CN101376675A - 一种抗微生物肽 - Google Patents

Abstract

一种抗微生物肽，该肽具有如序列表SEQ ID NO：1所示的肽序列，该肽可用以有效抑制及杀死微生物，减少病原菌，达到治疗目的，以提升动物体的健康状态；另外可借由诱导编码该抗微生物肽的免疫基因表达，以提升动物体的免疫力及抗病能力，达到减少死亡，提高动物存活率与产量。

Description

一种抗微生物肽

技术领域

本发明涉及一种抗微生物肽，特别涉及一种可抑制及杀死微生物，并用以作为治疗目的与增加个体健康的抗微生物肽。

背景技术

石斑鱼为亚太地区重要的养殖鱼种之一，由于其肉质鲜美，长久以来位居水产品销售之首，广受台湾、香港、大

、日本及东南亚地区的消费者的喜爱。台湾石斑鱼繁养殖始于1975年，养殖方式可区分为海上箱网养殖与内陆咸水鱼塭养殖。1997年农委会渔业署为推动台湾成为亚太水产种苗中心，已将各类石斑鱼繁养殖列为首要的施政项目亦是科技养殖的重点(蔡贤筑，2000，石斑鱼饲料之改进-不同蛋白源取代鱼粉试验，硕士论文，台湾海洋大学水产养殖研究所，1-20页)。台湾石斑鱼养殖已有将近20年的历史，在1999-2002年获利率更高达20％，显示石斑鱼为高经济价值鱼种，且在台湾已是发展成熟并且能稳定获利的产业。

石斑鱼的病害主要分为病毒与细菌性两类，病毒是目前危害石斑鱼很严重的病害，包括虹彩病毒(iridovirus)与神经坏死病毒(nervous necrosis virus)是为石斑鱼易感染的两种病毒；其中，神经坏死病毒(nervous necrosis virus，NNV)是目前石斑鱼最为困扰的病毒，这种病毒的传染能力迅速，致病力超强，短时间内可以让鱼苗大量的死亡。

神经坏死病毒属于结病毒科(Nodaviride)，其没有外套膜，构形为二十面体与球形间，具有双股RNA。石斑鱼在鱼苗时期最容易受到感染，感染时会使鱼苗失去平衡能力，以螺旋方式游泳，而且还会向不同方向冲撞；严重的病鱼会浮在水面上，体侧向上漂浮，有刺激时会突然快速游动(刘文御，2002，养殖水产生物病害防治，行政院农业委员会水产试验所，84-88页)。

细菌性毒害包括：爱德华氏菌、弧菌、产气单胞菌、链球菌和葡萄球菌，这些细菌类一直以来是养殖业者都会遇到的问题，石斑鱼亦容易遭受细菌性感染，造成业者的损失。鱼体被细菌感染的原因有许多，最容易发病的几个原因为：饲养密度过高、鱼只大小差異大、残食、水质不当等，这些都是容易让鱼体产生伤口，导致细菌容易感染的因素；细菌性感染分为全身性感染以及局部性感染；全身性感染为细菌感染部位遍及每个组织，局部性感染则为细菌只感染体表或是内脏。当石斑鱼受到弧菌感染时，身体表面会出现白色斑点。随着病情的严重，伤口溃烂、红肿、鳞片脱落和内脏的出血，最终导致鱼只死亡(刘文御，2002，养殖水产生物病害防治，行政院农业委员会水产试验所，84-88页)。

石斑鱼为台湾经济养殖鱼种，但在鱼苗时期容易被疾病所困扰，导致每年产量不稳定，目前各种研究都是利用疫苗的方式，來增加鱼体的免疫能力；然而，使用疫苗所产生的免疫能力不佳，常需要追加施打疫苗來维持鱼体中免疫反应，因此疫苗无法有效的让鱼体持续增加免疫能力。非但如此，这些疫苗中有五成以上利用死亡的病原菌，这方式到目前都让业者质疑疫苗的安全性。由此可知，研究鱼类免疫系统与找寻鱼类自体抗菌物质有其必要性。

抗微生物肽(antimicrobial peptides，AMPs)普遍存在于植物与动物中，属于内生型免疫系统中的一环。抗微生物肽通常是小分子的阳離子，由带正电荷的氨基酸组成(Hancock，R.E.，Lehrer，R.，1998.Cationic peptides：a new source of antibiotics.TrendsBiotechnol 16，82-88.)。鱼类的抗微生物肽，从鲨鱼的角鲨胺(squalamine)被发现后(Moore，K.S.，Wehrli，S.，Roder，H.，Rogers，M.，Forrest，J.N.，Jr.，McCrimmon，D.，Zasloff，M.，1993.Squalamine：an aminosterol antibiotic from the shark.Proc Natl AcadSci U S A 90，1354-1358.)，目前许多鱼类的抗微生物肽也被发表。

抗微生物肽根据化学结构分为三大类，第一类为两亲α-螺旋(amphipathicα-helix)肽，因为结构的关系也称为线性肽(linear peptides)，结构中由于没有半胱氨酸残基(cysteine residues)，因此无双硫键形成；第二类则是形成分子内双硫键(interamolecular disulfide bond)，此类抗微生物肽含有半胱氨酸残基(cysteineresidues)，可产生双硫键(disulfide bond)因而形成发夹状β-折板(hairpin-like β-sheet)及α-螺旋β-折板混合(α-helix-β-sheet mix)两种结构(Bulet，P.，Hetru，C.，Dimarcq，J.L.，Hoffmann，D.，1999.Antimicrobial peptides in insects；structure and function.Dev CompImmunol 23，329-344.)；第三类为脯氨酸和/或甘氨酸残基过度保留区(overpresentation proline and/or glycine residues)，此种微生物肽含有高度脯氨酸(proline-rich)的肽，从分子的大小又可以分为短链(short-chain)及长链(long-chain)。

在目前抗微生物肽的研究上发现，抗微生物肽可以对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌及原生动物都有破坏的能力(Powers，J.P.and Hancock，R.E.，2003.Therelationship between peptide structure and antibacterial activity.Peptides 24，1681-1691.)；除了对抗微生物之外，抗微生物肽亦可能与发育(development)、动物脱壳(molting)及生殖(reproduction)有关联；但目前的研究中并未揭示抗微生物肽和动植物的免疫因子调控有任何相关可能性。

