CN106063929B - 用于促进伤口愈合的吴郭鱼抗菌胜肽 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于促进伤口愈合的吴郭鱼抗菌胜肽，具体涉及一种吴郭鱼抗菌胜肽(TP)用于制备促进伤口愈合药物的用途，其中该吴郭鱼抗菌胜肽选自由吴郭鱼抗菌胜肽1、吴郭鱼抗菌胜肽2、吴郭鱼抗菌胜肽3、吴郭鱼抗菌胜肽4、吴郭鱼抗菌胜肽5及上述之组合所组成之群组。

Description

用于促进伤口愈合的吴郭鱼抗菌胜肽

技术领域

本发明关于一种用于促进伤口愈合的新药物，具体而言是治疗伤口抗甲氧苯青霉素金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)感染的新药物。

背景技术

抗生素的发现已成为现代医学最伟大的成就之一。然而，在感染性疾病的管理中，无论是在医院环境或是在社区，抗生素的抗药性都被认为是世界性的重大问题。不过，由于多重抗药性的生物体，例如抗甲氧苯青霉素金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcus aureus,MRSA)，伤口感染正持续增加。

抗甲氧苯青霉素金黄色葡萄球菌(MRSA)是受伤患者感染的主要原因，而且医疗保健相关的(HA)和社区相关的(CA)MRSA近年来已经变得普遍。MRSA的出现是过度使用某些抗生素的结果。MRSA通常不会在没有受伤之下引起感染。当MRSA通过割伤或擦伤进入人体时，MRSA可能会藉由避开身体的自然保护机制而引起感染。这使得替代疗法的使用成为必要的，替代疗法理想上不会通过连续的选择性压力而导致抗药性。MRSA感染近年来已被使用莫匹罗星、克林霉素、甲氧芐啶/磺胺甲恶唑、强力霉素、米诺环素、利奈唑胺、万古霉素、达托霉素、及特拉万星治疗[Bjorn et al.,Anti-infectious and anti-inflammatoryeffects of peptide fragments sequentially derived from the antimicrobialpeptide centrocin 1 isolated from the green sea urchin,Strongylocentrotusdroebachiensis. AMB Express 2012,2:67]。同时，万古霉素、利奈唑胺、达托霉素(Cubicin)、替加环素 (Tygacil)、及特拉万星(Vibativ)据报告可在医院治疗皮肤和软组织的严重MRSA感染。主要用于治疗MRSA的万古霉素具有高的最低抑制浓度(MIC)值和其他限制 [Palazzolo-Ballance et al.,Neutrophil microbicides induce a pathogensurvival response in community-associated methicillin-resistantStaphylococcus aureus.J Immunol 2008, 180:500-9]。

阳离子基因编码的宿主防御胜肽(host defense peptidesm,HDP)是自然界最多样化且类型丰富的抗生素。HDP被称为抗微生物胜肽(antimicrobial peptide,AMP)的子类可发挥直接的抗微生物活性。抗微生物胜肽(AMPs)是广泛的无脊椎动物、植物、及动物的宿主防御系统的一部分[Lee et al.,A helix-PXXP-helix peptide with antibacterialactivity without cytotoxicity against MDRPA-infected mice.Biomaterials.52014；35:1025-1039； Wimley&Hristova,Antimicrobial peptides:successes,challenges and unanswered questions. The Journal of membrane biology.2011；239:27-34]。抗微生物胜肽通常对范围广泛的细菌、病毒、真菌及原生动物表现出有效的抗微生物活性。抗微生物胜肽的主要特征在于他们是短的、双性的、及阳离子型的，抗微生物胜肽拥有快速的灭杀能力，而且他们以细胞的膜和内部成分为目标[Brogden,10Antimicrobial peptides:pore formers or metabolic inhibitors in bacteria,Nature reviews Microbiology.2005；3:238-250；Yount&Yeaman, Immunocontinuum:perspectives in antimicrobial peptide mechanisms of action and resistance.Protein and peptide letters.2005；12:49-67；Yeaman&Yount,Mechanisms ofantimicrobial peptide action and resistance.Pharmacological reviews.2003；55:27-55；Hancock&Scott,The role of antimicrobial peptides 15 in animaldefenses.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Statesof America.2000；97:8856-8861]。

抗菌胜肽(Piscidin)AMPs被发现是由多达21～44个残基组成并具有双性螺旋结构 [Maisetta et al.,In Vitro Bactericidal Activity of Human β-Defensin 3against Multidrug-Resistant Nosocomial Strains.Antimicrobial Agents and 20Chemotherapy 2006；50:806-809；Winkler et al.,Unexpected Challenges in Treating432 Multidrug-resistant Gram-negative Rods:Resistance to Ceftazidime-Avibactam in Archived Isolates of Pseudomonas aeruginosa.Antimicrob AgentsChemother 2014]。在2012年，五种名为吴郭鱼抗菌胜肽1-5(tilapia piscidin 1-5,TP1-5)的新抗菌胜肽被从尼罗河吴郭鱼(尼罗口孵非鲫，Oreochromis niloticus)分离出[Penget al.,Five Different Piscidins from Nile Tilapia, Oreochromis niloticus:25Analysis of Their Expressions and Biological Functions.PloS ONE 2012；7(11):e50263]。

然而，仍需要开发用于伤口愈合的新治疗或新疗法，尤其是治疗伤口MRSA感染。

发明内容

意外地发现到五种分离自吴郭鱼的抗菌胜肽显示可有效促进伤口愈合，具潜力作为伤口愈合的治疗剂、尤其是伤口MRSA感染的治疗剂。

在一方面，本发明提供一种吴郭鱼抗菌胜肽(tilapia piscidin,TP)用于制备促进伤口愈合药物的用途。

在另一方面，本发明提供一种吴郭鱼抗菌胜肽用于制备预防或治疗伤口抗甲氧苯青霉素金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)感染药物的用途。

在一个进一步方面，本发明提供一种用于预防或治疗伤口MRSA感染的组合物或医药组合物。

在又一个方面，本发明提供一种预防或治疗伤口MRSA感染的方法，包含施予有需要的个体治疗有效量的吴郭鱼抗菌胜肽(tilapia piscidin,TP)。

在本发明的一个具体实施例中，该吴郭鱼抗菌胜肽(TP)选自由吴郭鱼抗菌胜肽 1(TP1)、吴郭鱼抗菌胜肽2(TP2)、吴郭鱼抗菌胜肽3(TP3)、吴郭鱼抗菌胜肽4(TP4)、吴郭鱼抗菌胜肽5(TP5)及上述之组合所组成之群组。

在本发明的一个特定实例中，该吴郭鱼抗菌胜肽为吴郭鱼抗菌胜肽3或吴郭鱼抗菌胜肽4。

附图说明

当结合附图一起阅读时，将更好地理解前面的概述、以及以下本发明的实施方式。为了说明本发明的目的，在图式中有图示出目前较佳的具体实施例。然而，应当理解的是，本发明并不限于此具体实施例。

在附图中：

图1A-图1D图示吴郭鱼抗菌胜肽3(TP3)在幼仓鼠肾细胞(BHK-21)的细胞毒性和抗菌活性。在图1A、图1B及图1C中，使用不同剂量的TP3治疗BHK-21细胞24小时；而且分别藉由中性红、LDH及MTT试验量测细胞存活率。(r＝3；n＝6)。在图1D 中，MRSA是在不同浓度的TP3中培养；而相对细菌增生是在600nm下基于光密度测得。(r＝3；n＝6)。经ANOVA测定，不同字母的值显示显著差异(p<0.05)。

