CN100497595C - 一种土壤放线菌发酵液的提取物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种土壤放线菌GDPPRA 3704发酵液的提取物及其制备方法，以及该提取物在制备杀灭小菜蛾和鱼类寄生虫中华鳋等农药中的应用。经土壤放线菌GDPPRA 3704的种子培养；土壤放线菌GDPPRA 3704的液体发酵培养；有效物质的浸出和有效物质的分离，即得到发酵液的提取物。本发明发酵工艺和提取工艺简单，有效物质回收率高。小菜蛾和中华鳋对本发明提取物较敏感，较低浓度已具有杀灭作用，可望制成生物农药，具有较高的经济和社会效益。同时，此发酵液提取物为土壤放线菌发酵产生的，在自然条件下可降解，对环境影响较少。
Description
技术领域
本发明涉及一种自新疆那拉提地区分离的土壤放线菌发酵液的提取物及其制备方法，以及该提取物在制备抗小菜蛾和鱼类寄生虫中华鳋的农药中的应用。
背景技术
小菜蛾(Plutella xylostella Linnaeus)属鳞翅目菜蛾科，是世界性十字花科蔬菜的主要害虫，年发生世代多(一般亚热带地区8～12代，热带地区20代以上)，繁殖系数高，平均每头雌虫成虫产卵在170粒以上，世代间虫口数量增长快，重叠现象严重。在全世界，小菜蛾造成的经济损失十分严重，在美国，每年由虫害引起的损失达30亿美元，而由小菜蛾造成的损失达10亿美元，占三分之一。在我国，每年小菜蛾造成的损失以亿元计。在产量方面，由小菜蛾危害引起蔬菜减产在美国达4000多万吨；在我国，部分地区由于小菜蛾大暴发曾使油菜颗粒无收。在防治上，全世界用于杀灭小菜蛾的费用达数十亿美元，这还不包括研究开发新杀虫剂投入的费用。
60年代中期，我国使用有机磷农药来防治小菜蛾，80年代初又使用拟除虫菊酯类农药，到80年代后期，小菜蛾对这两类农药产生了高度的抗药性。苯甲酰基脲类(BPUS)杀虫剂被称为第3代农药，通过抑制昆虫表皮基丁质合成，导致昆虫新表皮不能正常形成而死亡，由于其机理独特，曾认为该类杀虫剂不易产生抗药性，但在某些地区，由于不合理使用，使得小菜蛾很快产生抗药性。苏云金杆菌与阿维菌素属于生物农药范围，过去人们认为对小菜蛾不易产生抗药性，但近年的研究表明，小菜蛾已对苏云金杆菌与阿维菌素产生抗药性，且抗性水平有逐年提高的趋势。因此，研制新的生物农药以防治抗药性小菜蛾具有重要意义。
中华鳋(Sinergasilus spp)是鱼类常见的严重寄生虫，常常造成鱼类减产和大批死亡。目前防治此类寄生虫的主要是敌百虫等药剂。这些药剂的长期使用已造成寄生虫对药剂产生抗药性。因此，寻找新的生物农药成为当务之急。
从土壤放线菌中研制新的生物农药是一种有效途径，如井冈霉素、阿维菌素都是开发成功的例子。目前，人类发现的大约上万种抗生素，有70％是由土壤放线菌产生的。近五十年来，人们大约只研究和分离了1～2％的土壤放线菌，其中大部分特别是一些人类活动很少干扰的土壤放线菌研究几乎是空白的。
发明内容
为了解决上述现有技术中存在的不足，本发明的首要目的在于提供一种具有潜在生物农药价值的土壤放线菌发酵液的提取物。
本发明的另一目的在于提供上述土壤放线菌发酵液的提取物的制备方法。
本发明的再一目的在于提供上述土壤放线菌发酵液的提取物在制备抗小菜蛾或抗鱼类寄生虫等农药中的应用。该土壤放线菌发酵液提取物是土壤放线菌GDPPRA 3704发酵物中对小菜蛾和中华鳋有效部分油状物。
本发明所涉及的土壤放线菌分离自新疆那拉提地区的沿河树林。本发明所用的微生物菌株是广东省农业科学院植物保护研究所生化组自新疆那拉提地区分离得到土壤微生物，初步鉴定为放线菌目(Actinomycetales)，链霉菌属(Streptomyces)的一个种Streptomyces sp.，编号为GDPPRA 3704，在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏时间为2006年7月14日，菌种保藏号为CCTCCNo：M 206067。
