CN113666996B - 一种中国鲎抗菌肽及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种中国鲎抗菌肽（Tatritin）及其制备方法和应用，抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID：4所示，通过实验证实了该抗菌肽对无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌和嗜水气单胞菌均具有抑菌活性，且对耐药菌株如产超广谱β‑内酰胺大肠杆菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和致病真菌白色念珠菌也有明显的抑菌作用，因此该抗菌肽可用于制备抗菌药物。

Description

一种中国鲎抗菌肽及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种中国鲎抗菌肽，同时还涉及中国鲎抗菌肽的制备方法及其用途。
背景技术
中国鲎(Tachypleus tridentatus)是一种古老的海洋无脊椎动物，最早出现在4.5亿年前的寒武纪，几亿年来其形态基本没有发生变化，被称为“生物活化石”。迄今为止，人类从鲎的血液中分离出50余种生物活性成分，分别具有抗菌、抗病毒和抑制肿瘤的活性。在这些活性物质中，抗菌肽(鲎素)主要发挥抗病原微生物的作用，它的发现被认为是天然抗生素研究的一个里程碑。
自1928年青霉素问世以来，人类逐渐进入控制和治疗细菌感染性疾病的时代。然而大量抗生素的使用加速了致病菌的进化，使得大量耐药细菌及多重耐药细菌不断出现，细菌对传统抗生素的耐药性已成为全球关注的重大公共卫生问题，而曾在维持人类生命健康方面发挥巨大作用的抗生素也饱受争议。因此，开发替代抗生素的新型抗菌药物显得愈发重要。抗菌肽不仅对细菌和真菌有广谱杀灭作用，而且还具有很好的抗病毒和抗肿瘤作用。另外，与传统抗生素相比，抗菌肽的作用机制独特，能够迅速杀菌且不易引发细菌的耐药性，可单独或与抗生素联合使用杀伤病原体，因此抗菌肽成为一类发展潜力巨大的新型抗菌类药物，在新型抗菌药物开发领域具有巨大的优势。
相比陆生动物，海洋动物的抗菌肽种类更丰富，也更具有独特性，是抗菌肽生物资源的巨大宝库。已有报道证实，海洋生物中的某些抗菌肽比高等脊椎动物具有更强的杀菌活性，因此，对海洋生物抗菌肽的基础研究与开发利用具有重要的科学意义和潜在应用价值。
抗菌肽是一类生物来源的具有广谱抗菌活性的天然小分子多肽，通常被认为分子量小于10kDa，带有正电荷。根据结构和功能的不同，可分为杀菌肽(天蚕素)、防御素、富含脯氨酸的抗菌肽(蛙皮素)、富含甘氨酸的抗菌肽(蜂毒素)。其中防御素因其广泛表达于机体各组织和粘膜上皮，是宿主抵抗外界病原微生物入侵的第一道防线，被认为是最重要的一类抗菌肽。然而，天然抗菌肽来源有限，化学合成也存在成本高、批量生产困难的问题。另外抗菌肽的抗菌活性与多肽分子的空间结构密切相关，体外合成的抗菌肽与天然多肽尽管一级结构相同，但空间结构却存在一定差异，导致其活性受到较大的影响。巴斯德毕赤酵母(Pichia pasoris)由于兼有原核细胞良好的可操作性和真核系统的翻译后加工、修饰的特点，且发酵条件简单，表达水平高，适合高密度培养，为工业化生产和纯化回收提供极大的方便。因此，采用基因工程方法制备抗菌肽具有较大优势。
发明内容
本发明从中国鲎中克隆得到一种新的抗菌肽基因(命名为Tatritin)，并通过体外化学合成和酵母表达系统高效表达制备重组蛋白的方法制备目标抗菌肽，该抗菌肽可应用于制备抗菌药物。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明所述抗菌肽基因的获得：利用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)的方法，以中国鲎总RNA为模板，将其反转录成cDNA，然后通过RT-PCR获得中国鲎抗菌肽基因，其cDNA序列如SEQ ID NO：1所示，开放阅读框(ORF)如SEQ ID NO：2所示。
本发明所述中国鲎抗菌肽成熟区氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，其制备方法为：
i.多肽体外化学合成；
ii.重组蛋白制备：在优选实施例中，以毕赤酵母表达载体pGAPZαA为基础，根据酵母细胞密码子偏好性优化Tatritin基因序列，并在目的基因前引入6×His标签便于纯化，插入表达载体的序列如SEQ ID NO：5所示，通过酵母表达系统高效表达制备重组蛋白，利用His标签分离纯化重组蛋白6His-Tatritin。
