CN107459562A

CN107459562A - 重组表达的腺病毒纤毛蛋白肽、腺病毒亚单位疫苗及其制备方法

Info

Publication number: CN107459562A
Application number: CN201710764922.3A
Authority: CN
Inventors: 田新贵; 周荣; 廖嘉仪; 李潇; 周志超
Original assignee: First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University
Current assignee: First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University
Priority date: 2017-08-30
Filing date: 2017-08-30
Publication date: 2017-12-12
Anticipated expiration: 2037-08-30
Also published as: CN107459562B

Abstract

本发明公开了一种重组表达的腺病毒纤毛蛋白肽、腺病毒亚单位疫苗及其制备方法，所述重组表达的腺病毒纤毛蛋白肽具有如SEQ ID No:2所示的氨基酸序列，所述疫苗包含上述腺病毒纤毛蛋白肽。本发明的腺病毒纤毛蛋白肽表达量高、免疫小鼠可以诱导高滴度中和抗体，免疫原性强，可以作为腺病毒亚单位疫苗候选，生产和纯化方便、成本低；可以诱导交叉中和作用抗体，可以作为多价腺病毒疫苗候选；和其他型别knob配伍也可作为一种多价腺病毒亚单位疫苗候选；可作为制备广谱中和活性单克隆抗体或人源单抗的免疫抗原和检测抗原。

Description

重组表达的腺病毒纤毛蛋白肽、腺病毒亚单位疫苗及其制备方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，更具体地，本发明涉及一种重组表达的腺病毒纤毛蛋白肽、腺病毒亚单位疫苗、多价腺病毒亚单位疫苗及其制备方法。

背景技术

人腺病毒(human Adenovirus,HAdV)可以感染多种粘膜组织，如胃肠道、呼吸道、泌尿生殖道及眼角结膜等，导致急性呼吸道感染(ARI)、急性胃肠炎、肾炎、眼角膜结膜炎、膀胱炎等自限性的粘膜感染甚至严重的致死性感染。腺病毒流行广泛，传播快，近年来在多个国家和地区时有爆发和流行，严重威胁到社会公共卫生安全。各个年龄段人群均能被腺病毒感染，其中易感人群多为婴幼儿和免疫功能受损的患者(如骨髓移植、人类免疫缺陷病毒感染)，常可引起严重甚至致死性感染；军队中腺病毒是致发热性呼吸道疾病的重要病原体。HAdV暴发感染多发生在幼儿园、新兵营等封闭或拥挤的场所，大规模流行中其所致的重症肺炎病死率较高，甚至未经治疗的重症HAdV肺炎或弥散性疾病的死亡率可能超过50％。腺病毒引起的肺炎尤为严重，不仅可以引起心力衰竭、呼吸衰竭，还可以引起肺外受累，如脑炎、肝损害、心肌炎或心肌损害等，甚至导致死亡，而且通常预后较差。

至今已发现的人腺病毒有7组50多种血清型，超过69种基因型。腺病毒是致病毒性肺炎的主要病原体之一，B组、C组、E组腺病毒都可以引起呼吸道感染，其中人B组腺病毒的3型、7型、14型、55型和E组4型腺病毒是致急性呼吸道感染(ARI)和婴幼儿致死性肺炎的重要病原体，传染性强，常导致爆发流行，在国内外多有报道。国内流行毒株主要型别为3型和7型，近年高致病力毒株HAdV-B55在全国多个省份的军队和群众中已有多起爆发流行，已经成为国内导致肺炎的主要病原体之一。

