TW201620393A - 一種製備含表面素之飼料添加劑的方法 - Google Patents

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Abstract

本發明為一種製備含表面素之飼料添加劑的方法，係利用具高表面素(surfactin)產量之枯草桿菌突變株(Bacillus subtilis TH)，以黃豆作為基質進行半固態發酵，再將發酵後的黃豆經過乾燥與粉碎成為一黃豆粉後，即得一含有表面素之飼料添加劑；其中每公斤發酵黃豆粉中含有表面素約6-7g。本發明發現餵食含有表面素之飼料添加劑的石斑魚，其生長速率較快、免疫型基因的表現量較高(如：AMP、Mx與IFN-induced protein)且感染病菌的魚類，其死亡率大幅下降，顯示該含表面素之飼料添加劑具有促進生長、增加免疫力與抵抗病源菌的感染的效果。

Description

一種製備含表面素之飼料添加劑的方法
本發明屬於農業領域中的水產養殖技術領域和生物技術領域，涉及一種枯草桿菌製備的微生物脂肽-表面素(surfactin)的生產方法及其在水產飼料中的應用。
枯草桿菌(Bacillus subtilis)生產的二次代謝產物有β-內醯胺(β-lactams)、胺基糖苷(aminoglycoside)、聚乙醯胺衍生物(polyketides)和小型多胜肽(small polypeptides)，其中以脂肽與脂蛋白類(lipopeptides and lipoproteins)較受到矚目，因為脂肽與脂蛋白類具有抗菌效果，又被稱為抗菌胜肽(Antimicrobial Peptide，AMP)。
目前發現的抗菌胜肽可分為三家族，其一為豐原素(Fengycin)，分子中由十個胺基酸分子組成環狀胜肽鏈，在胜肽鏈N端接上14到18個不等的脂肪酸支鏈，具有良好的抗真菌能力，但對於酵母菌與細菌沒有明顯的效果(Schneider et al.,1999)；另一個為伊枯草桿菌素(Iturin)，含有七個α-胺基酸環接耦合至β-胺基酸與烷基鏈，在胜肽鏈上接有14到17個不等的脂肪酸支鏈，分子量大小約1044~1081kD，功能為對抗真菌及細菌，具有生物降解性、高表面活性與低毒性等優點(Bonmatin,Laprevote,& Peypoux,2003)；第三個則為本發明所探討的表面素(Surfactin)，其含有7個環狀胺基酸與13到16個不等的脂肪酸支鏈，枯草桿菌在生產表面素時，通 常會伴隨著一枯草桿菌素出現，當兩種抗菌胜肽共同存在時，會因為混合微胞對細胞擁有高親和力，使得紅血球溶血率增加，因此也會增加抗真菌的活性(Feignier,Besson,& Michel,1995；R Maget-Dana,Thimon,Peypoux,& Ptak,1992；Sandrin,Peypoux,& Michel,1990)。
Arima等人於1968年在枯草桿菌培養液中發現一個白色針狀結晶，因其具有界面活性故將其命名為表面素(Kakinuma,Hori,Isono,Tamura,& Arima,1969)。在過去的研究指出，當在水中含有20μM的表面素，其可將水溶液的表面張力由72mN/m降至27mN/m，是目前發現界面活性最佳的生物界面活性劑(Arima,Kakinuma,& Tamura,1968)。表面素是一個環型的脂胜肽，其含有7個環狀胺基酸與13到16個不等的脂肪酸支鏈(Kakinuma,Sugino,Isono,Tamura,& Arima,1969)。在溶液中，脂肪酸碳鏈呈疏水特性，而環狀的胺基酸則為親水端，胺基酸中的天門冬胺酸(aspartic acid)及麩胺酸(glutamic acid)皆帶負電，兩個帶負電的胺基酸會形成鉗狀，使表面素分子形成帶負電的馬鞍結構，屬於陰離子生物界面活性劑的一員(Tsan,Volpon,Besson,& Lancelin,2007)，根據胺基酸序列的不同，可將表面素分四種類型：A、B、C、D。其主要差別在於環狀胺基酸後所接的脂肪酸碳鏈數的不同(Shaligram & Singhal,2010；Singh & Cameotra,2004)。