抗微生物肽的抗微生物的机制分为两大类，第一类为肽脂质交互作用(peptide-lipid interaction)，其中可细分为筒狀穿凿模式(barrel-stave mode)和地毯狀覆盖模式(carpet mode)(Shai，Y.，1999.Mechanism of the binding，insertion and destabilization ofphospholipid bilayer membranes by alpha-helical antimicrobial and cell non-selectivemembrane-lytic peptides.Biochim Biophys Acta 1462，55-70.)。筒狀穿凿模式以两亲α-螺旋(α-helix)抗菌肽卷成筒狀插入膜内，利用抗微生物肽疏水性(hydrophobic)端与菌的细胞膜接触，另一亲水性(hydrophilic)端互相面对面，则为抗微生物肽的亲水性端面向中心点，以聚合体的方式在膜上形成孔洞，來造成菌体内外渗透压不平行，导致菌体死亡(邱子庭，2001，分子选殖与草虾抗微生物胜肽特性之研究，硕士论文，台湾海洋大学水产养殖研究所，1-39页)。另外，地毯狀覆盖模式则是在带正电的抗微生物肽与带负电菌体细胞膜结合后，抗微生物肽的亲水性端与膜上的磷脂质(phospholipids head groups)或水分子反应，抗微生物肽经过翻转后，导致疏水性端的部分包围一部分菌体的膜，进而把此膜构造移除，破坏菌体膜的结构而使病原菌死亡(杨子萱，2004，利用重组大肠杆菌表现草虾抗微生物胜肽，硕士论文，台湾大学微生物与生化学研究所硕士论文，1-16页)。

抗微生物机制的第二类为间接由受体介导的辨識过程(Receptor-mediatedrecognition processes)，有些抗微生物肽可能与原核生物的脱氧核醣核酸(deoxyribonucleic acid)、自溶素(autolysins)和细胞通透能力(permeability)有关，可以抑制真菌孢子的萌芽及菌丝的延长与分枝(Thevissen，K.，Osborn，R.W.，Acland，D.P.，Broekaert，W.F.，1997.Specific，high affinity binding sites for an antifungal plantdefensin on Neurospora crassa hyphae and microsomal membranes.J Biol Chem 272，32176-32181.)。另外有文献指出，抗微生物肽有与原核生物核酸结合的能力，因而抑制蛋白质的产生(Powers，J.P.and Hancock，R.E.，2003.The relationship betweenpeptide structure and antibacterial activity.Peptides 24，1681-1691.)。

由此可见，上述现有技术动物抗微生物的方式仍有诸多缺点，而亟待加以改良。

发明内容

本发明的目的即在于提供一种抗微生物肽，以减少动物体内的病原菌，达到治疗效果，并提升动物体的健康状态。

本发明的次一目的是在于提供一种用以编码如上述发明目的抗微生物肽的核苷酸片段。

本发明的另一目的是在于提供一种用以杀死微生物的组合物，该组合物包含药学有效量的肽片段，以及药学上可接受的载体。

本发明的又一目的在于提供一种用以筛选能增加动物免疫力的免疫诱导剂(immune elicitors)的方法。

本发明的再一目的是在于提供一种增加动物抗病力的方法，是将免疫诱导剂口服投予动物体内。

可实现上述发明目的的抗微生物肽，包含如序列表SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

由于本发明的抗微生物肽是一种抗菌肽(antimicrobial peptide，AMP)，抗菌肽为一种广泛分布于各动植物免疫系统中的肽片段；因此，本发明的抗微生物肽可取自天然的动物，尤其是水生动物，或以已知化学合成法合成，亦可以已知分子生物学方法制备。

本发明亦包含一种用以编码上述抗微生物肽的核苷酸片段，该核苷酸片段具有如序列表SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

本发明更提供一种用以杀死微生物的医药组合物，该组合物包含：

药学有效量的肽片段；以及

药学上可接受的载体。

其中该肽片段具有如序列表SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

其中该组合物的形式可为包埋物、浸泡液、饲料、饲料添加物、口服液、注射疫苗、贴片、粉末、锭剂、注射液体、悬浮液、外用液、滴剂、擦剂、涂剂、乳霜、油膏、软膏、糊状剂、胶以及凝胶等。

其中该载体可为赋形剂、稀释剂、增稠剂、填充剂、结合剂、崩解剂、润滑剂、油脂或非油脂的基剂、界面活性剂、悬浮剂、胶凝剂、辅助剂、防腐剂、抗氧化剂、稳定剂、着色剂、香料等。

其中该润滑剂包含但不限于甘油及油类(如：花生油、蓖麻油)。

其中该基剂包含碳氢化合物(ydrocarbons)，该碳氢化合物包含但不限于硬石蜡、软石蜡、石蜡油、甘油、蜂蜡、金属皂、天然油(如：杏仁油、玉米油、花生油、蓖麻油或橄榄油)、羊毛脂及其衍生物、脂肪酸(如：硬脂酸或油酸)或其组合物。

其中该界面活性剂包括阴离子界面活性剂、阳离子界面活性剂、非离子界面活性剂，该界面活性剂包含但不限于脱水山梨醇酯(sorbitan esters)、聚氧化乙烯(polyoxyethylene)及其衍生物(如：聚氧化乙烯脂肪酸酯polyoxyethylene fattyacid esters)、羧基聚亚甲基物(carboxypolymethylene)及其衍生物(如：卡伯汉树脂carbopol)。

其中该悬浮剂包含但不限于天然胶(natural gums)、纤维素(Cellulose)衍生物、无机物(如：silicaceous silicas)、聚乙二醇540(polyethylene glycol 540)、聚乙二醇3350及丙二醇(propyl glycol)等。

其中该胶凝剂包含任何用于药学上形成胶体的胶凝剂，该胶凝剂包含但不限于纤维素(Cellulose)衍生物(如：甲基纤维素(methyl cellulose)、羟基乙基纤维素(hydroxyethyl cellulose)以及羧甲基纤维素(carboxymethyl cellulose)等)、乙烯基聚合物(vinyl polymers)，如：聚乙烯醇(polyvinyl alcohols)、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidones)、羧基聚亚甲基物(carboxypolymethylene)衍生物(如：卡伯汉树脂carbopol)、果胶、胶类(gums)(如：阿拉伯树胶、黄蓍胶(tragacanth)、藻胶(alginates)、琼脂(agar)、明胶(gelatin)以及角菜酸盐(carrageenates))。

其中该医药组合物是以口服、浸泡、注射、涂抹或贴片的方式投予人体及动物体内。

其中该动物可为畜产动物或水生动物；当为畜产动物时，较佳者为牛、羊、鸡或猪，更佳者为鸡；当为水生动物时，较佳者为鱼类，更佳者为养殖鱼类；在此所称的养殖鱼类是指可借由人工饲养的鱼类，较佳为水产养殖业者所养殖的鱼类，例如：石斑鱼(grouper)、海鲡(cobia)、鲷鱼(seabream)、比目鱼(halibut)、鲑鱼(salmon)、鳟鱼(trout)、鲶鱼(catfish)、鲤鱼(carp)、金鱼(goldfish)、吴郭鱼(tilapia)与斑马鱼(zebrafish)等，但并不仅限于此。

本发明所述的动物，可为畜产动物或水生动物；当为畜产动物时，较佳者为牛、羊、鸡或猪，更佳者为鸡；当为水生动物时，较佳者为鱼类，更佳者为养殖鱼类；在此所称的养殖鱼类是指可借由人工饲养的鱼类，较佳为水产养殖业者所养殖的鱼类，例如：石斑鱼(grouper)、海鲡(cobia)、鲷鱼(seabream)、比目鱼(halibut)、鲑鱼(salmon)、鳟鱼(trout)、鲶鱼(catfish)、鲤鱼(carp)、金鱼(goldfish)、吴郭鱼(tilapia)与斑马鱼(zebrafish)等，但并不仅限于此。

