℃灭菌30min。
2.按照权利要求1所述的饲料添加剂，其特征在于其组成成份及其重量份为：
3.权利要求1或2所述的饲料添加剂在蛋鸡饲料中应用。
4.按照权利要求3所述的应用，其特征在于所述的饲料添加剂在蛋鸡饲料中的添加比例为0.03～0.1％。
5.含有权利要求1或2所述的饲料添加剂的蛋鸡饲料，其特征在于权利要求1或2所述的饲料添加剂的重量百分比为0.03％～0.1％，其中基础饲料的组成成份及预混料及其重量份为：
6.按照权利要求5所述的蛋鸡饲料，其特征在于所述的预混料的组成为：每千克预混料提供：维生素D3为20～40万IU，维生素E为1300～3000IU，维生素K3为200～400mg，维生素B1为≥160mg，维生素B2为≥700mg，维生素B6为≥300mg/Kg，维生素B12为≥1.8mg，生物素为≥12mg，烟酸为≥2200mg，泛酸为≥900mg，叶酸为≥70mg。
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