CN105061564A - 一种抗菌肽pd22 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗菌肽PD22。所述抗菌肽PD22的氨基酸序列如SEQ？ID？NO:1所示。本发明中的抗菌肽PD22具有分子量小、人工合成方便且成本低、对大肠杆菌、沙门氏菌和魏氏梭菌等细菌杀菌作用强、细胞毒性低，在断奶仔猪饲料中应用能够显著降低断奶仔猪腹泻率和提高断奶仔猪的生长速度的优点。
Description
技术领域
本发明涉及多台领域，尤其涉及一种抗菌肽PD22。
背景技术
为了提高母猪繁殖效率和减少母源性疾病的垂直传播，我国养猪场仔猪一般选择3-4周龄断奶，而断奶过程在自然界中一般发生在3-4个月。仔猪早期断奶给仔猪造成了巨大的应激，仔猪和母猪分开、营养来源从液态的母乳变为固态的饲料、混群和环境的变化，且早期断奶仔猪消化系统和免疫系统发育并不完善，极容易受各种病原菌的攻击而感染疾病，其中消化道疾病是最常见、最严重的疾病之一，也是导致断奶仔猪生长抑制甚至死亡的重要原因。长期以来，使用抗生素是预防和治疗断奶仔猪腹泻的主要手段，但是抗生素的大量使用导致病原菌耐药性不断增强、抗生素使用效果不断削弱，且生猪生产中抗生素的长期大量使用导致的畜产品药物残留和有害菌种耐药性增强已经成为威胁人类安全的重大隐患。因此，寻找能够替代抗生素解决断奶仔猪肠道疾病问题的产品是当前动物营养研究中的热点课题。抗菌肽是自然界生物中广泛存在的小分子活性多肽，具有抗菌谱广、热稳定性强和不易产生细菌耐药性等特点，是替代抗生素理想的潜在物质。然而，天然来源的抗菌肽大多具有分子量大、抗菌活性不高、对宿主细胞具有毒副作用或能导致宿主溶血等缺陷，在一定程度上限制了抗菌肽在断奶仔猪养殖中的推广应用。通过分子设计和改造是克服天然来源抗菌肽缺陷、促进抗菌肽在断奶仔猪养殖中应用的有效手段。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的抗菌肽。
为实现上述目的，本发明提供一种抗菌肽PD22，其特征在于：所述抗菌肽PD22的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。具体为：KKIVKAALQAATQ，分子量为1369.67Da，等电点为10.30。
上述抗菌肽的制备方法，包括以下步骤：
1)抗菌肽的化学合成方法：按SEQIDNO：1所示氨基酸序列，用全自动多肽合成仪(ABI433)合成抗菌肽全序列，并通过HPLC反相柱层析脱盐纯化；
2)纯化的抗菌肽分子量采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)测定，等电点使用等电聚焦电泳测定，氨基酸序列采用自动氨基酸序列测定仪进行解析。
本发明的抗菌肽在仔猪饲料中的应用。
本发明具有如下优点：本发明中的抗菌肽PD22具有分子量小、人工合成方便且成本低、对大肠杆菌、沙门氏菌和魏氏梭菌等细菌杀菌作用强、细胞毒性低等优点，在断奶仔猪饲料中应用能够显著降低断奶仔猪腹泻率和提高断奶仔猪的生长速度。
本发明的实施例通过测定抗菌肽PD22最小抑菌浓度(minimalinhibitoryconcentration,MIC)来反映其抗菌效果，最小抑菌浓度为检测不到细菌生长的最低样品浓度。结果表明本发明的抗菌肽PD22对大肠杆菌、魏氏梭菌、沙门氏菌和枯草芽孢杆菌均有非常强的杀伤作用。在细胞毒性实验上，即使在300ug/mL的浓度下，抗菌肽PD22对猪小肠上皮细胞IPEC-1也存在很低(小于10％)的细胞毒副作用。与阴性对照相比，抗菌肽PD22可显著降低断奶仔猪腹泻率。抗菌肽PD22可显著提高断奶仔猪日增重和降低料重比，显著提高断奶仔猪空肠和回肠绒毛高度及绒毛高度与隐窝深度的比值，说明抗菌肽PD22能够显著改善断奶仔猪肠道功能。
附图说明
图1是抗菌肽PD22细胞毒性分析图；
图2抗菌肽PD22对大肠杆菌攻毒断奶仔猪(24日龄)腹泻的影响图；
图3抗菌肽PD22对24日龄断奶仔猪腹泻率的影响图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：抗菌肽PD22的制备
抗菌肽PD22的化学合成方法：根据发明内容中所述氨基酸序列，用全自动多肽合成仪(ABI433)合成PD22全序列(湖南师范大学生命科学学院合成)，并通过HPLC反相柱层析脱盐纯化；