在致婴幼儿和成人急性呼吸道感染ARI的腺病毒中，人腺病毒B组3型、7型、14型和55型是最重要的几个型别。其中3型腺病毒主要导致婴幼儿严重感染，一般不导致成年人严重感染。相对其它型别的腺病毒感染，B组人7型腺病毒(HAdV-B7)、人55型(HAdV-B55)感染引起的肺炎症状通常更严重。国内从60年代以来一直有HAdV-B7重症感染和爆发流行的报道。近年来新出现的HAdV-B55腺病毒导致的呼吸道感染和严重肺炎暴发流行的报道越来越多，在全国范围内在人群密集的军营和高校已有多起爆发流行，已经成为重要的流行病毒株，引起人们更多重视。人腺病毒14型(HAdV-B14)引起的幼儿和成人急性呼吸道感染在国内外都有过爆发病例报道，并且常常导致重症肺炎，特别是近年来出现的高致病的HAdV-14p1株的流行严重威胁公众健康。HAdV-B55是一种基因组重组的腺病毒，其基因组包括纤毛基因主要来自14型腺病毒，只有六邻体高变区来源于人11型腺病毒，这种重组变异导致其不能被HAdV-B14抗血清中和。重组是腺病毒进化的主要方式，重组可能产生生物学特性改变的新型腺病毒，出现更强致病性或更强传染性的新毒株，将会严重威胁人类健康。

腺病毒致病的广泛性和危害的严重性使得腺病毒的防治显得十分重要，目前在世界范围内还没有针对腺病毒特异有效的治疗药物，其治疗主要采取对症治疗，接种腺病毒亚单位疫苗是预防腺病毒感染最有效的方法之一。因此，有必要研制一种多价腺病毒亚单位疫苗，可以预防常见的腺病毒型别感染，并且要适合普通人群特别是婴幼儿使用。

目前只有美国军队中正在使用的4型、7型肠溶型非减毒活疫苗。常规的多价疫苗制备方法为分离不同型别的临床毒株，分别培养纯化，合适比例配伍后制成多价疫苗，但这种方法制备多价腺病毒亚单位疫苗有其缺陷，首先，不同型别腺病毒基因组间易发生重组，可能产生毒力更强的新型腺病毒；其次，不同型别腺病毒的复制增殖效率不同，导致研制多价疫苗时配伍困难。目前国际上人腺病毒亚单位疫苗只有人4型、7型腺病毒亚单位疫苗，这两种疫苗为活的口服肠溶型疫苗，仅在美国军队的新兵训练营中使用，其应用显著减少了美军发热性呼吸道感染的发病率。但是这种疫苗只能预防人4型、7型腺病毒感染，对其它广泛流行的型别如3型、14型和55型没有预防作用，这种疫苗也不适合在普通人群或儿童中使用，仍需要探索研制新型腺病毒亚单位疫苗。

人腺病毒是无包膜二十面体对称结构，主要衣壳蛋白包括六邻体、五邻体，五邻体包括五邻体基座(pentonbase)和纤毛蛋白(fiber)，均能在体内诱导型特异性的中和抗体应答。纤毛蛋白是最主要的受体结合蛋白，其头部结构域(knob)与宿主细胞表面的病毒特异性受体结合完成病毒的吸附。重组六邻体蛋白多肽由于不能形成正确的3聚体构象，免疫小鼠不能或只能诱导很弱的中和抗体应答。有文献报道表明人5型、2型等腺病毒knob可以自组装成可溶性的三聚体结构，免疫小鼠后能诱导中和抗体应答。与真核表达系统相比，大肠杆菌表达系统更早、更广泛地被应用于生物医药领域，并且是公认的高效、低成本、安全性良好的表达系统。大肠杆菌来源的疫苗产量高、成本低，尤其适合开发面向全世界(特别是多数的发展中国家)的新型疫苗。因此如果能够在大肠杆菌中高效表达腺病毒亚单位疫苗，将更有价值。

目前，大肠杆菌表达的重组蛋白疫苗如丙肝疫苗已经临床应用，其成本低、制备方便，在之前文献报道knob多肽可以在大肠杆菌中进行表达，包括C组5型、2型，B组3型，以及其它组部分型别。只有5型和2型有报道有中和作用，有报道证明纤毛蛋白是中和抗原，但没有作为腺病毒亚单位疫苗应用的报道。B组腺病毒不同型别Knob间的交叉中和作用没有报道。

发明内容

基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种重组表达的腺病毒纤毛蛋白肽、腺病毒亚单位疫苗、多价腺病毒亚单位疫苗及其制备方法。

