KR20230022334A - Api5에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 API5에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 및 이들의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 다양한 암종에서 발현이 증가되어 있는 API5에 특이적 결합이 확인되었는 바, 내성암 또는 항암 치료 후의 재발 또는 전이암의 치료 연구 등에 적용될 수 있다.

Description

API5에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도{Antibody specifically binding to API5 and Uses thereof}
본 발명은 API5에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 및 이들의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로는 API5에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 및 이들을 이용한 암의 치료 용도에 관한 것이다.
암의 치료를 위해서는 외과적 수술, 방사선 치료법, 항암제 치료법, 면역치료법 등 다양한 치료 요법이 존재한다. 그 중, 면역 관문(immune checkpoint) 인자 PD-L1(Programmed death-ligand 1) 항체 치료 및 종양 항원 특이 T 세포를 이용한 항암 면역치료는 타 항암 치료 요법에 비해 성공적인 임상효과로 주목받고 있으나 여전히 반응성이 낮고 재발률이 높은 한계점이 있다.
이러한 임상적 난제의 주요 원인은 항암 면역치료에 대한 암세포의 내성 획득과 관련된다. 따라서 암 치료 효율 증진을 위해서는 암의 내성 극복에 대한 연구 및 표적 방법에 대한 연구가 필요하다.
성공적인 항암 면역치료 반응 도출을 위해서는 암세포 특이적인 T 세포 면역 반응이 형성되는 일련의 과정인 암 면역 순환고리(Cancer immunity cycle)가 원활히 형성되어야 한다. 이 과정은 1) 종양의 세포사멸 및 종양 항원 노출, 2) 항원제시세포의 종양 항원 제시, 3) 항원제시세포의 종양 항원 특이적 T 세포 생성 유도, 4) 종양 항원 T 세포의 종양 부위로의 이동, 5) 종양 내로의 침투, 6) 암세포 인지 및 사멸 유도의 순환이다.
이러한 과정 중 하나 혹은 여러 단계에서의 문제 발생은 항암 면역 반응 형성을 막으며, 면역치료 효율을 감소시킨다. 이에, 억제된 각 단계를 재활성시킬 수 있는 암 치료제들과 면역치료법의 병용이 항암 면역치료 내성 극복 방안으로 제안되고 있지만, 각각의 단일 단계 활성만으로는 여러 단계 이상을 극복할 수 없다.
한편, API5(Apoptosis inhibitor protein 5)는 다양한 암종에서 발현이 증가되어 있으며, 본 발명자의 선행 연구에서 ERK 기전을 통해 면역 내성 유도에 관여하는 인자로 보고된 바 있다(Cancer research. 2014). 또한, 후성 유전학적 조절인자와의 결합을 통해 면역 내성 유도 인자 NANOG의 발현을 전사 단계에서 조절함으로써 면역 내성뿐만 아니라 암의 다양한 악성(암전이능, 암줄기능, 항암제 내성 등)의 원인 인자임이 확인되었다(Oncogenesis. 2017, Exp Mol Med. 2017, BMB Rep. 2015, BMC Cancer. 2014).
본 발명자들은 내성암 또는 항암 치료 후의 재발 또는 전이암의 치료를 위한 표적 항체를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 다양한 암종에서 발현이 증가되어 있는 API5에 특이적으로 결합하는 신규한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 개발함으로써, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 API5(Apoptosis inhibitor protein 5) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 벡터를 포함하는 숙주세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 API5 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 암 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 API5 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 상기 암 치료용 약제학적 조성물을 치료가 필요한 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 내성암 또는 항암 치료 후의 재발 또는 전이암의 치료를 위한 표적 항체를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 다양한 암종에서 발현이 증가되어 있는 API5에 특이적으로 결합하는 신규한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 개발하였다.
본 발명은 API5(Apoptosis inhibitor protein 5) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 이를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자, 이를 포함하는 재조합 벡터, 이를 포함하는 숙주세포, API5 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 암 치료용 약제학적 조성물, 및 API5 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 이를 포함하는 암 치료용 약제학적 조성물을 치료가 필요한 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료방법에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 API5(Apoptosis inhibitor protein 5) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.
본 명세서에서, 용어 "API5(Apoptosis inhibitor protein 5)"은 API5 유전자에 의해 인코딩되는 단백질이다. API5 유전자는 성장인자 없이도 세포사멸이 이루어지지 않은 세포의 cDNA 분석을 통해, 발현이 증가된 유전자로 발견되어 AAC-11이라고 명명되었다(Cancer Res. 1997, 57(18):4063-9). API5 유전자는 여러 암세포에서 암의 생존 증가에 관여한다고 보고되었는데, Acinus(ACIN1)와의 물리적 결합을 통해 Acinus-매개 DNA 절편을 통한 세포사멸 유도를 억제하고 세포사멸 단백질인 Caspase-3의 활성을 막는다고 알려져 있다(EMBO J. 2009, 28(11):1576-88).
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 API5 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 a) 서열번호 1로 표시되는 HCDR1, 서열번호 2로 표시되는 HCDR2, 및 서열번호 3으로 표시되는 HCDR3를 포함하는 중쇄 가변영역; 및 b) 서열번호 4로 표시되는 LCDR1, 서열번호 5로 표시되는 LCDR2, 및 서열번호 6으로 표시되는 LCDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 각각 본 발명의 실시예에서 선별한 인간 항체 라이브러리에서 도출한 클론 3F2로부터 유래한 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 하기 서열번호 7로 표시되는 중쇄 가변영역 및 서열번호 8로 표시되는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 API5 단백질은 인간 유래 API5 단백질이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열번호 17 내지 18의 아미노산 서열 중 어느 하나로 표시되는 API5 폴리펩타이드 또는 rhAPI5 폴리펩타이드 내에 존재하는 에피토프(epitope)에 결합하는 것이다.
상기 서열번호 17의 아미노산 서열은 인간 유래 API5 단백질을 표시한다.
상기 서열번호 18의 아미노산 서열은 전장 재조합 인간 API5 폴리펩타이드를 표시한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 가변영역의 프레임워크(framework) 서열은 인간 유래 프레임워크 서열 또는 마우스 유래 프레임워크 서열로부터 유래하는 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 항체는 당 업계에 알려져 있는 다양한 파지 디스플레이(phage display) 방법을 사용하여 생성될 수 있고, [Brinkman et al., 1995, J. Immunol. Methods, 182:41-50]; [Ames et al., 1995, J. Immunol. Methods, 184, 177-186]; [Kettleborough et al. 1994, Eur. J. Immunol, 24, 952-958]; [Persic et al., 1997, Gene, 187, 9-18]; 및 [Burton et al., 1994, Adv. Immunol., 57, 191-280]; WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; 및 WO 95/20401; 및 US 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; 5,733,743; 및 5,969,108 에 게시된 것을 포함한다.