其中该肽片段可由已知化学合成法合成，亦可以已知分子生物学方法制备，分子生物学方法如下：

步骤a 提供如序列表SEQ ID NO：2所示的核苷酸片段；

步骤b 提供一表达载体；

步骤c 将该核苷酸片段与该表达载体重组为一重组表达载体；

步骤d 将该重组表达载体送入宿主细胞中；以及

步骤e 使该宿主细胞表达该肽片段。

其中该宿主细胞可以是大肠杆菌(E.coli)、酵母菌及动物细胞，但不仅限于此。

以大肠杆菌(E.coli)为例，可选定大肠杆菌(E.coli)系统的表达载体(expressionvector)后，再选定该表达质体中适当的限制酶切位(restriction enzyme site)，以该限制酶剪切该表达质体，亦以该限制酶剪切含有可编码本发明的肽片段的核苷酸序列的核苷酸片段，将前述经限制酶剪切后的表达质体及核苷酸片段进行接合反应(ligation)，接着将含有可编码本发明的肽片段的核苷酸序列的大肠杆菌(E.coli)系统表达质体转化(transform)入大肠杆菌(E.coli)菌体中，该大肠杆菌(E.coli)可为E.coli BL21^TM(DE3)pLysS，转化可用电转化(electro-transformation)或热休克(heatshock)等任何已知转化技术来进行，转化后用诱导物(inducer)诱导大肠杆菌(E.coli)表达本发明的肽片段，诱导物可为異丙基硫代半乳糖(isopropylthiogalactoside，IPTG)等已知诱导物。

以酵母菌为例，则可选定酵母菌系统的表达载体及该表达质体中适当的限制酶切位后，以该限制酶剪切该表达质体，亦以该限制酶剪切含有可编码本发明的肽片段的核苷酸序列的核苷酸片段，将以限制酶剪切后的表达质体及核苷酸片段进行接合反应，接着将含有可编码本发明的肽片段的核苷酸序列的酵母菌系统的表达质体转化入酵母菌中，转化可用任何已知转化技术来进行，例如可先去除酵母菌的细胞壁，使酵母菌形成原生质球状体(spheroplast)再进行转化，或是用碱性阴离子(如：LiCl或RbCl)加上热休克来处理酵母菌以进行转化，转化后用诱导物诱导酵母菌表达本发明的肽片段，诱导物可为IPTG等已知诱导物。

以动物细胞为例，可选定动物细胞系统的表达载体及该表达质体中适当的限制酶切位后，以该限制酶剪切该表达质体，亦以该限制酶剪切含有可编码本发明的肽片段的核苷酸序列的核苷酸片段，将以限制酶剪切后的表达质体及核苷酸片段进行接合反应，接着将含有可编码本发明的肽片段的核苷酸序列的动物细胞系统的表达质体转染(transinfection)入动物细胞中，该动物细胞可为昆虫细胞或哺乳动物细胞，转染可用任何已知转染技术来进行，如用微脂粒感染法(lipofection)或磷酸钙(calcium phosphate)法来表达本发明的肽片段。

此外，为使以本发明的抗微生物的方法处理的动物的抵抗疾病能力可有效提升，前述的免疫诱导剂可经由口服、浸泡或注射的方式投予该动物的体内；口服可以是直界面服或添加于饲料中，当以口服方式投予时，为避免该免疫诱导剂在通过该动物的消化道时，被消化道中的消化液所破坏，该免疫诱导剂可进一步借由已知技术将其进行微包埋处理，以增强其抵抗消化液的能力；该注射方式则包括静脉注射(intravenous injection，IV)、肌肉注射(Intramuscular injection，IM)及腹腔注射(intraperitoneal injection，IP)等，但并不仅限于此；当以静脉注射方式投予动物体内时，使其能发挥最大的效果。

本发明的组合物或肽，可促进动物抵抗病原菌入侵，因此可增加动物抗病力，提升动物的健康状态。

本发明的组合物或肽还可做为外用防腐剂、杀菌剂之用。

附图说明

请参阅以下有关本发明一较佳实施例的详细说明及其附图，将可进一步了解本发明的技术内容及其目的功效；有关该实施例的附图为：

图1为龙胆石斑抗微生物肽基因全长的cDNA序列。总共494核苷酸组成，包含92个核苷酸所组成的5端未转译区(5’UTR)、204核苷酸所组成的转译区域(codingregion)及198核苷酸所组成的3端未转译区域(3’UTR)。起始密码(start codon)ATG以粗体表示，终止密码(stop codon)TGA以星号(＊)表示。转译区域推测可以转译成67氨基酸，其中包含信号肽(signal peptide)22个氨基酸(以底线标示)，成熟肽(mature peptide)25个氨基酸(以方框标示)，以及N末端前结构域(prodomain)20个氨基酸(以波浪底线标示)。

图2为重组抗微生物肽(recombination AMP，rAMP)蛋白质的SDS-PAGE电泳图。利用15％的SDS-PAGE检视诱发结果；箭号表示rAMP。

图3为各物种抗微生物肽氨基酸序列比对(alignment)。包括来自龙胆石斑(Epinephelus lanceolatus)，点带石斑(Epinephelus coioides)，翘嘴鳜(Sinipercachuatsi)，欧洲狼鲈(Dicentrarchus labrax)，金眼狼鲈(Morone chrysops)，斑纹鲈鱼(Morone saxatilis)，比目鱼(Pleuronectes americanus)，庸鲽(Hippoglossushippoglossus)，大西洋拟庸鲽(Hippoglossus platessoides)等的抗微生物肽。

图4为龙胆石斑微生物肽3D立体结构。是使用protein structure modelling分子模拟龙胆石斑抗菌肽3D结构图，含有讯号肽、成熟肽、N末端前结构域(prodomain)。

图5为龙胆石斑AMP成熟肽(mature peptide)疏水性(hydrophobic)及亲水性区域(hydrophilic)的预测。以Kyte-Doolittle hydropathy plots程序分析AMP成熟肽的极性区域。

图6为龙胆石斑AMP成熟肽(mature peptide)疏水性(hydrophobic)及亲水性区域(hydrophilic)的预测。以BioEdit划出HelicalWheel分析α螺旋(α helix)区域疏水性及亲水性氨基酸的分布，蓝色代表疏水性，红色代表亲水性。

图7为AMP基因在龙胆石斑各组织的表达情形。分别取龙胆石斑的脑、心脏、肝脏、脾脏、肠、胃、肌肉、血液、鳃丝、眼睛、头肾(为鱼类肾脏的一部份，位于肾脏前端接近头部，故称为前肾，同时也是鱼类免疫器官)、皮肤及鳍组织以实时定量聚合酶连锁反应(real-time quantitative RT-PCR)分析抗微生物肽基因在各组织表达的模式。