为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：

一种重组表达的腺病毒纤毛蛋白肽，所述重组表达的腺病毒纤毛蛋白肽具有如SEQ ID No:2所示的氨基酸序列。

在其中一些实施例中，所述重组表达的腺病毒纤毛蛋白肽由如SEQ ID No:1所示的碱基序列所编码。

本发明还提供了上述重组表达的腺病毒纤毛蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：

(1)、对人3型腺病毒knob基因分别进行密码子优化以适于大肠杆菌表达，分别合成基因，并克隆到原核表达载体PQE30中；

(2)、转化大肠杆菌Top10化学感受态，挑取单菌落进行基因测序，取与理论序列一致无突变的菌落保种并提取质粒；

(3)、将鉴定正确的表达质粒转化表达菌BL21感受态，挑单菌落接种至含Amp的LB培养基摇培，加IPTG诱导，离心收集菌体；

(4)、用PBS缓冲液重悬菌体，溶菌酶或超声波裂解细菌，高速离心后取上清，用镍柱进行纯化，梯度咪唑进行洗涤和洗脱，洗脱液去除咪唑，即得重组表达的腺病毒纤毛蛋白肽。

本发明还提供了一种腺病毒亚单位疫苗，所述疫苗包含上述重组表达的腺病毒纤毛蛋白肽。

在其中一些实施例中，所述疫苗还包括磷酸铝凝胶佐剂，所述重组表达的腺病毒纤毛蛋白肽与所述磷酸铝凝胶佐剂以相同体积配比。

本发明还提供了一种多价腺病毒亚单位疫苗，所述疫苗包含上述重组表达的腺病毒纤毛蛋白肽。

本发明还提供了一种多价腺病毒亚单位疫苗，所述疫苗包含上述重组表达的腺病毒纤毛蛋白肽、以及SEQ ID No:4所示氨基酸序列的重组表达的腺病毒纤毛蛋白肽。

在其中一些实施例中，所述多价腺病毒亚单位疫苗还包括磷酸铝凝胶佐剂，所述重组表达的腺病毒纤毛蛋白肽与所述磷酸铝凝胶佐剂以相同体积配比。

本发明还提供了一种多价腺病毒亚单位疫苗，所述疫苗包含上述重组表达的腺病毒纤毛蛋白肽、SEQ ID No:4所示氨基酸序列的重组表达的腺病毒纤毛蛋白肽、以及SEQ IDNo:6所示氨基酸序列的重组表达的腺病毒纤毛蛋白肽。

本发明还提供了一种单克隆抗体，所述单克隆抗体是采用上述重组表达的腺病毒纤毛蛋白肽作为免疫原或检测抗原制备获得。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明对人3型腺病毒knob基因进行密码子优化适合大肠杆菌表达后合成，克隆入原核表达载体PQE30中，再转化BL21(DE3)进行表达，收集细菌，溶菌酶裂解，用镍柱进行纯化；纯化的knob多肽表现为同源三聚体结构，表达量高、免疫小鼠可以诱导高滴度中和抗体，免疫原性强，可以作为腺病毒亚单位疫苗候选，生产和纯化方便、成本低；

2、本发明的3型腺病毒knob可以诱导极强的针对人3型、14型和55型腺病毒交叉中和作用抗体，可以作为多价腺病毒亚单位疫苗候选；采用3型腺病毒与其他几种型别的knob混合也可作为一种广谱多价腺病毒亚单位疫苗候选；

3、本发明的重组knob多肽可作为制备广谱中和活性单克隆抗体或人源单抗的免疫抗原和检测抗原。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，不用于限定有权利要求所界定的本发明范围。