본 명세서에서, 용어 "항체(antibody)"는 API5 단백질에 대한 특이적 항체로서, 완전한 항체 형태뿐만 아니라 항체 분자의 항원 결합 단편(antigen binding fragment)을 포함한다.
완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(kappa) 및 람다(lambda) 타입을 가진다(Cellular and Molecular Immunology, Wonsiewicz, M. J., Ed., Chapter 45, pp. 41-50, W. B. Saunders Co. Philadelphia, PA(1991); Nisonoff, A., Introduction to Molecular Immunology, 2nd Ed., Chapter 4,pp. 45-65, sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1984)).
본 명세서에서, 용어 "항원 결합 단편"은 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2, 화학적으로 연결된 F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 다이설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 PCT 국제 공개특허출원 WO 88/10649, WO 88/106630, WO 88/07085, WO 88/07086 및 WO 88/09344에 개시되어 있다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 단쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 또는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
본 발명에서 항체는 구체적으로 scFv 형태이거나 완전한 항체 형태이다. 또한, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 또는 엡실론(ε) 중의 어느 한 이소타입으로부터 선택될 수 있다. 구체적으로는, 불변영역은 감마1(IgG1), 감마 2(IgG2), 감마 3(IgG3) 및 감마 4(IgG4)이다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 형일 수 있으며, 구체적으로는 카파형이다.
본 명세서에서, 용어 "중쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VH 및 3 개의 불변 영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3를 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다. 또한 본 명세서에서 용어 "경쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VL 및 불변 영역 도메인 CL을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.
본 명세서에서, 용어 "CDR(complementarity determining region)"은 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 초가변영역(hypervariable region, HVR)의 아미노산 서열을 의미한다(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)). 중쇄(CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3) 및 경쇄(CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3)에는 각각 3개의 CDR이 포함되어 있다. CDR은 항체가 항원 또는 에피토프에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공한다.
본 명세서에서 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 전장 또는 원래 그대로의 폴리클로날 또는 모노클로날 항체뿐만 아니라, 이의 항원 결합 단편들(예를 들어, Fab, Fab′, F(ab′)2, Fab3, Fv 및 이의 변이체들), 하나 또는 그 이상의 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 인간화 항체, 미니바디, 다이아바디, 트리아바디, 테트라바디, 선형 항체, 단일 체인 항체(scFv), scFv-Fc, 이중특이적 항체, 다중특이적 항체, 필요한 특이성의 항원 인식 부위를 포함하는 면역 글로불린 분자의 다른 변형된 배열형태로서 항체의 글리코실화 변이체, 항체의 아미노산 서열 변이체 및 공유결합으로 변형된 항체를 포함한다. 변형된 항체 및 이의 항원 결합 단편의 구체적인 예에는 나노바디, AlbudAbs, DARTs(dual affinity re-targeting), BiTEs(bispecific T-cell engager), TandAbs(tandem diabodies), DAFs(dual acting Fab), two-in-one antibodies, SMIPs(small modular immunopharmaceuticals), FynomAbs(fynomers fused to antibodies), DVD-Igs(dual variable domain immunoglobulin), CovX-bodies(peptide modified antibodies), 듀오바디 및 triomAbs이 포함된다. 이와 같은 항체 및 이의 항원 결합 단편들의 목록은 상기에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서, 용어 "프레임 워크(Framework)" 또는 "FR"은 초가변영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 나타낸다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4 개의 FR 도메인 FR1, FR2, FR3 및 FR4로 구성된다. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH 및 VL/VK에서 다음의 순서로 나타난다:
(a) FRH1(Framework region 1 of Heavy chain)-CDRH1(complementarity determining region 1 of Heavy chain)-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4; 및
(b) FRL1(Framework region 1 of Light chain)-CDRL1(complementarity determining region 1 of Light chain)-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 다음과 같은 순서로 나타날 수 있다:
(a) FRL1(Framework region 1 of Light chain)-CDRL1(complementarity determining region 1 of Light chain)-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4; 및
(b) FRH1(Framework region 1 of Heavy chain)-CDRH1 (complementarity determining region 1 of Heavy chain)-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4.
본 명세서에서, 용어 "가변 영역(variable region)" 또는 "가변 도메인(variable domain)"은 항체를 항원에 결합시키는 것과 관련되는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 의미한다. Native 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인(각각 VH 및 VL)은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 각 도메인은 4 개의 보존된 프레임워크 영역 (framework regions, FR) 및 3 개의 초가변 영역 (hypervariable regions, HVR)을 포함한다. (Kindt et al., Kuby Immunology, 제 6 판, W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)). 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 또한, 특정 항원에 결합하는 항체는, 항원과 결합하여 각각 상보적인 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 스크리닝하는 항체로부터, VH 또는 VL 도메인을 사용하여 분리될 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "특이적으로 결합한다" 또는 이와 같은 것은, 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 scFv와 같은 다른 구성물이 생리적 조건 하에서 비교적 안정한 항원과 복합체를 형성한다는 것을 의미한다. 특이적 결합은 적어도 약 1 x 10-6 M 이하(예컨대, 9 x 10-7 M, 8 x 10-7 M, 7 x 10-7 M, 6 x 10-7 M, 5 x 10-7 M, 4 x 10-7 M, 3 x 10-7 M, 2 x 10-7 M, 또는 1 x 10-7 M), 바람직하게는 1 x 10-7 M 이하(예컨대, 9 x 10-8 M, 8 x 10-8 M, 7 x 10-8 M, 6 x 10-8 M, 5 x 10-8 M, 4 x 10-8 M, 3 x 10-8 M, 2 x 10-8 M, 또는 1 x 10-8 M), 보다 바람직하게는 1 x 10-8 M 이하(예컨대, 9 x 10-9 M, 8 x 10-9 M, 7 x 10-9 M, 6 x 10-9 M, 5 x 10-9 M, 4 x 10-9 M, 3 x 10-9 M, 2 x 10-9 M, 또는 1 x 10-9 M)의 평형 해리 상수(예를 들어, 이보다 작은 KD는 보다 단단한 결합을 나타냄)로 특성화될 수 있다. 2 개의 분자가 특이적으로 결합하는지 여부를 결정하는 방법은 당 업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 평형 투석, 표면 플라스몬 공명 등을 포함한다.
