CN113135997B - 一种用于食品保鲜的杂合肽及其在酿酒酵母表达系统的基因表达方法 - Google Patents
一种用于食品保鲜的杂合肽及其在酿酒酵母表达系统的基因表达方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种用于食品保鲜的杂合肽及其在酿酒酵母表达系统的基因表达方法，属于功能多肽筛选技术领域。为了克服现有技术的不足，本发明提供一种用于食品保鲜的杂合肽及其在酿酒酵母表达系统的基因表达方法，该杂合肽融合了猪源抗菌肽cecropin P1的活性区域和牛源抗菌肽的活性区域的优势获得新型的杂合肽，通过人工合成杂合肽基因并将目的基因连接在质粒pYES2‑ɑ上获得新型杂合肽重组酵母菌株，使用半乳糖诱导其表达，上清液进一步纯化后即可用于食品保鲜，尤其对于新鲜猪肉保鲜和牛奶保鲜具有很好的效果。
Description
技术领域
本发明属于功能多肽筛选技术领域，涉及一种一种用于食品保鲜的杂合肽及其在酿酒酵母表达系统的基因表达方法。
背景技术
随着人们生活水平的提高，消费需求和方式的转变，生鲜食品已成为城乡居民生活中的必需品。但由于保鲜技术的相对滞后，生鲜食品产后容易腐败变质，成为制约我国农产品加工业和食品工业发展的重要因素之一。生鲜食品保鲜已成为当今农业、食品企业、物流业和消费者所关心的热点问题。多重耐药性超级细菌的频繁出现，让人们意识到滥用抗生素造成的药物残留以及环境污染等问题的严重性。近年来，生物保鲜技术由于其环保且不会产生耐药性越来越受到青睐。
生物保鲜技术是将某些具有抑菌或杀菌活性的天然物质配制成适当浓度的溶液，通过浸泡喷淋或涂膜等方式应用于生鲜食品中，进而达到防腐保鲜的效果。生物保鲜技术的机理包括抑制或杀灭食品中的微生物，隔离食品与空气的接触，延缓氧化作用，调节贮藏环境的气体组成及相对湿度等因生物保鲜剂具有天然、安全、简便等优点，故应用范围不断扩大，已成为食品保鲜技术的研究热点之一。
目前生物保鲜方面研究较多的是利用微生物菌体及其代谢产物保鲜、生物天然提取物保鲜和基因工程技术保鲜。抗菌肽是具有抗微生物活性的小分子多肽，其产生于抗致病菌的防御反应过程中。由于抗菌肽来源广，相对分子质量小，且具有强阳离子性、良好的热稳定性、酸碱稳定性和蛋白酶稳定性以及较为广泛的抑菌谱，因此使用绿色、稳定、安全、小分子的抗菌肽代替抗生素用于生物保鲜以及抑菌防腐已成近年来研究的热点。
抗菌肽cecropin P1是1989年Lee等首先从猪小肠分离得到的，后来研究表明，其实际上来源于猪肠道内的蛔虫。由31个氨基酸组成，分子量为3.3KDa。二级结构为：ɑ-螺旋，N端为强碱性，C端为强疏水性，且中间可形成柔性弯曲的谷氨酸－甘氨酸(Glu-Gly)卷曲序列，其螺旋－卷曲－螺旋结构对抗菌活性具有特殊的重要性。牛源抗菌肽BMAP-27和BMAP-28分别由27和28个氨基酸，在C末端分别包含一个抗菌活性的ɑ-螺旋结构域，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有良好的抗菌活性。但目前抗菌肽cecropin P1还存在抑菌活性不强以及溶血性较高的特点，如何最大程度上发挥或增强抗菌肽的抑菌活性并降低其细胞毒性成为抗菌肽的研究的焦点所在。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供一种用于食品保鲜的杂合肽及其在酿酒酵母表达系统的基因表达方法，该杂合肽融合了猪源抗菌肽cecropin P1的活性区域和牛源抗菌肽的活性区域的优势获得新型的杂合肽，通过人工合成杂合肽基因并将目的基因连接在质粒pYES2-ɑ上获得新型杂合肽重组酵母菌株，使用半乳糖诱导其表达，上清液进一步纯化后即可用于食品保鲜，尤其对于新鲜猪肉保鲜和牛奶保鲜具有很好的效果。