本发明获得的中国鲎抗菌肽具有抗菌作用：分别采用抑菌曲线法和牛津杯法对化学合成的中国鲎抗菌肽和重组酵母菌表达上清液进行抑菌活性测定，实验证明中国鲎抗菌肽对革兰氏阳性菌如金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和革兰氏阴性菌如大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌和嗜水气单胞菌以及致病真菌如白色念珠菌等均具有良好的抑菌活性。因此，本发明的中国鲎抗菌肽可用于制备抗病菌类产品，包括医药产品如抗菌药物，饲料添加剂，兽药，防腐剂等。
本发明的优点和有益效果：本发明公开的中国鲎抗菌肽对金黄色葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌和嗜水气单胞菌等均具有良好的抑菌活性，甚至对耐抗生素病原菌如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和产超广谱β－内酰胺酶大肠杆菌以及顽固致病真菌如白色念珠菌也具有良好的抑菌活性。因此，该抗菌肽可为抗感染及抵抗耐药或顽固型病原菌提供一类疗效显著的新药。而且，本发明在化学合成法之外还提供了酵母重组表达制备抗菌肽的方法，能够减少制备费用，缩短生产时间，提高利用效率，有利于工业化生产。
附图说明
图1为本发明所述中国鲎抗菌肽基因RT-PCR扩增产物。1：目的基因；M：2kb DNA分子量标准。
图2是体外化学合成中国鲎抗菌肽对部分革兰氏阴性和革兰氏阳性菌抑菌活性测定。
图3是体外化学合成中国鲎抗菌肽对部分抗生素耐药菌抑菌活性测定。
图4是体外化学合成中国鲎抗菌肽对致病真菌白色念珠菌抑菌活性测定。
图5为重组中国鲎抗菌肽真核表达载体构建示意图。
图6为重组中国鲎抗菌肽PAGE凝胶电泳测定。粗提物为发酵液上清冷冻干燥浓缩而来，流穿液为亲和层析柱上样时流穿的液体，洗脱液为亲和层析纯化最后洗脱下的样品。
图7为重组中国鲎抗菌肽对大肠杆菌抑菌活性测定。A：无菌水；B：150μg/mL卡那霉素；C：0.033mg/mL 6His-Tatritin。
图8为重组中国鲎抗菌肽对嗜水气单胞菌抑菌活性测定。A：无菌水；B：100μg/mL氨苄青霉素；C：0.033mg/mL 6His-Tatritin。
图9为重组中国鲎抗菌肽对肺炎克雷伯菌抑菌活性测定。
具体实施方式
实施例1：中国鲎RNA的提取及cDNA的合成
1.中国鲎总RNA的提取
实验用的塑料研磨棒经0.1％DEPC水浸泡过夜，121℃30min高温高压灭菌。实验中所用各种型号EP管均为biosorfa无酶管。各试剂用无RNase的0.01％DEPC水配置。无菌注射器于中国鲎头胸甲和腹甲连接处抽取100μL血液，加入含有1mL预冷Trizol溶液的EP管中。总RNA的提取按Trizol说明书进行。提取的RNA通过1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，可见清晰的条带(图1)。总RNA样品冻存于-80℃，备用。
2.cDNA(反转录产物)第一条链的合成
以提取的中国鲎总RNA为模板进行反转录，反应体系为25μL，即：
Total RNA 1μg
Oligo(dT)20(10μmol/L) 5μL
RNase-free water up to 15μL
70℃5min，立即冰浴冷却，之后分别加入：
混匀，反转录反应条件为：42℃60min，70℃10min，最后4℃结束反应，-20℃保存备用。
实施例2：中国鲎抗菌肽基因的克隆及序列分析
1.引物设计
根据中国鲎转录组(NCBI/SRA SRP267502)数据组装的转录本预测抗菌肽候选基因并设计扩增引物，序列为F：CCAGTGACTTAGCGGTACG，R：AGCCTCAAGAAGTATGTGATGA。
2.PCR扩增
以反转录产物(cDNA)为模板进行PCR扩增，反应体系为10μL，即：EsTaq酶0.3μL、10×buffer 1μL、上下游引物F/R(100mmol/L)各0.5μL、cDNA 0.5μL、灭菌无离子水7.2μL，总体积为10μL，混匀。PCR扩增反应条件为：94℃预变性3min；然后进行35个循环反应，循环条件为94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s；72℃延伸7min后4℃保存。
3.PCR产物鉴定