由於表面素的非專一性的生物活性，使它可以藉由降低表面張力來破壞細菌的細胞膜，且不會造成抗藥性，因此被認為具有抗菌的潛力，而被歸類為抗菌脂肽的一員(Cho,Lee,Cha,Kim,& Shin,2003)。在過去的研究指出表面素可以抑制真菌、黴漿菌、格蘭氏陰性菌與革蘭氏陽性菌的生長(P.Das,Mukherjee,& Sen,2008；Singh & Cameotra,2004)；Heiko 等人發現當表面素濃度在12~50μg/ml即具有殺菌能力(Heerklotz & Seelig,2001)；海洋中的Bacillus circulans所產生的脂肽生物界面活性劑(lipopeptide biosurfactant)，對於少數的抗多種藥物菌株(multidrug-resistant strain，MDR)以及抗青黴素金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)具有抑制的效果(Pan et al.,2007)；表面素也具有抗黴漿菌的特性，可恢復被黴漿菌汙染的細胞的型態特徵，且對於細胞新陳代謝和增殖不會產生傷害(Vollenbroich,Pauli,Ozel,& Vater,1997)；經由電子顯微鏡發現表面素會使黴漿菌的膜形成穿孔現象，此時會導致黴漿菌內外滲透壓不平衡而死亡(Régine Maget-Dana & Ptak,1995)。
目前的研究認為表面素的抗病毒機制是藉由病毒的脂質外套膜和表面素的物理化學作用後，造成病毒外套膜及蛋白質外殼結構崩裂，並且抑制病毒核酸物質進行複製(Vollenbroich,Özel,Vater,Kamp,& Pauli,1997)。過去研究指出表面素能對抗好幾種病毒，包括人類後天免疫不全病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)、豬疱疹病毒第一型(Suid Herpes virus type 1，SHV-1)、單純皰疹病毒第一型(Herpes Simplex Virus 1，HSV-2)、濾泡性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus，VSV)、猿猴免疫缺陷病毒(Simian Immunodeficiency Virus，SIV)、貓流感病毒(Feline Calicivirus，FCV)、鼠腦心肌炎病毒(Murine Encephalomyocarditis Virus，MECV)、偽狂犬病毒(Pseudorabies Virus，PRV)、豬細小病毒(Porcine Parvovirus，PPV)、新城雞瘟病毒(Newcastle Disease Virus，NDV)、傳染性法式囊症病毒(Infectious Bursal Disease Virus，IBDV)(Huang et al.,2006；Itokawa et al.,1994；Vollenbroich,Özel,et al.,1997)。