본 명세서에서, 용어 "친화도(Affinity)"는 분자(예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 그 결합 파트너(예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호 작용의 총합의 강도를 의미한다. 달리 명시하지 않는 한, 본원에 사용된 바와 같이, "결합 친화력(binding affinity)"은 결합 쌍(예를 들어, 항체 및 항원)의 구성원 간의 1:1 상호 작용을 반영하는 내인성(intrinsic) 결합 친화력을 나타낸다. 분자 Y와 그의 파트너 Y의 친화도는 일반적으로 해리 상수(Kd)로 나타낼 수 있다. 친화도는 본원에 기술된 것들을 포함하여 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 측정될 수 있다.
또한 본 명세서에서 용어, "인간 항체(human antibody)"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생성된 항체, 또는 인간 항체 레퍼토리(repertoires) 또는 다른 인간 항체 코딩 서열을 이용하는 비인간 근원으로부터 유래된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 보유한다. 인간 항체의 이러한 정의는 비인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화(humanized) 항체를 배제한다.
본 명세서에서 용어, "키메라 항체(chimeric antibody)"는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 근원(source) 또는 종(species)으로부터 유래되고, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지가 상이한 근원 또는 종에서 유래한 항체를 의미한다.
본 명세서에서 용어 "인간화 항체"는 비-인간(예를 들어, 마우스, 닭) 항체의 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메릭 면역글로불린, 그의 면역글로불린 쇄 또는 단편(예를 들어 Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원-결합 하위서열)이다. 대부분의 경우에, 인간화 항체는 수용자의 상보성-결정 영역(CDR)의 잔기가, 목적하는 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 비-인간 종(공여자 항체), 예를 들어 마우스, 닭, 랫트 또는 토끼의 CDR의 잔기에 의해 대체된 인간 면역글로불린(수용자 항체)이다.
또한, 인간화 항체는 수용자 항체에서도 또는 수입된 CDR 또는 프레임워크 서열에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 추가로 개선 및 최적화하기 위해 이루어진다. 일반적으로, 상기 인간화 항체는 적어도 하나, 및 전형적으로는 2개의 모든 가변 도메인을 포함할 것이며, 상기 도메인에서 상기 CDR 영역의 전부 또는 실질적 전부는 비-인간 면역글로불린의 CDR 영역에 상응하고, 상기 FR 영역의 전부 또는 실질적 전부는 인간 면역글로불린의 FR 영역의 서열을 가진다. 상기 인간화 항체는 면역글로불린 불변 영역(Fc region)에, 적어도 일부 또는 실질적인 인간 면역글로불린의 불변 영역(Fc region)서열을 포함한다.
상기 항체 또는 항원 결합 단편의 변이체는 "실질적 유사성"을 가지는 것으로, 2개의 펩타이드 서열이 디폴트 갭 가중치를 사용하는 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의해서와 같이 최적으로 정렬되는 경우에 적어도 약 90%의 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 95%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 공유함을 의미한다. 바람직하게는, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환에 의해 상이하다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 화학적 특성(예: 전하 또는 소수성)을 갖는 측쇄(R기)를 갖는 또 다른 아미노산 잔기에 의해 치환된 것이다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 단백질의 기능성을 실질적으로 변화시키지 않는다. 2개 이상의 아미노산 서열이 보존적 치환에 의해 서로 상이한 경우에, 유사성의 퍼센트 또는 정도는 치환의 보존적 성질을 보정하기 위해 상향 조절될 수 있다.
이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 갖으며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능적 균등물이라 할 수 있다.
변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스(hydropathic idex)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신(+4.5); 발린(+4.2); 루이신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글라이신(-0.4); 쓰레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 타이로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 라이신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5).
단백질의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ±2 이내, 보다 바람직하게는 ±1 이내, 보다 더 바람직하게는 ±0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에서 치환을 한다.
한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌(+3.0); 라이신(+3.0); 아스팔테이트(+3.0± 1); 글루타메이트(+3.0± 1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글라이신(0); 쓰레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5 ± 1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 루이신(-1.8); 아이소루이신(-1.8); 타이로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4).
친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ±2 이내, 보다 바람직하게는 ±1 이내, 보다 더 바람직하게는 ±0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에서 치환을 한다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.
본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 상술한 아미노산 서열에 대하여 소폭의 변화, 즉, 3차 구조 및 항체의 기능에 거의 영향을 미치지 않는 변형을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 따라서 어떤 구현예의 경우 상술한 서열과 일치하지 않더라도 적어도 100%, 93%, 95%, 96%, 97%, 또는 98% 이상의 유사성을 가질 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 상술한 서열의 CDR을 포함하는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 포함하는 단일클론 항체, 이중특이적 항체, 다중특이적 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단일 체인 항체(scFv), Fab 단편, F(ab')단편, 다이설파이드-결합 Fvs(sdFV) 및 항-이디오타입(항-Id) 항체, 그리고 상기 항체들의 에피토프-결합 단편 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 구체적인 구현예에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 포함되는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역은 (Gly-Ser)n, (Gly2-Ser)n, (Gly3-Ser)n 또는 (Gly4-Ser)n 등의 링커에 의해 연결된다. 여기서 n은 1 내지 6의 정수이고, 구체적으로는 3 내지 4이나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 scFv의 경쇄 가변영역 및 중쇄 가변영역은 예를 들어 다음의 배향으로 존재할 수 있다: 경쇄 가변영역-링커-중쇄 가변영역 또는 중쇄 가변영역-링커-경쇄 가변영역.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 API5에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다.
본 명세서에서 용어 "핵산 분자(nucleic acid molecule)"는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).
본 발명의 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 구성하는 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열인 것으로 족하며, 어느 특정 뉴클레오타이드 서열에 한정되지 않는다는 것은 당업자에게 자명하다.
