CN114480408A

CN114480408A - Rhx6基因以及其在制备抗乳腺癌药物中的应用

Info

Publication number: CN114480408A
Application number: CN202210146866.8A
Authority: CN
Inventors: 李鲁远; 纪仁鹏
Original assignee: Nankai University
Current assignee: Nankai University
Priority date: 2022-02-17
Filing date: 2022-02-17
Publication date: 2022-05-13
Anticipated expiration: 2042-02-17
Also published as: CN114480408B

Abstract

本发明提供了RHX6基因以及其在制备抗乳腺癌药物中的应用，其CDS区域的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所述的RHX6基因存在于真核生物体内，并对乳腺癌细胞的增殖、迁移及EMT有抑制作用。

Description

RHX6基因以及其在制备抗乳腺癌药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，尤其是涉及RHX6基因以及其在制备抗乳腺癌药物中的应用。

背景技术

Human rhomboid family-1(RHBDF1)是菱形家族的成员。这个多跨膜蛋白家族的成员可以分为两组。一类如果蝇中的原型rhomboid-1，可以通过蛋白水解处理pro-EGF，而另一类，包括RHBDF1，在蛋白水解上没有活性，因此被称为inactive rhomboids。据报道，RHBDF1促进TGFα的分泌，TGFα是一种表皮生长因子(EGF)样配体，可激活一种重要的致癌基因，表皮生长因子受体(EGFR)。有趣的是，RHBDF1激活的TGFα-EGFR信号是G蛋白偶联受体(GPCR)激活依赖性的。RHBDF1促进前TGFα从内质网运输到细胞质膜，这一过程涉及形成网格蛋白包被的囊泡(CCV)。RHBDF1功能对上皮癌细胞的存活至关重要，RHBDF1基因沉默可抑制异种移植肿瘤的生长并导致上皮癌细胞凋亡或自噬。此外，RHBDF1是细胞对缺氧反应的细胞存活机制的重要组成部分。RHBDF1、RACK1和HSP90形成一个“分子开关”，控制HIF1α的非氧依赖性降解。据报道，RHBDF1还在小鼠胚胎发育和癌症易感综合征期间的信号传导中发挥重要作用，以及充当内质网应激下的蛋白酶体活性调节剂。最近我们报道了RHBDF1促进AP-1激活相关的内皮间充质转化。因此，这种多功能基因的表达调控机制值得进一步研究。

发明内容

有鉴于此，本发明旨在克服现有技术中的缺陷，提出RHX6基因以及其在制备抗乳腺癌药物中的应用。

为达到上述目的，本发明创造的技术方案是这样实现的：

为实现本发明的技术目的，本发明第一方面提供一种RHX6基因，其CDS区域的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

为实现本发明的技术目的，本发明第二方面一种RHX6基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

为实现本发明的技术目的，本发明第三方面提供一种扩增RHX6基因的CDS区域的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3-4所示。

为实现本发明的技术目的，本发明第四方面提供一种RHX6基因的qPCR的特异性引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5-6所示。

为实现本发明的技术目的，本发明第五方面提供一种含有上述RHX6基因重组载体。

为实现本发明的技术目的，本发明第六方面提供一种上述基因、蛋白或重组载体的制备抗乳腺癌药物中的应用，

优选的，上述应用为S1)或S2)或S3)：

S1)制备抑制乳腺癌细胞增殖的药物的应用；

S2)制备抑制乳腺癌细胞迁移的药物的应用；

S3)制备抑制乳腺癌细胞EMT(上皮细胞-间充质转化)药物的应用。

相对于现有技术，本发明创造具有以下优势：

本发明所述的RHX6基因存在于真核生物体内，并对乳腺癌细胞的增殖、迁移及EMT有抑制作用。

附图说明

图1为RHX6存在性及细胞和组织中表达情况，其中(A)RHX6鉴定。泳道1：RHX6特异性产物；泳道2：pMD-19T载体；泳道3：pMD-19T与RHX6特异产物构建的质粒。(B)特异性产物测序与数据库比对；(C)与MCF-10A细胞相比，MCF-7，MDA-MB-231，T47D细胞中RHX6 mRNA表达(三个重复孔；实验重复2次)；肿瘤组织与邻近正常组织中RHX6 mRNA表达(临床标本数n＝6；实验重复2次)，Data are mean±SD.*P<0.05,**P<0.01(Student's t test)。