图8为在不同浓度poly I:C处理下对龙胆石斑各组织的AMP基因表达的影响。每只鱼注射浓度分别为0μg/g BW(对照组)、1μg/g BW、2μg/g BW、5μg/g BW的poly I:C；龙胆石斑处理24小时后取头肾、脑、脾脏、肝脏、血液和鳃丝的totalRNA，利用实时定量聚合酶连锁反应分析AMP基因mRNA表达的影响，并以Duncan’s Multiple Range Test统计分析a、b、c表示有显着差异(p<0.05)；实验数据以平均值±SD表示。

图9为在不同时间点poly I:C处理下对龙胆石斑各组织的AMP基因表达的影响。每只鱼注射浓度为2μg/g BW的poly I:C处理后，分别在12小时、24小时、48小时、72小时取龙胆石斑头肾、脑、脾脏、肝脏、血液、皮肤和鳃丝的total RNA，利用实时定量聚合酶连锁反应分析AMP基因mRNA表达量，并以Duncan’s MultipleRange Test统计分析a、b、c表示有显着差异(p<0.05)，实验数据以平均值±SD表示。

图10为在不同浓度免疫诱导物LPS处理下对龙胆石斑各组织的AMP基因表达的影响。每只鱼注射LPS的浓度分别为0μg/g BW(对照组)、5μg/g BW、10μg/gBW、15ug/g BW，24小时后取龙胆石斑头肾、脑、脾脏、肝脏、血液和鳃丝的total RNA，利用实时定量聚合酶连锁反应分析AMP基因mRNA表达的影响，并以Duncan’s Multiple Range Test统计分析a、b、c、d表示有显着差异(p<0.05)，实验数据以平均值±SD表示。

图11为在不同时间点免疫诱导物LPS处理下对龙胆石斑各组织的AMP基因表达的影响。每只鱼注射LPS的浓度为15μg/g BW，于处理后24小时、48小时、96小时、132小时取龙胆石斑头肾、脑、脾脏、血液、皮肤和鳃丝的total RNA，利用实时定量聚合酶连锁反应分析AMP基因mRNA表达量。并以Duncan’s Multiple RangeTest统计分析a、b、c、d、e表示有显着差异(p<0.05)，实验数据以平均值±SD表示。

图12为盐度对于龙胆石斑各组织的AMP基因表达的影响。将盐度经过三天处理后调至5ppt取龙胆石斑头肾、脑、脾脏、肝脏、血液、皮肤和鳃丝的totalRNA，利用实时定量聚合酶连锁反应分析AMP基因mRNA表达量，并以Duncan’sMultiple Range Test统计分析a、b表示有显着差异(p<0.05)，实验数据以平均值±SD表示。

图13为抗微生物肽(AMP)对石斑鱼的保护作用。石斑鱼分别注射PBS(对照组)、弧菌、抗微生物肽cecropin+弧菌、本发明的抗微生物肽(gAMP)+弧菌。

具体实施方式

实施例1 本发明的抗微生物肽(AMP)片段的制备

首先依Chomczynski及Sacchi的方法(Chomczynski，P.and Sacchi，N.，1987.Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.Anal.Biochem.162(1)：156-9)从龙胆石斑(Epinepheluslanceolatus)的鳃丝组织分离总RNA(total RNA)；接下来，从10μg总RNA合成cDNA，使用含有200U Molony鼠类血癌病毒反转录酶(Molony murine leukemiavirus reverse transcriptase)、1mM dNTP、160U RNase抑制剂(inhibitor)及1.6μg随机引物(random primer)的1X反转录缓冲液，在42℃进行转录30分钟。接着以聚合酶连锁反应(polymerase chain reaction，PCR)放大(amplify)抗微生物肽(AMP)基因，PCR是使用含有20μg反转录产物、0.5U Taq DNA聚合酶及1μg正反向AMP引物的80μl1X PCR缓冲液，正向AMP引物具有如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，反向AMP引物具有如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列，PCR是于DNA温度循环反应器(thermal cycler)进行，PCR步骤为在55℃缓冷配对(annealing)1分钟30秒，在72℃延长(extension)1分钟30秒，在94℃变性(denaturation)1分钟，共35个循环(cycle)；PCR反应终止后，取15μl的PCR产物以2％琼脂糖凝胶(agarose gel)作电泳分析，接着进行溴化3，8—二氨基—5—乙基—6—苯基菲啶鎓(ethidium bromide)染色。

纯化的PCR产物会被选殖进M13mp18或pBluescript的SmaI位置，并会以双脱氧核醣链终止法(dideoxynucleotide chain termination)定序，AMP基因经定序后得到如序列表SEQ ID NO：2所示的序列；由序列表SEQ ID NO：2所示的序列可知，经龙胆石斑鳃丝中选殖出的抗微生物肽(AMP)cDNA序列，具有494个核苷酸，其中编码区域(coding region)由204核苷酸所组成，如图1所示，经演译(deduced)后得到具有67个氨基酸的抗微生物肽(AMP)，其序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

另一方面，将纯化的PCR产物与表达载体pET31b(+)分别以限制酶AlwNI剪切，再将剪切后的PCR产物及pET31b(+)进行接合反应，将接合反应后所得含有PCR产物的pET31b(+)转化至表达宿主E.coli BL21^TM(DE3)pLysS中，在37℃下以200rpm振荡培养，并以不同浓度的IPTG进行诱导(induce)，结果以1mM IPTG诱导的效果最好。以12％SDS-PAGE分析，发现E.coli BL21^TM(DE3)pLysS所表达的AMP肽位于不可溶蛋白部分，其分子量约为2.7kDa，如图2所示，Western印迹法亦证明其确为AMP肽。将所得不可溶蛋白部分以组胺酸亲和层析法(

chromatography)进行纯化，接着以溴化氰(CNBr)进行剪切，借此可得到纯化的AMP肽。

实施例2  不同动物的抗微生物肽(AMP)序列的比对

在已知的物种中，抗微生物肽皆属于小分子的肽，将本发明实施例1中所选殖出的抗微生物肽，与其它鱼类的抗微生物肽氨基酸序列进行比对，比对结果如图3所示，本发明的抗微生物肽与点带石斑的抗微生物肽氨基酸序列最为相近，而在其它鱼种则是与鲈鱼和比目鱼较为相近，而在抗微生物肽的分类上，各物种间均各成一类，但在相同物种里抗菌肽的类型也不相同，不论脊椎动物或是无脊椎动物，都难以找到一定的规则性。