本发明的目的之一是提供一种用于食品保鲜的杂合肽，该杂合肽包含33个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ.No1所示。该杂合肽的抗菌效果好，且细胞毒性低，提高其抗菌效果，降低其细胞毒性。
用于编码上述杂合肽的核苷酸序列如SEQ：No.2所示；其上游引物如SEQ：No.3所示；其下游引物如SEQ：No.4所示；
本发明还提供一种上述杂合肽在酿酒酵母表达系统的基因表达方法，其具体包括如下步骤：
1)人工合成杂合肽的基因序列，将杂合肽基因进行PCR扩增后使用连接酶将其连入重组酵母表达载体pYES2-ɑ中，构建表达重组质粒pYES2-ɑ-SS-33；
2)将构建的表达重组质粒pYES2-ɑ-SS-33电转化宿主酿酒酵母INVSc1，使用氨苄青霉素的YPDS选择平板筛选得到能表达杂合肽的重组基因工程酵母菌；
3)将筛选得到的重组基因工程酵母菌进行高密度发酵得到含有杂合肽的发酵液，冷冻离心即可得到含有杂合肽的上清液。
优选地，所述杂合肽在酿酒酵母表达系统的基因表达方法中，所述步骤1)包括如下步骤：杂合肽基因表达在N端引入Xho I酶切位点，使用Xho I对杂合肽基因表达产物进行酶切，使用Xho I和EcoR I将表达载体pYES2-ɑ进行酶切，通过T4连接酶将目的基因表达产物与酶切后的pYES2-ɑ进行连接得到重组载体pYES2-ɑ-SS-33，PCR鉴定后进行胶回收，即可得到纯化后的重组载体pYES2-ɑ-SS-33。其中PCR扩增的上游引物如SEQ：No.3所示；其下游引物如SEQ：No.4所示。
优选地，所述杂合肽在酿酒酵母表达系统的基因表达方法中，所述步骤2)包括如下步骤：制备酿酒酵母感受态细胞悬液，使用电转化的方法将重组载体pYES2-ɑ-SS-33加入酿酒酵母感受态细胞悬液中，使用氨苄青霉素的YPDS选择平板筛选阳性转化子；
具体地，将电转化后的酿酒酵母细胞均匀涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的YPDS选择平板上，28℃培养2-3天，挑取多个生长状态较好的阳性转化子的单菌落依次划线接种至含氨苄青霉素200μg/ml、500μg/ml、1000μg/ml的YPDS选择平板，选择在高浓度氨苄青霉素平板上正常生长的菌落作为阳性重组基因工程酵母菌；
优选地，所述杂合肽在酿酒酵母表达系统的基因表达方法中，所述步骤3)具体包括如下步骤：将筛选到的重组基因工程酵母菌接种于5ml SC-U诱导培养基中，28℃，200rpm培养24h后将菌液直接转接于250ml SC-U液体诱导培养基中，28℃震荡培养，每隔24h补加10％半乳糖溶液至终浓度达1％；培养120h后，在4℃12000rpm的离心条件下离心10min，收集上清液即可得到含有杂合肽的上清液。
本发明还提供一种上述杂合肽的新型用途，即上述杂合肽在食品保鲜中的应用。
作为本发明所优选的一种实施方式，所述的杂合肽用于新鲜猪肉保鲜；其中用于新鲜猪肉保鲜时使用浸泡法。本发明实施例4表明本发明杂合肽对于常见的十种食源性具有显著的抑菌作用，所述的杂合肽对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有显著的抑菌效果，其与常规的Cecropin P1标准品相比MIC显著降低。本发明实施例5表明，250μg/ml的杂合肽SS-33使用浸泡法使猪腿肉的货架期延长1-4天；125μg/ml的杂合肽SS-33使用浸泡法使猪腿肉的货架期延长1-3天。