图2A-图2B图示TP3治疗对感染MRSA小鼠的效果。图2A图示，小鼠被注射MRSA(1x106cfu/小鼠)，而且单独的组(n＝5)随后被注射TP3、万古霉素及甲氧苯青霉素。在每天的基础上监测存活率长达8天。图2B图示TP3的治疗潜力，其中小鼠先被注射 MRSA(1x106cfu/小鼠)，然后在10、60、120、或180分钟后被注射TP3(0.005mg/g)。在这些注射时间时，MRSA实验组分别表现出100％、80％、60％、及40％的存活率。

图3A-图3B图示在T3治疗之后干净的和受污染伤口的闭合效果，其中从受伤的时间直到闭合量测全厚度伤口的区域(最初直径1公分)。图3A图示所有全厚度无菌伤口都在第25天之前闭合。Meth.，甲氧苯青霉素；Vanc.，万古霉素。图3B图示被微生物污染的全厚度伤口大小最初增大，而TP3治疗的伤口并没有表现出初始膨胀，而且比万古霉素治疗的伤口稍快闭合(第25天)。

图4A-图4C图示小鼠体内TP3调节的基因表现分布。在感染MRSA的小鼠中使用 TP3和抗生素治疗成年小鼠，而对照组是未治疗的。不同天之后，将总RNA从伤口分离并逆转录用于实时qPCR分析TNF-α(图4A)、IL-6(图4B)及CXCL5(图4C)基因表现。R>3；n>3。经ANOVA测定，不同符號显示显著差异(P<0.05)。表示如下：n.s.，不显著；*，显著(P<0.05)；**，显著(P<0.001)。

图5A-图5F图示TP4对人类纤维母细胞细胞株(Hs68)没有表现出细胞毒性作用，而且实际上会刺激增生活性。在图5A-5C中，使用不同剂量的TP4治疗Hs68细胞48小时，并藉由中性红、LDH、及MTT试验量测细胞存活率。(r＝3；n＝6)。在图5D-图5F 中，使用TP4(6.25μg/ml)治疗实验Hs68细胞，而对照组细胞未治疗。48小时之后，分离出总RNA，并逆转录用于实时qPCR分析。每个试验分析六个复制孔。结果表示来自三个独立实验的平均值±SEM。(学生的t试验(Student’s-test)：*，P<0.05；**，P< 0.01，n.s.：不显著)。

图6A-图6E图示TP4对人类角质细胞细胞株(HaCaT细胞)没有表现出细胞毒性作用，并且实际上刺激增生活性。在图6A-6C中，使用不同剂量的TP4治疗HaCaT细胞 48小时，并藉由中性红、LDH、及MTT试验量测细胞存活率(r＝3；n＝6)。在图6D 和图6E中，使用TP4(6.25μg/ml)治疗实验HaCaT细胞，而对照组细胞未治疗。48小时之后，分离出总RNA，并逆转录用于实时qPCR分析。每个试验分析六个复制孔。结果表示来自三个独立实验的平均值±SEM。(学生的t试验：*，P<0.05；**，P<0.01， n.s.：不显著)。

图7A-图7B图示TP4治疗对感染MRSA小鼠的效果。在图7A中，小鼠被注射MRSA(1x106cfu/小鼠)，而且单独的组(n＝10)随后被注射TP4、万古霉素及甲氧苯青霉素。在每天的基础上监测存活率长达8天。图7B，为了测得治疗潜力，小鼠先被注射 MRSA(1x106cfu/小鼠)，然后在10、60、120、或180分钟后被注射TP4(0.005mg/g)。在这些注射时间时，MRSA实验组分别表现出100％、80％、60％、及50％的存活率。

图8A-图8B图示干净的和受污染伤口的闭合；其中从受伤的时间直到闭合量测全厚度伤口的区域(最初直径1公分)。图8A图示所有全厚度无菌伤口都在第25天之前闭合。Meth.，甲氧苯青霉素；Vanc.，万古霉素。图8B图示被微生物污染的全厚度伤口大小最初增大，而TP4治疗的伤口并没有表现出初始膨胀，而且比万古霉素治疗的伤口稍快闭合(第21天)。(r＝3；n＝6)。

图9A-图9C图示TP4调节MRSA介导诱导的TNF、IL-6、及IL-1。从无麻醉小鼠的腹部取出约1平方公分的皮肤区块，并使伤口感染50ml含有单独106个cfu的MRSA 或连同抗甲氧苯青霉素、万古霉素、或TP4的培养液混合物。在感染后不同天，藉由ELISA 检测血清中的(图9A)TNF、(图9B)IL-6、及(图9C)IL-1。(r＝3；n＝6)。经ANOVA 测定，不同字母的值显示显著差异(P<0.05)。

图10A-图10C图示TP4影响伤口受感染的小鼠体内的细胞增生基因的表现分布。使成年小鼠感染MRSA，并使用TP4或抗生素治疗，而对照组则受感染但未治疗。在指定的天数，将总RNA从伤口分离并逆转录用于实时qPCR分析(图10A)EGF、(图10B) TGF-β、及(图10C)VEGF的基因表现(r＝3；n＝6)。经ANOVA测定，不同字母的值显示显著差异(P<0.05)。

具体实施方式

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语皆具有与本发明所属技术领域中具有通常知识之人士一般理解的相同的含义。

除非内文以其他方式清楚指明，否则本文中使用的单数形「一」及「该」包括复数的指示对象。因此，举例来说，提及「一样品」包括复数个这样的样品及所属技术领域中具有通常知识者习知的该样品之均等物。

吴郭鱼抗菌胜肽

如Peng等人揭示的，收集吴郭鱼的脾脏组织用于萃取RNA，并使用来自PubMedGenBank数据的GR649653.1(名为TP1)、GR604642.1(XM 003456635；名为TP2)、 GR645750.1(XM 003456614；名为TP3)、GR634176.1(XM 003456613；名为TP4)、及 GR648328.1(名为TP5)藉由聚合酶链反应(PCR)放大尼罗河吴郭鱼抗菌胜肽编码区。使用以下的引子：

引子序列：

TP1:5'(5'-ATGAAGTCTGCTGTGATCTTTCTTGTGC)(序列编号：1)

3'(5'-CTAGTCAAATTCCCGTTGACGCA)(序列编号：2)

TP2:5'(5'-ATGAAGTGTGCTGCAGTATTTCTTATGCTGTCC)(序列编号：3)

3'(5'-CTAGTCAAAATTAAGTCGACGAGGGT)(序列编号：4)

TP3:5'(5'-ATGAAGTGCACCATGCTGTTCCTTGTGCTGTCGATGGTT) (序列编号：5)

3'(5'-CTAGTTAAAAGCAGCCCTTTCCC)(序列编号：6)

TP4:5'(5'-ATGAAGTGCACTATACTGTTCCTTGTGCTGTCGATGGTG) (序列编号：7)

3'(5'-CTAGTTAAAAGCAACTCTCTCTCGTTTG)(序列编号：8)

TP5:5'(5'-ATGAAGTCTGCCATAATCTTTCTTGTAT)(序列编号：9)

3'(5'-CTATGACATCACAGCATCTTCAAATTC)(序列编号：10)

将PCR产物复制到pCR-Blunt(美国加州Invitrogen公司)并转入DH5α大肠杆菌菌株中，而且选择重组殖株来定序并识别吴郭鱼抗菌胜肽。

由GL Biochem(中国上海)使用Fmoc化学的固相程序合成TP的肽。将粗肽萃取、冻干、并藉由反相高效液体层析术(HPLC)纯化。分别藉由质谱术和HPLC验证纯化肽的分子量和纯度。在磷酸盐缓冲盐水(PBS；pH 7.4)中重组纯度>95％的合成肽用于实验。从复制的cDNA获得尼罗河吴郭鱼抗菌胜肽的胺基酸序列：