取PCR产物2μL与6×核酸上样缓冲液混匀点样，1.0％琼脂糖凝胶，150V电泳15min观察结果，PCR产物大小约439bp(见图1)。将目的片段用PCR产物液体纯化试剂盒进行纯化回收。
4.目的基因的克隆、筛选与测序
取pGEM-T easy(50ng/μL)0.5μL与胶回收的目的片段1.5μL混合后，加入2.5μLbuffer和0.5μL DNA连接酶(Promega)，混匀后24℃连接1h。取5μL连接产物，无菌条件下加入大肠杆菌TOP10感受态细胞中，用移液器温和反复吹打混匀，冰浴放置30min。42℃热激90s，随后迅速冰浴5min，加入200μL的LB培养液，180r/min 37℃振荡40min。向含有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB固体培养皿中加入40μL X-gal(20mg/mL)和4μL IPTG(200mg/mL)涂布均匀，然后取150μL菌液涂布于培养皿上。倒置培养皿于37℃恒温培养箱过夜培养，挑白色单菌落接种于含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养液中，200r/min，37℃培养12h。挑选PCR扩增为阳性的克隆，送至武汉天一辉远生物技术公司测序鉴定，获得如序列表SEQ ID NO：1所示的序列，长度439bp，开放阅读框(ORF)207bp(189-395位)，起始密码子ATG(189位)，终止密码子TGA(393位)，上游引物5’端序列1-19位，下游引物3’端序列互补链位置439-418位。
5.序列分析
上述步骤4所得中国鲎抗菌肽ORF序列如SEQ ID NO：2所示，全长207bp，编码氨基酸序列如SEQ ID：3所示(第1-21位氨基酸为预测信号肽区)，抗菌肽成熟区氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。该蛋白质含有68个氨基酸，分子量为7.89KDa，含有13个正电荷氨基酸残基，2个负电荷氨基酸残基，预测等电点9.85。
实施例3：重组真核表达载体的构建及在毕赤酵母中的诱导表达
1.密码子优化和基因合成
以毕赤酵母表达载体pGAPZαA为基础，根据酵母细胞密码子偏好性优化Tatritin基因序列并合成，在序列两端引入Xho I和Eco RI位点，为方便纯化在目的基因前引入6×His标签。插入表达载体的序列如SEQ ID NO：5所示，序列委托北京擎科生物科技有限公司合成，重组中国鲎抗菌肽真核表达载体构建如图5所示。
在合成之前，对Tatritin按照毕赤酵母密码子偏好性，通过密码子使用分析工具(http://gcua.schoedl.de/)及参照Invitrogen公司所推荐的毕赤酵母偏爱性密码子进行综合考虑，在不改变该Tatritin氨基酸序列的前提下，采用毕赤酵母偏好性密码子替代稀有密码子，对原始Tatritin(Orig)进行密码子优化。
2.质粒扩增
将测序正确的菌液扩大培养，并将摇好后的菌液利用高纯度质粒小提中量试剂盒提取质粒。质粒提取步骤如下：
1)取20mL菌液加入离心管中，12000r/min离心1min，尽量吸除上清；
2)向菌体沉淀中加入500μL溶液P1，使用漩涡振荡器彻底悬浮沉淀；
3)加入500μL溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解；
4)加入700μL溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀；
5)向吸附柱CP4中加入500μL平衡液BL，12000r/min离心1min，弃废液；
6)12000r/min离心10min，将上清加入过滤柱Cs中，12000r/min离心2min；
7)将上清液加入到吸附柱CP4中，12000r/min离心1min，弃废液；
8)向吸附柱CP4中加500μL去蛋白液PD，12000r/min离心1min，弃废液；
9)连续2次，向吸附柱CP4中加600μL漂洗液PW，12000r/min离心1min，弃废液；
10)12000r/min再次离心2min，弃废液；将吸附柱CP4开盖放置3-5min；
11)将吸附柱置于干净的离心管中，向吸附膜中加50μL去离子水；
12)室温放置2min，12000r/min离心1min，将质粒收集到离心管中；
13)分别用1％琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测质粒的纯度与浓度。
3.pGAPZαA的双酶切、连接