抗生素抗菌機制是抗生素與病原體特定部位的受體結合，使病原體的正常架構遭到破壞或阻礙某些生物合成，以達到抑菌或殺菌的作用。目前有研究朝著抗菌胜肽的角度來探討表面素，由於表面素和抗菌胜肽皆為兩性分子，但表面素的結構為環型，而抗菌胜肽依據結構的不同，分為四類：α-helix,β-sheet,β-turn loop,Boat-shaped。抗菌胜肽與細胞膜作用機制是利用胜肽脂質交互作用(Peptide-lipid interaction)，分為四個模式：聚集模式(Aggregate model)、環形孔洞模式(Toroidal pore model)、筒狀穿鑿式(Barrel-Stave model)及地毯覆蓋式(Carpet model)，其中這些作用模式大多是經由胜肽脂質的交互作用，造成膜內外滲透壓不平衡，使菌體死亡。目前表面素與細胞膜之間的作用機制尚無定論，但主要有幾種假說：1.類清潔劑(detergent-like)：此種機制為胜肽鏈的一部份插入膜的中間層進而引起膜的狀態極不穩定(stronger destabilization)進而造成膜產生裂縫(leak)以及分離(partitioning)(Lohner and Epand,1997；Heeklotz et al.,2004)；2.孔洞(vesicle)的形成：此機制可分為三個部分，(1)表面素藉由和膜之間的疏水作用力(hydrophobic interaction)而插入膜表面；(2)表面素結構中，帶負電的胺基酸會和帶負電的脂質頭部(lipid headgroups)產生電荷排斥(charge repulsions)，進而造成膜彎曲；(3)膜體極不穩定而產生類似微胞(micelle)的結構造成膜崩解(Sebastien Buchoux et al.,2008；Huang et al.,2009)。目前的研究認為表面素的非極性端可與有套膜(envelope)的病毒作用，並在膜上形成孔洞(pore)，進而產生離子通道(ion channels)破壞整個病毒的膜體(Vollenbroich et al.,1997)；有關表面素破壞不具套膜的病毒的外鞘蛋白(capsid)研究較少，但Vollenbroich等人認為表面素主要是藉由胜肽部分 (peptide moiety)而非脂肪酸碳鏈與病毒外鞘作用而造成病毒的傷害(Vollenbroich et al.,1997)。此兩種理論的差異在於一者主張裂縫的產生，而另一者主張孔洞的形成。綜合以上的說法可以得知表面素的確是可以造成膜本身的受損，進而影響到細胞正常的生理功能。目前研究發現，抗菌胜肽可以對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌及原生動物都有破壞的能力(Powers and Hancock,2003)；另外有文獻指出，抗菌胜肽與原核生物的核酸結合後，可抑制蛋白質的產生(Powers and Hancock,2003)。與傳統的抗生素相比，抗菌胜肽的活性具有廣效性、高效性、穩定性、快速殺菌能力和免疫系統的相互作用等特點。
報導指出，抗生素添加劑的使用嚴重破壞動物腸道的微生物平衡，並易在動物體內殘留，嚴重影響畜產品的品質和人類的健康，而使用抗菌胜肽作為飼料添加劑能夠解決上述問題，這也是抗菌胜肽在畜牧業上最直接的應用。高等動物腸道內的抗菌胜肽能抑制外源性病原菌，而對動物腸道存在的正常菌群和細胞無殺傷作用。抗菌胜肽成分為易消化吸收的胺基酸，可作為畜禽飼料添加劑和取代或部分取代目前動物所用的抗生素，減少抗生素對動物體的危害。抗菌胜肽可代替傳統抗生素，治療仔豬腹瀉、豬瘟、雞新城疫和奶牛乳房炎等各種棘手的疾病，不會產生抗藥性的細菌，無毒無殘留，在畜禽疾病治療與預防中具有廣闊的應用前景。抗菌胜肽作為飼料添加劑的眾多優點，正引起人們的廣泛關注，有望成為替代抗生素的產品之一。目前，國內外作為飼料添加劑生產應用的主要是天蠶抗菌胜肽AD-酵母製劑，大多數的畜禽試驗也是圍繞這種抗菌胜肽進行的。