胺基酸序列：

TP1：FDWDSVLKGVEGFVRGYF(序列编号：11)；

TP2：GECIWDAIFHGAKHFLHRLVNP(序列编号：12)；

TP3：FIHHIIGGLFSVGKHIHSLIHGH(序列编号：13)；

TP4：FIHHIIGGLFSAGKAIHRLIRRRRR(序列编号：14)；

TP5：QLQGKQVSGEVVQKVLQELIQSVAKP(序列编号：15)。

将五个不同抗菌胜肽序列的cDNA编码区分离和特征化。名为TP1-5的五个cDNA 序列分别编码68、77、76、89、及64个胺基酸。预测讯号肽的可能分裂位点为TP1在Pro19和Gly20之间、TP2在Pro19和Gly20之间、TP3在Pro19和Gly20之间、TP4在 Ala17和Glu18之间、及TP5在Leu22和Gln23之间。此外，发现到，尼罗河吴郭鱼抗菌胜肽TP4胺基酸序列中的一个共识核定位序列(NLS)位在胺基酸编号43(RRRR)。

吴郭鱼抗菌胜肽3(TP3)

吴郭鱼抗菌胜肽3(TP3)是从尼罗河吴郭鱼(尼罗口孵非鲫，Oreochromisniloticus) 分离的AMP，并被特征化。吴郭鱼抗菌胜肽3(TP3)是以苯丙胺酸(F)开始并以组胺酸(H)结束的23个胺基酸的肽。TP3是具有α螺旋结构的成孔肽，其赋予对抗细菌的选择性细胞溶解活性。除了破坏细菌的细胞膜之外，吴郭鱼α螺旋抗微生物肽已被报告可刺激免疫原性、诱导TH1细胞的免疫反应、并作为鱼接种疫苗的佐剂(Acosta等人，吴郭鱼α螺旋抗微生物肽与子单元抗原的共同施予促进小鼠和吴郭鱼的免疫原性， Vaccine.2014；32:223-229)。TP3具有对抗革兰氏阳性和阴性细菌的抗微生物活性。此外，临床案例的研究显示，施加抗微生物肽到严重感染的皮肤创伤可以清除感染并改善愈合 (O'Meara等人，S,CullumN、Majid M及Sheldon T，伤口护理管理的系统性检视：(3) 用于慢性伤口的抗微生物剂；(4)糖尿病足溃疡，Health Technol Assess.2000；4:1-237)。因此，TP3具有许多与抗生素一致的特征，但可能有更广泛的应用，而且可以避免或减少细菌抗药性的担忧。

吴郭鱼抗菌胜肽4(TP4)

吴郭鱼抗菌胜肽4(TP4)是从尼罗河吴郭鱼(尼罗口孵非鲫，Oreochromisniloticus) 分离的AMP，并被Peng等人特征化。吴郭鱼抗菌胜肽4(TP4)是以苯丙胺酸(F)开始并以组胺酸(H)结束的23个胺基酸的肽。TP4是具有α螺旋结构的成孔肽，其赋予对抗细菌的选择性细胞溶解活性。除了破坏细菌的细胞膜之外，吴郭鱼α螺旋AMPs已被报告可刺激免疫原性、诱导TH1细胞的免疫反应、并作为鱼接种疫苗的佐剂(Acosta 等人)。TP4具有既对抗革兰氏阳性细菌又对抗革兰氏阴性细菌的抗微生物活性。

如实施例1证明的，TP3提供抗菌活性而不诱导抗药性，并与抗生素的使用兼容，而且不具有任何明显的免疫毒性作用。在TP3的预防疾病效果而且没有能力引起抗药性的前提之下，TP3可以适用于有高感染风险的情况。得出的结论是，TP3可有效作为用于伤口愈合、以及伤口MRSA感染的良好治疗剂。

此外，还在实施例2示范的是，TP4提供抗菌活性而不诱导抗药性，并与抗生素的使用兼容，而且不具有任何明显的免疫毒性作用。发现的是，TP4诱导上皮细胞增生，这可能是由于胶原蛋白I、胶原蛋白III、角质细胞生长因子(KGF)、及角蛋白10的改变基因表现。除了对先天免疫系统的宿主防御功能和调节作用之外，TP4可以在降低感染风险中发挥重要的作用。还得出的结论是，TP4可有效作为用于伤口愈合、以及伤口 MRSA感染的良好治疗剂。

因此，本发明提供一种用于伤口愈合的方法，包含施予有需要的个体治疗有效量的吴郭鱼抗菌胜肽，具体而言是用于预防或治疗伤口的抗甲氧苯青霉素金黄色葡萄球菌(MRSA)感染。

吴郭鱼抗菌胜肽选自由吴郭鱼抗菌胜肽1、吴郭鱼抗菌胜肽2、吴郭鱼抗菌胜肽3、吴郭鱼抗菌胜肽4、吴郭鱼抗菌胜肽5及上述之组合所组成之群组。在本发明的一个具体实例中，吴郭鱼抗菌胜肽为吴郭鱼抗菌胜肽3或吴郭鱼抗菌胜肽4。

还提供一种用于预防或治疗伤口MRSA感染的组合物或医药组合物、及一种TP用于制造用于预防或治疗伤口MRSA感染的药物之用途。

本文中使用的「治疗有效量」乙词是指与未接收该量的相应个体相比导致疾病、失调、或副作用之治疗、痊愈、预防、或改善效果、或疾病或失调之进展速度减缓的药物或药剂量。该词还包括在其范围内可有效增强正常生理功能的量。

对于治疗的用途，治疗有效量的肽、或该肽之功能性变体可被配制成用于施予的医药组合物。因此，本发明进一步提供一种包含治疗有效量的肽及一种或更多种医药上可接受载体、稀释剂、或赋形剂的医药组合物。

载体、稀释剂、或赋形剂必须是在与制剂的其他成分兼容的意义上为可接受的，而且对于被施予该医药组合物的个体不会有害。所属技术领域中公知的或使用的任何载体、稀释剂、或赋形剂都可被用于本发明，取决于医药制剂的要求。

依据本发明，该医药组合物可适用于藉由任何适当的途径施予，该途径包括但不限于口服的、直肠的、经鼻的、局部的、阴道的、或肠胃外的途径。在本发明的一个特定实例中，该医药组合物被配制用于口服施予。这样的制剂可以藉由配药学技术领域中习知的任意方法制备。

在本发明的一个实例中，用于口服施予的医药组合物可以呈现分离的单元，例如胶囊或片剂；粉末或细粒；溶液或悬浮液、及其类似物。在一个特定的实例中，医药组合物是片剂的形式。

现在将参照以下实施例更特定地描述本发明，提供该等实施例是为了示范而不是限制的目的。

实施例

实施例1TP3之功效实验

材料与方法

1.1 细胞与小鼠

在补充有10％热失活胎牛血清的罗斯韦尔园区纪念学院介质(RPMI-1640)中培养幼仓鼠肾细胞株(BHK-21)。使用Balb/c雌性小鼠进行实验。让所有小鼠住在无特定病原体条件下的笼子中，并且在实验过程中给予水和随意的标准实验室食物。所有的动物处置程序均符合台湾海洋大学(NTOU)的指导方针。所有程序都经台湾基隆NTOU 的动物照护及使用委员会批准。

1.2 试剂

使用苏木紫-曙红(H&E)(目录号105175，德国达姆施塔特默克)和吉姆萨染色溶液(目录号51811826，美国密苏里州Sigma)来测定组织学。使用针对巨噬细胞(目录号550282，美国加州BD Biosciences)、淋巴细胞(CD3e)(目录号550277，美国加州 BD Biosciences)、及CD8a(目录号14008182，美国加州eBiosciences)的抗体用于免疫组织化学(IHC)。

