SK16852000A3 - Insekticídy na báze rekombinantného bakulovírusu - Google Patents

Description

INSEKTICÍDY ΝΑ BÁZE REKOMBINANTNÉHO BAKULOVÍRUSU

Oblasť techniky

Predkladaný vynález sa týka vylepšených Plutella xylostella bakulovírusov použiteľných ako biologické insekticídy. Vynález poskytuje rekombinantné bakulovírusy, ktoré boli geneticky upravené tak, aby obsahovali gény kódujúce insekticídne toxíny.

Doterajší stav techniky

Bakulovírusy sú hmyzie vírusy, ktoré sú použiteľné ako biologické insekticídy. Bolo popísaných viac ako 400 izolátov bakulovírusov. Vírus jadrovej polyhedrózy Autographa californica (AcMNPV), typický predstaviteľ čeľade Baculoviridae, bol pôvodne izolovaný z Autographa californica, nočného motýľa bežne známeho ako ďatelinová húsenica. Tento vírus infikuje 12 čeľadí a viac ako 30 druhov hmyzu radu Lepidopteran (Granados a kol., The Biology of Baculoviruses, I, 99 (1986)). Nie je známe, že by AcMNPV produktívne infikoval akýkoľvek druh mimo tento rad.

Životný cyklus bakulovírusov, ako je napríklad AcMNPV, má dve štádiá. Každé štádium životného cyklu je reprezentované špecifickou formou vírusu: vyvinuté virióny (BV), ktoré sú neuzatvorené, a oklúzne telieska (OB).

V prirodzenej forme infikujúcej hmyz sú početné virióny nachádzajúce sa vo forme zanorenej do parakryštalickej proteínovej matrice známej ako oklúzne teliesko (OB), ktoré sa tiež označuje ako polyhedrálne inklúzne teliesko (PIB). Proteínové vírusové obaly sa označujú ako polyhedrá. Polyhedrínový proteín majúci molekulovú hmotnosť 29 kD je hlavný vírus kódovaný štrukturálnym proteínom vírusovej oklúzie (U.S. patent č. 4 745 051).

Vírusové oklúzie sú významnou časťou prirodzeného životného cyklu bakulovírusu, pretože poskytujú prostriedok pre horizontálny (z hmyzu na hmyz) prenos medzi citlivými druhmi hmyzu. V prostredí požije citlivý hmyz (zvyčajne v larválnom štádiu) vírusové oklúzie v kontaminovanej potrave, ako je rastlina.

587/B ·· ···· • · ··· ·

Kryštalické oklúzie disociujú v čreve citlivého hmyzu za uvoľnenia infekčných vírusových častíc. Tieto vírusy vzniknuté z oklúzie (ODV) sa replikujú v bunkách tkaniva stredného čreva.

Predpokladá sa, že vírusové častice vstupujú do buniek endocytózou alebo fúziou a že vírusová DNA je neobalená v mieste jadrového póru alebo jadra. Replikácia vírusovej DNA sa detekuje v priebehu 6 hodín. 10-12 hodín po infekcii (p. i.) sa sekundárna infekcia šíri do iných tkanív hmyzu prostredníctvom extracelulárneho šírenia vírusu (BV) z povrchu buniek. BV forma vírusu je zodpovedná za šírenie vírusu medzi bunkami u infikovaného hmyzu, rovnako ako za prenos infekcie v bunečnej kultúre.

Neskôr, v infekčnom cykle (12 hodín p. i.) môže byť v infikovaných bunkách detekovaný polyhedrínový proteín. Za 18 - 24 p. i. sa polyhedrínový proteín skladá v jadre infikovanej bunky a vírusové častice sa zanorujú do proteínových oklúzií. Vírusové oklúzie sa akumulujú vo veľkom počte 4-5 dní, do lýzie bunky. Tieto polyhedrá nemajú aktívnu úlohu v šírení infekcie v larve. BV sa v hemolymfe množia a šíria, čo vedie k smrti larvy.

Po smrti infikovanej larvy zostávajú milióny polyhedier v rozkladajúcom sa tkanive, zatiaľ čo BV sa degradujú. Keď iná larva požrie polyhedrá, napríklad v kontaminovanom rastlinnom materiáli alebo inej potrave, cyklus sa opakuje.

Na záver, uzatvorená forma vírusu je zodpovedná za prvotnú infekciu hmyzu v čreve, rovnako ako za stabilitu vírusu v prostredí. ODV sú v podstate neinfekčné pri podaní infekciou, ale sú vysoko infekčné pri orálnom podaní. Neuzatvorená forma vírusu (t.j. BV) je zodpovedná za sekundárnu infekciu a infekciu medzi bunkami. BV sú vysoko infekčné pre bunky v kultúre alebo pre vnútorné tkanivá hmyzu pri injekcii, ale sú v podstate neinfekčné pri orálnom podaní.

