CN110283852A - 一种土壤放线菌发酵液的提取物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种土壤放线菌发酵液的提取物及其制备方法，具体涉及微生物发酵液的提取物制备技术领域，该提取物具体为土壤放线菌在生活过程中所产生的能干扰细菌发育功能的抗生素。本发明通过对高含量有机质的菜地进行土壤取样，并对土壤中的放线菌进行培养、分离、纯化以及对纯化菌种的抗性进行检测，最后制得该放线菌菌种的发酵液提取物，整个制备工艺简单，提取物性能参数更稳定，测试效果更精确。

Description

一种土壤放线菌发酵液的提取物及其制备方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵液的提取物制备技术领域，更具体地说，本发明涉及一种土壤放线菌发酵液的提取物及其制备方法。
背景技术
放线菌是一类生长在土壤、植物体表及内部，还有淡水或海洋中的微生物类群，是人们研究最早并广泛应用于农业生产中的微生物。目前发现的抗生素产生菌，绝大多数为放线菌，而80％以上得抗生素都来自链霉菌属。链霉菌主要存在于土壤当中，其孢子萌发后首先形成基内菌丝，接着分化成气生菌丝，气生菌丝形成孢子链，再形成成熟孢子。环境条件不适宜时链霉菌能够形成孢子，转入休眠状态，因此链霉菌能够适应多种环境。而目前得到的放线菌主要从土壤中筛选获得。
专利申请公布号CN 1974756A的发明专利公开了一种上壤放线菌发酵液的提取物及其制备方法和应用，经土壤放线菌GDPPRA 3704的种子培养；土壤放线菌GDPPRA 3704的液体发酵培养；有效物质的浸出和有效物质的分离，即得到发酵液的提取物。本发明发酵工艺和提取工艺简单，有效物质回收率高。小菜蛾和中华鳋对本发明提取物较敏感，较低浓度已具有杀灭作用，可望制成生物农药，具有较高的经济和社会效益。同时，此发酵液提取物为土壤放线菌发酵产生的，在自然条件下可降解，对环境影响较少。
但是其在实际使用时，仍旧存在较多缺点，如直接采用保藏好的放线菌种子来制备发酵液提取物，提取物的测试效果存在误差，导致测试结论不精确。
发明内容
为了克服现有技术的上述缺陷，本发明的实施例提供一种土壤放线菌发酵液的提取物及其制备方法，通过对高含量有机质的菜地进行土壤取样，并对土壤中的放线菌进行培养、分离、纯化以及对纯化菌种的抗性进行检测，最后制得该放线菌菌种的发酵液提取物，整个制备工艺简单，提取物性能参数更稳定，测试效果更精确，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种土壤放线菌发酵液的提取物，该提取物具体为土壤放线菌在生活过程中所产生的能干扰细菌发育功能的抗生素。
本发明还提供了一种土壤放线菌发酵液的提取物的制备方法，具体包括如下操作步骤：
步骤一：土壤放线菌株的选取：选取有机质含量高的菜地，按五点取样法将铲子插入土中数次进行取样，并将一定质量的样品充分混匀，除去其中的碎石以及植物残根，并在混匀除去碎石以及植物残根后，置于室温条件下进行风干处理；
步骤二：土壤放线菌的培养：
(1)制备高氏培养基，其中，高氏培养基的各原料组分用量为可溶性淀粉2g、硝酸钾0.1g、磷酸氢二钾0.05g、氯化钠0.05g、硫酸镁0.05g、硫酸亚铁0.001g、琼脂2g、水100ml备用；
(2)取适量风干处理后的土壤置于50ml的灭菌生理盐水中，震荡制成土壤悬液，并采用无菌吸管吸取适量的土壤悬液，加入至适量的灭菌生理盐水中进行10倍稀释，备用；
(3)将高氏一号培养基加热溶化，待冷至55-60℃时，加入质量浓度为3％的重铬酸钾数滴，混合均匀，分别吸取0.1ml稀释液于灭菌平皿中，再加入10-15ml恒温于55℃的含有重铬酸钾的高氏培养基中，轻轻旋转混合均匀，并将灭菌平皿倒置于28℃的恒温培养箱中培养一周；
步骤三：土壤放线菌的纯化：