이는 뉴클레오티드 서열의 변이가 발생하더라도 변이된 뉴클레오타이드 서열을 단백질로 발현하면 단백질 서열에서 변화를 가져오지 않는 경우도 있기 때문이다. 이를 코돈의 축퇴성이라고 한다. 따라서 상기 뉴클레오타이드 서열은 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈(예를 들어, 코돈의 축퇴성에 의해, 아르기닌 또는 세린에 대한 코돈은 여섯 개이다), 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 인코딩하는 본 발명의 핵산 분자는 이와 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인(align)하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60% 이상의 상동성(예컨대 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 또는 69%), 보다 구체적으로는 70% 이상의 상동성(예컨대 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 또는 79%), 보다 더 구체적으로는 80% 이상의 상동성(예컨대 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 또는 89%), 보다 더욱더 구체적으로는 90% 이상의 상동성(예컨대 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%), 가장 구체적으로는 95% 이상의 상동성(예컨대 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%)을 나타내는 서열을 의미한다. 상기 60% 이상 100% 이하의 모든 정수 및 이 사이에 존재하는 소수는 % 상동성과 관련하여 본 발명의 범위 내에 포함된다.
서열 비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10(1990))은 NBCI(National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blastn, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLAST는 ncbi 웹사이트의 BLAST 페이지를 통하여 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 ncbi 웹사이트의 BLAST help 페이지에서 확인할 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 본 발명의 API5에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 중쇄 CDR, 경쇄 CDR, 중쇄 가변영역, 경쇄 가변영역, 중쇄 및/또는 경쇄를 이루는 폴리펩티드와 이를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 본 명세서의 첨부된 서열목록에 수록되어 있다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 API5에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 명세서에서 용어 "벡터"는 전달 벡터와 발현 벡터를 포함한다.
본 명세서에서 용어 "전달 벡터"는 단리된 핵산을 포함하고 단리된 핵산을 세포 내부로 전달하는데 사용될 수 있는 물질의 조성을 지칭한다. 선형 폴리뉴클레오티드, 이온성 또는 양친매성 화합물과 연결된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드 및 바이러스를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 구체적으로 상기 전달 벡터는 자가 복제성 플라스미드 또는 바이러스를 포함한다. 상기 용어는 세포 내로의 핵산의 전이를 촉진시키는 비-플라스미드 및 비-바이러스성 화합물, 예컨대 폴리리신 화합물, 리포솜 등을 추가적으로 포함할 수 있는 것으로 해석되어야 한다. 바이러스성 전달 벡터는 아데노 바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어 "발현 벡터"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위하여, 발현시킬 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 발현 제어 서열을 포함하는 재조합 뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 지칭한다. 발현 벡터는 발현을 위한 충분한 시스 작용 인자(cis-acting element)를 포함하고, 발현을 위한 다른 요소는 숙주 세포 또는 시험관 내 발현 시스템에 의해 제공될 수 있다. 상기 발현 벡터는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드 벡터; 코즈미드 벡터; 그리고 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 벡터에서 상기 스위치 분자를 코딩하는 핵산 분자는 상기 벡터의 프로모터와 작동적으로 결합(operatively linked)되어 있다.
본 명세서에서 용어 "작동적으로 결합된"은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
본 발명의 재조합 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명의 벡터는 유전자 클로닝을 위한 벡터, 단백질의 발현을 위한 벡터, 또는 유전자의 전달을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터, beta-액틴 프로모터, 사람 헤로글로빈 프로모터 및 사람 근육 크레아틴 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터, HSV의 tk 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, HIV의 LTR 프로모터, 몰로니 바이러스의 프로모터 엡스타인 바 바이러스(EBV)의 프로모터 및 로우스 사코마 바이러스(RSV)의 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
본 발명의 벡터는 그로부터 발현되는 항체의 정제를 용이하게 하기 위하여, 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG(IBI, USA) 및 6x His(hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있다.
또한, 본 발명의 벡터에 의해 발현되는 단백질이 항체인 경우, 정제를 위한 추가적인 서열 없이도, 발현된 항체는 단백질 A 컬럼 등을 통하여 용이하게 정제할 수 있다.
한편, 본 발명의 발현 벡터는 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 및 이를 포함하는 CAR 폴리펩타이드의 발현을 평가하기 위한 선택표지로서 선택가능 마커 유전자 및/또는 리포터 유전자를 포함할 수 있다.
선택가능 마커 유전자로는 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 제네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다. 리포터 유전자로는 루시페라제, 베타-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제, 또는 녹색형광 단백질 유전자를 포함한다.
본 발명의 재조합 벡터를 세포 내로 도입하고 발현시키는 방법은 관련 기술분야에 잘 알려져 있다. 벡터는 당업계에 공지된 방법에 의해 숙주 세포, 예를 들어 포유동물, 박테리아, 효모, 또는 곤충 세포 내로 쉽게 도입될 수 있다. 예를 들면, 벡터는 물리적, 화학적, 또는 생물학적 수단에 의해 숙주 세포 내로 전달될 수 있다. 상기 물리적 수단은 인산칼슘 침전, 리포펙션, 입자 폭격(particle bombardment), 미세주입, 전기천공 등을 포함한다. 상기 화학적 수단은 콜로이드 분산액 시스템, 예컨대 거대분자 복합체, 나노 캡슐, 마이크로스피어, 비드, 및 수중유 에멀젼, 마이셀 (micelle), 혼합된 마이셀, 및 리포좀을 포함하는 지질-기반 시스템을 포함한다. 또한, 상기 생물학적 수단은 상술한 렌티바이러스, 레트로바이러스 등, DNA 또는 RNA 벡터의 사용을 포함한다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 재조합 벡터를 포함하는 분리된 숙주세포를 제공한다. 상기 숙주세포는 재조합 벡터에 의해 형질전환 되었다고 표현될 수 있다.
본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지되어 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, 상기 벡터의 적합한 진핵세포 숙주 세포는 이스트(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포, 원숭이 신장 세포7(COS7: monkey kidney cells), NSO 세포, SP2/0, 차이니즈 햄스터 난소(CHO: Chinese hamster ovary) 세포, W138, 어린 햄스터 신장(BHK: baby hamster kidney) 세포, MDCK, 골수종 세포주, HuT 78 세포 및 HEK-293 세포를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 용어 "형질전환 된", "형질도입 된" 또는 "형질감염 된"은 외인성 핵산이 숙주세포 내로 전달되거나 도입되는 과정을 지칭한다. "형질전환 된", "형질도입 된" 또는 "형질감염 된" 세포는 외인성 핵산으로 형질전환, 형질도입 또는 형질감염 된 세포이며, 상기 세포는 당해 세포 및 그의 계대배양으로 인한 자손 세포를 포함한다.