Hlavnou prekážkou intenzívneho použitia insekticídnych bakulovírusov v poľnohospodárstve je doba medzi prvotnou infekciou hmyzu a jeho smrťou. Táto doba môže byť rádovo dni až týždne. Počas tohto obdobia hmyz pokračuje v príjme potravy, čo ďalej poškodzuje rastliny. Kvôli skráteniu tohto stavu sa pripravili rekombinantné bakulovírusy, ktoré exprimujú substancie kontrolujúce alebo modifikujúce hmyz, ako sú toxíny, neuropeptidy, hormóny alebo enzýmy (Tomalski,

587/B ·· ···· • · · · · · ··· · ·· ·· ·

M. D. a kol., Náture, 352, 82 - 85 (1991), Federici, In Vitro, 28, 50A (1992), Martens a kol., App. and Envir. Microbiology, 56, 2764 - 2770 (1990), Menn a kol., Agric. Food Chem., 37, 271 - 278 (1989), Eldridge a kol., Insect Biochem., 21, 341 - 351 (1992), Hammock a koľ, Náture, 344, 458-461 (1990)).

Druhou hlavnou prekážkou použitia insekticídnych bakulovírusov je obmedzený rozsah ich hostiteľov. Hoci obmedzený rozsah hostiteľov pre bakulovírusy ich robí bezpečnými pre iné ako cieľové organizmy, znemožňuje im tiež kontrolu rôznych škodcov čeľade Lepidopteran prítomných na poli. Toto hlavne platí vtedy, keď komplex hmyzu čeľade Lepidopteran, ktorý sa má kontrolovať, zahrňuje hmyz, ktorý je buď nepermisívny alebo semipermisívny na infekciu použitým insekticídnym bakulovírusom. Hmyz, ktorý je nepermisívny pre infekciu, je taký hmyz, ktorý nemôže byť produktívne infikovaný akoukoľvek dávkou; hmyz, ktorý je semipermisívny pre infekciu, je taký hmyz, ktorý môže byť produktívne infikovaný dávkou vírusu, ktorá je aspoň o jeden, častejšie však o dva alebo viac rádovo vyššia ako dávka nutná pre produktívnu infekciu citlivých hostiteľov, t.j. permisívnych hostiteľov. Pred predkladaným vynálezom nebol identifikovaný žiaden bakulovírus rodu Nucleopolyhedrovírus, pre ktorý je pradiarka poľná, Plutella xylostella, permisívnym hostiteľom. Tento hmyz je významný škodca na mnohej zelenine a vyvinula sa u neho rezistencia ako na chemické, tak na biologické insekticídy.

Preto existuje potreba biologických insekticídov, ktoré majú (i) lepšiu účinnosť a kratšiu dobu medzi infekciou a mortalitou a (ii) väčší rozsah hostiteľov, ktorý umožní kontrolu širokého rozsahu hmyzích škodcov čeľade Lepidopteran, vrátane, napríklad Plutella xylostella.

Podstata vynálezu

Predkladaný vynález poskytuje rekombinantné bakulovírusy pre Plutella xylostella (PxNPV), ktoré majú lepšiu insekticídnu aktivitu proti Plutella xylostella ako iné prirodzené a rekombinantné bakulovírusy.

Rekombinantné PxNPV podľa predkladaného vynálezu sú PxNPV obsahujúce jednu alebo viacero genetických alterácií vzhľadom k prirodzenému PxNPV. Medzi

587/B ·· ···· ·· ···· genetické alterácie patrí napríklad vloženie alebo delécia jedného alebo viacerých reštrikčných miest; modifikácia, delécia alebo duplikácia jedného alebo viacerých génov kódovaných vírusom; a vloženie jedného alebo viacerých génov kódujúcich heterológne proteíny, t.j. proteíny, ktoré nie sú kódované vírusom alebo sú kódované iným vírusom.

Výhodne obsahujú rekombinantné PxNPV vo svojich genómoch sekvenciu nukleovej kyseliny kódujúcu substanciu ovplyvňujúcu hmyz, ako je napríklad insekticídny toxín, peptidový hormón, enzým alebo receptor, ktorá je operatívne naviazaná na promótor schopný aktivovať transkripciu v cieľovom hmyze. Najlepšie je substanciou ovplyvňujúcou hmyz insekticídny toxín. Predpokladá sa, že rekombinantný bakulovírus kódujúci insekticídny toxín v kontexte s PxNPV genómom bude mať výrazne lepšie insekticídne vlastnosti.

Príkladmi insekticídnych toxínov sú AalT, AaHITI, AaHIT2, LqhlT2, LqqlTI, LqqlT2, BjlT1, BjlT2, LqhP35, LqhalfalT, SmplT2, SmpCT2, SmpCT3, SmpMT, DK9.2, DK11, DK12, μ-agatoxín, King Kong toxín, Pt6, NPS-326, NPS-331, NPS373, Tx4(6-1), TxP-1, omega-atratoxíny, alfa-konotoxíny, μ-konotoxíny, chlorotoxín a omega-konotoxíny. V niektorých vyhotoveniach sa použil prirodzený sekrečný signálny peptid, t.j. signálny peptid asociovaný s toxínom; v iných vyhotoveniach sa použil heterológny signálny peptid na navodenie sekrécie toxínu z infikovaných hmyzích buniek. Príkladmi použiteľných heterológnych signálnych peptidov sú peptidy odvodené od pBMHPC-12 signálnej sekvencie z Bombyx mori; signálna sekvencia adipoklnetického hormónu z Mandura sexta; apolipoforínová signálna sekvencia z Manduca sexta; choriónová signálna sekvencia z Bombyx mori; kutikulová signálna sekvencia zDrosophila melanogaster; signálna sekvencia esterázy-6 z Drosophila melanogaster; a pohlavne špecifická signálna sekvencia z Bombyx mori.