本发明的抗微生物肽具有67个氨基酸(如序列表SEQ ID NO：1所示)，其中包含信号肽(signal peptide)、成熟肽(mature peptide)及N末端前结构域(prodomain)，其3D立体结构如图4所示。信号肽具有如序列表SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，主要在细胞内信号传递时产生功能进行切割，剩下成熟肽与N末端前结构域(prodomain)。成熟肽具有如序列表SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，是主要与病菌作用的位置，带有电荷可与细菌的细胞膜结合，目前可能的AMP作用模式为筒状穿凿模式(barrel-stave mode)以α-helix抗菌肽卷成筒状插入细胞膜膜内，利用抗菌肽疏水性端与菌的细胞膜接触，另一亲水性端互相面对面，则为抗菌肽的亲水性端面向中心点，以聚合体的方式在膜上形成孔洞，来造成菌体内外渗透压不平行，导致菌体死亡(邱子庭，2001，分子选殖与草虾抗微生物胜肽特性之研究，硕士论文，台湾海洋大学水产养殖研究所，1-39页)。地毯状覆盖模式(carpet mode)(Shai，Y.，1999.Mechanism of the binding，insertion and destabilization of phospholipid bilayermembranes by alpha-helical antimicrobial and cell non-selective membrane-lyticpeptides.Biochim Biophys Acta 1462，55-70.)。带正电的抗菌肽与带负电的细菌细胞膜结合后，亲水性端与膜反应，抗菌肽经过翻转后导致疏水性的部分，包围部分细菌细胞膜进而把此膜构造移除，破坏菌体膜的结构使得病原菌死亡(杨子萱，2004，利用重组大肠杆菌表现草虾抗微生物胜肽，硕士论文，台湾大学微生物与生化学研究所硕士论文，1-16页)。造成细菌的死亡，有效的抵抗病原菌产生内生型免疫。

N末端前结构域(prodomain)具有如序列表SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列，其功能则是中和成熟肽的电荷，当在成熟肽不需要与外来病原菌作用时使成熟肽不具有活性，以免伤害到宿主本身(Yin，Z.X.et.al.，2006.Cloning，expression andantimicrobial activity of an antimicrobial peptide，epinecidin-1，from the orange-spottedgrouper Epinephelus coioides.Aquaculture 253，204-211.)。成熟肽带正电会与带负电的细菌细胞膜作用，而在生物体本身细胞膜也为带负电，抗菌肽无法专一性的辨认何为外来病源菌与生物体本身，所以需要N末端前结构域(prodomain)来中和抗菌肽的电荷，以免造成生物体的伤害。

实施例3  龙胆石斑抗菌肽结构及极性分析

使用Kyte-Doolittle hydropathy blots程序分析SEQ ID NO：6AMP成熟肽，显示第7到16氨基酸后具有明显疏水性(hydrophobic)及亲水性(hydrophilic)交错的区域(如图4、图5及图6所示)。在使用巨分子序列分析软件中protein analysis的HelicalWheel指令分析疏水性及亲水性氨基酸的分布以及3-D结构图，可以发现龙胆石斑抗微生物肽所形成α螺旋(αhelix)会有明显疏水性及亲水性的分部(如图5及图6所示)，该抗微生物肽属于两亲(amphipathic)分子，为传统的抗微生物肽(Hancock，R.E.，Lehrer，R.，1998.Cationic peptides：a new source of antibiotics.Trends Biotechnol 16，82-88.)。

由本实施例可推测龙胆石斑抗微生物肽的杀菌机制为筒状穿凿模式或是地毯状覆盖模式，因为龙胆石斑抗微生物肽结构为α螺旋带正电，当在杀病原菌细胞膜作用的时候，抗菌肽需要为两亲分子，才能顺利把病原菌的膜产生孔洞，造成渗透压不平衡使病原菌死亡(Shai，Y.，1999.Mechanism of the binding，insertion anddestabilization of phospholipid bilayer membranes by alpha-helical antimicrobial and cellnon-selective membrane-lytic peptides.Biochim Biophys Acta 1462，55-70.)。ExPASyProteomics软件分析后在第30至35氨基酸位置上的N-myristoylation site主要功能在于使蛋白质酰化与C-14饱和脂肪酸结合，推测为抗菌肽与细胞膜上的磷脂质结合用(Towler，D.A.，Gordon，J.I.，Adams，S.P.，Glaser，L.，1988.The biology andenzymology of eukaryotic protein acylation.Annu Rev Biochem 57，69-99.)。由3D立体结构图预测可得知，龙胆石斑AMP分为三个部分，而在成熟肽的部分为α-helix结构(如图4所示)，属于第一类的两亲抗微生物肽，推测可能为本发明抗微生物肽主要为与细菌的细胞膜作用位置。

实施例4  抗微生物肽(AMP)的mRNA在石斑鱼体内的分布

本实验以实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative PCR)技术，分析抗微生物肽(AMP)基因在龙胆石斑各组织的表达模式。利用荧光染剂SYBR green I可镶嵌在DNA双股凹槽上，经由卤素灯激发而产生荧光的特性，侦测其荧光值的量。当SYBR green I没有镶嵌在双股DNA上时，荧光背景值非常低；当SYBRgreen I开始镶嵌在PCR放大的标的基因片段上时，荧光值讯号也会相对的提高。如无非特異性引物的结合，或基因组DNA(genomic DNA)的污染等干扰影响，PCR反应合成标的基因的DNA的合成狀态，可区分为：(1)两倍倍增的几何级數倍增期(geometric phase)；(2)反应物不足时，基因合成非两倍倍增的线性增加期(linearphase)；以及(3)最后反应物耗尽、失效，达反应终点的高原期(plateau phase)。因此要侦测标的基因在组织器官的表达量，必须在PCR反应的几何级数倍增期(geometric phase)定量才具有意义。Real-time quantitative PCR的原理就是利用不同浓度模板在相同PCR反应条件下，含有高浓度模板的反应会较快达到几何级數倍增期，相对的，低浓度的模板则较慢达到，将定义达到几何级數倍增期中点的臨界PCR循环數目定为CT(threshold cycle)，亦即CT值会随模板浓度降低而升高。利用不同浓度标准品在同步定量PCR反应的CT值，由软件计算绘制标准曲线与回归公式，以内插法换算待测样品内含有标的基因绝对表达量。同时若要得到熔解曲线(Melting Curve)，则在标的基因放大循环后进行熔解温度(melting temperature)66℃-99℃的連续荧光侦测，分析熔解曲线的结果可以了解引物是否会自行有互补的现象，或是引物的专一性，以更正确的帮助了解实验定量的正确性。

4.1 抽取点带石斑各组织的总RNA(total RNA)

分别取点带石斑的脑、鳃丝、眼、心脏、头肾、肝脏、脾、肠、胃、肌肉、血液、皮肤组织，加入10倍体积的TRIzol试剂(Invitrogen，U.S.A.)，用剪刀先将组织剪碎再用均质棒打碎，加入1/5体积的氯仿(chloroform)，强力摇晃30秒，置于室温下静置10分钟，在4℃下12000xg離心15分钟；吸取上清液至新的微量離心管中，加入TRIzol试剂等量体积的异丙醇(isopropanol)均匀混合，置于室温下静置10分钟，在4℃下12000xg離心15分钟；将RNA溶解在20μl DEPC水中，置于55℃下溶解10分钟，然后储存在-80℃冰箱中备用，以测量RNA浓度与纯度比值。

4.2 反转錄酶反应(Reverse Transcription)

将萃取出來的RNA每管定量至5μg的total RNA，并进行反转錄酶反应。

4.3 实时定量聚合酶連锁反应(real-time quantitative PCR)