1.3 体外毒性

在平底96孔盘中以每孔5×104个细胞的密度培养细胞，并补充各种组合的AMPs。在24小时后，分别藉由中性红、LDH及MTT试验量测细胞存活率。

1.4 吴郭鱼抗菌胜肽3肽的合成和抑菌分析

由GL Biochem(中国上海)使用Fmoc化学的固相程序合成TP3肽。将粗肽萃取、冻干、并藉由反相高效液体层析术(HPLC)纯化。分别藉由质谱术和HPLC验证纯化肽的分子量和纯度。在磷酸盐缓冲盐水(PBS；pH 7.4)中重组纯度>95％的合成肽用于实验。TP3序列为FIHHIIGGLFSVGKHIHSLIHGH。在没有修饰之下基于在线方法(http://cmdr.ubc.ca/bobh/methods/MODIFIEDMIC.html；加拿大不列颠哥伦比亚省不列颠哥伦比亚大学微生物和免疫学系的Hancock实验室方法)藉由培养液微稀释分析测定肽的最小抑制浓度(MIC)。

1.5 体内毒性

为了测定TP3的毒性，将TP3溶于磷酸盐缓冲盐水(PBS；pH 7.4)，并在左大腿以肌肉内推注施予(2mg/小鼠)。观察小鼠的全身毒性症状。为了研究治疗对生物化学的效果，使用PBS(对照组)处理小鼠(每组n＝6)。在最后注射TP3之后，在第1天、第3天及第6天收集血液样品(0.2ml)，并用于测定麸胺酸草乙酸转胺酶(GOT)、麸胺酸丙酮酸转胺酶(GPT)、血脲氮(BUN)、肌酸酐(CRE)、总葡萄糖(GLU)、及肌酸磷酸激酶(CPK)的血清水平。

1.6 MRSA脓毒症的小鼠模型中的治疗用途

将雌性Balb/c小鼠(6-8周龄)每只小鼠腹膜内注射106CFU的MRSA。注射MRSA 之后十分钟，将小鼠腹膜内注射万古霉素(0.01mg/小鼠体重g)、甲氧苯青霉素(0.01mg/ 小鼠体重g)、或TP3(0.005mg/小鼠体重g)。在第二组实验中，在注射MRSA之后10、 60、120、或180分钟给予小鼠腹膜内注射TP3(0.005mg/小鼠体重g)。每24小时记录存活率和状态持续长达192小时。为了检查细菌传播，在注射抗生素或TP3之后48小时牺牲小鼠，并记录血液、腹膜、脾、肝、及肠系膜淋巴结中的细菌数量。将来自稀释细菌溶液的菌落数量相对于在治疗开始时的表示。这些实验由四个组组成，每个组含有5 只小鼠。

1.7 用于伤口愈合的小鼠模型

将雌性Balb/c小鼠(6-8周龄)用于伤口愈合的实验。将所有小鼠单独圈养，以防止打架和进一步伤害伤口，并且随意提供小鼠食物和水。将小鼠保持在室温下12小时的光：暗循环，并在实验使用之前使小鼠适应环境至少一周。处理小鼠时，所有的研究人员都穿戴帽子、无菌手套、隔离衣及鞋套。藉由剃毛从小鼠的背去除毛发，然后在暴露区域中作出全厚度伤口(直径1cm)。每个伤口使用50μ1含有106个cfu(菌落形成单元) 的金黄色葡萄球菌的培养液混合物接种。在接种后5分钟施加总体积0.1ml的50μl TP3 (2mg/ml)。治疗后30分钟，使用Tegaderm(明尼苏达州圣保罗市3M)覆盖伤口以保持均匀性，并防止小鼠移除治疗。基于最初的实验，我们在受伤后0、3、5及19天检视伤口，以免干扰感染。这样的检视截取从发炎到再生、及再生到伤口愈合的解决阶段的过渡。动物随后藉由吸入二氧化碳安乐死并评估伤口。在每个实验的每个时间点检查每一组的四个个体。量测每个伤口，然后从动物移出伤口，并从对侧背部取出未受伤的皮肤作为对照。将每个活检等分，且三个切片被用于张力量测和组织学，而两个切片用于定量测定微生物负载。重复三次伤口愈合的研究。

1.8 伤口闭合量测

受伤后立即进行描记。对于未受污染的伤口，每隔一天测定伤口的大小。对于受污染的伤口，在第3、5、19天将小鼠安乐死并制作伤口边缘的描记。使用麦金塔AdobePhotoshop程序、直方图分析测得伤口面积。计算伤口收缩的百分比如下：伤口收缩％＝(A0-At)/A0x100，其中A0是原始伤口面积，At是每两天活检时的相应伤口面积。

1.9 伤口感染评估

选取通常与人体的伤口感染有关的金黄色葡萄球菌多重抗药性菌株来产生多微生物溶液。MRSA菌株是来自从台北市立医院(和平妇幼分院)获得的粪便的临床分离物。藉由在37℃下在胰蛋白酶大豆培养液(TSB)中培养需氧菌整夜来制备初始接种物，随后将培养液以1000rpm离心15分钟，并用15％的甘油、或切碎的肉萃取物与15％甘油 (用于需氧菌)再悬浮于TSB中。将浓度调整到106cfu/50μ1并储存于-80℃。在伤口施加之前，培养液混合物含有106cfu(菌落形成单元)的金黄色葡萄球菌。在接种后5分钟施加总体积0.1ml的50μl TP3(2mg/ml)。治疗后30分钟，使用Tegaderm(明尼苏达州圣保罗市3M)覆盖伤口以保持均匀性，并防止小鼠移除治疗。基于最初的实验，我们在受伤后0、3、5及19天检视伤口，以免干扰感染。这样的检视截取从发炎到再生、及再生到伤口愈合的解决阶段的过渡。动物随后藉由吸入二氧化碳安乐死并评估伤口。在每个实验的每个时间点检查每一组的四个个体。量测每个伤口，然后从动物移出伤口，并从对侧背部取出未受伤的皮肤作为对照。将每个活检等分，且三个切片被用于张力量测和组织学，而两个切片用于定量测定微生物负载。重复三次伤口愈合的研究。

1.10 伤口闭合量测

受伤后立即进行描记。对于未受污染的伤口，每隔一天测定伤口的大小。对于受污染的伤口，在第3、5、19天将小鼠安乐死并制作伤口边缘的描记。使用麦金塔AdobePhotoshop程序、直方图分析测得伤口面积。计算伤口收缩的百分比如下：伤口收缩％＝(A0-At)/A0x100，其中A0是原始伤口面积，At是每两天活检时的相应伤口面积。

1.11 伤口感染评估

选取通常与人体的伤口感染有关的金黄色葡萄球菌多重抗药性菌株来产生多微生物溶液。MRSA菌株是来自从台北市立医院(和平妇幼分院)获得的粪便的临床分离物。藉由在37℃下在胰蛋白酶大豆培养液(TSB)中培养需氧菌整夜来制备初始接种物。随后将培养液以1000rpm离心15分钟，并用15％的甘油、或切碎的肉萃取物与15％甘油 (用于需氧菌)再悬浮于TSB中。将浓度调整到106cfu/50μ1并储存于-80℃。在伤口施加之前，将细菌原料重新混合。藉由直接电镀来测定微生物负载，随后与接种同时进行冷冻-解冻和cfu计数。将接种物藉由无菌移液管递送到开放性伤口的中心。安乐死之后 (在第0、3、5、或19天)，使用UPMC临床微生物实验室操作手册中所述用于人体伤口活检培养的协议利用两个等分的组织片段来测定微生物负载。将组织活检称重并放在 1.5ml的TSB中，然后在组织研磨机中均质化。将一滴匀质物放在载玻片上并进行革兰氏染色用于粗估(假使一种或更多种细菌存在于油浸视野内，则预计组织中的数量为至少105cfu/g)。使用蒸馏水连续稀释(1：10(0.1+0.9))组织匀质物。计算组织的cfu/g 如下：

cfu/g＝盘数量(l/稀釋)×10/均质组织的重量。

1.12 免疫组织化学(IHC)