(1)将灭菌平皿上的土壤放线菌菌落挑出，并在淀粉琼脂平皿上分区划线，然后将划线的淀粉琼脂平皿置于28℃恒温培养箱中培养一周，观察土壤放线菌菌落特征；
(2)将纯化好的土壤放线菌菌落转入到斜面，并置于4℃下保存，备用；
步骤四：土壤放线菌的抗性检测：
(1)挑取其中一个土壤放线菌的菌落接种到含有250ml淀粉液体培养基的三角瓶，28℃恒温培养一周；
(2)将2ml培养8h的稻瘟病菌分别加到十个装有灭菌的牛肉膏蛋白胨培养基的培养皿中混合均匀，每个培养皿中倒入20ml，凝固后待用；
(3)在上面培养皿中均匀放入多个牛津杯，每个牛津杯中加入1ml放线菌发酵培养液，并进行灭菌处理后，将培养皿放入37℃培养箱恒温培养12h，测量抑菌圈的大小；
步骤五：土壤放线菌的发酵：
(1)制备发酵培养基，其中，发酵培养基的各原料组分用量为蔗糖35-55g，黄豆粉15-30g，磷酸氢二钾0.1-0.3g，氯化钠0.3-1.6g，硫酸钠0.05-0.15g，硫酸亚铁0.008-0.014g，碳酸钙1.5-5g，蒸馏水1000ml；
(2)将试管斜面菌种转管活化，28℃培养7天后，以接种取一环孢子转入装有50ml种子培养基的250ml三角摇瓶中，并进行灭菌处理后，于28℃、200r/min-1的条件下培养4天；
(3)以6％的接种量将种子液转接入装有50ml初始发酵培养基的250ml三角摇瓶中，于28℃、200r/min-1的条件下培养4天；
步骤六：提取提取物：将步骤五中的发酵液经4000r/min-1离心15min，取上清，用乙酸乙酯以1:1的比例进行萃取，并对萃取物进行减压浓缩，所得到的棕色油状物即为放线菌发酵液的提取物。
在一个优选地实施方式中，所述步骤一的取样过程中，先铲去表层2cm的土壤，然后取2-10cm的土壤作为样品。
在一个优选地实施方式中，所述步骤二的(1)中，先将可溶性淀粉放置在烧杯中，加入5ml水调成糊状后，倒入95ml水，搅匀后依次加入除琼脂以外的其他药品，并使其充分溶解，然后加热至煮沸时，加入琼脂，并不停地搅拌，待琼脂完全溶解后，补足失水，调整pH至7.2-7.4，进行灭菌处理。
在一个优选地实施方式中，所述步骤二的(2)中，制土壤悬液的震荡时间为10min，且土壤悬液的稀释在无菌条件下进行。
在一个优选地实施方式中，所述步骤四的(3)中，放线菌发酵培养液的各原料组分用量为蔗糖22.5g，黄豆粉12.5g，磷酸氢二钾0.2g，氯化钠1g，硫酸钠0.1g，硫酸亚铁0.01g，碳酸钙2g，蒸馏水1000ml。
在一个优选地实施方式中，所述步骤四的放线菌发酵培养液以及步骤五中的放线菌发酵培养基的pH值均为7.2，且置于120℃的条件下灭菌20min。
在一个优选地实施方式中，所述步骤四的放线菌发酵培养液以及步骤五中的放线菌发酵培养基在灭菌处理后，需连接通气管路，并调整通气量为3-5L/min。
本发明的技术效果和优点：
本发明选用高含量有机质的菜地进行土壤取样，并对土壤中的放线菌进行培养、分离、纯化以及对纯化菌种的抗性进行检测，最后制得该放线菌菌种的发酵液提取物，整个制备工艺简单，提取物性能参数更稳定，测试效果更精确，并且，该提取物的稀释液能够提高所在地的水稻抗稻瘟病率，有望制成生物农药，由于该提取物是土壤放线菌发酵所产生的，使得其可在自然条件下降解，从而大大降低农药对环境的污染。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
本发明提供的一种土壤放线菌发酵液的提取物，该提取物具体为土壤放线菌在生活过程中所产生的能干扰细菌发育功能的抗生素。
本发明还提供了一种土壤放线菌发酵液的提取物的制备方法，具体包括如下操作步骤：
步骤一：土壤放线菌株的选取：选取有机质含量高的菜地，先铲去表层2cm的土壤，然后取2-10cm的土壤作为样品，按五点取样法将铲子插入土中数次进行取样，并将一定质量的样品充分混匀，除去其中的碎石以及植物残根，并在混匀除去碎石以及植物残根后，置于室温条件下进行风干处理；