图2为RHX6表达质粒构建及验证图，其中(A)表达质粒菌液PCR图(B)RHX6表达质粒构建验证和限制性内切酶酶切验证；泳道1：pEGFP-C2载体；Lane2：RHX6 CDS区PCR产物；泳道3：RHX6表达质粒；(C)泳道1：XhoI单酶切验证；Lane2：Acc65I单酶切验证；泳道3：XhoI、Acc65I双酶切验证。(D)CDS区产物测序与数据库比对；

图3为RHX6表达质粒在细胞内可以表达图，其中(A)转染载体和RHX6的293T细胞的荧光表达；(B)转染对照、载体和RHX6的各组中RHX6的表达；泳道1：未处理；Lane2：转染pEGFP-C2载体；泳道3：转染RHX6质粒；

图4为RHX6可以抑制乳腺癌细胞增殖图，其中(A)用载体或RHX6转染MCF-7,MDA-MB-231和T47D细胞中集落形成的百分比(显示了整个板的图像；实验重复两次)；(B)用载体或RHX6转染MCF-7,MDA-MB-231和T47D细胞中的OD值(一式三份；实验重复两次)；Data aremean±SD.*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001(Student's t test)；

图5为RHX6可以抑制乳腺癌细胞迁移图，其中(A)转染载体或RHX6的MCF-7，MDA-MB-231，T47D细胞创面闭合率；比例尺，100μm；(实验重复两次)；(B)MCF-7，MDA-MB-231，T47D细胞转染载体或RHX6穿过滤膜的细胞数；比例尺，100μm；(实验重复两次)；Data aremean±SD.*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001(Student's t test)；

图6为RHX6可以抑制乳腺癌细胞EMT E-cadherin和Vimentin在转染载体或RHX6的MCF-7细胞中的蛋白表达(实验重复两次)。

具体实施方式

除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明创造所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下面结合实施例来详细说明本发明创造。

一、质粒构建及验证

1.目的片段扩增

(1)根据RHX6基因的特异性序列和代表表达基因全长的CDS区，设计特异区的引物(Forward primer:TTCTTTGCCCGGGTATCCTCCA；Reverse primer:TCAGTGGAGCTGAGCGTCCA)及能够扩增全长的带有XhoI和ACC65I双酶切位点的引物(Forward primer:CCGCTCGAGCATGCTGCCCTTGGAGCGAGG；Reverse primer:CGCGGTA CCTCAGTGGAGCT GAGCGTCCAGTT)；

(2)培养人乳腺上皮细胞(MCF-10A)，待状态良好时，收Trizol样品，提取RNA，反转录成cDNA；

(3)按照下表添加成分，进行目的基因扩增，扩增体系为50μL，PCR反应的条件为94℃预变性3min；94℃，30s；60℃，20s；72℃，1min共35个循环，72℃延伸10min，最后4℃保存。

试剂名称	用量
		cDNA	200ng
正向引物(10μM)	3μL
		反向引物(10μM)	3μL
高保真酶	25μL
		dd H<sub>2</sub>O	补足至50μL

2、特异性产物末端加A

特异区的引物扩增出的产物中加入0.5μL qpcr的MIX酶，72℃ 30min

3、核酸凝胶电泳

在两种PCR产物中分别加入10×loading buffer后上样，并在一侧空泳道中加入DNA Marker，按照100v，40min，进行凝胶电泳。

4、目的片段的胶回收

(1)电泳结束后，将凝胶取出，利用凝胶成像仪拍照，确认目的条带分子量大小。

(2)带上护目镜，在有防护的紫外灯下，用干净的刀片将DNA条带从琼脂糖凝胶上切下，尽量去掉不含DNA片段的杂胶，使切下的凝胶质量要尽量小一点。

(3)将切下的凝胶装入一个干净的1.5mL的EP管中，进行凝胶称重，在装入凝胶之前先把空管称重。

(4)加入三倍质量的溶胶buffer，以100mg的质量为100μL，如果凝胶的浓度大于2％，加入六倍体积的buffer。

(5)装有凝胶的EP管置于56℃的金属浴中10min，在这期间要上下混匀二到三次，确保凝胶溶解完全。

(6)EP管取下放置室温，把得到的液体加入到吸附管中，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体。