(1)提取的pGAPZαA质粒分别用Eco RI和Xba I限制性内切酶进行双酶切，酶切体系和程序如下：
将各组分轻轻地充分混匀，离心几秒后，在37℃下孵育12h。
(2)将酶切后pGAPZαA和6His-Tatritin基因片段进行连接，反应体系如下：
轻柔混匀，瞬时离心后，在23℃下连接30min。
(3)将连接产物转化至DH5α感受态细胞中，用涂布器涂布于含Zeocin+的低盐LB培养皿上。过夜培养后挑取单菌落经过菌液PCR鉴定后，将含阳性克隆的菌液送公司测序，将测序正确的菌液加入甘油置于-80℃冰箱保存备用。并将构建好的载体分别命名pGAPZαA-6His-Tatritin和空载pGAPZαA。
4.质粒线性化
用限制性内切酶Avr II将重组质粒pGAPZαA-6His-Tatritin酶切，反应体系如下：
酶切条件：37℃水浴30min。
5.酶切产物的回收
(1)向上述酶切产物中加入5倍体积的Buffer P，不弃枪头，直接用移液器吸打几次混匀，并将混合液转移到核酸纯化柱中，盖上管盖。
(2)12000r/min离心30s，弃2mL离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2mL离心管中。
(3)在核酸纯化柱中加入700μLBuffer WB，盖上管盖，12000r/min离心30s，弃去滤液，将核酸纯化柱放回2mL离心管中。
(4)14000r/min离心1min，弃2mL离心管。
(5)将核酸纯化柱置于一个干净的1.5mL离心管中，在纯化柱的膜中央加入30-50μL TE，室温静置1min。
(6)弃纯化柱，洗脱的DNA用于后续实验。
6.毕赤酵母X33感受态细胞的制备
(1)将5μL用甘油保存的X33菌种接种到YPD液体培养基中，使该菌株活化。在30℃，200r/min的条件下振荡培养16-18h。
(2)将上述活化的菌液在平板上划线，获得单克隆菌落。用无菌牙签挑单菌落并接种到YPD液体培养基中。
(3)取50μL种子液接到50mL YPD液体培养基中。在30℃，180r/min的条件下过夜培养，当OD600达到0.8-1.0时，取出菌液开始制备感受态细胞。
(4)将50mL菌液，4℃、4000r/min离心10min。
(5)用50mL预冷的无菌水将菌体沉淀重新悬起，并离心(4℃，4000r/min，10min)，并重复一次。
(6)加入50mL预冷的1mol/L山梨醇溶液重新悬浮菌体沉淀，并4℃，4000r/min离心10min。
(7)加入20m L预冷的1mol/L山梨糖醇溶液重新悬浮菌体沉淀，4℃，4000r/min离心10min。
(8)用无菌EP管分装酵母感受态细胞，每管150μL，置于冰上备用。
7.电转化
(1)取线性化的重组质粒pGAPZαA-6His-Tatritin和150μL感受态细胞充分混匀后，转移至0.2cm预冷的电转杯中，小心敲打管壁使悬浮液落于电击杯的最底端，然后冰浴5min。
(2)将电转杯外壁上的水气轻轻擦拭干净，打开电转仪预热，设置电转参数，然后置于仪器中进行电击转化。
(3)电转完成后，在电转杯中加入1mL预冷的1mol/L山梨醇溶液，混匀后，吸取到无菌EP管中，30℃温育2h。
(4)吸取上述菌液均匀涂布于含100μg/mL Zeocin的YPD平板，每个平板涂200μL，在30℃培养箱中倒置培养2-3d。选取大菌落接种于YPD液体培养基中，30℃，200r/min培养2h。
(5)取上述菌液，涂布于含100μg/mL Zeocin的YPDS平板。
8.高拷贝子筛选
取1mL毕赤酵母的菌液，12000r/min，5min离心去上清，向毕赤酵母菌体沉淀中加入100μL 50mmol/L NaOH，置于95℃水浴锅中处理20min后，使用10μL 50mmol/L pH8.2Tris-HCl平衡前面加入NaOH带来的pH偏离，12000r/min，5min离心取上清，并测定DNA浓度，用ddH2O调整DNA浓度一致后作为PCR模板，引物为：F：GTCCCTATTTCAATCAATTGAA，R：GCAAATGGCATTCTGACATCC。PCR反应体系如下：
扩增反应步骤：
通过琼脂糖凝胶电泳，比对条带灰度，选取相对较亮的菌株作为高拷贝菌株用于后续实验。
9.重组蛋白的发酵
将选取的菌株以1.0％的接种量接种于含有50mL YPD的250mL锥形瓶中，在30℃，200r/min下培养96h后，12000r/min，离心5min。将上清与菌体沉淀分离，上清经过冷冻干燥后用Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳分析，结果如图6所示。