如前所述取出并固定皮肤组织[25]。简言之，用4％甲醛固定冷冻切片，并使用苏木紫/曙红、吉姆萨、或革兰氏染色将组织样品染色。由三个独立的研究者分析IHC。使用BX-51显微镜(日本Olympus)撷取影像。

1.13 传讯(m)RNA的分离和实时PCR

从伤口组织分离出总RNA，并使用Qiagen RNeasy套组纯化。按照制造商的建议使用iScript cDNA合成套组(USA BIO-RAD)进行反转录成cDNA。按照制造商的说明使用实时聚合酶炼反应(PCR)分析来分析基因表现。将iQSYB Green Supermix(USA BIO-RAD)和特异性引子对用于选定的基因，并使用用于GAPDH的引子对作为参考基因。按照以下条件进行定量PCR：在95℃1分钟、在55℃30秒、及在72℃1分钟40个循环。使用0.5ml的cDNA、2倍的SYBRGreen PCR Supermix、以及500nM的正向和反向引子以BIO-RAD软件计算临界循环数(Ct)。使用ΔCt法且GAPDH作为从同一样品放大的参考基因来计算相对转录量。ΔCt是选定基因的传讯(m)RNA之临界循环相对于 GAPDH mRNA之临界循环的差异。每个实验组进行实时PCR重复三次。

引子序列：

TNF-α:F-GGTGTTCATCCATTCTCTAC(序列编号：16)

R-CCCAGCATCTTGTGTTTC(序列编号：17)

IL-6:F-TCCATCCAGTTGCCTTCTTG(序列编号：18)

R-TTTCTCATTTCCACG ATTTCCC(序列编号：19)

CXCL5:F-CTGACCCCAGTGAAGATAAG(序列编号：20)

R-CCGATAGTGTGACAGATAGG(序列编号：21)

GAPDH:F-ACAATGAATACGGCTACAG(序列编号：22)

R-GGTCCAGGGTTTCTTACT(序列编号：23)

1.14 统计分析

以三次或更多次的重复进行实验，并重复至少3次。误差条表示标准偏差。组织学和体内研究结果代表三个独立的实验。每个治疗使用一组7只的小鼠，而且重复实验三次。

1.15 结果

TP3的体外毒性和功效

为了评估TP3在BHK-21细胞中的细胞毒性，将藉由中性红、LDH及MTT试验测得的细胞毒性试验结果图示于图1A、图1B及图1C，在高达40μg/ml的各种浓度下的 TP3不影响细胞存活力。TP3对抗MRSA的最小抑制浓度(MIC)>3.9μg/ml。同样地，>3.9 μg/ml的TP3可有效杀死悬浮于10mM磷酸钠缓冲液、pH 7.2的MRSA(图1D)。

TP3没有在小鼠体内施展急性毒性作用

经由肌肉(i.m.)注射递送TP3到小鼠体内来检查TP3的毒性并量测血液中的生化因子。用2mg TP3治疗的小鼠并没有在麸胺酸草乙酸转胺酶(GOT)、麸胺酸丙酮酸转胺酶(GPT)、血脲氮(BUN)、肌酸酐(CRE)、总葡萄糖(GLU)、及肌酸磷酸激酶(CPK) 的水平上诱发任何明显的变化(表1)。

表1肌肉注射TP3(2mg/小鼠)之后小鼠的生化参数

*所有数据皆表示为平均值±SD并与ANOVA(n＝6)比较。

将p<0.05的差异视为是统计学上显著的。

结果表明，TP3不会诱发全身性毒性作用，即使是在最高的测试浓度(2mg/小鼠)。

TP3增强感染MRSA的小鼠之存活

在使用TP3或抗生素治疗之前藉由监测感染MRSA的小鼠之存活来研究TP3的体内杀菌作用。所有感染MRSA的未治疗小鼠在感染72小时内死亡，而使用TP3共同治疗降低了死亡率，参见图2A。在感染MRSA之后8天，分别使用TP3(0.005mg/g)、万古霉素(0.01mg/g)、及甲氧苯青霉素(0.01mg/g)处理的小鼠存活率为100％、80％、及0％。在感染MRSA的小鼠中，未治疗组在48小时内的致命率为20％，而使用TP3 或万古霉素治疗大大降低了死亡率(表2)。细菌评估显示，感染任一菌株的未治疗小鼠表现出100％的阳性血培养物及对于所有测试器官的高水平细菌移生(CFU/g的数量不低于10⁶)(表2)。

表2.每只小鼠腹腔內注射1×10⁶CFU的MRSA之后TP3、甲氧苯青黴素及万古黴素对小鼠存活的影响。

注射TP3或抗生素之后监测致死率2天。

与未治疗的对照组(P<0.05)相比，TP3治疗明显减少所有检查器官的细菌负荷。这些数据表示，TP3可以在感染小鼠的器官中有效地控制MRSA。为了测定治愈潜力，先将小鼠注射MRSA，然后在10、60、120、或180分钟后注射TP3(0.005mg/g)。在这些注射时间时，MRSA实验组分别表现出100％、80％、60％、及40％的存活率，参见图2B。使用TP3治疗的小鼠之存活率一致高于未治疗的小鼠(PBS治疗的对照小鼠)。这些数据表示，立即施加TP3(0.005mg/g)对于防止严重感染是很重要的。在感染MRSA 的10至60分钟内施加使TP3能够充当有效治疗剂。TP3被用于伤口愈合感染实验的测试和探究抗菌活性并促进伤口修复。

TP3在体内伤口闭合的疗效

在以无菌方式促进伤口愈合中测定TP3的作用，参见图3A。在未治疗伤口和Tegaderm^TM或抗生素治疗伤口的区域之间未观察到统计差异，且全部都在>25天闭合。这并不令人意外，因为健康小鼠的皮肤伤口可有效愈合，而这个过程不太可能会明显改善。然而，未治疗的受感染伤口导致在第一周死亡，参见图3B。使用万古霉素治疗导致与对照组类似的伤口闭合时间，而伤口闭合被单独TP3治疗加速。在未受污染的伤口没有观察到这种伤口闭合的增加，表示TP3藉由打击感染来促进伤口恢复。不像未受污染的伤口，在所有的治疗组中，在一周后伤口尺寸大部分保持不变，参见图3B。在14天， TP3治疗组的伤口尺寸小于万古霉素治疗组的伤口尺寸(P<0.05)。然而，这两组都在第 30天结束前显现完全闭合。

经治疗伤口中的微生物负载

未经治疗的受污染伤口的伤口尺寸增加以及MRSA和MRSA+Meth(甲氧苯青霉素)治疗组(图3B)没有闭合表示活性伤口感染。这可由伤口菌落的定量评估(表3)支持。

表3.细菌负载。在每个时间点四只小鼠的平均值；对照是指每只小鼠的初始接种。

在MRSA和MRSA+Meth组中，每种生物体约4.5～5.2xl04cfu/10μl的初始接种物在第3天增加到约6.7～7.3xl08cfu/10μl。在第3天和第5天之间，MRSA+Vanc和MRSA+TP3 组的菌落数量减少，且在TP3组观察到最快速的减少(在第5天与另一组相比明显不同)。在临床实施中，由于现场的需氧性质，通过培养来自皮肤伤口的厌氧菌来计数MRSA菌落的尝试常常导致低估。

利用组织的革兰氏染色评估伤口，以确定皮肤上的厌氧菌是否超过藉由定量需氧菌所实现的数量。定量上真皮中每高倍率视野的革兰氏阳性生物体之数量反映出定量的细胞数量。正如所料，使用抗微生物剂治疗时更快速地减少了细菌负载。