步骤二：土壤放线菌的培养：
(1)制备高氏培养基，其中，高氏培养基的各原料组分用量为可溶性淀粉2g、硝酸钾0.1g、磷酸氢二钾0.05g、氯化钠0.05g、硫酸镁0.05g、硫酸亚铁0.001g、琼脂2g、水100ml，先将可溶性淀粉放置在烧杯中，加入5ml水调成糊状后，倒入95ml水，搅匀后依次加入除琼脂以外的其他药品，并使其充分溶解，然后加热至煮沸时，加入琼脂，并不停地搅拌，待琼脂完全溶解后，补足失水，调整pH至7.2-7.4，进行灭菌处理，备用；
(2)取适量风干处理后的土壤置于50ml的灭菌生理盐水中，震荡10min制成土壤悬液，并采用无菌吸管吸取适量的土壤悬液，在无菌条件下加入至适量的灭菌生理盐水中进行10倍稀释，备用；
(3)将高氏一号培养基加热溶化，待冷至55-60℃时，加入质量浓度为3％的重铬酸钾数滴，混合均匀，分别吸取0.1ml稀释液于灭菌平皿中，再加入10-15ml恒温于55℃的含有重铬酸钾的高氏培养基中，轻轻旋转混合均匀，并将灭菌平皿倒置于28℃的恒温培养箱中培养一周；
步骤三：土壤放线菌的纯化：
(1)将灭菌平皿上的土壤放线菌菌落挑出，并在淀粉琼脂平皿上分区划线，然后将划线的淀粉琼脂平皿置于28℃恒温培养箱中培养一周，观察土壤放线菌菌落特征；
(2)将纯化好的土壤放线菌菌落转入到斜面，并置于4℃下保存，备用；
步骤四：土壤放线菌的抗性检测：
(1)挑取其中一个土壤放线菌的菌落接种到含有250ml淀粉液体培养基的三角瓶，28℃恒温培养一周；
(2)将2ml培养8h的稻瘟病菌分别加到十个装有灭菌的牛肉膏蛋白胨培养基的培养皿中混合均匀，每个培养皿中倒入20ml，凝固后待用；
(3)在上面培养皿中均匀放入多个牛津杯，每个牛津杯中加入1ml放线菌发酵培养液，并进行灭菌处理后，将培养皿放入37℃培养箱恒温培养12h，测量抑菌圈的大小，其中，放线菌发酵培养液的各原料组分用量为蔗糖22.5g，黄豆粉12.5g，磷酸氢二钾0.2g，氯化钠1g，硫酸钠0.1g，硫酸亚铁0.01g，碳酸钙2g，蒸馏水1000ml；
步骤五：土壤放线菌的发酵：
(1)制备发酵培养基，其中，发酵培养基的各原料组分用量为蔗糖35g，黄豆粉15g，磷酸氢二钾0.1g，氯化钠0.3g，硫酸钠0.05g，硫酸亚铁0.008g，碳酸钙1.5g，蒸馏水1000ml；
(2)将试管斜面菌种转管活化，28℃培养7天后，以接种取一环孢子转入装有50ml种子培养基的250ml三角摇瓶中，并进行灭菌处理后，于28℃、200r/min-1的条件下培养4天；
(3)以6％的接种量将种子液转接入装有50ml初始发酵培养基的250ml三角摇瓶中，于28℃、200r/min-1的条件下培养4天；
步骤六：提取提取物：将步骤五中的发酵液经4000r/min-1离心15min，取上清，用乙酸乙酯以1:1的比例进行萃取，并对萃取物进行减压浓缩，所得到的棕色油状物即为放线菌发酵液的提取物。
进一步的，所述步骤四的放线菌发酵培养液以及步骤五中的放线菌发酵培养基的pH值均为7.2，且置于120℃的条件下灭菌20min。
进一步的，所述步骤四的放线菌发酵培养液以及步骤五中的放线菌发酵培养基在灭菌处理后，需连接通气管路，并调整通气量为3-5L/min。
实施例2：
本发明提供的一种土壤放线菌发酵液的提取物，该提取物具体为土壤放线菌在生活过程中所产生的能干扰细菌发育功能的抗生素。
本发明还提供了一种土壤放线菌发酵液的提取物的制备方法，具体包括如下操作步骤：
步骤一：土壤放线菌株的选取：选取有机质含量高的菜地，先铲去表层2cm的土壤，然后取2-10cm的土壤作为样品，按五点取样法将铲子插入土中数次进行取样，并将一定质量的样品充分混匀，除去其中的碎石以及植物残根，并在混匀除去碎石以及植物残根后，置于室温条件下进行风干处理；
步骤二：土壤放线菌的培养：