Vynález tiež zahrňuje priame ligačné vektory, ktoré sú navrhnuté kvôli uľahčeniu konštrukcie v rekombinantných PxNPV genómov pomocou ligácie DNA fragmentov in vitro. Vloženie DNA vzniknutej pri takejto ligácii do vhodného hostiteľa vedie k produkcii rekombinantných PxNPV.

587/B ·· ···· ·· ····

V inom aspekte vynález poskytuje expresné kazety kódujúce insekticídne toxíny. Expresné kazety obsahujú promótorovú sekvenciu, výhodne odvodenú od Drosophila meianogaster hsp70 promótora, ktorá je operatívne naviazaná na sekvenciu nukleovej kyseliny kódujúcej toxín. Expresné kazety podľa predkladaného vynálezu môžu byť tiež obsiahnuté v plazmidových vektoroch, ktoré sú navrhnuté ako modulárne expresné vektory.

V ešte inom vyhotovení vynález poskytuje gény s optimalizovanými kodónmi kódujúce hmyzie toxíny, ako sú napríklad gény uvedené na obr. 10 a 11, ďalej. Gény s optimalizovanými kodónmi sú tie gény, v ktorých boli jednotlivé kodóny prítomné v prirodzenej sekvencií kódujúcej toxín substituované alternatívnymi kodónmi, ktoré sú účinnejšie využívané aparátom syntetizujúcim proteíny v hmyzej bunke.

V ešte inom aspekte vynález poskytuje insekticídne kompozície a prípravky obsahujúce aspoň jeden rekombinantný PxNPV podľa predkladaného vynálezu a poľnohospodársky prijateľný nosič.

V ešte inom aspekte vynález poskytuje spôsob ničenia hmyzích škodcov a redukcie zamorenia škodcami, ktorý obsahuje aplikáciu insekticídne účinného množstva insekticídnej kompozície alebo prípravku obsahujúceho PxNPV do danej oblasti.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1 je schematické znázornenie postupov použitých na prípravu pmd 205.1, pmd 216.1 a pmd 220.2 vektorov na produkciu rekombinantných PxNPV s deletovaným génom pre vírusovú ecdysteroid glukózytransferázu (egt).

Obr. 2 je schematické znázornenie postupov použitých na prípravu vektoru LAB 50.2.

Obr. 3 je schematické znázornenie štruktúry pMEV modulárnych expresných vektorov.

587/B ·· ···· ·· ···· ···· ·· ·· · ·

Obr. 4 je schematické znázornenie pMEV vektorov obsahujúcich rôzne promotory.

Obr. 5 je schematické znázornenie klonovania sekvencií do modulárnych expresných vektorov.

Obr. 6 ukazuje D. melanogaster hsp70 promótorový modul v pMEV5 a amplifikačné priméry použité na izoláciu sekvencie.

Obr. 7 ukazuje D. melanogaster hsp70 promótorový modul v pMEV6 a amplifikačné priméry použité na izoláciu sekvencie.

Obr. 8 je ilustrácia DNA sekvencie s optimalizovanými kodónmi kódujúcej AalT a ukazuje oligonukleotidy a amplifikačné priméry použité na syntézu sekvencie.

Obr. 9 je schematické znázornenie štruktúry pMEV/ADK modulárnych expresných vektorov.

Obr. 10 je ilustrácia DNA sekvencie s optimalizovanými kodónmi kódujúcej LqhlT2 toxín a ukazuje oligonukleotidy a amplifikačné priméry použité na syntézu sekvencie.

Obr. 11 je ilustrácia DNA sekvencie s optimalizovanými kodónmi kódujúca omega-ACTX-HV1 toxín a ukazuje oligonukleotidy a amplifikačné priméry použité na syntézu sekvencie.

Podrobný popis vynálezu

Pri vykonávaní predkladaného vynálezu sa môže použiť veľa techník molekulárnej biológie, mikrobiológie, rekombinantnej DNA, proteínovej biochémie a hmyzej virológie známych odborníkom v odbore, ako sú plne vysvetlené v, napríklad, Sambrook a kol., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vy d., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Gold Spring Harbor, New York; Oligonucleotide Synthesis, 1984 (M. L. Gait, ed.); Ausubel a kol., Current Protocols in Molecular Biology, 1997 (John Wíley and Sons); séria Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Protein Purification: Principles and Practice, 2. vyd. (Springer-Verlag, N.Y.); Summers a kol., A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Celí

587/B ·· ···· ·· ····

···· ·· ·· ·· ·

Culture Procedures, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin č. 1555, 1987, a O'Reilly a kol., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, 1994 (Oxford Univ. Press, N.Y.).