GDPPRA 3704的形态特征为：在高氏一号琼脂培养基上，基丝灰黄色，气丝淡黄至象牙黄，无可溶性色素。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种土壤放线菌发酵液提取物的制备方法，包括以下步骤：
(1)土壤放线菌GDPPRA 3704的种子培养：
将高氏一号培养基制成试管斜面或茄子瓶斜面，接菌株孢子涂斜面，28℃培养7～10天。
(2)土壤放线菌GDPPRA 3704的液体发酵培养：
将斜面中成熟菌株制成孢子悬浮液，接入液体发酵培养基中进行液体发酵培养，接种量为8～16％，通气量(V/Vmin)为1:0.6～1.2，发酵温度为26～32℃，发酵培养周期为72～108小时。
(3)有效物质的浸出：
将步骤(2)培养的发酵液离心分离，弃去上清液，保留菌丝，用60～80％(体积百分比)丙酮浸泡菌丝8～24小时，离心除去菌丝体，保留滤液。
(4)有效物质的分离：
用大孔吸附树脂对滤液进行吸附，用纯丙酮洗脱，对洗脱液进行减压浓缩，得到棕色油状物，即为土壤放线菌发酵液的提取物。
所述菌株为土壤放线菌GDPPRA 3704，在中国典型培养物保藏中心保藏，菌种保藏号为CCTCC No：M 206067。
所述高氏一号培养基组成为：KNO3 1g，NaCl 0.5g，MgSO4 0.5g，K2HPO40.5g，FeSO4 0.01g，可溶性淀粉20g，琼脂20g，水1000ml。
所述液体发酵培养基为：葡萄糖15～30g，淀粉5～15g，豆饼粉10～25g，玉米浆10～15g，氯化钠2～8g，碳酸钙2～8g，水1000ml。
一种土壤放线菌发酵液的提取物就是通过上述制备方法制备而成的。
上述土壤放线菌发酵液的提取物在制备抗小菜蛾或抗鱼类寄生虫等农药中的应用。
本发明的提取物(油状物)能杀死小菜蛾和鱼类寄生虫中华鳋，具体效果可达到：175ml，72h，100％杀灭小菜蛾；0.6μg/ml，24h，100％杀灭中华鳋。本发明的提取物可用于制备杀小菜蛾的农药和用于制备杀鱼类寄生虫的农药。
本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：本发明发酵工艺和提取工艺简单，有效物质回收率高。小菜蛾和中华鳋对本发明油状物较敏感，较低浓度已具有杀灭作用，可望制成生物农药，具有较高的经济和社会效益。同时，此土壤放线菌发酵液的提取物(油状物)为土壤放线菌发酵产生的，在自然条件下可降解，对环境影响较少。
本发明土壤放线菌GDPPRA 3704，为放线菌目、链霉菌属的一个种Streptomyces sp，在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏时间为2006年7月14日，保藏号为CCTCC No：M 206067。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
本发明提取物——棕色油状物的制备方法：
(1)土壤放线菌GDPPRA 3704的种子培养：
高氏一号培养基，培养基组成为：KNO3 1g，NaCl 0.5g，MgSO4 0.5g，K2HPO4 0.5g，FeSO4 0.01g，可溶性淀粉20g，琼脂20g，水1000ml，制成茄子瓶斜面，接菌株孢子涂斜面，28℃培养10天。
(2)土壤放线菌GDPPRA 3704的液体发酵培养：
采用30L发酵罐进行液体发酵培养，发酵培养基为：葡萄糖20g，淀粉10g，豆饼粉15g，玉米浆15g，氯化钠5g，碳酸钙3g，水1000ml；将茄子瓶斜面中成熟菌株制成孢子悬浮液接入发酵罐，接种量为10％，发酵温度为30℃，通气量(V/V min)为1:0.8，发酵培养96小时。
(3)有效物质的浸出：
将步骤(2)培养好的发酵液在2000r/min离心10min，弃去上清液，保留菌丝，用60％(体积百分比)丙酮浸泡12小时，在2000r/min离心10min，除去菌丝体，保留滤液。
