CN114671934B - 桃蛀螟抗菌肽、基因及其产品与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种桃蛀螟抗菌肽、基因及其产品与应用，涉及生物技术领域。本发明提供的桃蛀螟抗菌肽，长度短、分子量小、化学合成难度低，经发明人研究发现，当桃蛀螟抗菌肽浓度为100μg/ml时，即可对包括绿僵菌在内的病原菌实现良好的抑菌作用，且安全性高，该抗菌肽在生产上具有较低的成本和较高的经济价值，应用前景良好。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种桃蛀螟抗菌肽、基因及其产品与应用。
背景技术
僵病是蚕茧生产过程中较为常见且危害较大的病害，严重影响家蚕生长发育，由此造成严重的经济损失，其中常见的病原菌有白僵菌、绿僵菌、米曲霉和黄曲霉等，而白僵菌与绿僵菌则是首要的致病菌。
目前防治真菌细菌方法主要依靠化学药物以及抗生素等，虽在生产实践中取得一定效果，但长期施用易造成环境污染，致病菌易产生抗性，严重影响了人类健康以及生态安全，因此亟需开发出一种新型的高效低毒、安全性高的农药。昆虫抗菌肽具有无免疫原性、热稳定性强、抗菌谱广特点，具有替代传统杀菌药物潜力。
目前，还未见桃蛀螟抗菌肽在抗绿僵菌方面的报道。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种桃蛀螟抗菌肽，以解决上述问题中的至少一种。
本发明的第二目的在于提供上述桃蛀螟抗菌肽在制备抗真菌产品中的应用。
本发明的第三目的在于提供上述桃蛀螟抗菌肽在制备僵病防治产品中的应用。
本发明的第四目的在于提供一种药物。
本发明的第五目的在于提供一种编码上述桃蛀螟抗菌肽的基因。
本发明的第六目的在于提供一种桃蛀螟抗菌肽前体。
第一方面，本发明提供了一种桃蛀螟抗菌肽，所述桃蛀螟抗菌肽具有如SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列。
第二方面，本发明提供了一种桃蛀螟抗菌肽在制备抗真菌产品中的应用。
作为进一步技术方案，所述真菌包括绿僵菌。
第三方面，本发明提供了一种桃蛀螟抗菌肽在制备僵病防治产品中的应用。
作为进一步技术方案，所述僵病的致病菌包括绿僵菌。
第四方面，本发明提供了一种药物，包括上述桃蛀螟抗菌肽。
第五方面，本发明提供了一种基因，所述基因编码上述桃蛀螟抗菌肽。
作为进一步技术方案，所述基因具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
作为进一步技术方案，所述基因具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
第六方面，本发明提供了一种桃蛀螟抗菌肽前体，所述桃蛀螟抗菌肽前体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的桃蛀螟抗菌肽，长度短、分子量小、化学合成难度低，经发明人研究发现，当桃蛀螟抗菌肽浓度为100μg/ml时，即可对包括绿僵菌在内的病原菌实现良好的抑菌作用，且安全性高，该抗菌肽在生产上具有较低的成本和较高的经济价值，应用前景良好。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1中抗菌肽Alo-2.1序列与已知的桃蛀螟Alo-2序列blast比对结果图；
图2为本发明实施例1中抗菌肽Alo-2.1序列与NCBI中已知的Alo-2序列多序列比对结果图；
图3为本发明实施例1中抗菌肽Alo-2.1序列信号肽预测结果图；
图4为本发明实施例1中抗菌肽Alo-2.1序列二级结构图；
图5为本发明实施例1中抗菌肽Alo-2.1序列3D结构图；
图6为本发明实施例1中抗菌肽Alo-2.1序列质谱结果图；
图7为本发明实施例2中平板a抗菌肽Alo-2.1序列抑菌效果图；
图8为本发明实施例2中平板b抗菌肽Alo-2.1序列抑菌效果图；
图9为本发明实施例2中平板c抗菌肽Alo-2.1序列抑菌效果图；
图10为本发明实施例2中平板d抗菌肽Alo-2.1序列抑菌效果图。
具体实施方式
下面将结合实施方式和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
第一方面，本发明提供了一种桃蛀螟抗菌肽，所述桃蛀螟抗菌肽具有如SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列。
SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列如下：
CIKNRDGCQPDGSQGNCCSGYCHKEPGWVAGYCR(SEQ ID NO.1)。
本发明通过生物信息学分析发现一条新的桃蛀螟Alo-2类型抗菌肽，并对非信号肽部分氨基酸序列进行人工合成，研究发现该小分子多肽(即本发明提供的桃蛀螟抗菌肽)对绿僵菌具有优异的抑菌活性，可作为制备预防或抑制绿僵菌侵染家蚕的产品。
第二方面，本发明提供了一种桃蛀螟抗菌肽在制备抗真菌产品中的应用。
本发明提供的桃蛀螟抗菌肽对于包括绿僵菌在内的真菌具有良好的抑菌活性，能够用于抗真菌产品的制备中。