Predkladaný vynález poskytuje izolované, prečistené, rekombinantné Plutella xylostella bakulovírusy (PxNPV), ktoré sú použiteľné ako biologické insekticídy. PxNPV, ako je tu použitý, označuje izolát bakulovírusu rodu Nucleopolyhedrovirus (NPV), ktorého prirodzená verzia bola izolovaná z infikovaných lariev Plutella xylostella a ktorý je geneticky odlišný od iných známych bakulovírusov a ktorý vykazuje vyššiu infektivitu pre larvy Plutella xylostella ako ostatné bakulovírusy. Genómové sekvencie rekombinantných PxNPV podľa predkladaného vynálezu, s vylúčením heterológnych sekvencií, vykazujú aspoň 90 % identitu sekvencie, a lepšie aspoň 95 % identitu sekvencie, s genómovou sekvenciou PxNPV uloženou ako ATCC VR-2607. PxNPV spadajúci do rozsahu predkladaného vynálezu sa môže identifikovať:

(i) Meraním infektivity pre larvy Plutella xylostella. PxNPV podľa predkladaného vynálezu zvyčajne vykazuje infektivitu pre larvy Plutella xylostella, ktorá je aspoň o dva rády vyššia ako je infektivita V8 kmeňa AcMNPV uloženého ako ATCC VR-2465.

(ii) Trávením vírusovej genómovej DNA Hindlll, Xhol a/alebo Pstl a porovnaním vzniknutých reštrikčných fragmentov s fragmentmi produkovanými trávením genómovej DNA odvodenej od PxNPV a non- PxNPV bakulovírusov. PxNPV podľa predkladaného vynálezu, s vylúčením fragmentov vzniknutých v dôsledku genetických zmien, má reštrikčné fragmenty charakteristické pre PxNPV, t.j. fragmenty, ktoré vznikajú pri trávení PxNPV a nevznikajú pri trávení DNA iných bakulovírusov.

Vynálezcovia zistili, že rekombinantný PxNPV podľa predkladaného vynálezu má lepšiu insekticídnu aktivitu na larvy Plutella xylostella v porovnaní s prirodzenými PxNPV a/alebo rekombinantnými NPV odvodenými od iných druhov bakulovírusov. Rekombinantné PxNPV podľa predkladaného vynálezu sú PxNPV, ktoré obsahujú jednu alebo viacero genetických alterácií vzhľadom k prirodzenému PxNPV. Termín „genetická alterácia,, označuje akúkoľvek zmenu v sekvencii genómu PxNPV, vrátane, napríklad, vloženia alebo delécie jedného alebo viacerých reštrikčných

587/B ·· ···« ·· ···· • · · · · · • · · · · • · · · · · • · · · · · · ···· ·· ·· ·· ·· • · · ·· miest; modifikácie, delécie alebo duplikácie jedného alebo viacerých génov kódovaných vírusom; a vloženia jedného alebo viacerých génov kódujúcich heterológne proteíny, t.j. proteíny, ktoré nie sú kódované vírusom alebo sú kódované iným vírusom. Napríklad, modifikované PxNPV, ktorých genómy obsahujú reštrikčné miesta neprítomné v prirodzených PxNPV, alebo naopak, ktoré neobsahujú jedno alebo viacero reštrikčných miest prítomných v prirodzenom PxNPV, spadajú do rozsahu predkladaného vynálezu. Termín „reštrikčné miesto,, označuje sekvenciu nukleovej kyseliny, ktorá je rozpoznávacím miestom pre reštrikčnú endonukleázu. Zvyčajne sa vykoná adícia a/alebo delécia jedného alebo viacerých reštrikčných miest kvôli vytvoreniu klonovacieho miesta neprítomného v prirodzenom PxNPV, t.j. kvôli vytvoreniu sekvencie obsahujúcej aspoň jedno jedinečné reštrikčné miesto na vloženie heterológneho génu do genómu PxNPV. Výhodne obsahuje rekombinantný PxNPV vo svojom genóme aspoň jeden heterológny gén, vrátane napríklad génov kódujúcich substancie ovplyvňujúce hmyz, ako sú napríklad insekticídne toxíny, hormóny, enzýmy alebo receptory.

Najlepšie obsahuje rekombinantný PxNPV heterológny gén kódujúci insekticídny toxín. Medzi vhodné insekticídne toxíny patria napríklad toxíny uvedené v nasledujúcej tabuľke:

Toxín	Odkaz
AalT, AaHITI, AaHIT2	Darbon a kol., Int. J. Peptide Proteín Res., 20, 320 - 330, 1982; Loreta kol., Biochem., 29, 142- 1501, 1990
LqhlT2	Zlotkin a koľ, Biochem., 30, 4814 - 4821, 1991; Zlotkin a kol., Európska patentová prihláška EP 0374753 A2, 1990
LqqlTI, LqqlT2	Zlotkin a kol., Árch. of Biochem. and Biophys., 240, 877 - 887, 1985; Zlotkin a kol., Európska patentová prihláška EP 0374753A2, 1990
BjlT1, BjlT2	Loret a kol., Biochem. Biophys. Acta, 701, 370 - 387, 1982; Zlotkin a kol., Európska patentová prihláška, EP 0374753 A2, 1990
LqhP35	Zlotkin a kol., Európska patentová prihláška EP 0374753