图1为本发明实施例1中腺病毒纤毛蛋白knob纯化产物的SDS-PAGE经考马斯亮蓝染色的图谱，其中，-1为未煮沸样品，-2为煮沸样品；

图2为本发明实施例2中重组knob蛋白免疫小鼠血清对各自型别腺病毒的细胞微量中和实验结果；

图3为本发明实施例2中重组knob蛋白免疫小鼠血清(10000倍稀释)ELISA检测结果。

具体实施方式

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

以下实施例中所使用的试剂或原料，如无特殊说明，均来源于市售。

本说明书实施例中所述Ad3为HAdv3-gz01病毒株，全基因组Genbank号：DQ099432。本说明书实施例中所述Ad7病毒株(Ad7-GZ08)全基因组序列GenBank号：GQ478341.1；Ad4病毒株(Ad4-GZ01)全基因组序列GenBank号：KF006344.1。Ad14病毒株(Ad14-GZ01)全基因组序列GenBank号：JQ824845.1；Ad55病毒株(Ad55-Shanxi-Y16)六邻体基因序列GenBank号：KF911353.1；复制缺陷型Ad5病毒株(AdEASY)来源于pAdEasy-1，其GenBank号：AY370909.2；本说明书实施例中knob基因和这些病毒株一致，氨基酸序列无突变；本实施例中中和实验等也使用这些毒株。

实施例1重组人腺病毒knob多肽的表达

1、对人3型、7型、14型、4型、5型腺病毒knob基因进行大肠杆菌偏好密码子优化以适应大肠杆菌表达，分别合成基因，并克隆入原核表达载体PQE30(Qiagen公司)中；

2、以人55型腺病毒基因组为模板，以引物对A55Kn-RH/A55Kn-UB进行PCR，扩增55型knob基因，BamHI和HindIII双酶切PCR片段后连接到上述PQE30中，转化大肠杆菌Top10化学感受态，挑取单菌落进行基因测序。取与理论序列一致无突变的菌落保种并提取质粒；

A55Kn-RH:AGCTAATTAAGCttagtcgtcttctctgatgtagta(SEQ ID No：13)

A55Kn-UB:ACCATCACGGATCCaacaacatttgcattgatgac(SEQ ID No：14)

3、将鉴定正确的表达质粒转化表达菌BL21(DE3)感受态，挑单菌落接种5ml的LB(加100ug/ml的Amp)培养基37℃摇培过夜，全部接种至200ml的LB(加100ug/ml的Amp)培养基37℃摇培3-4hr，加0.5mM IPTG在37℃诱导4-5小时或低温(18℃)诱导过夜，离心收集菌体。用PBS缓冲液(1mM EDTA，10％甘油，1％Triton X100，10mM咪唑)重悬菌体，溶菌酶(2mg酶/g菌体)或超声波(3s/3s、60次)裂解细菌，12000g高速离心后取上清，用镍柱进行纯化，用10mM、20mM、200Mm、400mM梯度咪唑进行洗涤和洗脱，洗脱液用10kDa超滤管离心置换PBS缓冲液(1mM EDTA，10％甘油)去除咪唑，纯化蛋白冻存于-20℃。

纯化的蛋白表现为同源三聚体结构。Ad3、Ad4、Ad5、Ad7、Ad14 Knob重组蛋白用0.5mM IPTG于37℃诱导5h，表达，纯化；Ad55knob重组蛋白为0.5mM IPTG于18℃诱导过夜，表达，纯化；Ad4、Ad5、Ad7、Ad14knob蛋白表达量高，可溶并呈三聚体；Ad3knob蛋白可溶，但三聚体量较少，Ad55 knob蛋白可溶表达，呈三聚体，但表达量相对较低(如图1)。

重组人腺病毒knob多肽分别具有以下碱基组成和氨基酸组成：

1、Ad3-knob：碱基序列如SEQ ID No:1所示，氨基酸序列如SEQ ID No:2所示；

2、Ad7-knob：碱基序列如SEQ ID No:3所示，氨基酸序列如SEQ ID No:4所示；

3、Ad4-knob：碱基序列如SEQ ID No:5所示，氨基酸序列如SEQ ID No:6所示；

4、Ad14-knob：碱基序列如SEQ ID No:7所示，氨基酸序列如SEQ ID No:8所示；

5、Ad55-knob：碱基序列如SEQ ID No:9所示，氨基酸序列如SEQ ID No:10所示；

6、Ad5-knob：碱基序列如SEQ ID No:11所示，氨基酸序列如SEQ ID No:12所示。

实施例2重组蛋白的免疫原性试验

为分析实施例1的重组蛋白的免疫原性，采用重组蛋白加磷酸铝佐剂(ADJU-PHOS，Brenntag Biosector)乳化后免疫小鼠，共免疫四次，每只小鼠每次免疫40ug蛋白，末次免疫7天后采集血清，进行ELISA检测和细胞微量中和实验。