본 발명의 벡터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은, 숙주세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 침전법(Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기 천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법(Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 등에 의해 벡터를 숙주 세포 내로 주입할 수 있다.
본 발명에서 숙주세포 내에 포함된 재조합 벡터는 숙주 세포 내에서 재조합 된 상기의 항체 또는 항원 결합 단편, 또는 이를 포함하는 융합단백질을 발현할 수 있으며, 이러한 경우에는 다량의 항체 또는 항원 결합 단편, 또는 융합단백질을 얻게 된다. 예를 들어, 상기 발현 벡터가 lac 프로모터를 포함하는 경우에는 숙주 세포에 IPTG(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside)를 처리하여 유전자 발현을 유도할 수 있다.
상기 배양은 통상적으로 진탕 배양 또는 회전기에 의한 회전에 의한 것과 같은 호기성 조건하에서 행한다. 배양 온도는 바람직하게는 10 내지 40℃의 범위에서 행하고, 배양시간은 일반적으로 5 시간 내지 7 일간 행한다. 배지의 pH는 배양 중에서 바람직하게는 3.0 내지 9.0의 범위를 유지한다. 배지의 pH는 무기 또는 유기산, 알칼리 용액, 우레아, 칼슘 카보네이트, 암모니아 등으로 조절할 수 있다. 배양 중에는 필요한 경우 재조합 벡터의 유지 및 발현을 위해 암피실린, 스트렙토마이신, 클로람페니콜, 카나마이신 및 테트라사이클린과 같은 항생제를 첨가할 수 있다. 유도(induction) 가능한 프로모터를 갖는 재조합 발현 벡터로 형질전환 된 숙주세포를 배양하는 경우 필요하다면 배지에 적합한 유도제(inducer)를 첨가할 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터가 lac 프로모터를 함유하는 경우 IPTG를 첨가하고, trp 프로모터를 포함하는 경우 인돌아크릴산(indoleacrylic acid)을 배지에 첨가할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 API5에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 상술한 본 발명의 API5에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 상술한 본 발명의 API5에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 이용하기 때문에, API5의 고발현과 관련된 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
상기 API5의 고발현과 관련된 암은 항암 면역 내성암일 수 있다.
본 명세서에서 "항암 면역 내성암"은 "항암 면역치료 내성암"과 동일한 의미로 사용되며, 면역요법에 의한 항암치료 후 재발되어 내성이 생기고 면역억제능을 가진 암을 뜻한다. 상기 암의 종류로는 뇌종양, 척수종양, 망막 세포종, 구강암, 비강암, 부비동암, 인두암, 후두암, 경부암을 포함하는 두경부암; 피부암, 유방암, 갑상선암, 악성 부신 종양을 포함하는 내분비암; 폐암, 흉막 종양을 포함하는 호흡기암; 식도암, 위암, 소장의 악성 종양, 대장암, 항문암, 간암, 담도암, 췌장암을 포함하는 소화기암; 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 음경암을 포함하는 비뇨기암; 자궁경부암, 자궁체부암, 융모상피암, 난소암을 포함하는 부인암; 급성 또는 만성 백혈병, 악성림프종, 다발성 골수증을 포함하는 혈액암; 흑색종, 기저세포암, 편평상피세포암을 포함하는 피부암; 및 소아 백혈병 또는 소아 고형 종양을 포함하는 소아암; 등일 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 예컨대 정맥내 투여, 피하 투여, 근육 투여, 복강 내 투여, 척수강 내 투여, 뇌내 투여, 흉골내 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.0001-100 mg/kg이다. 본 명세서에서 용어 "약제학적 유효량"은 상술한 질환을 예방 또는 치료하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 명세서에서 용어 "예방"은 질환 또는 질환 상태의 방지 또는 보호적인 치료를 의미한다. 본 명세서에서 용어 "치료"는 질환 상태의 감소, 억제, 진정 또는 근절을 의미한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 좌제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 또한 상술한 유효성분 이외에 다른 약제학적 활성 약제 및 요법과 조합하여 사용될 수 있다. 상기 "조합"은 동시 또는 병용투여로 표현될 수 있다.
상기 본 발명의 약제학적 조성물과 조합하여 사용될 수 있는 치료제로는 당업계에 공지된 1 이상의 화학치료제(예컨대 아스파라기나제, 부설판, 카보플라틴, 시스플라틴, 다우노루비신, 독소루비신, 플루오로우라실, 겜시타빈, 하이드록시우레아, 메토트렉세이트, 파클리탁셀, 리툭시맙, 빈블라스틴, 빈크리스틴 등), 1 이상의 표적치료제(예컨대 베바시주맙(bevacizumab), 올라파립(olaparib) 등), PD-1/PD-L1 특이적인 면역관문 억제제(예컨대 옵디보, 키트루다)가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 약제학적 조성물을 치료가 필요한 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료방법을 제공한다.
본 발명의 치료방법의 대상 질병인 상기 암은 약학적 조성물의 치료 대상 질병과 관련하여 정의한 것과 같다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 대상체는 포유동물 또는 인간이다.
본 발명의 암의 치료방법은 상술한 약제학적 조성물을 대상체에 투여하는 방법이므로, 중복되는 내용에 대해서는 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명은 API5에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 및 이들의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 다양한 암종에서 발현이 증가되어 있는 API5에 특이적 결합이 확인되었는 바, 내성암 또는 항암 치료 후의 재발 또는 전이암의 치료 연구 등에 적용될 수 있다.
도 1은 API5 표적 항체 개발을 위한 인간화 항체 제작 과정 모식도를 나타낸다.
도 2a 및 도 2b는 인간 Fab 항체 단편 스크리닝을 통한 API5 표적 인간 항체 3F2 선별 결과를 나타낸다.
도 3a 및 도 3b는 본 발명의 API5 표적 인간 항체 3F2의 API5 단백질과의 결합력을 확인한 결과를 나타낸다.
도 4a 및 도 4b는 본 발명의 API5 항체 3F2 처리 시 면역치료 내성 유도 기전인 ERK의 활성(ERK 인산화)의 감소를 나타낸다.
도 5a 및 도 5b는 본 발명의 API5 항체 3F2 처리 시 내성암 세포의 T 세포 매개 세포사멸 증가를 나타낸다.