(1)制备高氏培养基，其中，高氏培养基的各原料组分用量为可溶性淀粉2g、硝酸钾0.1g、磷酸氢二钾0.05g、氯化钠0.05g、硫酸镁0.05g、硫酸亚铁0.001g、琼脂2g、水100ml，先将可溶性淀粉放置在烧杯中，加入5ml水调成糊状后，倒入95ml水，搅匀后依次加入除琼脂以外的其他药品，并使其充分溶解，然后加热至煮沸时，加入琼脂，并不停地搅拌，待琼脂完全溶解后，补足失水，调整pH至7.2-7.4，进行灭菌处理，备用；
(2)取适量风干处理后的土壤置于50ml的灭菌生理盐水中，震荡10min制成土壤悬液，并采用无菌吸管吸取适量的土壤悬液，在无菌条件下加入至适量的灭菌生理盐水中进行10倍稀释，备用；
(3)将高氏一号培养基加热溶化，待冷至55-60℃时，加入质量浓度为3％的重铬酸钾数滴，混合均匀，分别吸取0.1ml稀释液于灭菌平皿中，再加入10-15ml恒温于55℃的含有重铬酸钾的高氏培养基中，轻轻旋转混合均匀，并将灭菌平皿倒置于28℃的恒温培养箱中培养一周；
步骤三：土壤放线菌的纯化：
(1)将灭菌平皿上的土壤放线菌菌落挑出，并在淀粉琼脂平皿上分区划线，然后将划线的淀粉琼脂平皿置于28℃恒温培养箱中培养一周，观察土壤放线菌菌落特征；
(2)将纯化好的土壤放线菌菌落转入到斜面，并置于4℃下保存，备用；
步骤四：土壤放线菌的抗性检测：
(1)挑取其中一个土壤放线菌的菌落接种到含有250ml淀粉液体培养基的三角瓶，28℃恒温培养一周；
(2)将2ml培养8h的稻瘟病菌分别加到十个装有灭菌的牛肉膏蛋白胨培养基的培养皿中混合均匀，每个培养皿中倒入20ml，凝固后待用；
(3)在上面培养皿中均匀放入多个牛津杯，每个牛津杯中加入1ml放线菌发酵培养液，并进行灭菌处理后，将培养皿放入37℃培养箱恒温培养12h，测量抑菌圈的大小，其中，放线菌发酵培养液的各原料组分用量为蔗糖22.5g，黄豆粉12.5g，磷酸氢二钾0.2g，氯化钠1g，硫酸钠0.1g，硫酸亚铁0.01g，碳酸钙2g，蒸馏水1000ml；
步骤五：土壤放线菌的发酵：
(1)制备发酵培养基，其中，发酵培养基的各原料组分用量为蔗糖45g，黄豆粉25g，磷酸氢二钾0.2g，氯化钠1g，硫酸钠0.1g，硫酸亚铁0.01g，碳酸钙3g，蒸馏水1000ml；
(2)将试管斜面菌种转管活化，28℃培养7天后，以接种取一环孢子转入装有50ml种子培养基的250ml三角摇瓶中，并进行灭菌处理后，于28℃、200r/min-1的条件下培养4天；
(3)以6％的接种量将种子液转接入装有50ml初始发酵培养基的250ml三角摇瓶中，于28℃、200r/min-1的条件下培养4天；
步骤六：提取提取物：将步骤五中的发酵液经4000r/min-1离心15min，取上清，用乙酸乙酯以1:1的比例进行萃取，并对萃取物进行减压浓缩，所得到的棕色油状物即为放线菌发酵液的提取物。
进一步的，所述步骤四的放线菌发酵培养液以及步骤五中的放线菌发酵培养基的pH值均为7.2，且置于120℃的条件下灭菌20min。
进一步的，所述步骤四的放线菌发酵培养液以及步骤五中的放线菌发酵培养基在灭菌处理后，需连接通气管路，并调整通气量为3-5L/min。
实施例3：
本发明提供的一种土壤放线菌发酵液的提取物，该提取物具体为土壤放线菌在生活过程中所产生的能干扰细菌发育功能的抗生素。
本发明还提供了一种土壤放线菌发酵液的提取物的制备方法，具体包括如下操作步骤：
步骤一：土壤放线菌株的选取：选取有机质含量高的菜地，先铲去表层2cm的土壤，然后取2-10cm的土壤作为样品，按五点取样法将铲子插入土中数次进行取样，并将一定质量的样品充分混匀，除去其中的碎石以及植物残根，并在混匀除去碎石以及植物残根后，置于室温条件下进行风干处理；
步骤二：土壤放线菌的培养：