结果如图2和图3所示，结果表明各型重组knob免疫小鼠均能诱导出高滴度抗体应答，对各自型别腺病毒的中和抗体滴度约500-4000(图2)，用重组蛋白抗原进行ELISA检测其滴度可以达到10⁶-10⁷(图3)。

实施例3小鼠抗腺病毒纤毛蛋白头(knob)血清对不同型别腺病毒的交叉中和作用分析

采集实施例2的经四次免疫后的抗纤毛蛋白头血清进行交叉中和作用检测，结果如表1所示。

表1小鼠抗腺病毒纤毛蛋白头血清对不同型别腺病毒的交叉中和作用

-:未检测到中和作用

表1结果发现：有些型别对同组内多种型别腺病毒有交叉中和作用，而且这种交叉中和作用非常强。Ad3型Knob抗血清可以中和人3型、14型、55型腺病毒，因此Ad3型Knob可以作为一种预防人3型、14型、55型腺病毒的多价腺病毒疫苗候选。

实施例4不同型别重组knob等量混合后免疫小鼠实验

根据型间交叉反应的结果，采用不同组合方式制备多价腺病毒候选疫苗，一种是3型、7型腺病毒重组knob在体外同质量混合后加磷酸铝佐剂免疫小鼠，每次每只小鼠免疫总蛋白量50ug(每种25ug)；另一种是3型、4型、7型腺病毒重组knob在体外同质量混合后加磷酸铝佐剂免疫小鼠，每次每只小鼠免疫总蛋白量60ug(每种20ug)；肌肉注射，共免疫两次后收集抗血清，进行体外细胞微量中和实验，检测抗血清对各型别腺病毒的中和效价。

结果表明3型、7型knob混合后免疫小鼠可以诱导抗3型、7型、14型、55型腺病毒中和抗体，中和效价为1000-4000，可以作为一种4价腺病毒亚单位疫苗使用，各型间中和效价差异不显著(表2)。

表2人3型、7型腺病毒knob混合后免疫小鼠抗血清对各型别腺病毒的中和作用

-:未检测到中和作用

3型、4型、7型knob混合后免疫小鼠可以诱导抗3型、4型、7型、14型、55型腺病毒中和抗体，中和效价为1000-4000，可以作为一种5价腺病毒候选疫苗使用，各型间中和效价差异不显著(表3)。

表3人3型、4型、7型腺病毒knob混合后免疫小鼠抗血清对各型别腺病毒的中和作用

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 广州医科大学附属第一医院

<120> 重组表达的腺病毒纤毛蛋白肽、腺病毒亚单位疫苗及其制备方法

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 588

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 1

aatagcattg cactgaaaaa taacaccctg tggaccggtc cgaaaccgga agccaattgt 60

attattgaat atggcaaaga aaatccggat agtaaactga ccttaattct ggttaaaaat 120

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accttaatta cctctccgtt tacctttagc tatattaccg aagatgat 588