纯化的抗菌肽PD22分子量采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)测定,等电点使用等电聚焦电泳测定，氨基酸序列采用自动氨基酸序列测定仪进行解析。
抗菌肽PD22，所述的抗菌肽PD22为人工设计合成的活性多肽，包含13个氨基酸残基，分子量为1369.67Da，等电点为10.30，其氨基酸序列为KKIVKAALQAATQ(SEQIDNO:1)。
实施例2：抗菌肽PD22抑菌实验
通过测定抗菌肽PD22最小抑菌浓度(minimalinhibitoryconcentration,MIC)来反映其抗菌效果，最小抑菌浓度为检测不到细菌生长的最低样品浓度。采用二倍稀释法，具体方法如下：
受试细菌接种于LB固体培养基上，然后于37℃培养箱中倒置培养。待菌落长出后，用一次性接种环挑取各受试细菌单菌落至LB液体培养基中，37℃培养箱中震荡培养至对数生长期。紫外分光光度计上检测菌液OD600，根据1OD600＝1×109CFU/mL将受试菌菌液用液体LB培养基稀释至2×105CFU/mL。然后在无菌96孔板各孔中加入100μLLB液体培养基，然后在A1孔中加入100μL稀释到一定浓度的抗菌肽PD22样品(抗菌肽样品加入前用0.22μm微孔滤膜过滤除菌)，混匀后取100μL加入A2孔，A2孔混匀后再取100μL加入A3孔，依次倍比稀释，最后从A12孔吸出100μL弃去，至此抗菌肽PD22二倍浓度梯度样制成。向预先加入抗菌肽PD22的各孔中再依次加入已稀释好的菌液100μL混匀，于37℃缓慢震荡培养16h，然后测定600nm处吸光值。结果计算：取检测不到细菌生长的孔和与之相邻的有细菌生长的孔中抗菌肽PD22浓度之和的平均值作为抗菌肽PD22最小抑菌浓度。测试结果见表1所示。从表1中可以看出抗菌肽PD22对大肠杆菌、魏氏梭菌、沙门氏菌和枯草芽孢杆菌(中国科学院亚热带农业生态研究所提供)均有非常强的杀伤作用。
表1：抗菌肽PD22对各菌的最小抑菌浓度表
| 受试菌种 | PD22MIC(ug/mL) |
| 大肠杆菌09 | 2.34 |
| 大肠杆菌064 | 9.83 |
| 大肠杆菌0141 | 4.7 |
| 沙门氏菌 | 4.7 |
| 魏氏梭菌 | 9.83 |
注：1)其中PD22MIC即抗菌肽PD22的最小抑菌浓度，大肠杆菌09、大肠杆菌064和大肠杆菌0141分别表示血清型为09、064和0141的致病大肠杆菌。
2)所述结果为五次独立重复实验结果的平均值。
实施例3：抗菌肽PD22的细胞毒性实验
猪小肠上皮细胞IPEC-1(中国科学院亚热带农业生态研究所提供)培养于含有5％太牛血清、200U/mL双抗(青霉素和链霉素各100U/mL)，5ug/L表皮生长因子(EGF)的HAM’S/F12培养基中培养至对数期，用磷酸盐缓冲液(HyClone)清洗三遍后，加入0.25％(2.5g/L)的胰蛋白酶消化至单个细胞，加入HAM’S/F12培养基后400g离心4分钟，弃上清后用新鲜的HAM’S/F12培养基悬浮细胞，调整至细胞密度为1×106个/mL，然后往96孔细胞培养板每孔中加入200uL，待细胞贴壁后加入不同浓度抗菌肽PD22，置于二氧化碳培养箱(37℃、5％CO2)培养24小时后，每孔中加入20uLCCK-8(碧云天)CCK-8溶液，继续培养2小时，然后用酶标仪检测450nm波长的吸光值。检测结果如图1所示(其中PD22-300表示300ug/mL抗菌肽PD22；PD22-200表示200ug/mL抗菌肽PD22；PD22-100表示100ug/mL抗菌肽PD22；PBS为磷酸盐缓冲液(对照组)，所述实验结果为五次独立实验结果的平均值)，从图1中可以看出，虽然抗菌肽PD22细胞毒作用随着其添加浓度而增加，但是抗菌肽PD22细胞毒很小，即使在300ug/mL的浓度下，抗菌肽PD22对猪小肠上皮细胞IPEC-1也存在很低(小于10％)的细胞毒副作用。
实施例4：抗菌肽PD22对断奶仔猪(24日龄)大肠杆菌攻毒实验