作为本发明所优选的另一种实施方式，所述的杂合肽用于鲜牛奶保鲜。本发明实施例6表明，未添加杂合肽组的pH值下降速度均快于添加杂合肽SS-33组，且随着杂合肽添加量的增加，pH值稳定性越好；未添加杂合肽组的活菌计数均高于于添加杂合肽SS-33组，且随着杂合肽添加量的增加，检出的活菌数量减少。这表明，本发明所述的杂合肽用于鲜牛奶保鲜具有很好的保鲜效果。
本发明与现有技术相比具有如下技术优势：本发明利用分子设计和基因工程技术构建了能表达一种新型杂合肽SS-33的重组酵母菌株。将重组杂合肽SS-33制备成纯品，其抑菌效价高、抑菌谱广、细胞毒性低，可应用于食品保鲜，具有广阔的市场前景和开发价值。
(1)本发明所述的杂合肽用于食品保鲜时具有抑菌效果更好的效果，其对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有显著的抑菌效果，其与常规的Cecropin P1标准品相比MIC显著降低。将其用于牛奶保鲜和鲜肉保鲜时，其活菌检出数量显著降低，且pH变化较慢，均具有很好的保鲜效果。
(2)本发明所述的杂合肽具有更低的溶血率和更低的细胞毒性，本发明实施例2表明0-500μg/ml之内的新型杂合肽SS-33对猪源红细胞的溶血率均在15％以下。本发明实施例3表明，在0-125μg/ml之内的新型杂合肽SS-33对BHK细胞是无毒性的。
附图说明
图1不同浓度下杂合肽SS-33的最低溶血浓度测定结果。
图2新型杂合肽SS-33对BHK细胞的毒性结果。
图3添加不同浓度的杂合肽的溶液浸泡下的新鲜猪肉的pH随时间的变化图。
图4添加不同浓度的杂合肽的溶液浸泡下的新鲜猪肉的总挥发性盐基氮随时间的变化。
图5添加不同浓度的杂合肽的溶液浸泡下的新鲜猪肉的活菌计数随时间的变化图。
图6添加不同浓度的杂合肽的溶液浸泡下的新鲜猪肉的感官得分随时间的变化图
图7新鲜猪肉的感官评分标准。
图8添加不同浓度的杂合肽下的鲜牛奶的pH随时间的变化图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式来进一步描述本发明，但所述领域技术人员应能知晓，所述实施例并不以任何方式限定本发明专利保护的范围，在本发明技术思路基础上所作出的技术特征的等同替换均应当包括在本发明专利保护的范围之中。
实施例1新型杂合肽表达载体的构建与工程菌的获得
将目的基因扩增后使用Xho I对目的基因片段进行酶切，用Xho I和EcoR I将表达载体pYES2-ɑ进行酶切，并通过T4连接酶将目的基因酶切后片段与酶切后的表达载体pYES2-ɑ连接，从而得到重组载体pYES2-ɑ-SS-33，进行PCR鉴定后进行胶回收得到纯化后的重组载体pYES2-ɑ-SS-33。
转化重组质粒pYES2-ɑ-SS-33加入酿酒酵母感受态细胞悬液中，电转化后酿酒酵母感受态细胞悬液均匀涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的YPDS选择平板上，28℃培养2-3天挑取生长状态较好的阳性转化子的单菌落依次划线接种至含氨苄青霉素200μg/ml、500μg/ml、1000μg/ml的YPDS选择平板上，以在高浓度氨苄青霉素平板上正常生长的菌落为可能高拷贝重组菌株。
将筛选到的阳性重组菌株的单菌落接种于含100μg/ml氨苄青霉素的YPDS液体培养基中，28℃，200rpm培养过夜。取此菌液按4％体积比接种于5ml SC-U诱导培养基中，28℃，200rpm培养24h左右。菌液直接转接于250ml SC-U液体诱导培养基中，28℃震荡培养。为了维持诱导表达，每隔24h补加10％半乳糖溶液至终浓度达1％。120h后，4℃12000rpm，离心10min，收集上清液，进行抑菌活性测定。