飼料及飼料原料受到黴菌污染是一個全球性問題。為了減少黴菌污染發生，對已被污染的飼料採取適當的處理並以最大限度減少黴菌毒素對動物健康的危害，是多年來國際畜牧、獸醫、飼料科技界研究的重要課題。最初人們透過控制飼料中含水量、環境溫度、濕度等手段而減少黴變的量。隨著化學和微生物學的發展，人們研發出化學防腐劑，目前使用較多的主要有：有機酸、有機酸鹽(酯)和複合防黴劑三大類，但它們對食用都具有毒性。而抗菌胜肽類防腐劑是一種蛋白質，在消化系統中容易降解成胺基酸，對人類副作用小、食用安全，如乳酸鏈球菌肽(Nisin)，已在全世界50多個國家廣泛應用於食品防腐保鮮。來源天然、無毒副作用的抗菌胜肽類防腐劑漸漸有取代傳統化學防腐劑的趨勢，相信未來抗菌胜肽在飼料行業及相關的一些行業產品的防腐中將會擔當重要的角色。
由於抗生素在畜禽和水產動物中的大量使用，藥物在畜禽和水產動物體內嚴重殘留及抗藥性細菌的產生使得動物性食品的安全問題越來越嚴重，威脅著人類的身體健康和養殖業的發展，並且對於畜產品出口貿易帶來巨大的損失。抗菌胜肽因為具有廣效性抗菌活性、快速殺菌、不易產生抗藥性菌株並且能與傳統抗生素有協同作用等特點，而被認為將有廣闊的應用前景。更重要的是，抗菌胜肽在序列和架構上具有多樣性，為新藥設計提供了很大的想像和發揮空間，能生產出性能穩定的產品。
抗菌胜肽作為飼料添加劑時，可以耐飼料製粒時的高溫，滿足飼料添加劑生產流程的要求。抗菌胜肽作為抗生素時，其殺菌機制獨特，具有廣效性抗菌作用，對水產養殖動物與畜禽具有加速生長、保健和治療疾病的功能，並且無毒副作用、無殘留、無抗藥性產生等問題，且生產成 本低也不受季節和氣候變化等外在環境的影響。產業化生產含天然活性的水生微生物的抗菌胜肽，可以滿足水產與畜牧業發展的需求，推展綠色飼料添加劑行業的發展。
抗菌胜肽作為飼料添加劑的研究是最近幾年才發展起來，還處於探索階段，距離形成成熟的技術、大規模的應用到生產中還有很多問題需要解決：1.抗菌胜肽的天然資源有限，化學合成和基因工程便成為獲取抗菌胜肽的主要手段；2.合成的成本昂貴，目前還無法大規模的生產；3.透過基因工程，在微生物中直接表現抗菌肽基因，可能會造成微生物死亡，或產物表現量過少的問題。目前一般抗菌胜肽的量產模式大多是利用合成菌株進行液態發酵所生產，其缺點為：1.初期液態發酵生產設備與投資費用非常高，投資回收慢；2.若不經過純化程序，直接將合成菌株做為飼料添加劑，會有GMO基改添加劑之疑慮。故研發天然、可廣效性殺(抗)菌、價格低廉且非GMO的替代抗生素的抗菌胜肽為醫藥、飼料添加劑研發的重要課題。
本發明是利用具表面素產量的枯草桿菌突變株，以黃豆為發酵基質，進行半固態發酵，再將發酵後的黃豆經乾燥和粉碎後，將所得之黃豆粉做為飼料添加劑。
本發明之目的係提供一種製備含表面素之飼料添加劑的方法。
該方法包括以下步驟，步驟一：將高產量枯草桿菌突變株(Bacillus subtilis TH)之菌液接種至含30%無機鹽液體培養基(Mineral salt medium)與黃豆之混合物中，於溫度30-40℃，濕度80-90%，進行半固態發酵2-3天，得一發酵過的黃豆；其中高產量枯草桿菌突變株之菌液接種體積與該混合物中黃豆體積之比例為5：100-10：100。
步驟二：將該發酵過的黃豆於溫度50-60℃烘乾，時間為2-3小時，再經過磨碎與過篩，得富含表面素的黃豆粉末(每公斤6-7克)；該黃豆粉末即為含有表面素(surfactin)的飼料添加劑，其表面素含量為6-7克/公斤。
本發明之目的係提供一種製備含表面素飼料添加劑的方法，該飼料添加劑係應用於水產生物(如：石斑魚或南美白蝦)之飼料，具有促進水產生物之生長率、增加免疫力及抗細菌、抗真菌與抗病毒之活性。
第一圖係利用不同濃度的表面素處理病毒感染細胞株之中和力價分析。
第二圖之圖二A係表面素對神經壞死病毒顆粒造成之型態影響，(A)1%L-15處理組；(B)1% L-15+100μg/ml表面素混合處理組；(C)1%L-15神經壞死病毒混合處理組，箭頭指出表示正常的病毒顆粒；(D)40μg/ml表面素+神經壞死病毒混合處理組，箭頭指出表示不正常的病毒顆粒；(E)100μg/ml表面素和神經壞死病毒混合處理組，箭頭指出表示不正常的病毒顆粒。圖二B係表面素對虹彩病毒顆粒造成之型態影響，(A)正常的虹彩病毒顆粒組；(B)10μg/ml表面素+虹彩病毒混合處理組，該病毒顆粒外觀變形；(C)40μg/ml表面素+虹彩病毒混合處理組，表面素與病毒顆粒之間有沾黏現象。