(7)把吸附管重新置于收集管中，加入600μL的漂洗液，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体。

(8)重复上述步骤，倒掉收集管中的液体。

(9)将吸附管重新置于收集管中，12000rpm室温离心2min，进一步去除吸附管中残留的液体。

(10)取出吸附管置于干净的EP管中，室温晾1min，加入合适体积的洗脱液，12000rpm离心1min。

(11)Nanodrop测回收的DNA浓度。

5、CDS区产物目的片段与载体质粒的双酶切

按照下表用量，加入各个组分，50μL的双酶切体系在37℃，酶切1h，85℃酶灭活10min。

试剂名称	用量
		10×1:3buffer	5μL
XhoI	1μL
		ACC65I	1μL
pEGFP-C2质粒/目的片段	1μg
		dd H<sub>2</sub>O	补足至50μL

6、酶切后凝胶电泳以及胶回收

(1)将酶切后的质粒和目的片段分别加入10×loading buffer后进行琼脂糖凝胶上样，并在一侧空泳道中加入DNA Marker，100v，40min，进行凝胶电泳

(2)按照上述方法进行胶回收，并测最终收获质粒和目的片段的浓度。

7、目的片段与质粒的连接

按照下表用量，加入各个组分，PCR仪中16℃连接过夜。其中目的片段：质粒≈3:1(摩尔比)。CDS区产物与pEGFP-C2载体连接；特异性产物与T载体连接。

8、连接质粒的转化

(1)把置于-80℃的感受态Ecoli DH5α拿出，置于冰上融化。

(2)待融化后加入过夜连接的质粒，加入的体积不超过感受态体积的1/10，轻轻的用移液枪搅动混匀，冰上放置30min。

(3)30min后，把EP管置于42℃的金属浴中，热激1min，迅速取出放置在冰上2min。

(4)EP管中加入500μL的无卡那的LB液体培养基，200rpm，37℃培养1h，使感受态细胞复苏，表达卡那抗性基因。

(5)2000rpm，室温离心5min，移去部分上清，用移液枪充分混合均匀，在无菌操作台上把菌液均匀涂布在卡那平板上，涂布完成后，把平板室温正置放一会，将其转移到37℃培养箱，倒置过夜培养，大概12-16h。

9、质粒克隆的初步鉴定

Ⅰ.菌落PCR鉴定

(1)挑取单菌落，置于装有1mL LB培养基的1.5mL的EP管中进行摇菌，8h左右；

(2)LB培养基浑浊后，直接用菌液进行PCR扩增，按照下表用量，加入各个组分，PCR扩增体系为50μL，PCR反应的条件为94℃预变性3min；94℃，30s；60℃，20s；72℃，1min共35个循环，72℃延伸10min，最后4℃保存。

(3)通过琼脂糖凝胶电泳，检测PCR片段的大小，对比目的片段的大小初步判断质粒是否连接成功。

Ⅱ.CDS区质粒双酶切鉴定

(1)将菌落PCR鉴定条带位置正确的菌液扩大培养，用试管摇8mL的菌液(带卡那的LB培养基)，230rpm，37℃培养16h。

(2)对菌液进行离心，12000rpm，2min。

(3)移去上清，尽量除尽残液，加入试剂盒中的P1溶液，然后用移液枪吹打，使细菌与P1溶液混合均匀。

(4)加入250μL P2溶液进行细胞裂解，轻微的上下颠倒离心管4-6次，直到溶液变的澄清，应注意裂解的时间不要超过5min，这时可以看到溶液变成蓝色。

(5)加入350μL N3溶液，上下翻转离心管4-6次，这时可以看到溶液由蓝色变成无色，13000rpm，室温离心10min。

(6)把吸附柱装入收集管中，转移上清至吸附柱中，尽量不要碰到底部的沉淀，13000rpm，室温离心1min。

(7)倒掉收集管中的残液，往吸附柱中加入500μL的PB溶液，13000rpm，室温离心1min。

(8)倒掉收集管中的残液，在吸附柱中加入750μL的PE溶液，13000rpm，室温离心1min。

(9)倒掉废液，把吸附柱放入收集管中，13000rpm，室温离心2min。

(10)把吸附柱置于干净的1.5mL的离心管中，室温干燥2-5min。

(11)加入50μL提前55℃预热的洗脱液EB，室温放置2min，13000rpm，室温离心1min，为了使洗脱更加充分，把离心管中洗脱下来的液体重新加入吸附柱中，13000rpm，室温离心1min；