587/B ·· ···· ·· ···· ···· ·· ·· ·· ·· ·

	A2, 1990
LphalfalT	Eitan a kol., Biochem., 29, 5941 - 5947, 1990
SmplT2	Zlotkin a kol., Európska patentová prihláška EP 0374753 A2, 1990
SmpCT2	Zlotkin a koľ, Európska patentová prihláška EP 0374753 A2, 1990
SmpCT3	Zlotkin a kol., Európska patentová prihláška EP 0374753 A2, 1990
SmpMT	Zlotkin a kol., Európska patentová prihláška EP 0374753 A2, 1990
DK9.2	Krapcho a kol., Medzinárodná patentová prihláška WO 92/15195, 1992
DK11	Krapcho a kol., Medzinárodná patentová prihláška WO 92/15195, 1992
DK12	Krapcho a kol., Medzinárodná patentová prihláška WO 92/15195, 1992
μ-agatoxín	Skinner a kol., J. Biol. Chem., 264, 2150 - 2155, 1989; Adams a kol., J. Biol. Chem., 265, 861 - 867, 1990
King Kong toxín	Hillyard a kol., Biochem., 28, 358 - 361, 1989
Pt6	Leisy a kol., Európska patentová prihláška EP 0556160 A2, 1993
NPS-326	Krapcho a kol., Medzinárodná patentová prihláška WO 93/15192, 1993
NPS-331	Krapcho a kol., Medzinárodná patentová prihláška WO 93/15192, 1993
NPS-373	Krapcho a kol., Medzinárodná patentová prihláška WO 93/15192, 1993
Tx4(6-1)	Figueriredo a kol., Toxicon, 33, 83 - 93,1995
TxP-1	Tomalski a koľ, Toxicon, 27, 1151 - 1167, 1989
omega - atrakotoxíny	Atkinson a kol., Medzinárodná patentová prihláška WO 93/15108, 1993

587/Β ·· ···· ·· ···· ·· • · · · • · B • · · B ···· BB ·· B ·· BB

alfa-konotoxíny	Gray a kol., J. Biol. Chem., 256, 4734 - 4740, 1981; Gray a kol., Biochem., 23, 2796-2802, 1984
μ-konotoxíny	Cruz a kol., J. Biol. Chem., 260, 9280 - 9288, 1989; Cruz a kol., Biochem., 28, 3437- 3442, 1989
chlorotoxín	Debin a kol., Am. J. Physiol., 264, 361 - 369, 1993
omega - konotoxíny	Olivera a kol., Biochem., 23, 5087 - 5090, 1984; Riviér a koľ, J. Biol. Chem, 262, 1194-1198, 1987

Sekvencia kódujúca toxín je operatívne naviazaná na promótor, t.j. promótorová sekvencia je umiestnená pred sekvenciou kódujúcou toxín tak, že expresia toxínu je pod kontrolou promótora. Promótor môže byť promótor odvodený od bakulovírusu, ako je napríklad DA26, 35K, 6,9K a polyhedrínový (polh) promótor (O'Reilly a kol., J. Gen. Virol, 71, 1029 (1990); Friesen a kol., J. Virol, 61, 2264, 1987; Wilson a kol., J. Virol., 61, 661 -666, 1987; Hooft van Iddekinger a kol., Virol., 131, 561, 1983; a všeobecne pozri Miller, ed., The Baculoviruses, Plénum Press, New York, 1997). Alternatívne sa môže použiť promótor hostiteľskej bunky, ako je napríklad hmyzí hsp70 promótor alebo aktinový promótor. Môže sa použiť akýkoľvek prirodzený alebo syntetický promótor aktívny v navodení transkripcie v cieľových hmyzích bunkách.

Ďalej, DNA sekvencia kódujúca toxín môže obsahovať pred sebou sekvenciu kódujúcu signálny peptid, ktorý - vo svojej pôvodnej bunke - riadi sekréciu toxínu. Alternatívne môže byť sekvencia kódujúca toxín fúzovaná v rámci s predchádzajúcou DNA sekvenciou kódujúcou heterológnu signálnu sekvenciu, t.j. sekvenciu odvodenú z iného zdroja, vrátane napríklad sekvencii odvodených zpBMHPC-12 signálnej sekvencie z Bombyx mori; signálnu sekvenciu adipokinetického hormónu z Mandura sexta; apolipoforínové signálne sekvencie z Manduca sexta; choriónové signálne sekvencie z Bombyx mori; kutikulové signálne sekvencie z Drosophila melanogaster; signálne sekvencie esterázy-6 z Drosophila melanogaster; a pohlavne špecifické signálne sekvencie z Bombyx mori, ktoré sú všetky popísané v U.S. patente č. 5 547 871.

587/B ·· ···· ·· ···· ···· ·· ·· ·· • · • · · · • · · • · · · ·· ·

V niektorých vyhotoveniach obsahujú PxNPV podľa predkladaného vynálezu vo svojom genóme gén kódujúci prirodzenú alebo mutantnú esterázu juvenilného hormónu (JHE), ktorej expresia môže spôsobiť ireverzibilné ukončenie príjmu potravy a zakuklenie, a tak môže viesť k smrti cieľového hmyzu, pozri napríklad WO 94/03588.