도 6a 및 도 6b는 본 발명의 API5 표적 항체 투여를 통한 항암 면역치료 내성암 치료 효과 확인 결과를 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예. API5에 특이적으로 결합하는 항체의 선별
<인간 Fab 합성 라이브러리를 이용한 API5 표적 인간 항체 선별>
API5에 결합하는 항체를 발굴하기 위하여, 도 1과 같이 인간 합성 Fab 파지 라이브러리(Human synthetic Fab phage library)를 사용하고 고정 항원으로 Expi293 세포(Thermo Fisher Scientific)에 API5 유전자 발현 벡터를 일시발현 후 정제한 API5 단백질을 사용하여 파지 디스플레이(phage display) 기술을 통해 API5와 결합능을 나타내는 항체를 선별하였다.
그 결과, 3F2로 명명한 Fab 항체 파지 클론이 선별되었다(표 1).
선별된 3F2 항체의 CDR(complementarity determining region) 서열
중쇄(Heavy chain) 경쇄(Light chain)
CDR1 GFTFSTYA (서열번호 1) QSISRY (서열번호 4)
CDR2 ISGSGGST (서열번호 2) AAS (서열번호 5)
CDR3 AKLVLEWQYFSMDH (서열번호 3) QQSYSFPWT (서열번호 6)
실험예 1. 3F2 항체의 정제 및 순도 확인
상기 실시예에서 선별된 3F2 항체의 물성 및 정제 순도를 SDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulfate Poly Acrylamide Gel Electrophoresis) 분석 및 SEC-HPLC(Size exclusion chromatography-High Performance Liquid Chromatography) 분석을 통해 확인하였다.
도 2a 및 2b에서 확인할 수 있듯이, 순도 약 99% 이상의 3F2 항체가 확인되었다.
실험예 2. 3F2 항체의 API5 단백질과의 결합 확인
상기 실시예에서 선별된 3F2 항체의 농도 3.125 nM부터 200 nM까지 단계 희석(serial dilution) 한 7개의 포인트와 0 nM를 포함한 총 8개의 포인트에서 ELISA를 이용해 Kd value를 분석하였다.
도 3a에서 확인할 수 있듯이, Kd(M) = 1.201x10-9 값의 결합력이 확인되었다.
다음으로, 상기 실시예에서 선별된 3F2 항체의 농도 3.125 nM부터 100 nM까지 단계 희석 한 6개의 포인트와 0 nM를 포함한 총 7개의 포인트에서 SPR(Surface plasmon resonance, Biacore) Biacore T200 장비를 이용해 Kd value를 분석하였다.
도 3b에서 확인할 수 있듯이, Kd(M) = 4.620x10-9 값의 결합력이 확인되었다.
실험예 3. ( in vitro ) 3F2 항체 처리에 따른 내성 유도 기전(ERK)의 활성(ERK 인산화) 감소 확인
상기 실시예에서 선별된 3F2 항체(0, 0.2, 1, 5 및 25 ng/ml)를 PD-1/PD-L1 항체치료 내성암 모델인 CT26 P3(대장암) 혹은 TC-1 LP3(폐암) 암세포주에 처리 후, Western blot 실험을 통해 ERK 인산화 수준을 확인하였다.
도 4a 및 4b에서 확인할 수 있듯이, 3F2 항체 처리 농도 증가 의존적으로 ERK 인산화가 감소되었으며, 25 ng/ml 농도에서 0 ng/ml 대비 CT26 P3 세포에서는 약 5배, TC-1 LP3 세포에서는 약 10배 감소하였다.
실험예 4. ( in vitro ) 3F2 항체 처리에 따른 내성암 세포의 T 세포 매개 세포사멸 증가 확인
항암면역치료 내성 표현형인 T 세포 매개 세포사멸에 대한 저항성 억제 효능을 확인하기 위하여, CT26 P3 또는 TC-1 LP3 세포주에 상기 실시예에서 선별된 3F2 항체를 10 ng/ml 농도로 24 시간 처리하였다. 그 다음, T 세포 매개 세포사멸 유도의 주요 기능 단백질인 Granzyme B를 BioPORTER lipid 기반 전달기법을 이용하여 상기 CT26 P3 또는 TC-1 LP3 세포주에 전달하였다. 약 4~6시간 후 flow cytometry 장비를 통한 세포 내 active-caspase-3 수준 분석을 통하여 암세포의 세포사멸 정도를 확인하였다.
도 5a 및 5b에서 확인할 수 있듯이, 3F2 항체 처리 시 CT25 P3 또는 TC-1 LP0 세포의 세포사멸이 IgG 처리 세포 대비 약 3배 증가함이 확인되었다.
실험예 5. ( in vivo ) 3F2 항체 투여를 통한 내성암 치료 효과 확인
먼저, balb/c 마우스(오리엔트바이오)에 피하로 마우스 1두당 1x105의 CT26 P3 종양세포를 접종하고, 8일차부터 3일 간격으로 상기 실시예에서 선별된 3F2 항체(200 ug/100 ul) 200 ug를 4회 복강주사 하였다(도 6a 참조).
다음으로, C57bl/6 마우스(오리엔트바이오)의 폐에 마우스 1두당 5x104의 TC-1 LP3 종양세포를 주입하고, 3일차부터 2일 간격으로 상기 실시예에서 선별된 3F2 항체(200 ug/100 ul) 200 ug를 4회 복강주사 하였다(도 6b 참조).
도 6a 및 6b에서 확인할 수 있듯이, CT26 P3 종양세포 주입 20일 후 3F2 항체 처리 시 IgG 대조군 대비 종양의 체적이 약 10배 가까이 감소함이 확인되었다. 또한 TC-1 LP3 종양세포 주입 15일 후 3F2 항체 처리 시 4마리 중 3마리의 종양이 치료됨이 확인되었다.