专一性引物(Primer)根据SEQ ID NO：1设计AMP基因部分cDNA序列，利用LightCycler Probe Design program设计实时定量聚合酶連锁反应专一性引物(primer)，AMP基因分别利用real-time quntitative PCR AMP专一性引物A3及A4(其序列分别如序列表SEQ ID NO：8及SEQ ID NO：9所示)进行real-time quntitativePCR。

4.4 实时定量聚合酶連锁反应(real-time quntitative PCR)

4.4.1 标准曲线制备

4.4.1.1 质粒小量抽提(Mini-preparation)

将SEQ ID NO：1定序且确定含有Mx基因与AMP基因部分cDNA序列的菌种由-80℃冰箱中取出，培养于30ml的LB/Ampicillin培养液(Luria-Bertani medium)中，以37℃震荡培养至隔夜约16小时后，取出菌液并进行质粒小量抽提。

取出隔夜培养的菌液1ml置入1.5ml微量离心管中，于4℃下以12,000xg离心5分钟，倒掉上清液，加入150μl Solution I(50mM glucose、25mM Tris-HCl pH8.0、10mM EDTA pH 8.0)重新悬浮菌体，加入200μl新鲜配制的Solution II(0.2NNaOH、1％ SDS)，置于冰上10分钟，加入150μl Solution III(3M potassiumacetate、10％ glacial acetic acid)，置于冰上5分钟，于4℃下以12,000xg离心5分钟，收集上清液至新的微量离心管中，加入等量体积的饱和酚(phenol)与氯仿(chloroform)，强力摇晃30秒，置于室温下静置10分钟，在4℃下以12,000xg离心15分钟。

收集上清液至新的微量离心管中，加入两倍体积的95％冰酒精，混合均匀置于-20℃下20分钟，于4℃下以12,000xg离心5分钟，倒掉上清液留下沉淀物，以70％酒精洗涤沉淀物两次，然后真空干燥离心沉淀物，将沉淀物溶于20μl无菌水中，存于-20℃备用。

4.4.1.2 质粒DNA浓度和纯度的计算

以分光光度计测量OD260，计算质粒DNA的浓度的标准为1OD₂₆₀＝50μg ofDNA/ml，其公式为50μg×dilute factor×A260＝μg/ml。质粒DNA纯度以OD260/OD280的比值介于1.6～1.8之间为较纯的DNA。

待质粒DNA浓度计算出来后，将质体DNA浓度调整至1μg/μl，并依10倍稀释方式由10^-1連续稀释至10^-9，稀释后将质体DNA存于-20℃备用。

4.4.1.3 制备标准曲线

分别由10^-4-10^-8的稀释后质粒溶液中取3μl置于反应毛细管中，再分别加入2.4μl MgCl₂、1μl SYBR、real-time quntitative PCR AMP专一性引物A3及A4(其序列分别如序列表SEQ ID NO：8及SEQ ID NO：9所示)各0.5μl、12.6μl无菌水，最后总体积为20μl；将反应毛细管置入及时定量分析仪(LightCycler 1.2)中，设定以下条件反应：95℃解離10分钟；95℃解離0秒；64℃黏合10秒；72℃合成15秒；解離、黏合、合成步骤重复40个循环后降温至40℃后持续升温至95℃，以解離反应后产物并連续侦测荧光值。反应后侦测结果以LightCycler Software 3.5program分析后制作标准曲线。

4.4.2.1 龙胆石斑各组织实时定量聚合酶連锁反应侦测

取3μl实施例4.2所制得的反转錄酶反应(RT)产物置于反应毛细管中，分别加入2.4μl MgCl₂、1μl SYBR、real-time quntitative PCR AMP专一性引物A3及A4(其序列分别如序列表SEQ ID NO：8及SEQ ID NO：9所示)各0.5μl、12.6μl无菌水，最后总体积为20μl。将反应毛细管置入及时定量分析仪(LightCycler 1.2)中，设定以下条件反应：95℃解離10分钟；95℃解離0秒；64℃黏合5秒；72℃合成15秒；解離、黏合、合成步骤重复40个循环后降温至40℃后持续升温至95℃，以解離反应后产物并連续侦测荧光值。反应后侦测结果以LightCycler Software 3.5program配合标准曲线分析，分析后所得數据单位为μg/μl，接着除以质粒的碱基对數目，再除以碱基对分子量660dalton以换算成mole/μl，乘以6.02×10²³得copies/μl。实验所得的數据，以SAS(Statistic AlaIysis System)软件，运用单变量分析(One-way analysis ofvariance)，利用Duncan’s MultipleRange Tes比较各因子间显着差異程度(p<0.05)，所得數据以平均±标准偏差(Mean±SD)表示；本发明中所有AMP基因表达分析均使用此方法。

请参阅图7，由AMP基因在各组织间的表达模式实验结果显示，龙胆石斑在脑、心脏、肝脏、脾脏、肠、胃、肌肉、血液、鳃丝、眼睛、头肾、皮肤及鳍均有AMP基因的表达；头肾的表达量最高，其次是脾脏、鳃丝、血液。这些组织都具有血液流动相关组织，进一步证明AMP基因可能是由血球细胞所分泌。在比目鱼的AMP研究指出，鳃在鱼类中也是一个重要的免疫器官(Murray，H.M.，Gallant，J.W.，Douglas，S.E.，2003.Cellular localization of pleurocidin gene expression andsynthesis in winter flounder gill using immunohistochemistry and in situ hybridization.Cell Tissue Res 312，197-202)；而由本实施例的结果显示，AMP基因在鳃丝有明显的表达(如图7所示)，因此在本发明接下来的实施例中，将以鳃丝作为分析AMP基因表达的指针性组织。

实施例5  注射仿病毒核酸的药品聚肌苷酸多聚胞苷酸(polyI:C)至龙胆石斑内，分析其抗微生物肽(AMP)基因表达情形

将龙胆石斑鱼分成四组，每组分别注射不同浓度的仿病毒核酸药品聚肌苷酸多聚胞苷酸(polyI:C)，以每克鱼体重(BW)为单位，每克鱼体重注射药品的体积为200μl，各组poly I:C的注射浓度分别为0μg/gBW(对照组)、1μg/gBW、2μg/gBW、5μg/gBW，溶剂为石斑鱼的PBS，以肌肉注射，注射在背部肌肉。24小时后使用150ppm的MS-222(3-氨基-苯甲酸乙酯甲磺酸盐)，让鱼麻醉降低刺激；分别取鳃丝、头肾、脾脏、脑、血液、肝、皮肤等七个组织，利用TRIzol试剂萃取totalRNA，保存于-80℃冰箱，以进行实时定量聚合酶连锁反应(real-time quantitativePCR)分析AMP基因表达模式。

各组织在注射不同浓度的poly I:C24小时后的AMP基因表达如图8所示；以鳃丝作为分析AMP基因表达的指针性组织来看，以每克鱼体重注射2μg poly I:C的处理组的AMP基因表达量最高。