(4)有效物质的分离：
用大孔吸附树脂HZ-841对滤液进行吸附，用纯丙酮洗脱，对洗脱液进行减压浓缩，得到棕色油状物1.75g。即为本发明的土壤放线菌发酵液的提取物。
实施例2
本发明提取物——棕色油状物的制备方法：
(1)土壤放线菌GDPPRA 3704的种子培养：
高氏一号培养基，培养基组成为：KNO3 1g，NaCl 0.5g，MgSO4 0.5g，K2HPO4 0.5g，FeSO4 0.01g，可溶性淀粉20g，琼脂20g，水1000ml，制成试管斜面，接菌株孢子涂斜面，28℃培养8天。
(2)土壤放线菌GDPPRA 3704的液体发酵培养：
采用30L发酵罐进行液体发酵培养，发酵培养基为：葡萄糖30g，淀粉15g，豆饼粉25g，玉米浆10g，氯化钠8g，碳酸钙8g，水1000ml；将试管斜面中成熟菌株制成孢子悬浮液接入发酵罐，接种量为16％，发酵温度为26℃，通气量(V/V min)为1:1.2，发酵培养108小时。
(3)有效物质的浸出：
将步骤(2)培养好的发酵液离心，弃去上清液，保留菌丝，用80％丙酮浸泡24小时，离心，除去菌丝体，保留滤液。
(4)有效物质的分离：
用大孔吸附树脂HZ-841对滤液进行吸附，用纯丙酮洗脱，对洗脱液进行减压浓缩，得到棕色油状物1.75g。即为本发明的土壤放线菌发酵液的提取物。
实施例3 本发明提取物——棕色油状物杀灭小菜蛾和中华鳋活性实验
A、抗小菜蛾试验
将实施例1得到的棕色油状物进行系列浓度稀释，然后将菜心叶子浸泡于溶液30秒，拿出，自然晾干后，将人工养殖的2龄小菜蛾幼虫接到药剂处理的叶片上，在25℃条件下养殖，每24小时调查一次小菜蛾的死亡率，以丙酮为空白对照，每处理3个重复。实验结果见表1。药剂浓度为175μg/ml，72h可以100％杀灭小菜蛾；浓度为350μg/ml，48h可以100％杀灭小菜蛾。
表1
B、抗鱼类寄生虫中华鳋的试验
用500ml三角瓶将实施例1得到的棕色油状物进行系列浓度稀释，然后将中华鳋接到各处理的三角瓶中，在25℃条件下养殖，每24小时调查一次中华鳋的死亡率，以丙酮为空白对照，每处理3个重复。实验结果见表2。从表2的结果可知，本发明提取物对中华鳋具有明显的杀灭作用，药剂浓度在0.6μg/ml，24小时可100％杀死中华鳋。
表2
如上所述，可较好地实现本发明。
Claims (4)
1、一种土壤放线菌发酵液提取物的制备方法，其特征是包括以下步骤：
(1)土壤放线菌GDPPRA 3704的种子培养：
将高氏一号培养基制成试管斜面或茄子瓶斜面，接菌株孢子涂斜面，28℃培养7～10天；
(2)土壤放线菌GDPPRA 3704的液体发酵培养：
将斜面中成熟菌株制成孢子悬浮液，接入液体发酵培养基中进行液体发酵培养，接种量为8～16％，通气量为1：0.6～1.2V/Vmin，发酵温度为26～32℃，发酵培养周期为72～108小时；
(3)有效物质的浸出：
将步骤(2)培养的发酵液离心分离，弃去上清液，保留菌丝，用体积百分比为60～80％丙酮浸泡菌丝8～24小时，离心除去菌丝体，保留滤液；
(4)有效物质的分离：
用大孔吸附树脂对滤液进行吸附，用纯丙酮洗脱，对洗脱液进行减压浓缩，得到棕色油状物，即为土壤放线菌发酵液的提取物；
所述菌株为土壤放线菌GDPPRA 3704，在中国典型培养物保藏中心保藏，菌种保藏号为CCTCC No：M 206067。
2、根据权利要求1所述的一种土壤放线菌发酵液提取物的制备方法，其特征是：所述液体发酵培养基为：葡萄糖15～30g，淀粉5～15g，豆饼粉10～25g，玉米浆10～15g，氯化钠2～8g，碳酸钙2～8g，水1000ml。
3、一种土壤放线菌发酵液的提取物，就是通过权利要求1所述的制备方法制备而成的。
4、权利要求3所述的土壤放线菌发酵液的提取物在制备抗小菜蛾或抗鱼类寄生虫农药中的应用。
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