<210> 2

<211> 196

<212> PRT

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 2

Asn Ser Ile Ala Leu Lys Asn Asn Thr Leu Trp Thr Gly Pro Lys Pro

1 5 10 15

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20 25 30

Leu Thr Leu Ile Leu Val Lys Asn Gly Gly Ile Val Asn Gly Tyr Val

35 40 45

Thr Leu Met Gly Ala Ser Asp Tyr Val Asn Thr Leu Phe Lys Asn Lys

50 55 60

Asn Val Ser Ile Asn Val Glu Leu Tyr Phe Asp Ala Thr Gly His Ile

65 70 75 80

Leu Pro Asp Leu Ser Ser Leu Lys Thr Asp Leu Gln Leu Lys Tyr Lys

85 90 95

Gln Thr Thr His Phe Ser Ala Arg Gly Phe Met Pro Ser Thr Thr Ala

100 105 110

Tyr Pro Phe Val Leu Pro Asn Ala Gly Thr Asp Asn Glu Asn Tyr Ile

115 120 125

Phe Gly Gln Cys Tyr Tyr Lys Ala Ser Asp Gly Ala Leu Phe Pro Leu

130 135 140

Glu Val Thr Val Thr Leu Asn Lys Arg Leu Pro Asp Ser Arg Thr Ser

145 150 155 160

Tyr Val Ile Thr Phe Leu Trp Ser Leu Asn Ala Gly Leu Ala Pro Glu

165 170 175

Thr Thr Gln Ala Thr Leu Ile Thr Ser Pro Phe Thr Phe Ser Tyr Ile

180 185 190

Thr Glu Asp Asp

195

<210> 3

<211> 609

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 3

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gaagatgat 609

<210> 4

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<212> PRT

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

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<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

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gccaattctt atacctttag ttatattgca caggaa 576

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<211> 192

<212> PRT

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

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aataacattt gtattgatga taatattaat accctgtgga ccggtgtgaa tccgaccgaa 60