实施例2本发明新型杂合肽SS-33的最低溶血浓度测定(MHC)
将发酵上清液用纯R1640培养基在EP管内进行倍比稀释，向圆底96孔板每孔加入用10％R1640培养基稀释的100μL 2％红细胞悬液，每孔再加上100μL抗菌肽，使得抗菌肽的终浓度分别为500、250、125、50、25、12.5、5、2.5、1.25、0.5μg/ml。设置阳性对照孔为：加入100μL红细胞悬液和100μL 10％的TritonX-100。设置空白对照：加入100μL红细胞悬液和和100μL10％R1640培养基。每个浓度做8个复孔。将96孔板置于37℃5％CO2培养箱中培养18-24h。
培养结束后，将96孔板进行离心，小心吸取上清液至另一新的平底96孔板中，用酶标仪测定各孔在414nm、546nm下的OD值，软件分析得到OD414nm、OD556nm和Delta OD值，根据以下公式可得出抗菌肽对猪红细胞的溶血率：
其中W:猪红细胞溶血率，C:试验孔Delta OD值，K:空白对照孔Delta OD值，Y:阳性对照孔Delta OD值
结果表明：不同浓度下杂合肽SS-33的最低溶血浓度测定结果如图1所示，0-500μg/ml之内的新型杂合肽SS-33对猪源红细胞的溶血率均在15％以下。
实施例3新型杂合肽SS-33对BHK细胞的毒性
将稀释后的BHK细胞悬浮液按100μL每孔均匀铺到平底96孔板中，将96孔板放在37℃5％CO2培养箱中4-6h，显微镜下观察细胞生长状态，细胞完全贴壁后弃去培养液。分别用10％DMEM纯培养基进行倍比稀释发酵上清液，抗菌肽终浓度为：500、250、125、50、25、12.5、5、2.5、1.25、0.5μg/ml。用1×PBS溶液作为阳性对照，用10％DMEM培养基做空白对照，每个浓度做8个复孔，放置于37℃，含有5％CO2培养箱中48h。
向每孔加入10μLCCK-8溶液(注意尽量不要产生气泡，以免影响OD值的读数)。放入37℃，含有5％CO2培养箱中孵育2h，用酶标仪检测在450nm处的吸光值，根据以下公式可得出细胞存活率：
其中S:细胞存活率，C:试验孔OD值，K:空白对照孔OD值，N:阳性对照孔OD值。
新型杂合肽SS-33对BHK细胞的毒性结果如图2所示，可以看出在0-125μg/ml之内的新型杂合肽SS-33对BHK细胞是无毒性的。
实施例4新型杂合肽SS-33的最小抑菌浓度测定
1、实验菌株：大肠杆菌O157:H7、金黄色葡萄球菌29213、单增李斯特菌EGD、单增李斯特菌10403s、志贺氏菌shig、沙门氏菌SM001、鼠伤寒沙门氏菌、沙门氏菌14025、猪链球菌SS2、大肠杆菌DH5ɑ，上述菌株均来自于本实验室保藏菌株，其菌株为常规菌种。
2、菌株处理：将菌种复苏，在固体MH培养基上划线，在培养箱中37℃培养过夜。挑取单菌落于4ml的液体MHB培养基中，37℃200rpm培养过夜。将菌液置于OD600的条件下测其吸光度值，用MHB液体培养基将菌液稀释为2-7×105CFU/ml。
3、杂合肽SS-33定量后用液体培养基MHB进行稀释，将稀释后的杂合肽SS-33和稀释后的菌液以1:1的比例混匀后加入96孔板中，每个浓度8个复孔，每孔终体积为200μL，杂合肽SS-33终浓度为：500、250、125、50、25、12.5、5、2.5、1.25、0.5μg/ml，用MHB纯培养基溶液作为空白对照，用氨苄青霉素、卡那霉素溶液作为阳性对照，37℃静置培养过夜，观察无菌96孔板中每个浓度菌液的浑浊度，后将每孔液体涂至MH固体培养板上过夜培养，观察有无菌落生长加以验证。