(1)制备高氏培养基，其中，高氏培养基的各原料组分用量为可溶性淀粉2g、硝酸钾0.1g、磷酸氢二钾0.05g、氯化钠0.05g、硫酸镁0.05g、硫酸亚铁0.001g、琼脂2g、水100ml，先将可溶性淀粉放置在烧杯中，加入5ml水调成糊状后，倒入95ml水，搅匀后依次加入除琼脂以外的其他药品，并使其充分溶解，然后加热至煮沸时，加入琼脂，并不停地搅拌，待琼脂完全溶解后，补足失水，调整pH至7.2-7.4，进行灭菌处理，备用；
(2)取适量风干处理后的土壤置于50ml的灭菌生理盐水中，震荡10min制成土壤悬液，并采用无菌吸管吸取适量的土壤悬液，在无菌条件下加入至适量的灭菌生理盐水中进行10倍稀释，备用；
(3)将高氏一号培养基加热溶化，待冷至55-60℃时，加入质量浓度为3％的重铬酸钾数滴，混合均匀，分别吸取0.1ml稀释液于灭菌平皿中，再加入10-15ml恒温于55℃的含有重铬酸钾的高氏培养基中，轻轻旋转混合均匀，并将灭菌平皿倒置于28℃的恒温培养箱中培养一周；
步骤三：土壤放线菌的纯化：
(1)将灭菌平皿上的土壤放线菌菌落挑出，并在淀粉琼脂平皿上分区划线，然后将划线的淀粉琼脂平皿置于28℃恒温培养箱中培养一周，观察土壤放线菌菌落特征；
(2)将纯化好的土壤放线菌菌落转入到斜面，并置于4℃下保存，备用；
步骤四：土壤放线菌的抗性检测：
(1)挑取其中一个土壤放线菌的菌落接种到含有250ml淀粉液体培养基的三角瓶，28℃恒温培养一周；
(2)将2ml培养8h的稻瘟病菌分别加到十个装有灭菌的牛肉膏蛋白胨培养基的培养皿中混合均匀，每个培养皿中倒入20ml，凝固后待用；
(3)在上面培养皿中均匀放入多个牛津杯，每个牛津杯中加入1ml放线菌发酵培养液，并进行灭菌处理后，将培养皿放入37℃培养箱恒温培养12h，测量抑菌圈的大小，其中，放线菌发酵培养液的各原料组分用量为蔗糖22.5g，黄豆粉12.5g，磷酸氢二钾0.2g，氯化钠1g，硫酸钠0.1g，硫酸亚铁0.01g，碳酸钙2g，蒸馏水1000ml；
步骤五：土壤放线菌的发酵：
(1)制备发酵培养基，其中，发酵培养基的各原料组分用量为蔗糖55g，黄豆粉30g，磷酸氢二钾0.3g，氯化钠1.6g，硫酸钠0.15g，硫酸亚铁0.014g，碳酸钙5g，蒸馏水1000ml；
(2)将试管斜面菌种转管活化，28℃培养7天后，以接种取一环孢子转入装有50ml种子培养基的250ml三角摇瓶中，并进行灭菌处理后，于28℃、200r/min-1的条件下培养4天；
(3)以6％的接种量将种子液转接入装有50ml初始发酵培养基的250ml三角摇瓶中，于28℃、200r/min-1的条件下培养4天；
步骤六：提取提取物：将步骤五中的发酵液经4000r/min-1离心15min，取上清，用乙酸乙酯以1:1的比例进行萃取，并对萃取物进行减压浓缩，所得到的棕色油状物即为放线菌发酵液的提取物。
进一步的，所述步骤四的放线菌发酵培养液以及步骤五中的放线菌发酵培养基的pH值均为7.2，且置于120℃的条件下灭菌20min。
进一步的，所述步骤四的放线菌发酵培养液以及步骤五中的放线菌发酵培养基在灭菌处理后，需连接通气管路，并调整通气量为3-5L/min。
分别将上述实施例制备所得的提取物进行同比稀释后，喷洒到当地的水稻上，对水稻的抗稻瘟病性能进行检测，并将其与不喷洒该提取物稀释液的水稻进行对比，其对比结果如下表所示：
实施例1 实施例2 实施例3 对比例
稀释液颜色 浅棕色 棕色 棕色 ---
抗稻瘟病率(％) 96.8 98.7 98.6 15.8
由上述对比数据可知，当且仅当发酵培养基的各原料组分用量为蔗糖45g，黄豆粉25g，磷酸氢二钾0.2g，氯化钠1g，硫酸钠0.1g，硫酸亚铁0.01g，碳酸钙3g，蒸馏水1000ml时，采用该法所制备的提取物稀释液的防稻瘟病率达到最优，且发酵培养基的原料用量相对较少。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种土壤放线菌发酵液的提取物，其特征在于：该提取物具体为土壤放线菌在生活过程中所产生的能干扰细菌发育功能的抗生素。