gccaattgtc agatgatgga tagtagcgaa agcaatgatt gtaaactgat tctgacctta 120

gttaaaaccg gcgcactggt gaccgccttt gtgtatgtga ttggcgtttc aaataacttt 180

aatatgttaa ccacctatcg taatattaat tttaccgcag aactgttctt cgatagcgca 240

ggcaatctgc tgacctctct gtctagtctg aaaaccccgc tgaatcataa aagtggtcag 300

aatatggcaa ccggtgccat taccaatgcc aagagcttta tgccgagcac caccgcctat 360

ccgtttaaca acaattcacg cgaaaattat atatacggca cctgtcatta taccgcctca 420

gatcataccg cctttccgat tgatattagt gttatgctga atcagcgtgc cattcgtgca 480

gataccagct attgtattcg cattacctgg agttggaata ccggcgatgc cccggaaggc 540

cagacctctg caaccaccct ggtgaccagt ccgtttacct tttattatat tcgcgaagat 600

gat 603

<210> 8

<211> 201

<212> PRT

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 8

Asn Asn Ile Cys Ile Asp Asp Asn Ile Asn Thr Leu Trp Thr Gly Val

1 5 10 15

Asn Pro Thr Glu Ala Asn Cys Gln Met Met Asp Ser Ser Glu Ser Asn

20 25 30

Asp Cys Lys Leu Ile Leu Thr Leu Val Lys Thr Gly Ala Leu Val Thr

35 40 45

Ala Phe Val Tyr Val Ile Gly Val Ser Asn Asn Phe Asn Met Leu Thr

50 55 60

Thr Tyr Arg Asn Ile Asn Phe Thr Ala Glu Leu Phe Phe Asp Ser Ala

65 70 75 80

Gly Asn Leu Leu Thr Ser Leu Ser Ser Leu Lys Thr Pro Leu Asn His

85 90 95

Lys Ser Gly Gln Asn Met Ala Thr Gly Ala Ile Thr Asn Ala Lys Ser

100 105 110

Phe Met Pro Ser Thr Thr Ala Tyr Pro Phe Asn Asn Asn Ser Arg Glu

115 120 125

Asn Tyr Ile Tyr Gly Thr Cys His Tyr Thr Ala Ser Asp His Thr Ala

130 135 140

Phe Pro Ile Asp Ile Ser Val Met Leu Asn Gln Arg Ala Ile Arg Ala

145 150 155 160

Asp Thr Ser Tyr Cys Ile Arg Ile Thr Trp Ser Trp Asn Thr Gly Asp

165 170 175

Ala Pro Glu Gly Gln Thr Ser Ala Thr Thr Leu Val Thr Ser Pro Phe

180 185 190

Thr Phe Tyr Tyr Ile Arg Glu Asp Asp

195 200

<210> 9

<211> 609

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 9

aacaacattt gcattgatga caatattaac accctgtgga caggaattaa ccccaccgaa 60

gccaactgtc aaatgatgga ctccagtgaa tctaatgatt gcaaattaat tctaacacta 120

gttaaaactg gagccctagt cactgcattt gtttatgtta taggagtatc taacaatttt 180

aatatgctaa ctacatacag aaatataaat tttactgcgg agctgttttt tgattctgcg 240

ggtaatttac taactagcct gtcatcccta aaaactccac ttaatcataa atcaggacaa 300

aacatggcta ctggtgccat tactaatgct aaaagtttca tgcccagcac aactgcttat 360

cctttcaata ataattctag agaaaaagaa aactacattt acggaacctg tcactacaca 420

gctagtgatc acactgcttt tcccattgac atatctgtca tgcttaacca aagagcaata 480

agagctgata catcatattg tattcgtata acttggtcct ggaacacagg agatgcccca 540

gaggggcaaa cctctgctac aaccctagtt acctccccat ttacctttta ctacatcaga 600

gaagacgac 609

<210> 10

<211> 203

<212> PRT

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 10

Asn Asn Ile Cys Ile Asp Asp Asn Ile Asn Thr Leu Trp Thr Gly Ile

1 5 10 15

Asn Pro Thr Glu Ala Asn Cys Gln Met Met Asp Ser Ser Glu Ser Asn

20 25 30

Asp Cys Lys Leu Ile Leu Thr Leu Val Lys Thr Gly Ala Leu Val Thr

35 40 45

Ala Phe Val Tyr Val Ile Gly Val Ser Asn Asn Phe Asn Met Leu Thr

50 55 60

Thr Tyr Arg Asn Ile Asn Phe Thr Ala Glu Leu Phe Phe Asp Ser Ala

65 70 75 80

Gly Asn Leu Leu Thr Ser Leu Ser Ser Leu Lys Thr Pro Leu Asn His

85 90 95

Lys Ser Gly Gln Asn Met Ala Thr Gly Ala Ile Thr Asn Ala Lys Ser

100 105 110

Phe Met Pro Ser Thr Thr Ala Tyr Pro Phe Asn Asn Asn Ser Arg Glu

115 120 125