4、用微量稀释法测定重组新型杂合肽SS-33对十种食源性微生物的最低抑菌浓度，同时设定常规的Cecropin P1标准品作为阳性对照，结果表明本发明所述的杂合肽对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有显著的抑菌效果，其与常规的Cecropin P1标准品相比MIC显著降低。
表1本发明杂合肽不同浓度条件下对致病菌株的MIC值测定结果
实施例5新型杂合肽SS-33对鲜猪肉保鲜的应用
1、将新鲜(宰杀24h之内)猪腿肉进行去皮、去脂肪处理。用无菌水去除表面血水后，用无菌手术刀和无菌剪刀将猪腿肉进行切块处理，每块约5g左右。
2、用生理盐水将定量后的杂合肽SS-33进行稀释，终浓度为：250μg/ml、125μg/ml、50μg/ml。将切块后的猪腿肉在不同浓度的杂合肽溶液中浸泡15s，沥干3-5min。设置空白对照组(不进行处理)和阴性对照组(用生理盐水处理)。将猪肉放置于无菌托盘后用食品级保鲜膜封住，置于4℃冰箱，避光保存。分别在第0、3、6、9、12、15、18、21天取样，进行PH值、活菌计数(Total Viable Counts，TVC)、总挥发性碱性氮(Total Volatile Basic Nitrogen，TVB-N)的测定，并在第9天时对猪肉进行感官评价。
3、根据国家标准可知：新鲜肉、次鲜肉及变质肉的如下参数存在区别，具体为：
活菌计数：新鲜肉≤104CFU/g、次鲜肉104-106CFU/g、变质肉>106CFU/g
PH值：新鲜肉5.8-6.2、次鲜肉6.3-6.6、变质肉>6.7
总挥发性盐基氮：新鲜肉≤15mg/100g、次鲜肉≤20mg/100g、变质肉>20mg/100g
添加不同浓度的杂合肽的溶液浸泡下的新鲜猪肉的pH随时间的变化图如图3所示；添加不同浓度的杂合肽的溶液浸泡下的新鲜猪肉的总挥发性盐基氮随时间的变化图如图4所示；添加不同浓度的杂合肽的溶液浸泡下的新鲜猪肉的活菌计数随时间的变化图如图5所示；添加不同浓度的杂合肽的溶液浸泡下的新鲜猪肉的感官得分随时间的变化图如图6所示；新鲜猪肉的感官评分标准如图7所示。
根据上述数据可知：250μg/ml的杂合肽SS-33使用浸泡法使猪腿肉的货架期延长1-4天；125μg/ml的杂合肽SS-33使用浸泡法使猪腿肉的货架期延长1-3天。
实施例6新型杂合肽SS-33对鲜牛奶保鲜的应用
将从市场买来的新鲜牛奶进行分装，每瓶50ml。按照0.15g/kg、0.2g/kg、0.25g/kg将杂合肽SS-33加入鲜牛奶中，设置空白对照组(不进行处理)，煮沸后装入无菌瓶子内，密封后置于4℃冰箱，避光保存。分别在第0、1、4、7、10、13、15天取样，进行PH值、活菌计数的测定，并在第4天时对猪肉进行感官评价。
不同浓度的杂合肽对鲜牛奶保鲜效果如表2所示，添加不同浓度的杂合肽下的鲜牛奶的pH随时间的变化图如图8所示。结果表明，未添加杂合肽组的pH值下降速度均快于添加杂合肽SS-33组，且随着杂合肽添加量的增加，pH值稳定性越好；未添加杂合肽组的活菌计数均高于于添加杂合肽SS-33组，且随着杂合肽添加量的增加，检出的活菌数量减少。
表2不同浓度的杂合肽对鲜牛奶保鲜效果
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院上海兽医研究所
<120> 一种用于食品保鲜的杂合肽及其在毕赤酵母表达系统的基因表达方法
<130>
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Ser Trp Leu Ser Lys Thr Ala Lys Lys Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Arg Phe Lys Arg Phe Arg Lys Lys Phe Lys Lys Leu Phe Lys Lys Leu