2.一种土壤放线菌发酵液的提取物的制备方法，其特征在于：具体包括如下操作步骤：
步骤一：土壤放线菌株的选取：选取有机质含量高的菜地，按五点取样法将铲子插入土中数次进行取样，并将一定质量的样品充分混匀，除去其中的碎石以及植物残根，并在混匀除去碎石以及植物残根后，置于室温条件下进行风干处理；
步骤二：土壤放线菌的培养：
(1)制备高氏培养基，其中，高氏培养基的各原料组分用量为可溶性淀粉2g、硝酸钾0.1g、磷酸氢二钾0.05g、氯化钠0.05g、硫酸镁0.05g、硫酸亚铁0.001g、琼脂2g、水100ml备用；
(2)取适量风干处理后的土壤置于50ml的灭菌生理盐水中，震荡制成土壤悬液，并采用无菌吸管吸取适量的土壤悬液，加入至适量的灭菌生理盐水中进行10倍稀释，备用；
(3)将高氏一号培养基加热溶化，待冷至55-60℃时，加入质量浓度为3％的重铬酸钾数滴，混合均匀，分别吸取0.1ml稀释液于灭菌平皿中，再加入10-15ml恒温于55℃的含有重铬酸钾的高氏培养基中，轻轻旋转混合均匀，并将灭菌平皿倒置于28℃的恒温培养箱中培养一周；
步骤三：土壤放线菌的纯化：
(1)将灭菌平皿上的土壤放线菌菌落挑出，并在淀粉琼脂平皿上分区划线，然后将划线的淀粉琼脂平皿置于28℃恒温培养箱中培养一周，观察土壤放线菌菌落特征；
(2)将纯化好的土壤放线菌菌落转入到斜面，并置于4℃下保存，备用；
步骤四：土壤放线菌的抗性检测：
(1)挑取其中一个土壤放线菌的菌落接种到含有250ml淀粉液体培养基的三角瓶，28℃恒温培养一周；
(2)将2ml培养8h的稻瘟病菌分别加到十个装有灭菌的牛肉膏蛋白胨培养基的培养皿中混合均匀，每个培养皿中倒入20ml，凝固后待用；
(3)在上面培养皿中均匀放入多个牛津杯，每个牛津杯中加入1ml放线菌发酵培养液，并进行灭菌处理后，将培养皿放入37℃培养箱恒温培养12h，测量抑菌圈的大小；
步骤五：土壤放线菌的发酵：
(1)制备发酵培养基，其中，发酵培养基的各原料组分用量为蔗糖35-55g，黄豆粉15-30g，磷酸氢二钾0.1-0.3g，氯化钠0.3-1.6g，硫酸钠0.05-0.15g，硫酸亚铁0.008-0.014g，碳酸钙1.5-5g，蒸馏水1000ml；
(2)将试管斜面菌种转管活化，28℃培养7天后，以接种取一环孢子转入装有50ml种子培养基的250ml三角摇瓶中，并进行灭菌处理后，于28℃、200r/min-1的条件下培养4天；
(3)以6％的接种量将种子液转接入装有50ml初始发酵培养基的250ml三角摇瓶中，于28℃、200r/min-1的条件下培养4天；
步骤六：提取提取物：将步骤五中的发酵液经4000r/min-1离心15min，取上清，用乙酸乙酯以1:1的比例进行萃取，并对萃取物进行减压浓缩，所得到的棕色油状物即为放线菌发酵液的提取物。
3.根据权利要求1所述的一种土壤放线菌发酵液的提取物的制备方法，其特征在于：所述步骤一的取样过程中，先铲去表层2cm的土壤，然后取2-10cm的土壤作为样品。
4.根据权利要求1所述的一种土壤放线菌发酵液的提取物的制备方法，其特征在于：所述步骤二的(1)中，先将可溶性淀粉放置在烧杯中，加入5ml水调成糊状后，倒入95ml水，搅匀后依次加入除琼脂以外的其他药品，并使其充分溶解，然后加热至煮沸时，加入琼脂，并不停地搅拌，待琼脂完全溶解后，补足失水，调整pH至7.2-7.4，进行灭菌处理。
5.根据权利要求1所述的一种土壤放线菌发酵液的提取物的制备方法，其特征在于：所述步骤二的(2)中，制土壤悬液的震荡时间为10min，且土壤悬液的稀释在无菌条件下进行。
6.根据权利要求1所述的一种土壤放线菌发酵液的提取物的制备方法，其特征在于：所述步骤四的(3)中，放线菌发酵培养液的各原料组分用量为蔗糖22.5g，黄豆粉12.5g，磷酸氢二钾0.2g，氯化钠1g，硫酸钠0.1g，硫酸亚铁0.01g，碳酸钙2g，蒸馏水1000ml。