(12)Nanodrop测质粒浓度，﹣20℃保存质粒溶液，备用。

(13)按照下表用量，加入各个组分，50μL的双酶切体系在37℃，酶切1h，85℃酶灭活10min。

试剂名称	用量
		10×1:3buffer	5μL
XhoI	1μL
		ACC65I	1μL
质粒	1μg
		dd H<sub>2</sub>O	补足至50μL

(14)将单酶切或双酶切后的质粒分别加入10×loading buffer后进行琼脂糖凝胶上样，并在一侧空泳道中加入DNA Marker，100v，40min，进行凝胶电泳

(15)电泳结束后，将凝胶取出，利用凝胶成像仪拍照，确认目的条带分子量大小。

10、质粒的测序验证

取出部分菌液PCR和双酶切鉴定都正确的菌液，送测序公司进行测序，测序结果通过pubmed中的blast功能进行比对。

二、qPCR

RHX6特异性引物：Forward primer:CCGTTAGGGATGGCACC TTT；Reverse primer:ATGGAGGATACCCGGGCAAA。

按照下表配置PCR混合液成分

(1)：94℃预变性2min；

(2)：94℃变性20s：高温的条件下双链DNA发生变性，解链之后形成两条单链DNA；

(3)：60℃退火20s：降低温度使模板与引物结合，形成局部杂交链；

(4)：72℃延伸20s：以DNA聚合酶与四种dNTP(dATP，dGTP，dTTP和dCTP)作为原料，在Mg²⁺存在下，按照引物的5′→3′的方向延伸，与模板互补的DNA链便得以合成；

(5)重复2、3、4步骤，扩增的循环数为40。

三、细胞转染

1.调整细胞密度到60-70％，且状态良好，细胞质和细胞核相对干净，并且在培养基中没有细胞外泌的颗粒物质存在。

2.转染前在细胞中加入800μL新鲜基础培养基，且不含抗生素。

3.在两个高压处理过的1.5mL离心管中各加入100μL的Opti-MEM，随后各加入2.5ug的质粒和7.5μL的lipofectamine 2000(以六孔板为例)，轻轻弹匀两个离心管，并在室温条件下静置5min。

4.将两个离心管中的液体混合，并室温静置15min。

5.轻轻吸取上述混合液200μL，均匀滴加入细胞培养基中。转染6h后要更新2ML完全培养基。

6.随时观察状态，如果状态不佳，要及时换液。

7. 48-72h以后利用转染过的细胞进行后续实验。

四、细胞划痕迁移实验

1.培养板划线

首先使用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀的划横线，大约每隔0.5-1cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过5条线。划线时注意线不要太粗。

2.细胞转染

按照二中细胞转染方式分别转染空载体pEGFP-C2和表达质粒pEGFP-C2-RHX6。

3.细胞划线

48h后用枪头或者无菌牙签，垂直与细胞平面，沿着第一天划在平板背面的线在细胞层上进行划痕(不同孔之间最好使用同一只枪头或牙签)。

4.洗细胞

划痕完成后，使用无菌PBS洗细胞3次，洗去不贴壁的细胞，即划线时划线的细胞，是划线后留下的间隙清晰可见，然后更换新鲜无血清培养基。

5.细胞培养、观察

将细胞放入37℃5％CO₂培养箱，培养。然后24h后取出细胞，显微镜线观察并拍照。

6.ImageJ分析伤口愈合率。

五、细胞transwell实验

1.按照二中细胞转染方式分别转染空载体pEGFP-C2和表达质粒pEGFP-C2-RHX6，48h后，胰酶消化，用基础培养基制成适宜浓度细胞悬液。

2.取1中细胞悬液200μl加入Transwell小室。

3. 12孔板下室加入700μl含FBS的培养基，将小室放于12孔板中，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板，放入培养箱内培养。

4. 24h后取出小室用棉签擦去PVPF膜靠近内室那一面的细胞，另一面的细胞用4％多聚甲醛室温固定30分钟，0.1％结晶紫染色20分钟，用PBS洗3遍以上，移到空的24孔板后在显微镜下观察细胞，记数。