20 25 30
Ser
<210> 2
<211> 113
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ctcgagtctt ggttatctaa aactgctaaa aaattaggtg gtggtggttc tggtagattt 60
aaaagattta gaaaaaaatt taaaaaatta tttaaaaaat tatcttagaa ttc 113
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ccgctcgagt cttggttatc taaaac 26
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gaattctaag ataatttttt aaat 24
Claims (8)
1.一种用于食品保鲜的杂合肽，该杂合肽包含33个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ.No.1所示，编码该杂合肽的核苷酸序列如SEQ：No.2所示。
2.一种权利要求1所述杂合肽在酿酒酵母表达系统的基因表达方法，其具体包括如下步骤：
1)人工合成编码杂合肽的基因序列，将基因进行PCR扩增后使用连接酶将其连入重组酵母表达载体pYES2-ɑ中，构建表达重组质粒pYES2-ɑ-SS-33；
2)将构建的表达重组质粒pYES2-ɑ-SS-33电转化宿主酿酒酵母INVSc1，使用氨苄青霉素的YPDS选择平板筛选得到能表达杂合肽的重组基因工程酵母菌；
3)将筛选得到的重组基因工程酵母菌进行高密度发酵得到含有杂合肽的发酵液，冷冻离心即可得到含有杂合肽的上清液。
3.根据权利要求2所述的杂合肽在酿酒酵母表达系统的基因表达方法，其特征在于，所述步骤1)包括如下步骤：使用限制性内切酶Xho I和EcoR I将表达载体pYES2-ɑ进行酶切，通过T4连接酶将目的基因与酶切后的pYES2-ɑ进行连接得到重组载体pYES2-ɑ-SS-33，PCR鉴定后进行胶回收，即可得到纯化后的重组载体pYES2-ɑ-SS-33。
4.根据权利要求2所述的杂合肽在酿酒酵母表达系统的基因表达方法，其特征在于，所述步骤2)包括如下步骤：制备酿酒酵母感受态细胞悬液，使用电转化的方法将重组载体pYES2-ɑ-SS-33加入酿酒酵母感受态细胞悬液中，使用氨苄青霉素的YPDS选择平板筛选阳性转化子。
5.根据权利要求2所述的杂合肽在酿酒酵母表达系统的基因表达方法，其特征在于，所述步骤3)具体包括如下步骤：将筛选到的重组基因工程酵母菌接种于5ml SC-U诱导培养基中，28℃，200rpm培养24h后将菌液直接转接于250ml SC-U液体诱导培养基中，28℃震荡培养，每隔24h补加10％半乳糖溶液至终浓度达1％；培养120h后，在4℃12000rpm的离心条件下离心10min，收集上清液即可得到含有杂合肽的上清液。
6.权利要求1所述的杂合肽在食品保鲜中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的杂合肽通过浸泡法用于新鲜猪肉保鲜。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的杂合肽用于鲜牛奶保鲜。
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