实施例4：中国鲎抗菌肽化学合成多肽和重组蛋白(或多肽)的抑菌活性鉴定
1.化学合成抗菌肽的抑菌活性鉴定
委托上海昕浩生物科技有限公司化学合成中国鲎抗菌肽的成熟区(不含信号肽)，N端乙酰化，C端酰胺化。将多肽溶解于灭菌双蒸水，浓度为160μmol/L(0.906mg/mL)的原液2倍梯度稀释，工作液浓度分别为1.25、2.5、5、10、20、40和80μmol/L。待测菌株(包括大肠杆菌、嗜水气单胞菌、肺炎克雷伯氏菌、无乳链球菌和金黄色葡萄球菌等)接种至LB液体培养基，37℃摇振至OD600＝0.6，于新鲜的LB中稀释至2×106CFU/mL，将稀释后的菌液向96孔酶标板的每孔中加入20μL，加入80μL多肽工作液，混匀后测量初始OD值，37℃温箱孵育18h后测量OD值。对照添加等量的双蒸水。18h的OD值减去初始OD值即为各个孔的增长值，多肽处理组的增长值比对照组的增长值，即可获得不同工作浓度的生长抑制比。另外，将待测的白色念珠菌接种于沙保氏液体培养基摇至OD600＝0.6，使用培养基稀释100倍后取20μL菌液与合成多肽(溶于20mmol/L Tris-HCl，工作浓度为0、1、2、4、8、16μmol/L)混合均匀，37℃孵育1h后涂布于含有0.1％氯霉素的沙保氏固体培养基过夜培养。
抑菌活性分析如图2～4所示。中国鲎抗菌肽化学合成多肽对革兰氏阴性菌如嗜水气单胞菌、肺炎克雷伯氏菌和革兰氏阳性菌如无乳链球菌、金黄色葡萄球菌有良好的抑菌效果(图2)，在抗菌肽4～16μmol/L的工作浓度下有效抑制率达到50％以上。同时，合成抗菌肽对部分耐抗生素细菌如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和产超广谱β-内酰胺大肠杆菌也有良好的抑菌活性(图3)，且抑菌效果与普通细菌作用效果基本一致。另外，合成抗菌肽与白色念珠菌的作用结果显示，合成多肽能在4～8μmol/L工作浓度下完全抑制白色念珠菌生长(图4)。
2.重组抗菌肽抑菌活性鉴定
将实施例3制备的工程菌200r/min 30℃震荡培养72h后，离心取上清，冷冻干燥12h后收集浓缩的液态样品，10000r/min离心收集上清，0.45μm滤膜过滤上清，并用镍柱对样品中的6His-Tatritin蛋白进行纯化。
采用牛津杯法对重组酵母菌表达上清液进行抑菌活性测定：测定菌种有产超广谱贝β内酰胺大肠杆菌(ATCC35218)、嗜水气单胞菌、肺炎克雷伯菌(CMCC(B)46117)3种菌。牛津杯琼脂扩散法操作过程如下：配制琼脂培养基，高压湿热灭菌，待其降温至50℃左右(琼脂未凝固)时，混入测试菌，混匀。将混有测试菌的培养基倒入加有已凝固的琼脂支撑培养基的皿中，至形成能够覆盖培养皿的薄层，每皿约25mL。将灭菌的牛津杯垂直放置于培养基表面，轻轻按压，使牛津杯与培养皿底部无空隙接触，在超净工作台中冷却，凝固后用镊子小心将牛津杯取出。在牛津杯中加入200μL的0.03mg/mL的重组6His-Tatritin抗菌肽，并设置无菌蒸馏水作为阴性对照，使用100mg/mL氨苄青霉素和50mg/mL卡那霉素作为阳性对照。培养皿于37℃培养过夜，结果显示6His-Tatritin抗菌肽对大肠杆菌(氨苄耐药型)(见图7)和阴性菌嗜水气单胞菌(见图8)、肺炎克雷伯菌(见图9)具有良好的抑菌活性。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 一种中国鲎抗菌肽及其制备方法和应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 439
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccagtgactt agcggtacgt ctgcggactt acgacactag aaaccgggtt ttgatacccg 60
tggtgggcag agcacaagtt tcccattgtg taactacgtg cttatttaca aacaaacaac 120
ggttgccgct tatcttgtta actattactg gagttaaaca cgaacgtttc ttttgaacgt 180
aagtgaggat gtgtcacaaa gcgatgctta cgctggttgt tttgatagct ttatgtggca 240
ttatgaaaac ttcgctatta gatcataaaa ttaccgaacg gtctctgaga tgtgctggat 300