六、细胞平板克隆实验

1.按照二中细胞转染方式分别转染空载体pEGFP-C2和表达质粒pEGFP-C2-RHX6，48h后，胰酶消化。

2.利用完全培养基重悬沉淀，并进行细胞计数，

3.每个六孔板中加入400个细胞，37℃，5％的CO₂培养条件下培养14天(每隔72h补加一次质粒)。

4. 14天后，利用预冷的PBS洗细胞3次，随后加入4％多聚甲醛室温固定30min。

5.吸出4％多聚甲醛，加入0.1％结晶紫，室温染色30min。

6.利用PBS洗细胞3次，于烘箱烘干。

7.统计克隆数量。克隆形成率＝克隆总数(每孔)/细胞数总数(每孔)×100％

七、CCK8实验

1.按照二中细胞转染方式分别转染空载体pEGFP-C2和表达质粒pEGFP-C2-RHX6，96孔板转染试剂量为的1.5mL离心管中各加入20μL的Opti-MEM，随后各加入0.2ug的质粒和0.5μL的lipofectamine 2000。96孔板细胞中加入60μL基础培养基和40μL混合液。

2. 72h后向每孔加入10μL CCK-8溶液(注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数)。

3.将培养板在培养箱内孵育4小时。

4.用酶标仪测定在450nm处的吸光度。

八、Western blot实验检测EMT指标

1.按照二中细胞转染方式分别转染空载体pEGFP-C2和表达质粒pEGFP-C2-RHX6。

2.细胞裂解。72h后取出细胞后利用PBS清洗细胞三次，最后一次将残余PBS吸取干净。然后加入RIPA裂解液(含蛋白酶抑制剂)，然后刮下细胞转入离心管中，每隔10min涡旋裂解液30s，随后在4℃条件下，13000rpm，离心10min。收集上清液到一个新的离心管中。2.BCA法测定蛋白质浓度。根据说明书提示，按照1:50的体积比混匀A，B两种工作液，利用0.3％的NP-40稀释2μg/μL的蛋白标准品，按照等比稀释形成1μg/μL，0.5μg/μL，0.25μg/μL，0.125μg/μL，最后设置只有0.3％的NP-40的0μg/μL。将25μL的上述浓度的标准品以及待测蛋白裂解液加入到96孔板中，然后每孔再加入200μL工作液，轻轻拍打96孔板，使溶液混匀。将96孔板放于37℃的烘箱中，30min后利用酶标仪检测蛋白质浓度。

3.蛋白质变性。按照1:4的体积比加入5×loading buffer，并涡旋混匀，99℃，煮蛋白10min。

4.配胶。首先将制胶板清洗干净，薄厚胶板下端对齐后插入制胶架中，随后放入下方有胶条的制胶台上，加入双蒸水进行验漏，20min内液面没有下移则证明密封性良好，随后弃掉胶板内ddH2O，并用真空泵吸走残余水滴。在玻璃烧杯中按照比例加入双蒸水，30％丙烯酰胺，1.5mol Tris-HCl(PH8.8),10％SDS，10％过硫酸铵，TEMED，随后吹打混匀，加入到胶板中间，随后沿着胶板上边沿加入ddH₂O，30min以后，可以看到水面和胶面形成一条分界线。接下来制备上层胶，在玻璃烧杯中按照比例加入ddH₂O，30％丙烯酰胺，1.5mol Tris-HCl(PH6.8)，10％SDS，10％过硫酸铵，TEMED。随后吹打混匀。将胶板内上层水弃掉，加入上层胶，然后立刻插入样品梳，室温凝固30min后，可进行上样跑胶。

5.跑胶。涡旋蛋白，直到蛋白液澄清。利用尖端较细的上样枪头吸取蛋白marker及蛋白样品，加入到上样孔中，上样过程中要保证不要溢孔，且不要打出气泡。设置跑胶电源模式为：上层胶为60V，30min，下层胶为120V，1.5h(跑胶时间可根据需要灵活设置)。跑胶结束后，我们将胶板取下，用撬胶板将薄厚胶板分开，裁下所需分子量胶，放入转膜缓冲液中待用。

6.转膜。将PVDF膜放入甲醇中浸泡20s，水洗5min，转膜缓冲液浸泡5min。然后按照电极有正到负的方向，按照“海绵-滤纸-PVDF膜-SDS-PAGE胶-滤纸-海绵”进行放置，用圆滚赶走气泡，设置电源模式为300mA,根据分子量设定转膜时间。同时将转膜槽周围加上碎冰以降低转膜温度。