Rekombinantné PxNPV sa môžu tiež pripraviť genetickým upravením prirodzeného alebo preexistujúceho rekombinantného PxNPV kmeňa tak, že výsledkom je modifikácia jednej alebo viacerých funkcií kódovaných vírusom. Napríklad jeden alebo viacero vírusových génov, ako sú napríklad gény kódujúce vírusový polyhedrínový proteín, ecdysteroid glukozyltransferázu (EGT) alebo p10 proteín, sa môžu modifikovať, deletovať alebo duplikovať. Okrem toho môžu byť vložené sekvencie odvodené od iných bakulovírusov, ako je napríklad región V8 kmeňa AcMNPV, ktorý obsahuje determinant vedúci k fenotypu s rýchlejším usmrcovaním, ako je popísané v U.S. patente č. 5 662 897.

Príklady rekombinantných PxNPV podľa predkladaného vynálezu sú tie, ktoré majú ATCC prírastkové č. VR-2607, VR-2608 a VR-2609.

Predkladaný vynález poskytuje spôsoby a prípravky pre konštrukciu rekombinantných PxNPV. Na prípravu rekombinantných PxNPV sa môže použiť akákoľvek metóda známa v odbore. Napríklad, súčasná infekcia vhodnej hostiteľskej bunky dvoma kmeňmi PxNPV môže viesť k homológnej rekombinácii medzi dvoma príbuznými sekvenciami in vivo, ktorá môže viesť k vzniku rekombinantného PxNPV. Podobne môže homológna rekombinácia prebehnúť in vivo v bunkách súčasne transfektovaných prečistenou genómovou DNA PxNPV vírusu a druhou nukleovou kyselinou obsahujúcou PxNPV sekvencie. Alternatívne môže byť rekombinantný PxNPV pripravený vložením izolovanej vírusovej genómovej DNA, ktorá bola vopred modifikovaná in vitro, do buniek.

V jednej sérii vyhotovenia sú rekombinantné PxNPV pripravené za použitia vektorov na priamu ligáciu a modulárnych expresných vektorov. Tieto zložky a spôsoby ich použitia na prípravu rekombinantných PxNPV sú popísané ďalej.

587/B ·· ···· • · ···· • · · • · • · • · e ···· ·· • · · • · · • · · · • · · · ·· *· ·· • · · • · • · · • · ·· ·

Vektory na priamu ligáciu odvodené od PxNPV

Vírusové vektory na priamu ligáciu obsahujú prečistené genómové DNA PxNPV vírusy, ktoré sa môžu použiť pre konštrukciu rekombinantných PxNPV genómov pomocou DNA ligácie in vitro. Vektory na priamu ligáciu riadia produkciu rekombinantných PxNPV viriónov po vnesení do vhodnej hostiteľskej bunky. V niektorých vyhotoveniach obsahujúcich PxNPV vektory na priamu ligáciu PxNPV genómovú DNA, ktorá bola modifikovaná tak, aby obsahovala aspoň jedno klonovacie miesto, ktoré nie je prítomné v prirodzenom PxNPV. Klonovacie miesto obsahuje jedno alebo viacero reštrikčných miest, ktoré buď nie sú prítomné v genóme prirodzeného PxNPV alebo nie sú prítomné v nukleovej kyseline kódujúcej alebo regulujúcej základné funkcie PxNPV vírusu. V druhom prípade sú vektory na priamu ligáciu podľa predkladaného vynálezu upravené tak, aby mali deletované akékoľvek reštrikčné miesta, ktoré sú mimo klonovacie miesto, takže klonovacie miesto obsahuje jedno jedinečné reštrikčné miesto. Trávenie vektoru na priamu ligáciu jedným alebo viacerými reštrikčnými enzýmami špecifickými pre klonovacie miesto potom vedie k zisku DNA prípravku, do ktorého sa môže vložiť heterológny segment nukleovej kyseliny, zvyčajne v jednom ligačnom kroku, bez narušenia základných vírusových funkcií. Po ligácii heterológnej nukleovej kyseliny do vektoru na priamu ligáciu môže byť vzniknutý DNA prípravok vložený do vhodnej hostiteľskej bunky kvôli propagácii rekombinantného PxNPV. Priame ligačné vektory zjednodušujú produkciu rekombinantných PxNPV tým, že eliminujú závislosť od rekombinácii in vivo tvoriacich rekombinantné vírusy, pozri napríklad Medzinárodná patentová prihláška WO 94/28114.

Klonovacie miesta na použitie v PxNPV priamych ligačných vektoroch sú navrhnuté najprv pomocou výberu jedného alebo viacerých reštrikčných enzýmov, ktoré buď (i) netrávia PxNPV DNA vôbec alebo (ii) rozpoznávajú malý počet miest, ktoré neležia v nukleovej kyseline kódujúcej alebo regulujúcej základné funkcie PxNPV vírusu. Selekcia sa vykoná (i) počítačovým prehľadávaním PxNPV DNA sekvencie alebo (ii) trávením PxNPV DNA enzýmom a detekciou prítomnosti alebo neprítomnosti produktov trávenia. Pokiaľ enzým rozpoznáva malý počet miest, tak môžu byť tieto miesta narušené, za použitia bežných techník (ako je napríklad

587/B ·· ···· ·· ···· • · · • · • · • · · ···· ·· • · · • · · • · · • · · · ·· ·« • · • · ·· · trávenie reštrikčným enzýmom nasledované zakončením lepivými koncami a religáciou) za zisku PxNPV DNA, ktorá neobsahuje tieto miesta, ale zachováva si vírusovú replikáciu a infektivitu.