选取24日龄杜洛克×长白×大白断奶仔猪240头，采用单因子试验设计，按体重和性别随机分到4个处理组，阴性对照组为基础日粮，PD22-50组为基础日粮中添加50mg/kg抗菌肽PD22；PD22-100组为基础日粮中添加100mg/kg抗菌肽PD22，阳性对照组为基础日粮中添加100mg/kg金霉素，每组6个重复，每个重复10头猪，试验期为14天。各处理组仔猪断奶当天开始饲喂不同日粮，4天后开始攻毒，每头仔猪按总大肠杆菌1×109个细胞分早晚2次给服两次培养液(由接种大肠杆菌的LB培养液于37℃恒温培养箱中震荡培养48小时获得)。抗菌肽PD22对大肠杆菌攻毒断奶仔猪腹泻率的影响见图3。其中PD22-50表示基础日粮中添加50mg/kg抗菌肽PD22；PD22-100表示基础日粮中添加100mg/kg抗菌肽PD22；阴性对照为基础日粮；阳性对照为基础日粮中添加100mg/kg金霉素。从图3的试验结果可以看出：与阴性对照相比，抗菌肽PD22可显著降低断奶仔猪腹泻率。
实施例5：抗菌肽PD22对断奶仔猪生长性能和肠道健康的影响
选取24日龄杜洛克×长白×大白断奶仔猪240头，采用单因子试验设计，按体重和性别随机分到3个处理组，对照组不添加抗菌肽PD22，PD22-45组日粮中添加抗菌肽PD2245mg/kg；PD22-90组日粮中添加抗菌肽PD2290mg/kg，每组8个重复，每个重复10头猪，试验期10天。基础日粮配方见表2。抗菌肽PD22对断奶仔猪生产性能、腹泻率和肠道形态结构的影响见图2-3和表3-4。从表3的试验结果可以看出抗菌肽PD22可显著提高断奶仔猪日增重和降低料重比。从图2-3的试验结果可以看出抗菌肽PD22可显著降低断奶仔猪腹泻率。从表4的试验结果可以看出抗菌肽PD22能够显著提高断奶仔猪空肠和回肠绒毛高度及绒毛高度与隐窝深度的比值，说明抗菌肽PD22能够显著改善断奶仔猪肠道功能。
表2：基础日粮组成表
| 原料组成 | 含量(％) |
| 膨化玉米 | 27 |
| 玉米 | 28.8 |
| 乳清粉 | 10 |
| 豆油 | 2 |
| 膨化大豆 | 10 |
| 43％豆粕 | 14 |
| 鱼粉 | 5 |
| 石粉 | 0.5 |
| 磷酸氢钙 | 1 |
| 赖氨酸 | 0.15 |
| 苏氨酸 | 0.1 |
| 50％氯化胆碱 | 0.05 |
| 氧化锌 | 0.3 |
| 丙酸钙 | 0.05 |
| 乙氧基喹啉 | 0.05 |
| 复合维生素 | 0.5 |
| 复合矿物质 | 0.5 |
| 合计 | 100 |
复合维生素配方：维生素A4g，维生素D31g，维生素E16g，维生素k0.6g，维生素B10.8g，维生素B21.7g，维生素B61g，维生素B121.3g，烟酸15g，D-泛酸钙5g，生物素0.5g，补足沸石粉到1000g。
复合矿物质配方：五水硫酸铜102g，硫酸亚铁61g，一水硫酸锌20g，硫酸锰30g，含硒1％的亚硒酸钠4g，含碘1％的碘酸钙10g，补足沸石粉到1000g。
表3：抗菌肽PD22对24日龄断奶仔猪生长性能的影响表
| 项目 | 对照组 | PD22-45组 | PD22-90组 |
| 日增重(g/d) | 285.3 | 307.2 | 327.9 |
| 日采食量(g/d) | 373.7 | 374.8 | 383.6 |
| 料肉比 | 1.31 | 1.22 | 1.17 |
表4：抗菌肽PD22对24日龄断奶仔猪肠道形态结构的影响表
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (3)
1.一种抗菌肽PD22，其特征在于，所述抗菌肽PD22的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。
2.根据权利要求1所述的一种抗菌肽，其特征在于，所述的抗菌肽PD22的分子量为1369.67Da，等电点为10.30。
3.一种如权利要求1或2所述的抗菌肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)按SEQIDNO:1所示氨基酸序列，用全自动多肽合成仪合成抗菌肽全序列，并通过HPLC反相柱层析脱盐纯化；
2)纯化的抗菌肽分子量采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱测定，等电点使用等电聚焦电泳测定，氨基酸序列采用自动氨基酸序列测定仪进行解析。
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