第三方面，本发明提供了一种桃蛀螟抗菌肽在制备僵病防治产品中的应用。
僵病是蚕茧生产过程中危害较大的病害，严重影响家蚕生长发育，而绿僵菌是僵病的首要致病菌。经发明人研究发现，本发明提供的桃蛀螟抗菌肽对于绿僵菌具有优异的抑菌活性，能够用于制备僵病防治产品中，为开发新型高效绿色蚕药奠定基础。
第四方面，本发明提供了一种药物，包括上述桃蛀螟抗菌肽。
本发明提供的桃蛀螟抗菌肽对于包括绿僵菌在内的真菌具有良好的抑菌活性，因此包括该桃蛀螟抗菌肽的药物同样具有抗真菌活性，用于僵病的防治。
第五方面，本发明提供了一种基因，该基因编码上述桃蛀螟抗菌肽。本发明中，对于基因的核苷酸序列不做具体限制，能够表达得到上述桃蛀螟抗菌肽即可，例如该基因可以具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，能够表达得到桃蛀螟抗菌肽；也可以具有如SEQID NO.3所示的核苷酸序列，该序列能够表达得到连接有信号的桃蛀螟抗菌肽(氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示)，信号肽切除后得到桃蛀螟抗菌肽。
其中，SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列如下：
TGCATCAAGAACCGCGACGGGTGCCAGCCCGATGGAAGCCAGGGCAACTGCTGCTCCGGGTACTGCCACAAAGAGCCTGGCTGGGTCGCCGGCTACTGCCGC(SEQ ID NO.2)。
SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列如下：
ATGAAGTTCAACCTGATCATCCTCGTCGCTGTATTCTTGGTAGCTGCCATGATCATGCCGACTCAAGTACTGGCGTGCATCAAGAACCGCGACGGGTGCCAGCCCGATGGAAGCCAGGGCAACTGCTGCTCCGGGTACTGCCACAAAGAGCCTGGCTGGGTCGCCGGCTACTGCCGCTGA(SEQ ID NO.3)。
SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列如下：
MKFNLIILVAVFLVAAMIMPTQVLACIKNRDGCQPDGSQGNCCSGYCHKEPGWVAGYCR(SEQ IDNO.4)。
第六方面，本发明提供了一种桃蛀螟抗菌肽前体，所述桃蛀螟抗菌肽前体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。该桃蛀螟抗菌肽前体的信号肽切除后，得到本发明的桃蛀螟抗菌肽。
下面通过具体的实施例和对比例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
实施例1抗菌肽Alo-2.1的选取与合成
1.桃蛀螟Alo-2.1序列的获得
利用基因组注释软件对实验室构建的基因组进行基因预测，将所有核苷酸序列通过blastn程序与NCBI的nt数据库比对，发现一条180bp序列与已知的桃蛀螟Alo-2序列存在92％相似度，如图1所示，故将其命名为Alo-2.1。
对鉴定到的核苷酸序列翻译为蛋白质序列，利用blastp程序与NCBI的nr库比对，发现其与已鉴定的所有Alo-2蛋白序列存在至少一个氨基酸的差异，如图2所示，通过多序列比对结果可知，其含有6个保守的半胱氨酸，属昆虫防御素典型特征，如图2所示。
2.Alo-2.1的选取与合成
使用SignalP对信号肽位点进行预测，结果显示MKFNLIILVAVFLVAAMIMPTQVLA(SEQID NO.5)为该抗菌肽的信号肽部分(图3)。使用ProtParam对氨基酸序列理化性质进行分析，结果表明其分子量约为6.42kDa，理论等电点为8.28，为碱性氨基酸；不稳定指数为36.62，为稳定蛋白；总平均亲水性值GRAVY＝0.358，为疏水性蛋白。通过SOPMA对二维结构进行预测，结果显示α螺旋占比42.37％，构成信号肽部分，延伸链占比13.56％，β转角占比6.78％，无规则卷曲占比37.29％(图4)。利用I-TASSER对三维结构拟合，3D空间结构如图5所示。综合以上分析结果，利用Fmoc固相合成法对非信号肽序列片段CIKNRDGCQPDGSQGNCCSGYCHKEPGWVAGYCR(SEQ ID NO.1)合成，合成工作由生工生物工程(上海)公司完成，纯度等级>95％，使用时乙酸作为溶剂溶解，质谱结果如图6所示。
实施例2抗菌肽Alo-2.1的抑菌活性验证
采用薄层琼脂糖穴孔扩散法测试合成肽Alo-2.1对绿僵菌的抗菌活性，用酮康唑作为阳性对照，溶解载体为乙酸。
先将绿僵菌接种于PDA固体培养基，置于27℃培养箱培养5天，将培养好的病原菌平板用直径为7mm的无菌打孔器打一个菌饼，溶解于1ml无菌水中，并于40-50℃条件下将菌液加入至50ml尚未凝固的PDA培养基，混匀，均匀倒入4个平板(分别记为平板a、平板b、平板c和平板d)中。