Lys Glu Asn Tyr Ile Tyr Gly Thr Cys His Tyr Thr Ala Ser Asp His

130 135 140

Thr Ala Phe Pro Ile Asp Ile Ser Val Met Leu Asn Gln Arg Ala Ile

145 150 155 160

Arg Ala Asp Thr Ser Tyr Cys Ile Arg Ile Thr Trp Ser Trp Asn Thr

165 170 175

Gly Asp Ala Pro Glu Gly Gln Thr Ser Ala Thr Thr Leu Val Thr Ser

180 185 190

Pro Phe Thr Phe Tyr Tyr Ile Arg Glu Asp Asp

195 200

<210> 11

<211> 585

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 11

ggcgccatta ccgtgggcaa caaaaacaat gataaactga ccctgtggac caccccggcc 60

ccgagtccga attgtcgctt aaatgcagaa aaagatgcca aactgacctt agtgctgacc 120

aaatgtggta gtcagattct ggccaccgtg agcgtgttag cagtgaaagg ctcactggcc 180

ccgattagcg gcaccgttca gagcgcacat ctgattattc gctttgatga aaatggcgtg 240

ctgttaaaca atagctttct cgatccggaa tattggaatt ttcgtaacgg agacctaacc 300

gaaggcaccg catataccaa tgcagttggc tttatgccga atctgtcagc ctatccgaaa 360

tcacatggga aaaccgccaa aagtaatatt gtgtctcagg tgtatctgaa tggcgataaa 420

accaaaccgg tgaccttaac cattaccctg aatggcaccc aggaaaccgg cgataccacc 480

ccgtctgcct atagtatgtc attttcttgg gattggagcg gtcataatta tattaacgag 540

atttttgcaa cctctagcta tacctttagt tatattgcac aggaa 585

<210> 12

<211> 195

<212> PRT

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 12

Gly Ala Ile Thr Val Gly Asn Lys Asn Asn Asp Lys Leu Thr Leu Trp

1 5 10 15

Thr Thr Pro Ala Pro Ser Pro Asn Cys Arg Leu Asn Ala Glu Lys Asp

20 25 30

Ala Lys Leu Thr Leu Val Leu Thr Lys Cys Gly Ser Gln Ile Leu Ala

35 40 45

Thr Val Ser Val Leu Ala Val Lys Gly Ser Leu Ala Pro Ile Ser Gly

50 55 60

Thr Val Gln Ser Ala His Leu Ile Ile Arg Phe Asp Glu Asn Gly Val

65 70 75 80

Leu Leu Asn Asn Ser Phe Leu Asp Pro Glu Tyr Trp Asn Phe Arg Asn

85 90 95

Gly Asp Leu Thr Glu Gly Thr Ala Tyr Thr Asn Ala Val Gly Phe Met

100 105 110

Pro Asn Leu Ser Ala Tyr Pro Lys Ser His Gly Lys Thr Ala Lys Ser

115 120 125

Asn Ile Val Ser Gln Val Tyr Leu Asn Gly Asp Lys Thr Lys Pro Val

130 135 140

Thr Leu Thr Ile Thr Leu Asn Gly Thr Gln Glu Thr Gly Asp Thr Thr

145 150 155 160

Pro Ser Ala Tyr Ser Met Ser Phe Ser Trp Asp Trp Ser Gly His Asn

165 170 175

Tyr Ile Asn Glu Ile Phe Ala Thr Ser Ser Tyr Thr Phe Ser Tyr Ile

180 185 190

Ala Gln Glu

195

<210> 13

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 13

agctaattaa gcttagtcgt cttctctgat gtagta 36

<210> 14

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 14

accatcacgg atccaacaac atttgcattg atgac 35

Claims

1.一种重组表达的腺病毒纤毛蛋白肽，其特征在于，所述重组表达的腺病毒纤毛蛋白肽具有如SEQ ID No:2所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的重组表达的腺病毒纤毛蛋白肽，其特征在于，所述重组表达的腺病毒纤毛蛋白肽由如SEQ ID No:1所示的碱基序列所编码。

3.权利要求1或2所述的重组表达的腺病毒纤毛蛋白肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

4.一种腺病毒亚单位疫苗，其特征在于，所述疫苗包含权利要求1或2所述的重组表达的腺病毒纤毛蛋白肽。

5.根据权利要求4所述的腺病毒亚单位疫苗，其特征在于，所述疫苗还包括磷酸铝凝胶佐剂，所述重组表达的腺病毒纤毛蛋白肽与所述磷酸铝凝胶佐剂以相同体积配比。

6.一种多价腺病毒亚单位疫苗，其特征在于，所述疫苗包含权利要求1或2所述的重组表达的腺病毒纤毛蛋白肽。

7.根据权利要求6所述的多价腺病毒亚单位疫苗，其特征在于，所述疫苗还包括磷酸铝凝胶佐剂，所述重组表达的腺病毒纤毛蛋白肽与所述磷酸铝凝胶佐剂以相同体积配比。

8.一种多价腺病毒亚单位疫苗，其特征在于，所述疫苗包含权利要求1或2所述的重组表达的腺病毒纤毛蛋白肽、以及SEQ ID No:4所示氨基酸序列的重组表达的腺病毒纤毛蛋白肽。

9.一种多价腺病毒亚单位疫苗，其特征在于，所述疫苗包含权利要求1或2所述的重组表达的腺病毒纤毛蛋白肽、SEQ ID No:4所示氨基酸序列的重组表达的腺病毒纤毛蛋白肽、以及SEQ ID No:6所示氨基酸序列的重组表达的腺病毒纤毛蛋白肽。

10.一种单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体是采用如权利要求1或2所述的重组表达的腺病毒纤毛蛋白肽作为免疫原或检测抗原制备获得。