7.封闭。打开转膜装置，将膜放入5％的脱脂牛奶中进行封闭，常温条件下封闭2h。

8.孵育一抗。按照抗体说明书稀释抗体，稀释液可采用1×TBST或者封闭液。孵育条件为4℃，摇床孵育过夜。

9.洗膜。1×TBST洗膜3次，每次10min。

10.孵育二抗。孵育一抗。按照体说明书稀释抗体，稀释液采用1×TBST或者封闭液。室温摇床慢摇2h。

11.洗膜。1×TBST洗膜3次，每次10min。

13.曝光。将发光液均匀加在膜表面，静置30s，随后采用曝光仪进行曝光。

八、实验结果

1、RHX6在真核生物体内存在性及其表达情况

设计针对RHX6特异性序列的引物克隆出产物后，与T载体连接，发现其条带位置与预测一致,在1786bp处(图1A)。测序结果表明，序列完全正确(图1B)。然后检测了其在三种乳腺癌细胞及乳腺癌组织中表达量，发现RHX6 mRNA表达水平远低于正常乳腺癌细胞及癌旁组织(图1C)。

2、成功构建RHX6表达质粒

构建表达RHX6 CDS区全长的质粒，带有EGFP标签，构建完成后，转化，做菌液PCR，琼脂糖结果发现在1620bp处有明显条带(图2A)，这与RHX6 CDS区全长位置基本吻合，初步证明RHX6基因插入载体内。选取一份菌液提质粒，然后用XhoI,ACC65I进行双酶切鉴定，发现条带位置正确(图2B-图2C)，证明质粒构建正确。最后将质粒送去测序，结果显示与NCBI中序列一致(图2D)，证明质粒构建成功。

3、RHX6质粒可以成功表达

为了验证构建质粒是否能在细胞内成功表达，按照上述转染方法，将质粒转染进293T细胞，由于载体带荧光标签，所以在荧光显微镜下观察，发现明显的绿色荧光(图3A)，证明质粒在细胞内成功表达。将转染细胞提取RNA，PCR试验后琼脂糖结果证明RHX6在细胞内确实高表达(图3B)。证明质粒可以在细胞内表达。

4、RHX6可以抑制乳腺癌细胞增殖

在MCF-7、MDA-MB-231、T47D三种乳腺癌细胞中分别过表达空载体和RHX6，通过平板克隆及CCK8实验检测其增殖能力变化。平板克隆实验结果显示，三种乳腺癌细胞系转染RHX6后，三种细胞系的克隆形成速度明显慢于转染空载体组(图4A)，说明RHX6可以抑制三种乳腺癌细胞系的增殖。CCK8结果发现，过表达RHX6组细胞OD值明显低于空载体组(图4B)，同样说明三种乳腺癌细胞的增殖受到了抑制。

5、RHX6可以抑制乳腺癌细胞迁移

在MCF-7、MDA-MB-231、T47D三种乳腺癌细胞中分别过表达空载体和RHX6，通过划痕实验和Transwell实验检测其迁移能力变化。划痕实验结果显示，三种乳腺癌细胞系转染RHX6后，三种细胞系的伤口愈合能力明显慢于转染空载体组(图5A)，说明RHX6可以抑制三种乳腺癌细胞系的迁移。Transwell结果发现，过表达RH X6组细胞可以穿过小室膜的数量明显低于空载体组(图5B)，同样说明三种乳腺癌细胞的迁移能力受到了抑制。

6、RHX6可以抑制乳腺癌细胞EMT

在MCF-7，MDA-MB-231，T47D三种乳腺癌细胞中分别过表达空载体和RHX6，通过Western blot实验检测EMT标志蛋白E-cadherin，Vimentin变化。Western blot实验结果显示，三种乳腺癌细胞系转染RHX6后，三种细胞系的E-cadherin表达量明显升高，而Vimentin表达量下降(图6)，说明三种乳腺癌细胞的EMT受到了抑制。

通过上述实验和实验结果可以得出：RHBDF1的一个变体transcript variant X6(RHX6)存在于真核生物体内，并对乳腺癌细胞的增殖，迁移及EMT有抑制作用。

以上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已，并不用以限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。