真皮和表皮成熟的评估

以上展现增强的伤口闭合的数据表示使用单独TP3治疗促进真皮基质的成熟。进行这种通过常规组织学的分析。真皮的成熟一般是在增生、重构、及成熟阶段进行评估。使用TP3治疗的伤口在所有这三个阶段都表现出加速的进展。还在表皮隔室中注意到加速愈合。

从无麻醉小鼠的腹部取出约1平方公分的皮肤区块，并使伤口感染50ml含有单独106个cfu的MRSA，或连同抗甲氧苯青霉素、万古霉素、或TP3的培养液混合物处理。将来自受伤部位的皮肤样品固定，并在治疗后第0、5及19天进行吉姆萨染色。观察伤口变化，发现使用TP3治疗的伤口如同正常皮肤是多层的，而且在第25天之前完全成熟。上皮的角质化和再生表示没有不整的迹象，而使用TegadermTM和MRSA+Vanc治疗的伤口与TP3组相比显现在整体表皮成熟上有所障碍。因此，在治疗受感染小鼠之后测试 TP3促进先天免疫反应和细胞激素产生的作用。吉姆萨染色显示，在使用MRSA处理的感染小鼠的皮肤中有免疫细胞累积。

TP3的活性机制

检视TP3的直接抗微生物活性的根本机制。使用IHC和实时PCR(参见图4A-图4C)量测TP3调节小鼠免疫细胞的能力。将受伤小鼠感染后第3天牺牲，将伤口部位的冷冻切片固定在甲醛中，并使用针对巨噬细胞、淋巴细胞或CD8的特异性抗体进行免疫组织化学分析，使用细胞表面标记抗体的IHC显示，在抗生素治疗的感染伤口中巨噬细胞、淋巴细胞、及CD8(细胞毒性细胞)的浸润明显增加，而在TP3组较少发现。其原因可能是抗微生物肽直接灭杀细菌、减少小鼠先天免疫反应的影响区域。促炎性细胞激素IL-6 充当先天免疫的强效调节剂，而趋化介素CXCL5增加巨噬细胞到伤口周围组织的募集。在治疗后1、3及5天量测感染MRSA的小鼠体内的伤口组织趋化介素和细胞激素的水平。使用感染MRSA的小鼠作为正对照组，以确认细胞激素的活化。与正对照组相比， TP3治疗减少了TNF-α、IL-6及CXCL5的诱导(参见图4A-图4C)。

总之，鉴于在体外和体内皆证实了TP3的伤口闭合活性，故TP3具有抗微生物活性。TP3在高达40μg/ml都没有影响幼仓鼠肾细胞的存活力，而且测定TP3对抗MRSA的 MIC。在小鼠模型中发现，TP3对于打击由MRSA引起的腹膜炎和伤口愈合感染是高效的，而且不会引起不良的行为效果或肝脏或肾脏毒性。结果显示，TP3通过抗微生物和免疫调节作用两者提高了感染细菌病原体MRSA的小鼠的存活率，表示TP3可以被开发作为用于伤口愈合、具体而言是感染MRSA的伤口的新型外用剂。

实施例2 TP4的疗效实验

材料与方法

2.1.细菌、细胞及小鼠

选取通常与人体的伤口感染有关的MRSA菌株来产生多微生物溶液。MRSA菌株是来自从台北市立医院(和平妇幼分院)获得的粪便的临床分离物。菌株是藉由常规实验室方法鉴定，并被储存在-80℃下的20％(体积/体积)甘油中。使用胰蛋白酶大豆培养液(TSB)作为培养基。在37℃的潮湿培养箱中、在5％CO2和95％空气下在含有10％ (v/v)FBS、0.37％(w/v)NaHCO3、青霉素(100单位/ml)、链霉素(100μg/ml)、 0.1mM NEAA、及1mM丙酮酸钠的DMEM中生长HaCaT人体角质细胞细胞株和HS-68 人体包皮纤维母细胞细胞株。在约90％聚集(约106个细胞/10-cm培养皿)时获取细胞。使用Balb/c雌性小鼠进行实验。让所有小鼠住在无特定病原体条件下的笼中，并在实验过程中随意给予水和标准实验室食物。所有的动物处置程序均符合台湾海洋大学 (NTOU)的指导方针。所有程序都经NTOU的动物照护及使用委员会批准。

2.2 肽、试剂及抗体

试剂和化学品是向Sigma(密苏里州圣路易斯)购得。依据CLSI的指导方针使用并制备甲氧苯青霉素的标准实验室粉末(目录号51454；密苏里州圣路易斯Sigma)和万古霉素(目录号v2002；密苏里州圣路易斯Sigma)。藉由固相肽合成法合成吴郭鱼抗菌胜肽4(TP4)(HFIHHIIGGLFSAGKAIHRLIRRRRR-OH)并由GL生物化学(目录号080571；中国上海)藉由反相高效液体层析术纯化到>98.19％的等级。使用用于介白素-1(目录号559603，美国加州BDBiosciences)、肿瘤坏死因子(目录号560478，美国加州BD Biosciences)、及介白素-6(目录号555240，美国加州BD Biosciences)的ELISA套组来测定细胞激素的水平。使用对抗VEGF的抗体(目录号550549，美国加州BD Biosciences) 进行免疫组织化学法(IHC)。

2.3 细胞增生

在平底96孔盘中以每孔5×104个细胞的密度培养细胞。在次聚集下，将细胞使用各种刺激和各种浓度的TP4培育48小时。按照制造商的说明藉由中性红、LDH、及MTT 试验量测细胞增生。在显微镜下观察细胞形态(BX-51，日本奥林巴斯)。

2.4 胶原蛋白I、胶原蛋白III、KGF、角蛋白10、及角蛋白17表现的量测

从HaCaT和Hs-68细胞分离出总RNA，并使用Qiagen RNeasy套组纯化。按照制造商的建议使用iScript cDNA合成套组(USA BIO-RAD)进行反转录成cDNA。按照制造商的说明使用0.5ml的cDNA、2倍的iQSYBR Green Supermix(USA BIO-RAD)、及 500nM对抗选定基因或GAPDH(参考基因)的正向和反向引子进行实时聚合酶炼反应 (PCR)来分析基因表现。在以下条件下进行定量PCR：在95℃1分钟、在55℃30秒、及在72℃1分钟40个循环。以BIO-RAD软件计算临界循环数(Ct)。使用ΔCt法且GAPDH 作为内部参考基因来计算相对转录量。ΔCt是选定基因的传讯(m)RNA之临界循环相对于 GAPDH mRNA之临界循环的差异。每个实验组进行实时PCR重复三次。

引子序列：

2.5 吴郭鱼抗菌胜肽4肽和抑菌分析

使用标准协议进行最小抑制浓度(MIC)抗微生物试验。对于MIC评估，将化合物稀释到100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.582、或0.78g/ml的最终浓度。在微量滴定盘中将20μl的每种稀释液与20μl的适当细菌指示剂悬浮液和160μl用于金黄色葡萄球菌的胰酪酶大豆培养液(TSB)混合到总体积200μl。检视每个金黄色葡萄球菌菌株、化合物、及浓度的三次重复试验。正对照组包含取代化合物的水，负对照组包含化合物而无细菌悬浮液。在600nm下藉由光密度量测自动测定微生物的生长(芬兰赫尔辛基 Labsystem Bioscreen C)。微孔盘在25℃下培育植物病原体，并在37℃下培育食物媒介的细菌菌株。在48小时的期间每隔一小时读取吸亮度读数。在每次量测之前摇动微孔盘20 秒。重复实验两次。将实验结束前产生零生长的最低化合物浓度视为MIC。