称量100μg人工合成抗菌肽溶解于1ml含0.01％乙酸的超纯水，混匀。
在已经凝固的含菌的PDA培养基上，用直径为7mm的无菌打孔器等距打三个孔，分别加入100μg/ml抗菌肽，500ppm酮康唑和0.01％乙酸溶液各40ul。
将上述平板放置于27℃培养箱中培养36h，观察测量抑菌圈，结果如表1和图7-图10所示，图中，c为桃蛀螟抗菌肽处理组；c-为阴性对照(0.01％乙酸溶液)；c+为阳性对照。
表1抗菌肽Alo-2.1对绿僵菌的抑菌圈直径(mm)
| Alo-2.1 | |
| a | 13.08 |
| b | 13.10 |
| c | 10.08 |
| d | 13.18 |
从图7可以看出，相较于阴性对照组c-，加入抗菌肽Alo-2.1的处理组c有明显的抑菌圈，具体抑菌圈直径数值详见表1。表明，本发明提供的桃蛀螟抗菌肽对于绿僵菌具有良好的抗菌活性。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院深圳农业基因组研究所
<120> 桃蛀螟抗菌肽、基因及其产品与应用
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Cys Ile Lys Asn Arg Asp Gly Cys Gln Pro Asp Gly Ser Gln Gly Asn
1 5 10 15
Cys Cys Ser Gly Tyr Cys His Lys Glu Pro Gly Trp Val Ala Gly Tyr
20 25 30
Cys Arg
<210> 2
<211> 102
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tgcatcaaga accgcgacgg gtgccagccc gatggaagcc agggcaactg ctgctccggg 60
tactgccaca aagagcctgg ctgggtcgcc ggctactgcc gc 102
<210> 3
<211> 180
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atgaagttca acctgatcat cctcgtcgct gtattcttgg tagctgccat gatcatgccg 60
actcaagtac tggcgtgcat caagaaccgc gacgggtgcc agcccgatgg aagccagggc 120
aactgctgct ccgggtactg ccacaaagag cctggctggg tcgccggcta ctgccgctga 180
<210> 4
<211> 59
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Met Lys Phe Asn Leu Ile Ile Leu Val Ala Val Phe Leu Val Ala Ala
1 5 10 15
Met Ile Met Pro Thr Gln Val Leu Ala Cys Ile Lys Asn Arg Asp Gly
20 25 30
Cys Gln Pro Asp Gly Ser Gln Gly Asn Cys Cys Ser Gly Tyr Cys His
35 40 45
Lys Glu Pro Gly Trp Val Ala Gly Tyr Cys Arg
50 55
<210> 5
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Met Lys Phe Asn Leu Ile Ile Leu Val Ala Val Phe Leu Val Ala Ala
1 5 10 15
Met Ile Met Pro Thr Gln Val Leu Ala
20 25
Claims (8)
1.一种桃蛀螟抗菌肽，其特征在于，所述桃蛀螟抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述的桃蛀螟抗菌肽在制备抗绿僵菌产品中的应用。
3.权利要求1所述的桃蛀螟抗菌肽在制备由绿僵菌导致的僵病防治产品中的应用。
4.一种药物，其特征在于，包括权利要求1所述的桃蛀螟抗菌肽。
5.一种基因，其特征在于，所述基因编码权利要求1所述的桃蛀螟抗菌肽。
6.根据权利要求5所述的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
7.一种桃蛀螟抗菌肽前体，其特征在于，所述桃蛀螟抗菌肽前体为连接有信号肽的桃蛀螟抗菌肽，所述桃蛀螟抗菌肽前体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
8.一种桃蛀螟抗菌肽前体的基因，其特征在于，所述桃蛀螟抗菌肽前体为连接有信号肽的桃蛀螟抗菌肽，所述桃蛀螟抗菌肽前体的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
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