第三圖係含表面素飼料添加劑促進南美白蝦成長試驗。
第四圖係含表面素飼料添加劑促進石斑魚成長試驗。
第五圖係含表面素飼料添加劑增加免疫型基因的表現量。
第六圖之圖六A係含表面素飼料添加劑降低感染神經壞死病毒後石斑魚的死亡率。圖六B係含表面素飼料添加劑降低感染虹彩病毒後石斑魚的死亡率。
實施例一.以半固態發酵方式製備含表面素之飼料添加劑。
本專利是採用高產量枯草桿菌突變株(寄存編號BCRC910653)以黃豆為基底，進行半固態發酵，該發酵過的黃豆表面富含二次代謝產物一表面素；發酵基質也可採用其他價格更為低廉的發酵基質如菜仔粕、棕櫚粕、椰仔粕、農業副產品或下腳料(馬鈴薯皮、木薯皮、蘋果皮)。
以10%黃豆量的比例，接種高產量枯草桿菌突變株之菌液至含30%無機鹽液體培養基與黃豆混合物中，進行半固態發酵，其條件為溫度30℃，濕度80%，發酵時間為48小時，再將發酵後的黃豆經過55℃烘乾2-3小時、粉碎後經60目篩網，置於4℃保存，其中每公斤黃豆粉含有6-7克的表面素。
實施例二.表面素之抑菌試驗
為了探討表面素是否具有抗細菌之活性，因此進行體外敏感性試驗。
細菌菌液製備分別將大腸桿菌(Escherichia coli DH5α)、哈威 氏弧菌(Vibrio harveyi)、溶澡弧菌(Vibrio alginolyticus)、鰻弧菌(Vibrio anguillarum)、鮭弧菌(Vibrio salmonicida)、產氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)培養於LBA(E.coli DH5α)或TSA(+1.5%NaCl)上，於37℃培養16小時後，刮下菌落並溶於指定培養液；使OD540為1時(濃度約為1×109/c.c.菌數)，取100μl菌液加入900μl的LB或TSB(+1.5%NaCl)，使菌液濃度5×105CFU/ml。
黴菌菌液製備
將黑曲黴(Aspergillus niger)培養於MEAIII平板上，於25℃培48小時後，刮下菌落溶於指定培養液。經由連續稀釋並塗於MEAIII平板上，計算菌落數推算原液濃度為1×106CFU/ml，之後取500μl菌液加入500μl的MEB，將菌液濃度稀釋至5×105CFU/ml。
敏感性試驗(Susceptibility test)
在96孔培養皿在每個凹槽加入130μl的菌液，菌液濃度為5×105CFU/ml，再加入20μl由滴定方式稀釋成不同濃度的表面素，於37℃培養16小時後，使用分光光度計計算菌體生長濃度，所得數據對照於原先起始值(OD540為1時)，以等於起始值(菌體沒有增生)之實驗組為最小抑菌濃度(Minimun inhibiting concentration，MIC)，每個實驗組各有三次重複及對照組。
試驗結果如表一所示：與枯草桿菌ATCC21332所生產的表面素比較，由高產量枯草桿菌突變株，所生產的表面素其最小抑菌濃度為96.5μM。
表一、枯草桿菌ATCC21332與高產量枯草桿菌突變株所生產之表面素之
實施例三.表面素與神經壞死病毒中和反應試驗