2.6 体内毒性

为了测定TP4的毒性，将TP4溶于磷酸盐缓冲盐水(PBS；pH 7.4)，并在左大腿以肌肉内推注施予(2mg/小鼠)。每组包含10只小鼠。使用PBS(对照)处理对照组。在最后注射TP4之后，在第1天、第3天及第6天收集血液样品(0.2ml)，并用于测定麸胺酸草乙酸转胺酶(GOT)、麸胺酸丙酮酸转胺酶(GPT)、血脲氮(BUN)、肌酸酐(CRE)、总葡萄糖(GLU)、及肌酸磷酸激酶(CPK)的血清水平。

2.7 MRSA脓毒症的小鼠模型中的治疗用途

将雌性Balb/c小鼠(6-8周龄)每只小鼠腹腔内注射106CFU的MRSA。注射MRSA 之后十分钟，将小鼠腹腔内注射万古霉素(0.01mg/小鼠体重g)、甲氧苯青霉素(0.01mg/ 小鼠体重g)、或TP4(0.005mg/小鼠体重g)。在第二组实验中，在注射MRSA之后10、 60、120、或180分钟给予小鼠腹腔内注射TP4(0.005mg/小鼠体重g)。每24小时记录存活率和状态持续长达192小时。为了检查细菌传播，在注射抗生素或TP4之后48小时牺牲小鼠，并记录血液、腹腔、脾、肝、及肠系膜淋巴结中的细菌数量。将来自稀释细菌溶液的菌落数量相对于在治疗开始时的表示。这些实验由四个组组成，每个组含有10 只小鼠。

2.8 用于伤口愈合的小鼠模型

将雌性Balb/c小鼠(6-8周龄)用于伤口愈合的实验。将所有小鼠单独圈养，以防止打架和进一步伤害伤口，并且随意提供小鼠食物和水。将小鼠保持在室温下12小时的光：暗循环，并在实验使用之前使小鼠适应环境至少一周。处理小鼠时，所有的研究人员都穿戴帽子、无菌手套、隔离衣及鞋套。藉由剃毛从小鼠的背去除毛发，然后在暴露区域中作出全厚度伤口(直径1cm)。每个伤口使用50μ1含有106个cfu(菌落形成单元) 的金黄色葡萄球菌的培养液混合物接种。在接种后5分钟施加总体积0.1ml的50μl TP4 (2mg/ml)。治疗后30分钟，使用Tegaderm(明尼苏达州圣保罗市3M)覆盖伤口以保持均匀性，并防止小鼠移除治疗。基于最初的实验，我们在受伤后3、7、14及21天检视伤口，以免干扰感染。这样的检视截取从发炎到再生、及再生到伤口愈合的解决阶段的过渡。动物随后藉由吸入二氧化碳安乐死并评估伤口。在每个实验的每个时间点检查每一组的四个个体。量测每个伤口，然后从动物移出伤口，并从对侧背部取出未受伤的皮肤作为对照。将每个活检分成六个切片，且三个切片被用于张力量测和组织学，而三个切片用于定量测定微生物负载。重复三次伤口愈合的研究。

2.9 伤口闭合量测与细胞增生基因表现

受伤后立即进行描记。对于未受污染的伤口，每隔一天测定伤口的大小。对于受污染的伤口，在第3、5、19天将小鼠安乐死并制作伤口边缘的描记。使用麦金塔AdobePhotoshop程序、直方图分析测得伤口面积。计算伤口收缩的百分比如下：

伤口收缩％＝(A0-At/A0)x100,

其中A0是原始伤口面积,At是活检时的相应伤口面积。使用上述方法藉由即时PCR进行细胞增生基因表现。

引子序列：

2.10 细胞激素的IHC和ELISA

如前所述取出并固定皮肤组织[28]。简言之，用4％甲醛固定冷冻切片，并使用VEGF 将组织样品染色。由三个独立的研究者分析IHC。使用BX-51显微镜(日本Olympus) 撷取影像。如前所述进行ELISA[29]。

2.11 统计分析

在三个生物学复制品上以一式三份进行全部实验。误差条表示标准偏差，并使用变异数分析(ANOVA)测得各组之间的显著差异(P<0.05)。使用条上方的不同字母表示各组之间的显著差异。每个治疗使用一组10只的小鼠，而且每个实验重复三次。

2.12 结果

藉由TP4增生的体外毒性和刺激

使用中性红、LDH、及MTT试验测试TP4在纤维母细胞细胞株(HS-68)和角质细胞细胞株(HaCaT)的细胞毒性；观察到TP4在Hs-68株中>20g/ml的浓度会影响细胞存活力，参见图5A、图5B及图5C。此外，低剂量(2.5-10g/ml)明显增加了细胞增生，如与未治疗组相比的细胞存活力变化所反映的。这也由光显微影像定性支持。TP4治疗也增加了形式为附着于表面的波纹状区域的细胞聚集物的量。接着，研究TP4对细胞增生因子的影响。胶原蛋白和角质细胞生长因子(KGF)是细胞增生的重要性能因素。在 TP4治疗的Hs-68细胞中分析胶原蛋白I和III、及KGF基因表现。与对照组的表现相比，藉由TP4治疗增强了所有基因的表现，参见图5D～图5F。

在TP4处理的HaCaT细胞上也观察到类似的结果。在测试浓度(降到10μg/ml)下的TP4并不影响HaCaT细胞的生存力，参见图6A-图6C。此外，较低的浓度(1.25-10μg/ml) 实际增强了细胞增生。在此角质细胞细胞株(HaCaT)的增生和分化介质中，角蛋白10 和17是特别重要的，因为他们在协调蛋白质合成和细胞生长的机制中发挥主要的作用。如图6D所示，TP4明显增加了角蛋白10的基因表现，但并不影响角蛋白17的基因表现，参见图6E。因此，结果表示，TP4增强了Hs-68和HaCaT细胞的增生，可能是通过活化编码胶原蛋白I和III、KGF、及角蛋白10的基因。

TP4在小鼠体内的急性毒性作用

经由肌肉(i.m.)注射递送TP4到小鼠体内来检查TP4的毒性，并于随后量测血液中的生化因子。用2mg TP4治疗的小鼠并没有在麸胺酸草乙酸转胺酶(GOT)、麸胺酸丙酮酸转胺酶(GPT)、血脲氮(BUN)、肌酸酐(CRE)、总葡萄糖(GLU)、或肌酸磷酸激酶(CPK)的水平上展现任何明显的变化(表4)。我们的结果显示，即使在最高的测试浓度(2mg/小鼠)，TP4也没有引发系统性毒性作用。

表4肌肉注射TP4(2mg/小鼠)之后小鼠的生化参数

*所有数据皆表示为平均值±SD并与ANOVA(n＝10)相比。在血液中量测以下参数：麸胺酸草乙酸转胺酶(GOT)、麸胺酸丙酮酸转胺酶(GPT)、肌酸酐(CRE)、血脲氮(BUN)、及肌酸磷酸激酶(CPK)。每个条表示三个测定的平均值±标准差(SD)。具有不同数值的数据明显不同(P<0.05)。

TP4增强感染MRSA的小鼠之存活

在使用TP4或抗生素治疗之前藉由监测感染MRSA的小鼠之存活来评估TP4的体内杀菌作用。所有感染MRSA的未治疗小鼠在感染72小时内死亡，而使用TP4共同治疗降低了死亡率，参见图7A。在感染MRSA之后8天，分别使用TP4(0.005mg/g)、万古霉素(0.01mg/g)、及甲氧苯青霉素(0.01mg/g)治疗的小鼠之存活率为100％、80％、及0％。在48小时，未治疗和感染的小鼠中的致命率为60％；使用TP4或万古霉素治疗大大降低了死亡率(表5)。细菌评估显示，感染任一菌株的未治疗小鼠表现出100％的阳性血培养物及对于所有测试器官的高水平细菌移生(CFU/ml的数量不低于106)(表5)。与未治疗的对照组(P<0.05)相比，TP4治疗明显减少所有检查器官的细菌负荷。这些数据表示，TP4可以在感染小鼠的器官中有效地控制MRSA。