序列表

<110> 南开大学

<120> RHX6基因以及其在制备抗乳腺癌药物中的应用

<141> 2022-02-10

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1620

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

atgctgccct tggagcgagg ctggcggaag cagaaggagg gcgccgcagc cccgcagccc 60

aaggtgcggc tccgacagga ggtggtgagc accgcggggc cgcgacgggg ccagcgtatc 120

gcggtgccgg tgcgcaagct cttcgcccgg gagaagcggc cgtatgggct gggcatggtg 180

ggacggctca ccaaccgcac ctaccgcaag cgcatcgaca gcttcgtcaa gcgccagatc 240

gaggacatgg acgaccacag gcccttcttc acctactggc ttaccttcgt gcactcgctc 300

gtcaccatcc tagccgtgtg catctatggc atcgcgcccg tgggcttctc gcagcatgag 360

acggtggact cggtgctgcg gaaccgcggg gtctacgaga acgtcaagta cgtgcagcag 420

gagaacttct ggatcgggcc cagctcggag gccctcatcc acctgggcgc caagttttcg 480

ccctgcatgc gccaggaccc gcaggtgcac agcttcattc gctcggcgcg cgagcgcgag 540

aagcactccg cctgctgcgt gcgcaacgac aggtcgggct gcgtgcagac ctcggaggag 600

gagtgctcgt ccacgctggc agtgtgggtg aagtggccca tccatcccag cgccccagag 660

cttgcgggcc acaagagaca gtttggctct gtctgccacc aggatcccag ggtgtgtgat 720

gagccctcct ccgaagaccc tcatgagtgg ccagaagaca tcaccaagtg gccgatctgc 780

accaaaaaca gcgctgggaa ccacaccaac catccccaca tggactgtgt catcacagga 840

cggccctgct gcattggcac caagggcagg tgtgagatca cctcccggga gtactgtgac 900

ttcatgaggg gctacttcca tgaggaggcc acgctctgct ctcaggtgca ctgcatggat 960

gatgtgtgtg ggctcctgcc ttttctcaac cccgaggtgc ctgaccagtt ctaccgcctg 1020

tggctatccc tcttcctgca cgccgggatc ttgcactgcc tggtgtccat ctgcttccag 1080

atgactgtcc tgcgggacct ggagaagctg gcaggctggc accgcatagc catcatctac 1140

ctgctgagtg gtgtcaccgg caacctggcc agtgccatct tcctgccata ccgagcagag 1200

gtgggtcctg ctggctccca gttcggcatc ctggcctgcc tcttcgtgga gctcttccag 1260

agctggcaga tcctggcgcg gccctggcgt gccttcttca agctgctggc tgtggtgctc 1320

ttcctcttca cctttgggct gctgccgtgg attgacaact ttgcccacat ctcggggttc 1380

atcagtggcc tcttcctctc cttcgccttc ttgccctaca tcagctttgg caagttcgac 1440

ctgtaccgga aacgctgcca gatcatcatc tttcaggtgg tcttcctggg cctcctggct 1500

ggcctggtgg tcctcttcta cgtctatcct gtccgctgtg agtggtgtga gttcctcacc 1560

tgcatcccct tcactgacaa gttctgtgag aagtacgaac tggacgctca gctccactga 1620

<210> 2

<211> 539

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 2

Met Leu Pro Leu Glu Arg Gly Trp Arg Lys Gln Lys Glu Gly Ala Ala

1 5 10 15

Ala Pro Gln Pro Lys Val Arg Leu Arg Gln Glu Val Val Ser Thr Ala

20 25 30

Gly Pro Arg Arg Gly Gln Arg Ile Ala Val Pro Val Arg Lys Leu Phe

35 40 45

Ala Arg Glu Lys Arg Pro Tyr Gly Leu Gly Met Val Gly Arg Leu Thr

50 55 60

Asn Arg Thr Tyr Arg Lys Arg Ile Asp Ser Phe Val Lys Arg Gln Ile

65 70 75 80

Glu Asp Met Asp Asp His Arg Pro Phe Phe Thr Tyr Trp Leu Thr Phe

85 90 95

Val His Ser Leu Val Thr Ile Leu Ala Val Cys Ile Tyr Gly Ile Ala

100 105 110

Pro Val Gly Phe Ser Gln His Glu Thr Val Asp Ser Val Leu Arg Asn

115 120 125

Arg Gly Val Tyr Glu Asn Val Lys Tyr Val Gln Gln Glu Asn Phe Trp