Po selekcii jedného alebo viacerých reštrikčných miest sa klonovacie miesto vloží akýmikoľvek vhodnými prostriedkami, vrátane homológnej rekombinácie in vivo alebo ligácie in vitro, do PxNPV DNA (či prirodzenej alebo modifikovanej, ako je popísané vyššie pre inaktiváciu jedného alebo viacerých reštrikčných miest). Výhodne obsahuje klonovacie miesto aspoň neprekrývajúce sa reštrikčné miesta kvôli umožneniu (i) priameho klonovania inzertu nukleovej kyseliny a/alebo (ii) nezávislej inzercie mnohých inzertov nukleovej kyseliny.

Na prípravu priamych ligačných vektorov z PxNPV sa môžu vložiť ďalšie modifikácie, vrátane napríklad modifikácií, ktoré vedú k inaktivácii vírusového génu, ako je napríklad gén kódujúci polyhedrín, ecdysteroid glukozyltransferázu (EGT) alebo p10 proteín. V niektorých vyhotoveniach je klonované miesto vložené v mieste, v ktorom spôsobí takúto inaktiváciu.

Modulárne expresné vektory a expresné kazety

Modulárne expresné vektory na použitie v predkladanom vynáleze sú plazmidové vektory obsahujúce expresnú kazetu, ktorá sa môže excidovať z modulárneho expresného vektoru a ligovať do PxNPV priamych ligačných vektorov popísaných vyššie. Zvyčajne expresná kazeta obsahuje v smere 5'-3': promótorovú sekvenciu operatívne naviazanú na 5' netranslatovaný región (UTR), ktorá obsahuje štart miesto pre transkripciu; sekvenciu obsahujúcu jedno alebo viacero reštrikčných miest kvôli uľahčeniu inzercie heterológneho génu (táto sekvencia je označená „inzerčné miesto,,); a 3' UTR sekvenciu obsahujúcu aspoň miesto na spracovanie 3' terminálnej mRNA a polyadenyláciu. Expresná kazeta susedí na jednom z koncov s vhodnými reštrikčnými miestami kompatibilnými s PxNPV priamym ligačným vektorom.

587/B ·· ···· ·· ···· ·· • · ··· ···· • · · · · · · • ···· ···· ···· ·· ·· ·· ·· ···

Medzi vhodné promótory na použitie v modulárnych expresných vektoroch patria bakulovírusové promótory a promótory hostiteľských buniek. Medzi vhodné bakulovírusové promótory patria napríklad DA26, 35K, 6.9K a polyhedrínový (polh) promótor. Medzi vhodné promótory hostiteľskej bunky patrí napríklad hsp70 a aktívny promótor, výhodne odvodený od hmyzu. Sekvencia „odvodená od„ promótorovej sekvencie je sekvencia obsahujúca modifikácie, vrátane delécií, inzercií, substitúcií a duplikácií prirodzenej promótorovej sekvencie. Jedinou požiadavkou je účinnosť konečného promotoru v cieľových hmyzích bunkách v zmysle riadenia expresie heterológneho génu, na ktorý je operatívne naviazaná.

Expresné kazety môžu tiež obsahovať sekvencie kódujúce signálne sekvencie, ktoré riadia sekréciu heterológneho proteínu. Signálne sekvencie môžu byť sekvencie asociované s heterológnym proteínom alebo môžu byť odvodené od iného proteínu. Medzi vhodné signálne sekvencie patria napríklad sekvencie odvodené od pBMHPC-12 signálnej sekvencie z Bombyx mori; od signálnej sekvencie adipokinetického hormónu z Mandura sexta; od apolipoforínovej signálnej sekvencie z Manduca sexta; od choriónovej signálnej sekvencie z Bombyx mori; od kutikulovej signálnej sekvencie z Drosophila melanogaster; od signálnej sekvencie esterázy-6 z Drosophila melanogaster; a od pohlavne špecifickej signálnej sekvencie z Bombyx mori. Sekvencia nukleovej kyseliny kódujúcej signálny peptid je inzertovaná medzi 5-UTR a začiatok zrelého heterológneho proteínu. Spoj medzi 3'koncom sekvencie kódujúcej signálny peptid a začiatkom zrelého heterológneho proteínu je navrhnutá tak, aby inzercia heterológnej sekvencie viedla k vzniku fúzneho proteínu medzi signálnym peptidom a heterológnou sekvenciou v čítacom rámci. Sekvencia „odvodená od„ známej signálnej sekvencie je sekvencia obsahujúca modifikácie, vrátane delécií, inzercií a substitúcií aminokyselinových zvyškov v signálnej sekvencii. Jedinou požiadavkou je účinnosť vzniknutej signálnej sekvencie v cieľových hmyzích bunkách v zmysle riadenia sekrécie heterológnej sekvencie, na ktorú je naviazaná, z hmyzích buniek.