atggcggaag gtgtaaccct tggagatatc ccaggtgttg ctggccgttg aagtgcaccc 360
gtttaaggtg ttaccgtggc ttcagaaacg gatgatgttt atattgtgtg cgccgtatca 420
tcacatactt cttgaggct 439
<210> 2
<211> 207
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgtgtcaca aagcgatgct tacgctggtt gttttgatag ctttatgtgg cattatgaaa 60
acttcgctat tagatcataa aattaccgaa cggtctctga gatgtgctgg atatggcgga 120
aggtgtaacc cttggagata tcccaggtgt tgctggccgt tgaagtgcac ccgtttaagg 180
tgttaccgtg gcttcagaaa cggatga 207
<210> 3
<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Cys His Lys Ala Met Leu Thr Leu Val Val Leu Ile Ala Leu Cys
1 5 10 15
Gly Ile Met Lys Thr Ser Leu Leu Asp His Lys Ile Thr Glu Arg Ser
20 25 30
Leu Arg Cys Ala Gly Tyr Gly Gly Arg Cys Asn Pro Trp Arg Tyr Pro
35 40 45
Arg Cys Cys Trp Pro Leu Lys Cys Thr Arg Leu Arg Cys Tyr Arg Gly
50 55 60
Phe Arg Asn Gly
65
<210> 4
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Ser Leu Leu Asp His Lys Ile Thr Glu Arg Ser Leu Arg Cys Ala Gly
1 5 10 15
Tyr Gly Gly Arg Cys Asn Pro Trp Arg Tyr Pro Arg Cys Cys Trp Pro
20 25 30
Leu Lys Cys Thr Arg Leu Arg Cys Tyr Arg Gly Phe Arg Asn Gly
35 40 45
<210> 5
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaattccatc atcaccacca ccactctttg ttggatcata agatcactga aagatctttg 60
agatgtgctg gttacggtgg tagatgtaat ccttggagat accctagatg ttgttggcct 120
ttgaagtgta ctagattgag atgttataga ggatttagaa acggatag 168

Claims (6)

1.一种中国鲎抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
2.权利要求1所述中国鲎抗菌肽的编码基因，其特征在于，所述编码基因如SEQ ID NO:2所示。
3.含有权利要求2所述中国鲎抗菌肽的编码基因的表达载体。
4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，以毕赤酵母表达载体pGAPZαA为基础，插入的表达序列如SEQ ID NO.5所示。
5.中国鲎抗菌肽在制备抗菌药物中的应用，其特征在于，所述菌为金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、嗜水气单胞菌以及白色念珠菌，所述中国鲎抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
6.一种具有抗菌作用的饲料添加剂，其特征在于，包括中国鲎抗菌肽，所述菌为金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、嗜水气单胞菌以及白色念珠菌，所述中国鲎抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
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