130 135 140

Ile Gly Pro Ser Ser Glu Ala Leu Ile His Leu Gly Ala Lys Phe Ser

145 150 155 160

Pro Cys Met Arg Gln Asp Pro Gln Val His Ser Phe Ile Arg Ser Ala

165 170 175

Arg Glu Arg Glu Lys His Ser Ala Cys Cys Val Arg Asn Asp Arg Ser

180 185 190

Gly Cys Val Gln Thr Ser Glu Glu Glu Cys Ser Ser Thr Leu Ala Val

195 200 205

Trp Val Lys Trp Pro Ile His Pro Ser Ala Pro Glu Leu Ala Gly His

210 215 220

Lys Arg Gln Phe Gly Ser Val Cys His Gln Asp Pro Arg Val Cys Asp

225 230 235 240

Glu Pro Ser Ser Glu Asp Pro His Glu Trp Pro Glu Asp Ile Thr Lys

245 250 255

Trp Pro Ile Cys Thr Lys Asn Ser Ala Gly Asn His Thr Asn His Pro

260 265 270

His Met Asp Cys Val Ile Thr Gly Arg Pro Cys Cys Ile Gly Thr Lys

275 280 285

Gly Arg Cys Glu Ile Thr Ser Arg Glu Tyr Cys Asp Phe Met Arg Gly

290 295 300

Tyr Phe His Glu Glu Ala Thr Leu Cys Ser Gln Val His Cys Met Asp

305 310 315 320

Asp Val Cys Gly Leu Leu Pro Phe Leu Asn Pro Glu Val Pro Asp Gln

325 330 335

Phe Tyr Arg Leu Trp Leu Ser Leu Phe Leu His Ala Gly Ile Leu His

340 345 350

Cys Leu Val Ser Ile Cys Phe Gln Met Thr Val Leu Arg Asp Leu Glu

355 360 365

Lys Leu Ala Gly Trp His Arg Ile Ala Ile Ile Tyr Leu Leu Ser Gly

370 375 380

Val Thr Gly Asn Leu Ala Ser Ala Ile Phe Leu Pro Tyr Arg Ala Glu

385 390 395 400

Val Gly Pro Ala Gly Ser Gln Phe Gly Ile Leu Ala Cys Leu Phe Val

405 410 415

Glu Leu Phe Gln Ser Trp Gln Ile Leu Ala Arg Pro Trp Arg Ala Phe

420 425 430

Phe Lys Leu Leu Ala Val Val Leu Phe Leu Phe Thr Phe Gly Leu Leu

435 440 445

Pro Trp Ile Asp Asn Phe Ala His Ile Ser Gly Phe Ile Ser Gly Leu

450 455 460

Phe Leu Ser Phe Ala Phe Leu Pro Tyr Ile Ser Phe Gly Lys Phe Asp

465 470 475 480

Leu Tyr Arg Lys Arg Cys Gln Ile Ile Ile Phe Gln Val Val Phe Leu

485 490 495

Gly Leu Leu Ala Gly Leu Val Val Leu Phe Tyr Val Tyr Pro Val Arg

500 505 510

Cys Glu Trp Cys Glu Phe Leu Thr Cys Ile Pro Phe Thr Asp Lys Phe

515 520 525

Cys Glu Lys Tyr Glu Leu Asp Ala Gln Leu His

530 535

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

atgctgccct tggagcgagg 20

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

tcagtggagc tgagcgtcca gtt 23

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

ccgttaggga tggcaccttt 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

atggaggata cccgggcaaa 20

Claims

1.一种RHX6基因，其特征在于：其CDS区域的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种RHX6基因编码的蛋白质，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种扩增RHX6基因的CDS区域的引物对，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.3-4所示。

4.一种RHX6基因的qPCR的特异性引物对，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.5-6所示。

5.一种含有权利要求1所述的RHX6基因的重组载体。

6.一种权利要求1所述的基因、权利要求2所述的蛋白质或权利要求5所示的重组载体的制备抗乳腺癌药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：为S1)或S2)或S3)：

S1)制备抑制乳腺癌细胞增殖的药物的应用；

S2)制备抑制乳腺癌细胞迁移的药物的应用；

S3)制备抑制乳腺癌细胞EMT药物的应用。