7.根据权利要求1所述的一种土壤放线菌发酵液的提取物的制备方法，其特征在于：所述步骤四的放线菌发酵培养液以及步骤五中的放线菌发酵培养基的pH值均为7.2，且置于120℃的条件下灭菌20min。
8.根据权利要求1所述的一种土壤放线菌发酵液的提取物的制备方法，其特征在于：所述步骤四的放线菌发酵培养液以及步骤五中的放线菌发酵培养基在灭菌处理后，需连接通气管路，并调整通气量为3-5L/min。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113215040A (zh) * 2021-05-11 2021-08-06 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 一种5406放线菌固体发酵培养基及发酵方法
CN113265319A (zh) * 2021-06-16 2021-08-17 山东天润和生物工程有限公司 一种土壤微生物分类批量培养方法
CN114921366A (zh) * 2022-05-06 2022-08-19 临沂大学 一种土壤中抗生素产生菌及其筛选、鉴定方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1974756A (zh) * 2006-09-21 2007-06-06 广东省农业科学院植物保护研究所 一种土壤放线菌发酵液的提取物及其制备方法和应用
KR20140037419A (ko) * 2012-09-18 2014-03-27 명지대학교 산학협력단 항세균성을 갖는 스트렙토마이세스 반고엔시스 엠제이엠２０７７ 균주, 그의 추출물 및 그들을 함유하는 항세균성 의약용 조성물
CN106834194A (zh) * 2017-03-28 2017-06-13 湖南神隆高科技股份有限公司 一种防治水稻稻瘟病的复合微生物菌剂及其制备方法
CN106942301A (zh) * 2017-03-28 2017-07-14 湖南神隆高科技股份有限公司 一种防控水稻稻瘟病的植物源农药制剂及其制备方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1974756A (zh) * 2006-09-21 2007-06-06 广东省农业科学院植物保护研究所 一种土壤放线菌发酵液的提取物及其制备方法和应用
KR20140037419A (ko) * 2012-09-18 2014-03-27 명지대학교 산학협력단 항세균성을 갖는 스트렙토마이세스 반고엔시스 엠제이엠２０７７ 균주, 그의 추출물 및 그들을 함유하는 항세균성 의약용 조성물
CN106834194A (zh) * 2017-03-28 2017-06-13 湖南神隆高科技股份有限公司 一种防治水稻稻瘟病的复合微生物菌剂及其制备方法
CN106942301A (zh) * 2017-03-28 2017-07-14 湖南神隆高科技股份有限公司 一种防控水稻稻瘟病的植物源农药制剂及其制备方法

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113215040A (zh) * 2021-05-11 2021-08-06 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 一种5406放线菌固体发酵培养基及发酵方法
CN113265319A (zh) * 2021-06-16 2021-08-17 山东天润和生物工程有限公司 一种土壤微生物分类批量培养方法
CN114921366A (zh) * 2022-05-06 2022-08-19 临沂大学 一种土壤中抗生素产生菌及其筛选、鉴定方法

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