<110> Korea University Research and Business Foundation Osong Medical Innovation Foundation <120> Antibody specifically binding to API5 and Uses thereof <130> PN210260 <160> 18 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> API5 HCDR1 <400> 1 Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ala 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> API5 HCDR2 <400> 2 Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr 1 5 <210> 3 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> API5 HCDR3 <400> 3 Ala Lys Leu Val Leu Glu Trp Gln Tyr Phe Ser Met Asp His 1 5 10 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> API5 LCDR1 <400> 4 Gln Ser Ile Ser Arg Tyr 1 5 <210> 5 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> API5 LCDR2 <400> 5 Ala Ala Ser 1 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> API5 LCDR3 <400> 6 Gln Gln Ser Tyr Ser Phe Pro Trp Thr 1 5 <210> 7 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> API5 VH <400> 7 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Leu Val Leu Glu Trp Gln Tyr Phe Ser Met Asp His Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 8 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> API5 VL <400> 8 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Arg Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Phe Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> API5 HCDR1 <400> 9 ggttttactt tctctactta tgca 24 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> API5 HCDR2 <400> 10 atctctggtt ctggtggttc tact 24 <210> 11 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> API5 HCDR3 <400> 11 gccaaactgg ttctggaatg gcagtacttc tctatggatc at 42 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> API5 LCDR1 <400> 12 cagtctatct ctcgttac 18 <210> 13 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> API5 LCDR2 <400> 13 gcagcatcc 9 <210> 14 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> API5 LCDR3 <400> 14 cagcaatctt actcttttcc gtggacg 27 <210> 15 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> API5 VH <400> 15 gaagtacagt tggtcgaaag tggcggtggc ctcgtgcaac cgggtggttc actgcgtctg 60 agctgcgccg cctcgggttt tactttctct acttatgcaa tgtcttgggt tcgtcaggcg 120 ccgggcaagg gtctcgaatg ggtttcagca atctctggtt ctggtggttc tacttactat 180 gccgattcag tgaagggtcg ctttaccatt tcccgtgaca actctaagaa tactctgtat 240 ctgcagatga actcgctgcg tgccgaagac acggccgtct attattgcgc caaactggtt 300 ctggaatggc agtacttctc tatggatcat tggggtcagg gcactttagt gaccgtctca 360 tcg 363 <210> 16 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> API5 VL <400> 16 gacattcaaa tgacgcagag tccctcctca ctgagtgcta gcgtgggcga tcgtgtgaca 60 attacttgtc gcgctagcca gtctatctct cgttacctga actggtatca gcagaaaccg 120 ggcaaggcgc caaaattgct gatttacgca gcatccactc tgcagtctgg tgtaccgtcc 180 cgtttctctg gcagcggttc tggtacggat tttaccctga ccatctcaag cctccagcct 240 gaagattttg ccacctatta ttgtcagcaa tcttactctt ttccgtggac gttcgggcag 300 ggaactaaag tggaaattaa a 321 <210> 17 <211> 504 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human API5 <400> 17 Met Pro Thr Val Glu Glu Leu Tyr Arg Asn Tyr Gly Ile Leu Ala Asp 1 5 10 15 Ala Thr Glu Gln Val Gly Gln His Lys Asp Ala Tyr Gln Val Ile Leu 20 25 30 Asp Gly Val Lys Gly Gly Thr Lys Glu Lys Arg Leu Ala Ala Gln Phe 35 40 45 Ile Pro Lys Phe Phe Lys His Phe Pro Glu Leu Ala Asp Ser Ala Ile 50 55 60 Asn Ala Gln Leu Asp Leu Cys Glu Asp Glu Asp Val Ser Ile Arg Arg 65 70 75 80 Gln Ala Ile Lys Glu Leu Pro Gln Phe Ala Thr Gly Glu Asn Leu Pro 85 90 95 Arg Val Ala Asp Ile Leu Thr Gln Leu Leu Gln Thr Asp Asp Ser Ala 100 105 110 Glu Phe Asn Leu Val Asn Asn Ala Leu Leu Ser Ile Phe Lys Met Asp 115 120 125 Ala Lys Gly Thr Leu Gly Gly Leu Phe Ser Gln Ile Leu Gln Gly Glu 130 135 140 Asp Ile Val Arg Glu Arg Ala Ile Lys Phe Leu Ser Thr Lys Leu Lys 145 150 155 160 Thr Leu Pro Asp Glu Val Leu Thr Lys Glu Val Glu Glu Leu Ile Leu 165 170 175 Thr Glu Ser Lys Lys Val Leu Glu Asp Val Thr Gly Glu Glu Phe Val 180 185 190 Leu Phe Met Lys Ile Leu Ser Gly Leu Lys Ser Leu Gln Thr Val Ser 195 200 205 Gly Arg Gln Gln Leu Val Glu Leu Val Ala Glu Gln Ala Asp Leu Glu 210 215 220 Gln Thr Phe Asn Pro Ser Asp Pro Asp Cys Val Asp Arg Leu Leu Gln 225 230 235 240 Cys Thr Arg Gln Ala Val Pro Leu Phe Ser Lys Asn Val His Ser Thr 245 250 255 Arg Phe Val Thr Tyr Phe Cys Glu Gln Val Leu Pro Asn Leu Gly Thr 260 265 270 Leu Thr Thr Pro Val Glu Gly Leu Asp Ile Gln Leu Glu Val Leu Lys 275 280 285 Leu Leu Ala Glu Met Ser Ser Phe Cys Gly Asp Met Glu Lys Leu Glu 290 295 300 Thr Asn Leu Arg Lys Leu Phe Asp Lys Leu Leu Glu Tyr Met Pro Leu 305 310 315 320 Pro Pro Glu Glu Ala Glu Asn Gly Glu Asn Ala Gly Asn Glu Glu Pro 325 330 335 Lys Leu Gln Phe Ser Tyr Val Glu Cys Leu Leu Tyr Ser Phe His Gln 340 345 350 Leu Gly Arg Lys Leu Pro Asp Phe Leu Thr Ala Lys Leu Asn Ala Glu 355 360 365 Lys Leu Lys Asp Phe Lys Ile Arg Leu Gln Tyr Phe Ala Arg Gly Leu 370 375 380 Gln Val Tyr Ile Arg Gln Leu Arg Leu Ala Leu Gln