為了探討表面素是否具有抗病毒活性，因此進行中和反應試驗。於實驗前一天，將GF-1細胞培養在96孔微量平底培養盤，每一孔接種5×103個細胞，待隔日(16小時)細胞生長成八分滿時，及可以進行力價測定。首先先將待測定之病毒液，以1% FBS-L15做連續十倍稀釋，稀釋倍數由101~1010，再將稀釋過的病毒液分別接種至96孔盤中，每一孔接種100μl，均勻搖晃培養盤讓病毒液均勻分散，共8重複；將培養盤放在28℃培養箱中，讓病毒吸附90分鐘後，換掉舊有的培養液，補入200μl的1% FBS-L15培養液，將培養盤放回28℃培養箱中，培養9天後觀察細胞變情形。病毒力價(50% tissue culture infection dose,TCID50)是依據Reed-Muench Method的方法計算，以TCID50表示，計算中和指數Neutralization index(NI=病毒原力價/經表面素中和後的病毒力價NI)，NI值愈高，表示表面素得的中和效價愈高。中和反應操作為系列10倍稀釋，中和效價的判定方式，當中和 指數小於10(即Log10NI值小於1)，為無中和效力；中和指數介於10~50之間(Log10NI值介於1~1.6)為中和效力不顯著，屬於存疑範圍；而當中和指數大於50(Log10NI值大於1.7)，則判定為具有顯著的中和效力(Grace,1979)。試驗結果如圖一所示。
實施例四.表面素與病毒作用機制
將表面素溶於滅菌水中，以0.2μm過濾膜過濾後，再利用1% FBS-L15稀釋至40μg/ml和100μg/ml。表面素處理組：以1：1體積比例將表面素與神經壞死病毒液混合；控制組：1% FBS-L15培養液與神經壞死病毒液混合，兩組分別混合後於28℃下培養一天，再以穿透式電子顯微鏡(Transmission electron microscope，Hitachi H-600)觀察。取6μl表面素處理組滴於銅網上並使病毒沉降約10分鐘，再以pH 7.4之1% phosphotungstic acid(PTA，Sigma)染色10分鐘，染色完成後，以濾紙吸去多餘的混合液並放置室溫30分鐘，使銅網陰乾後隨即觀察。穿透式電子顯微鏡使用電壓為75KV，底片曝光時間為4秒鐘。底片沖洗於海洋大學電顯中心暗房，將取出的底片放置於沖片架上以顯影劑D19顯影4分鐘，顯影完成後再以0.33%的冰醋酸停止顯影2分鐘，接著浸泡固定劑10分鐘，最後再以流水的方式洗去多餘的藥劑60分鐘後，陰乾底片。試驗結果如圖二所示。
實施例五.含表面素之飼料添加劑提升南美白蝦成長試驗
將發酵豆粉與市售蝦飼料粉碎，添加無菌水混合均勻後，利用飼料擠壓器製成顆粒狀，放置烘箱於70℃乾燥3小時，將飼料中的水分降至10%，並將乾燥後的飼料置於4℃冰箱保存。成長試驗分四個飼料處理組，分別為1.添加發酵豆粉其表面素含量為10ppm；2.添加發酵豆粉其表面 素含量為20ppm；3.添加水洗過後發酵豆粉2%；4.添加水洗過後發酵豆粉5%與控制組：市售飼料。每組為25隻白蝦蝦苗，濕重約為0.6g，實驗水槽為30公分×24公分×60公分之透明玻璃缸，內含水量約為45公升，實驗期間不控溫，持續打氣，每次換水量約為1/3。每天投餵量約為蝦重量的5%，投餵時間為每日早上8點及下午5點，每星期秤其濕重，記錄並計算其成長率。試驗結果如圖三所示。
實施例六.含表面素之飼料添加劑提升石斑魚成長試驗
飼料蛋白質與脂質含量參考Shiau和Lan(1996)試驗配製而成，試驗飼料配方為一般飼料，其粗蛋白為47%，脂質為10%。紅魚粉、玉米筋蛋白、小麥筋蛋白及烏賊粉，經由粉碎機研磨並過篩(35mesh篩網)，藉此增加飼料黏結性，所有飼料經由擠粒機擠粒、切粒並烘乾後，添加2-5%表面素，冰存於-20℃冰箱以確保飼料品質。試驗結果如圖四所示。
實施例七.含表面素之飼料添加劑可誘導動物先天免疫基因表現量
連續對石斑魚投餵含有0%、2%及5%表面素之飼料，可在第七天後誘發石斑魚免疫型基因AMP(Antimicrobial peptide)、MX(MX蛋白為干擾素(interferon)誘發的一種GTPase)、干擾素誘導蛋白(INF-inducted protein)的表現。試驗結果如圖五所示。
實施例八.含表面素之飼料添加劑增加動物抗病能力