针对每克鱼体重注射2μg poly I:C的处理组，分别在注射后12小时、24小时、48小时、72小时取其头肾、脑、脾脏、肝脏、血液、皮肤和鳃丝的total RNA，利用实时定量聚合酶连锁反应(real-time quantitative PCR)分析AMP基因表达模式，结果如图9所示，在72小时的长时间处理下，鳃丝与头肾的AMP基因表达均比对照组高，推测因为生物体诱导的抗微生物肽是免疫的第一道防线，当外来物质进入生物体内时，抗微生物肽(AMP)基因可能也会被诱导来对抗外来物。

实施例6  注射不同浓度的脂多醣类(脂多糖，LPS)至龙胆石斑内，分析其抗微生物肽(AMP)基因表达情形

将龙胆石斑鱼分成四组，每组分别注射不同浓度的LPS，以每克鱼体重(BW)为单位，每克鱼体重分别注射0μg(对照组)、5μg、10μg、15μg的LPS，每克鱼体重的注射物中添加200μl弗式不完全佐剂(Freund’sincomplete adjuvant)，注射方式为腹腔注射。24小时后使用150ppm的MS-222(3-氨基-苯甲酸乙酯甲磺酸盐)，让鱼麻醉降低刺激；分别取头肾、脑、脾脏、肝脏、血液和鳃丝等组织，利用TRIzol试剂萃取total RNA，保存于-80℃冰箱，以进行实时定量聚合酶连锁反应(real-timequantitative PCR)分析AMP基因表达模式。

各组织在注射不同浓度的LPS 24小时后的AMP基因表达如图10所示，AMP基因在鳃丝组织与头肾组织在各浓度的LPS下，均较对照组均有明显增加表达量(p<0.05)，显示AMP基因在不同组织所诱导的表达量不相同。

以腹腔注射每克鱼体重15μg的LPS，分别在24小时、48小时、96小时、132小时进行采样，探讨头肾、脑、脾脏、肝脏、血液和鳃丝的AMP基因表达量。如图11所示，结果显示鳃丝组织的AMP基因在48小时才会有明显的增加表达量；而脾脏和头肾均在24小时即有明显的增加表达量。由此可以推论，生物体各种器官的免疫反应速度不尽相同，且会因为受到刺激的位置不同，而改变免疫产生的组织。在Kim(2005)(Kim，Y.O.，Hong，S.，Nam，B.H.，Lee，J.H.，Kim，K.K.，Lee，S.J.，2005.Molecular cloning and expression analysis of two hepcidin genes from olive flounderParalichthys olivaceus.Biosci Biotechnol Biochem 69，1411-1414)的研究中发现比目鱼在不同组织被LPS诱导下，产生免疫反应的时间也会相对不同，而且长时间下有些组织的表达量会降低。

实施例7  改变环境因子盐度后龙胆石斑抗微生物肽(AMP)基因表达情形的分析

将龙胆石斑鱼分成一对照组及一实验组，对照组为纯海水(盐度为35‰)，而实验组则每天盐度减少10‰，处理三天使实验组盐度为5‰，放置24小时后，使用150ppm的MS-222(3-氨基-苯甲酸乙酯甲磺酸盐)，让鱼麻醉降低刺激；分别取鳃丝、头肾、脾脏、脑、血液、肝、皮肤等组织，利用TRIzol试剂萃取total RNA，保存于-80℃冰箱，以进行实时定量聚合酶连锁反应(real-time quantitative PCR)分析AMP基因表达模式。

如图12所示，实验组在低盐度环境下，其AMP基因在头肾、皮肤、血液、鳃丝等组织中有明显的增加表达量。可见在盐度改变的时候免疫基因会被诱导，进而增加鱼类的免疫能力，改变盐度为5‰时，推测会刺激龙胆石斑内生型免疫系统，使龙胆石斑不易受到病原菌感染或发病，使得龙胆石斑较不容易受到细菌和病毒感染。

鱼类免疫紧迫包括：盐度改变、温度改变、溶氧不足、化学药品污染等，使鱼产生许多生理上的改变，对环境的紧迫作出反应。当环境出现紧迫时，鱼类的生理、外表、组织和细胞都会产生免疫反应(Barton，K.A.，Blanchard，E.B.，2001.Thefailure of intensive self-regulatory treatment with chronic daily headache：a prospectivestudy.Appl Psychophysiol Biofeedback 26，311-318.)。本实施例结果进一步确认，可借由改变养殖环境盐度以提高AMP基因之表达量，进一步增强龙胆石斑抗病毒与抗细菌性感染的能力；本概念可应用于养殖业，以提升鱼体免疫力及抗病能力，达到减少死亡，提高存活率与产量等目的。

实施例8  化学合成石斑抗微生物肽对各病原菌的体外敏感性试验

以科罗耐国际科技有限公司合成的抗微生物肽，纯度经由高效液相层析(highperformance liquid chromatography，HPLC)测试纯度达90％以上；利用该合成抗微生物肽对细菌进行最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)和最小殺菌浓度(minimum bactericidal concentration，MBC)试验。

8.1 菌液的制备

将大肠杆菌(Escherichia coli DH5α)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、溶澡弧菌(Vibrio alginolyticus)、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、鲑弧菌(Vibrio salmonicida)、产气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)，将此七株菌株培养于LBA(E.coli DH5α)或TSA(+1.5％ NaCl)上，经过16小时37℃培养后，刮下菌落溶于指定培养液，使OD₅₄₀为1时(浓度约为1×10⁹菌數)，取500μl菌液加入500μl的LB或TSB(+1.5％ NaCl)使菌液浓度为1×10⁸菌數/ml。

8.2敏感性试验(Susceptibility test)

使用96孔培养皿在每个凹槽加入130μl的菌液，菌液浓度为1×10⁸菌數/ml，在加入20μl不同浓度(0.075μM-0.675μM)的化学合成龙胆石斑抗微生物肽后，以37℃培养16小时，观察没有细菌生长而呈现澄清的菌液的最低抗微生物肽浓度，此为最小抑菌浓度(MIC)；再将呈现澄清的菌液的组别，取完全菌液涂抹在培养于LBA(E.coli DH5α)或TSA(+1.5％ NaCl)上，经过16小时37℃培养后，观察菌落则得知最小殺菌浓度(MBC)，每个实验组各有三重复及对照组。

测试结果如表一所示，此七株菌最小抑菌浓度(MIC)分别为：大肠杆菌(Escherichia coli DH5α)0.075μM、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)0.15μM、溶澡弧菌(Vibrio alginolyticus)0.15μM、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)0.15μM、鲑弧菌(Vibriosalmonicida)0.15μM、产气单胞菌(Aeromonas hydrophila)0.375μM、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)0.075μM；而其最小杀菌浓度(MBC)分别为0.15μM、0.225μM、0.375μM、0.45μM、0.3μM、0.675μM、0.525μM。

表一 龙胆石斑抗微生物肽(AMP)对不同病源菌的最小抑菌浓度(MIC)与最小杀菌浓度(MBC)值

 