Gly Lys Thr Gly 385 390 395 400 Glu Ala Leu Lys Thr Glu Glu Asn Lys Ile Lys Val Val Ala Leu Lys 405 410 415 Ile Thr Asn Asn Ile Asn Val Leu Ile Lys Asp Leu Phe His Ile Pro 420 425 430 Pro Ser Tyr Lys Ser Thr Val Thr Leu Ser Trp Lys Pro Val Gln Lys 435 440 445 Val Glu Ile Gly Gln Lys Arg Ala Ser Glu Asp Thr Thr Ser Gly Ser 450 455 460 Pro Pro Lys Lys Ser Ser Ala Gly Pro Lys Arg Asp Ala Arg Gln Ile 465 470 475 480 Tyr Asn Pro Pro Ser Gly Lys Tyr Ser Ser Asn Leu Gly Asn Phe Asn 485 490 495 Tyr Glu Arg Ser Leu Gln Gly Lys 500 <210> 18 <211> 504 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> rhAPI5 <400> 18 Met Pro Thr Val Glu Glu Leu Tyr Arg Asn Tyr Gly Ile Leu Ala Asp 1 5 10 15 Ala Thr Glu Gln Val Gly Gln His Lys Asp Ala Tyr Gln Val Ile Leu 20 25 30 Asp Gly Val Lys Gly Gly Thr Lys Glu Lys Arg Leu Ala Ala Gln Phe 35 40 45 Ile Pro Lys Phe Phe Lys His Phe Pro Glu Leu Ala Asp Ser Ala Ile 50 55 60 Asn Ala Gln Leu Asp Leu Cys Glu Asp Glu Asp Val Ser Ile Arg Arg 65 70 75 80 Gln Ala Ile Lys Glu Leu Pro Gln Phe Ala Thr Gly Glu Asn Leu Pro 85 90 95 Arg Val Ala Asp Ile Leu Thr Gln Leu Leu Gln Thr Asp Asp Ser Ala 100 105 110 Glu Phe Asn Leu Val Asn Asn Ala Leu Leu Ser Ile Phe Lys Met Asp 115 120 125 Ala Lys Gly Thr Leu Gly Gly Leu Phe Ser Gln Ile Leu Gln Gly Glu 130 135 140 Asp Ile Val Arg Glu Arg Ala Ile Lys Phe Leu Ser Thr Lys Leu Lys 145 150 155 160 Thr Leu Pro Asp Glu Val Leu Thr Lys Glu Val Glu Glu Leu Ile Leu 165 170 175 Thr Glu Ser Lys Lys Val Leu Glu Asp Val Thr Gly Glu Glu Phe Val 180 185 190 Leu Phe Met Lys Ile Leu Ser Gly Leu Lys Ser Leu Gln Thr Val Ser 195 200 205 Gly Arg Gln Gln Leu Val Glu Leu Val Ala Glu Gln Ala Asp Leu Glu 210 215 220 Gln Thr Phe Asn Pro Ser Asp Pro Asp Cys Val Asp Arg Leu Leu Gln 225 230 235 240 Cys Thr Arg Gln Ala Val Pro Leu Phe Ser Lys Asn Val His Ser Thr 245 250 255 Arg Phe Val Thr Tyr Phe Cys Glu Gln Val Leu Pro Asn Leu Gly Thr 260 265 270 Leu Thr Thr Pro Val Glu Gly Leu Asp Ile Gln Leu Glu Val Leu Lys 275 280 285 Leu Leu Ala Glu Met Ser Ser Phe Cys Gly Asp Met Glu Lys Leu Glu 290 295 300 Thr Asn Leu Arg Lys Leu Phe Asp Lys Leu Leu Glu Tyr Met Pro Leu 305 310 315 320 Pro Pro Glu Glu Ala Glu Asn Gly Glu Asn Ala Gly Asn Glu Glu Pro 325 330 335 Lys Leu Gln Phe Ser Tyr Val Glu Cys Leu Leu Tyr Ser Phe His Gln 340 345 350 Leu Gly Arg Lys Leu Pro Asp Phe Leu Thr Ala Lys Leu Asn Ala Glu 355 360 365 Lys Leu Lys Asp Phe Lys Ile Arg Leu Gln Tyr Phe Ala Arg Gly Leu 370 375 380 Gln Val Tyr Ile Arg Gln Leu Arg Leu Ala Leu Gln Gly Lys Thr Gly 385 390 395 400 Glu Ala Leu Lys Thr Glu Glu Asn Lys Ile Lys Val Val Ala Leu Lys 405 410 415 Ile Thr Asn Asn Ile Asn Val Leu Ile Lys Asp Leu Phe His Ile Pro 420 425 430 Pro Ser Tyr Lys Ser Thr Val Thr Leu Ser Trp Lys Pro Val Gln Lys 435 440 445 Val Glu Ile Gly Gln Lys Arg Ala Ser Glu Asp Thr Thr Ser Gly Ser 450 455 460 Pro Pro Lys Lys Ser Ser Ala Gly Pro Lys Arg Asp Ala Arg Gln Ile 465 470 475 480 Tyr Asn Pro Pro Ser Gly Lys Tyr Ser Ser Asn Leu Gly Asn Phe Asn 485 490 495 Tyr Glu Arg Ser Leu Gln Gly Lys 500

Claims (12)

  1. Apoptosis inhibitor protein 5(API5)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 상기 API5에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은,
    a) 서열번호 1로 표시되는 HCDR1, 서열번호 2로 표시되는 HCDR2, 및 서열번호 3으로 표시되는 HCDR3를 포함하는 중쇄 가변영역; 및
    b) 서열번호 4로 표시되는 LCDR1, 서열번호 5로 표시되는 LCDR2, 및 서열번호 6으로 표시되는 LCDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편인, 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  3. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열번호 7로 표시되는 중쇄 가변영역 및 서열번호 8로 표시되는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편인, 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  4. 제1항에 있어서, 상기 API5는 인간 유래 API5 단백질 또는 마우스 유래 API5 단백질인, 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  5. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 가변영역의 프레임워크 서열은 인간 유래 프레임워크(framework) 서열로부터 유래하는 것인, 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  6. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 상기 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 포함하는 인간화 항체 또는 이들의 항원 결합 단편인, 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자.
  8. 제7항의 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터.
  9. 제8항의 재조합 벡터를 포함하는 숙주세포.
  10. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 API5에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 및 약제학적으로 허용되는 담체;를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 암은 항암 면역 내성암인, 약제학적 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 암은 뇌종양, 척수종양, 망막 세포종, 구강암, 비강암, 부비동암, 인두암, 후두암, 경부암, 피부암, 유방암, 갑상선암, 악성 부신 종양, 폐암, 흉막 종양, 식도암, 위암, 소장의 악성종양, 대장암, 항문암, 간암, 담도암, 췌장암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 음경암, 자궁경부암, 자궁체부암, 융모상피암, 난소암, 급성 또는 만성 백혈병, 악성림프종, 다발성 골수증, 흑색종, 기저세포암, 편평상피세포암, 소아 백혈병 또는 소아 고형 종양으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 암인, 약제학적 조성물.
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