为了测定治疗潜力，先对小鼠注射MRSA，然后在10、60、120、或180分钟后注射TP4(0.005mg/g)。在这些注射时间时，MRSA实验组分别表现出100％、80％、60％、及50％的存活率，参见图7B。使用TP4治疗的小鼠之存活率一致高于未治疗的小鼠(PBS 治疗的对照小鼠)。这些数据表示，立即施加TP4(0.005mg/g)对于防止严重感染是很重要的。在感染MRSA10至60分钟内施加使TP4能够充当有效治疗剂。因此，评估TP4 促进伤口修复的效果。

如表5所示，在感染MRSA的小鼠的指定器官中的最后治疗之后48小时的细菌计数。受感染的小鼠未治疗、或使用TP4、甲氧苯青霉素、或经由腹膜内注射的万古霉素治疗。随后记录血液、腹腔、脾、肝、及肠系膜淋巴结中的细菌数量。将来自稀释细菌溶液的菌落数量相对于在治疗开始时的表示。每个值表示三个测定的平均值±标准偏差 (SD)。具有不同数值的数据明显不同(P<0.05)。

表5在感染MRSA的小鼠的指定器官中的最后治疗之后48小时的细菌计数

注射TP4或抗生素之后监测致命性2天。

TP4在体内伤口闭合上的疗效

在以无菌方式促进伤口愈合中检视TP4的作用，参见图8A。在未治疗伤口和Tegaderm^TM或抗生素治疗伤口的区域之间未观察到统计差异，且全部都在>25天闭合。这并不令人意外，因为健康小鼠的皮肤伤口可有效愈合，而这个过程不太可能会明显改善。使用万古霉素治疗导致与对照组类似的伤口闭合时间，而伤口闭合被单独TP4治疗加速。在未受污染的伤口没有观察到这种伤口闭合的增加，表示TP4可以藉由打击感染来促进伤口恢复。不像未受污染的伤口，在所有的治疗组中，在一周后伤口尺寸大部分保持不变，参见图8B。在14天，TP3治疗组的伤口尺寸小于万古霉素治疗组的伤口尺寸(P<0.05)。然而，这两组都在第27天结束前显现完全闭合。

TP4减少发炎细胞激素

检视TP4的直接抗微生物活性。藉由ELISA量测TP4调节小鼠的细胞激素的能力，参见图9A-图9C。促炎性细胞激素IL-6充当先天免疫的强效调节剂，而趋化介素单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)增加单核细胞与巨噬细胞到伤口周围组织的募集。在治疗后3 天评估感染MRSA的小鼠体内的血清趋化介素和细胞激素的水平。使用感染MRSA的小鼠作为正对照组，以确认细胞激素的活化。与正对照组的表现相比，TP4治疗减少了IL-6 和TNF的诱导，参见图9A和图9B。另外，介白素-1(IL-1)蛋白对于皮肤的功能是重要的，其增强表皮的伤口愈合。与对照组伤口相比，观察到IL-1在TP4治疗的伤口中有统计上明显的增强，参见图9C。

TP4在感染MRSA的小鼠体内改变细胞增生基因表现分布

在伤口愈合期间，单核细胞在48小时开始替换嗜中性白血球，以去除伤口碎屑；接着在72小时为增生阶段，在此期间多种生长因子被诱导出。表皮生长因子(EGF)、转化生长因子β(TGF-β)、及血管内皮生长因子(VEGF)分别介导细胞增生、调节分化、及刺激血管生成和血管新生。为了检视细胞增生基因在使用TP4治疗的、感染MRSA的小鼠体内的表现分布，我们使在感染后第1、3、7、14、及21天从小鼠的伤口组织取出的RNA进行实时RT-PCR。与对照组和万古霉素治疗的小鼠中的表现相比，TP4治疗增强EGF(3天)、TGF(7天)、及VEGF(14天)的基因表现，参见图10A-图10C。

在受伤后第7、14、或21天牺牲小鼠，将伤口部位的冷冻切片固定在甲醛中，并使用针对VEGF的特异性抗体进行免疫组织化学分析并观察，发现使用TP4治疗受感染的小鼠增强了血管内皮生长因子(VEGF)的表现，显示完整和结构上正常的表皮再生。这项研究表示，TP4的局部施予可用于促进伤口愈合。

得出的结论是，伤口试剂应解决愈合的所有方面；伤口试剂不仅应促进组织再生，而且还应诱导止血并限制微生物感染。后面这两个过程是至关重要的，因为未能完成这些立即的早期步骤会防碍后续的修复。证实的是，TP4既刺激细胞增生，又发挥抗菌活性。同时，TP4似乎参与上皮细胞的某些过程的调节。在这里，我们观察到TP4可以通过控制纤维母细胞和角质细胞的增生和分化来调节表皮修复。我们报告的是，TP4在角质细胞细胞株(HaCaT)和纤维母细胞细胞株(Hs-68)增生上的作用可以通过活化胶原蛋白I、胶原蛋白III、角质细胞生长因子(KGF)、及角蛋白10的基因表现来介导。在临床相关的模型中(适用于阐明伤口愈合损伤下的病理生理学及用于测试新颖的治疗剂) 确认了TP4的效用。据证实，TP4具有体外抗菌活性。TP4在体内展现强抗微生物活性，在接触60分钟内即可验证。与感染MRSA组相比，在第1、2及3天TP4治疗在感染位点造成TNF和IL-6减少。虽然与对照组相比，TP4治疗导致IL-6适度增加，但这比MRSA 在第1天诱导的更少。TP4的抗发炎作用可能是由于几个相关机制的贡献，包括IL-10 的机制。此外，在第1天TP4在伤口部位减少MRSA诱导的TNF。然而，IL-1是否直接调节伤口闭合是未知的。这里，我们证明在小鼠身上感染MRSA的伤口中IL-1表现随着时间增加。还观察到TP4诱导表皮生长因子(EGF)、转化生长因子(TGF)、及血管内皮生长因子(VEGF)，此举可增强伤口闭合活性。

总之，使用TP4可以补足抗生素的使用。关键的是，TP4不太可能引发抗药性、与抗生素的使用兼容、而且不具有任何明显的免疫毒性作用。此外，TP4诱导上皮细胞增生，这可能是由于胶原蛋白I、胶原蛋白III、角质细胞生长因子(KGF)、及角蛋白10 的改变基因表现。除了对先天免疫系统的宿主防御功能和调节作用之外，TP4可以在降低感染风险上发挥重要的作用。

应将本说明书所提供的叙述和申请专利范围理解为以例示为目的，而不是以任何方式限制本发明的范围。

Claims (3)

1.一种吴郭鱼抗菌胜肽用于制备预防或治疗抗甲氧苯青霉素金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)感染伤口药物的用途，其中该吴郭鱼抗菌胜肽(TP)选自由如氨基酸序列编号：13所示的吴郭鱼抗菌胜肽3(TP3)、如氨基酸序列编号：14所示的吴郭鱼抗菌胜肽4(TP4)及上述的组合所组成的群组。

2.根据权利要求1所述的用途，其中该吴郭鱼抗菌胜肽为如氨基酸序列编号：13所示的吴郭鱼抗菌胜肽3。

3.根据权利要求1所述的用途，其中该吴郭鱼抗菌胜肽为如氨基酸序列编号：14所示的吴郭鱼抗菌胜肽4。

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