點帶石斑魚苗經連續投餵7天含有表面素之飼料，對於石斑魚感染神經壞死病毒或虹彩病毒後，死亡率之變化。實驗共分為4組，1.陰性控制組：餵食一般飼料+注射PBS；2.陽性控制組：餵食一般飼料+注射病 毒；3.實驗組：餵食含2%表面素的飼料+注射病毒；4.實驗組：餵食含5%表面素的飼料+注射病毒。試驗結果如圖六所示。
以上實施例揭露本發明方法所產生的表面素得應用於水產養殖投餵飼料，並且適應於水中環境變化與多種病原，具有耐酸鹼、耐高溫、廣譜性殺菌效果(革蘭氏陽性與陰性、真菌、寄生蟲、病毒)，不會造成抗藥性，且可以被微生物降解，是一種環境友善、綠色飼料添加劑，不會有藥物殘留問題，非常適合作為新型抗生素與抗病型飼料添加劑。
本發明方法採用固態發酵法，發酵完直接乾燥粉碎，即成飼料添加劑，得替代一般抗生素，此方法生產工藝簡單、生產成本低廉。
上述多項功效，實屬充分符合新穎性及進步性之法定發明專利要件，爰依法提出申請，懇請 貴局核准本件發明專利申請案以勵發明。
【生物材料寄存】 國內寄存資訊【請依寄存機構、日期、號碼順序註記】
寄存機構：財團法人 食品工業發展研究所
日期：103年11月3日
編號：BCRC910653
國外寄存資訊【請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記】
無

Claims (11)

  1. 一種製備含表面素之飼料添加劑的方法，該方法包括以下步驟：A、將高產量枯草桿菌突變株(Bacillus subtilis TH)之菌液接種至含30%無機鹽液體培養基(Mineral salt medium)與黃豆之混合物中，進行半固態發酵，得一發酵過的黃豆；B、將該發酵過的黃豆烘乾、磨碎與過篩，得一黃豆粉末；該黃豆粉末即為含有表面素(surfactin)的飼料添加劑。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之製備含表面素之飼料添加劑的方法，其中步驟A之高產量枯草桿菌突變株之菌液接種體積與該混合物中黃豆體積之比例為5：100-10：100。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之製備含表面素之飼料添加劑的方法，其中步驟A之半固態發酵係於溫度30-40℃，濕度80-90%，發酵2-3天。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之製備含表面素之飼料添加劑的方法，其中步驟B之烘乾係於溫度50-60℃，時間2-3小時，進行烘乾。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之製備含表面素之飼料添加劑的方法，其中步驟B之黃豆粉末，其表面素含量為6-7克/公斤。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之製備含表面素之飼料添加劑的方法，該飼料添加劑係應用於水產生物之飼料。
  7. 如申請專利範圍第6項所述之製備含表面素之飼料添加劑的方法，其中該水產生物係魚類或蝦類。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之製備含表面素之飼料添加劑的方法，其中魚類係石斑魚；該蝦類係南美白蝦。
  9. 如申請專利範圍第1項所述之製備含表面素之飼料添加劑的方法，該飼料添加劑係用以促進水產生物之生長率。
  10. 如申請專利範圍第1項所述之製備含表面素之飼料添加劑的方法，該飼料添加劑係用以水產生物之增加免疫力。
  11. 如申請專利範圍第1項所述之製備含表面素之飼料添加劑的方法，該飼料添加劑係具有抗細菌、抗真菌與抗病毒之活性。
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