菌种	最小抑菌浓度(MIC)	最小杀菌浓度(MBC)
			葛兰氏阴性菌
产气单胞菌(Aeromonas hydrophila)	0.375μM	0.675μM
			鳗弧菌	0.15μM	0.45μM

 

菌种	最小抑菌浓度(MIC)	最小杀菌浓度(MBC)
			(Vibrio anguillarum)
鲑弧菌(Vibrio salmonicida)	0.15μM	0.30μM
			哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)	0.15μM	0.225μM
溶澡弧菌(Vibrioal ginolyticus)	0.15μM	0.375μM
			大肠杆菌(Escherichia coli DH5α)	0.075μM	0.15μM
葛兰氏阳性菌
			表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)	0.075μM	0.525μM

由本实施例结果可知，本发明的抗微生物肽可杀死葛兰氏阳性菌与葛兰氏阴性菌，对不同微生物均有杀菌与抑菌效果，因此，本发明的抗微生物肽亦能作为广效性杀菌剂或防腐剂。

实施例9  抗微生物肽(AMP)对石斑鱼的保护作用

将龙胆石斑鱼分成四组，分别注射PBS(对照组)、弧菌(Vibrio harveyi，浓度为1×10⁶cfu/fish)、抗微生物肽cecropin(浓度为1μM/fish)+弧菌(浓度为1×10⁶cfu/fish)、本发明的抗微生物肽(gAMP，浓度为1μM/fish)+弧菌(浓度为1×10⁶cfu/fish)，经24、48、72小时后，观察各组的死亡率，结果如图13所示，注射PBS组(对照组)在72小时后死亡率为0％；注射弧菌组在72小时后死亡率为100％；注射抗微生物肽cecropin+弧菌组在72小时后死亡率为80％；注射本发明的抗微生物肽(gAMP)+弧菌在72小时后死亡率为60％；此实验仅注射各种AMP一次，由结果显示，注射本发明的抗微生物肽(gAMP)已可显着降低龙胆石斑鱼40％的死亡率，可见本发明的抗微生物肽(gAMP)已达到对鱼只提供保护作用的功效。

由注射本发明的抗微生物肽(AMP)对抗病力的影响试验可直接证明，当应用本发明的抗微生物肽(AMP)时，确实会增加石斑鱼的抗病力。由于AMP具有广效性杀菌能力，故使用本发明的抗微生物肽(AMP)可对动物提供保护，提高其抗病能力，该动物应不限制在水产动物，亦包括畜产动物及人类。

本发明所提供的一种抗微生物肽，与其它现有技术相互比较时，更具有下列的优点：

1.由上述说明及实施例可知，本发明的抗微生物肽基因在免疫系统的表达情形、抗微生物肽杀菌种类与浓度、物理因子(盐度)、免疫刺激物(polyI:C及LPS)等分析，均证实本发明的抗微生物肽基因表达和石斑鱼的免疫力成正相关，该抗微生物肽(AMP)mRNA表达量上升时，石斑鱼的抗病能力亦上升；在注射本发明的抗微生物肽(AMP)对抗病力的影响上，更直接证明当使用本发明的抗微生物肽(AMP)时，确实会增加石斑鱼的抗病力。

2.由本发明的抗微生物肽(AMP)的特殊化学结构，可得知该抗微生物肽(AMP)与微生物细胞膜作用能力，显示此抗微生物肽具有特殊杀菌能力，且对微生物杀菌能力具非特定性(non-specific)与广效性；因此，本发明所提供的抗微生物肽(AMP)，确实具有抗菌、抗病的功能。

上列详细说明是针对本发明的一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利权利要求范围，凡未脱离本发明技术精神所为的等效实施或变更，均应包含于本发明专利的权利要求范围中。

序列表

SEQ ID NO：1

长度：67

类型：氨基酸(amino acid)

生物：龙胆石斑

其它数据：抗微生物肽(AMP)

SEQ ID NO：2

长度：494

类型：核苷酸(DNA)

生物：龙胆石斑

其它数据：抗微生物肽(AMP)

SEQ ID NO：3

长度：21

类型：核苷酸(DNA)

生物：人造序列

其它数据：PCR引物，正向AMP引物

SEQ ID NO：4

长度：21

类型：核苷酸(DNA)

生物：人造序列

其它数据：PCR引物，反向AMP引物

SEQ ID NO：5

长度：22

类型：氨基酸(amino acid)

生物：龙胆石斑

其它数据：抗微生物肽(AMP)的信号肽(signal peptide)

SEQ ID NO：6

长度：25

类型：氨基酸(amino acid)

生物：龙胆石斑

其它数据：抗微生物肽(AMP)的成熟肽(mature peptide)

SEQ ID NO：7

长度：20

类型：氨基酸(amino acid)

生物：龙胆石斑

其它数据：抗微生物肽(AMP)的N末端前结构域(prodomain)

SEQ ID NO：8

长度：15

类型：核苷酸(DNA)

生物：人造序列

其它数据：PCR正向引物，real-time quntitative PCR AMP专一性引物A3

SEQ ID NO：9

长度：15

类型：核苷酸(DNA)

生物：人造序列

其它数据：PCR反向引物，real-time quntitative PCR AMP专一性引物A4

Claims (14)

1.一种抗微生物肽，其氨基酸序列是SEQ ID NO:1所示。

2.一种核苷酸片段，其碱基序列是SEQ ID NO:2所示。

3.含有权利要求2核苷酸片段的表达载体。

4.含有权利要求3表达载体的宿主细胞。

5.一种药物组合物，其特征在于，包含：药学有效量的权利要求1的抗微生物肽以及药学上可接受的载体。

6.如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，该药物组合物的形式为包埋物、浸泡液、饲料、饲料添加物、口服液、注射疫苗、贴片、粉末、锭剂、注射液体、悬浮液、外用液、滴剂、擦剂、涂剂、乳霜、油膏、软膏、糊状剂、胶或凝胶。

7.如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述的载体为赋形剂、稀释剂、增稠剂、填充剂、结合剂、崩解剂、润滑剂、油脂或非油脂的基剂、界面活性剂、悬浮剂、胶凝剂、辅助剂、防腐剂、抗氧化剂、稳定剂、着色剂或香料。

8.权利要求1的抗微生物肽在制备动物抗微生物药物中的用途。

9.权利要求2的核苷酸片段在制备动物抗微生物药物中的用途。

10.如权利要求8或9的用途，其特征在于，所述的微生物是细菌、真菌或病毒。

11.如权利要求8或9的用途，其特征在于，所述的动物是畜产动物或水生动物。

12.如权利要求11的用途，其特征在于，所述的畜产动物是牛、羊、鸡或猪；所述的水生动物是鱼。

13.如权利要求12的用途，其特征在于，所述的鱼是石斑鱼(grouper)、海鲡(cobia)、鲷鱼(seabream)、比目鱼(halibut)、鲑鱼(salmon)、鳟鱼(trout)、鲶鱼(catfish)、鲤鱼(carp)、金鱼(goldfish)、吴郭鱼(tilapia)或斑马鱼(zebrafish)。

14.权利要求1的抗微生物肽在制备动物外用防腐剂中的用途。

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