Heterológne sekvencie na použitie v predkladanom vynáleze zahrňujú, napríklad, sekvencie kódujúce substancie ovplyvňujúce hmyz, ako sú napríklad insekticídne toxíny, hormóny, enzýmy a receptory. Medzi vhodné insekticídne toxíny

587/B ·· ···· ·· ···· • · · · · ···· • · · · · · ·

4Γ · ········ ι u ········· ···· ·· ·· ·· ·· · patria napríklad AalT, AaHITI, AaHIT2, LqhlT2, LqqlTI, LqqlT2, BjlT1, BjlT2,

LqhP35, LqhalfalT, SmplT2, SmpCT2, SmpCT3, SmpMT, DK9.2, DK11, DK12, μagatoxín, King Kong toxín, Pt6, NPS-326, NPS-331, NPS-373, Tx4(6-1), TxP-1, omega-atratoxíny, alfa-konotoxíny, μ-konotoxíny, chlorotoxín a omega-konotoxiny.

Sekvencie nukleovej kyseliny kódujúce substanciu ovplyvňujúcu hmyz a/alebo signálne peptidy môžu zodpovedať prirodzeným sekvenciám nukleovej kyseliny kódujúcim tieto peptidy. Alternatívne môžu byť sekvencie zmenené tak, aby využívali optimálne kodóny pre známe gény vo vírusovom vektore (alebo v blízkych príbuzných kmeňoch) a/alebo v hmyze, ktoré sú cieľom insekticídnych vírusov podľa predkladaného vynálezu. Sekvencie s optimalizovanými kodónmi, t.j. sekvencie, v ktorých bola sekvencia nukleovej kyseliny kódujúca určitú aminokyselinu modifikovaná bez zmeny aminokyseliny kódovanej v tejto pozícii, sa môžu navrhnúť s použitím metód dobre známych v odbore, ako je napríklad porovnanie využitia kodónov v známych génových sekvenciách vírusu a/alebo cieľového hmyzu a v sekvenciách nukleovej kyseliny kódujúcich signálne peptidy a substancie ovplyvňujúce hmyz podľa predkladaného vynálezu. Vhodne odráža použitie kodónov v sekvenciách kódujúcich signálne peptidy a substancie ovplyvňujúce hmyz použitie kodónov vo vírusovom vektore alebo v cieľovom hmyze. Príklady sekvencii toxínu s optimalizovanými kodónmi sú uvedené na obr. 10 a 11.

Produkcia rekombinantných PxNPV

Rekombinantné PxNPV sa môžu produkovať buď (i) súčasnou transfekciou PxNPV DNA a heterológnej sekvencie do vhodnej hostiteľskej bunky kvôli umožneniu homológnej rekombinácie in vivo, alebo (ii) in vitro ligáciou heterológnej sekvencie do priameho ligačného vektoru, po ktorej nasleduje vloženie konštruktu do vhodnej hostiteľskej bunky kvôli umožneniu propagácie vírusu. Vhodnou hostiteľskou bunkou je akákoľvek bunka podporujúca replikáciu bakulovírusu, vrátane napríklad Sf9 buniek, Sf21 buniek a High Five™ buniek (Invitrogen, Carlsbad, CA). Izolovaný vírus podľa predkladaného vynálezu je vírus, ktorý bol klonovaný, napríklad pomocou prečistenia plakov v tkanivovej kultúre alebo ktorý bol inak pripravený z jedného vírusového genotypu.

587/B • e • ··· ···· »· ···· • ···· ···· ··· · · · · ·· ···· ·· ·· · ·· ·

Zvyčajne je modulárny expresný vektor konštruovaný tak, aby obsahoval expresnú kazetu, v ktorej je vhodná promótorová sekvencia operatívne naviazaná na sekvenciu kódujúcu heterológny proteín, t.j. expresia heterológneho proteínu je pod kontrolou promótora. Expresná kazeta je excidovaná z modulárneho expresného vektora a je inzertovaná do PxNPV priameho ligačného vektoru DNA ligáciou in vitro. Ligačná zmes sa potom prenesie do vhodnej hostiteľskej bunky. Rekombinantné PxNPV sú získané z kultivačného média a akoukoľvek vhodnou metódou sú stanovené LC50 a LT50, vrátane napríklad testu postreku potravy, testu inkorporácie do potravy a testov namočenia listov.

LC₅o je koncentrácia vírusu, pri ktorej hynie 50 % infikovaných lariev v priebehu trvania testu. ĽT₅₀ je čas po infekcii, kedy 50 % infikovaných lariev hynie po expozícii určitej dávke vírusu.

Výhodne má PxNPV podľa predkladaného vynálezu LC₅₀ približne 1 x 10⁵ OBs/16 cm² alebo menej pre larvy Plutella xylostella pri meraní štandardným testom nanesenia vírusu na potravu, ktorý je popísaný v príklade 6. Iné bakulovírusové izoláty majú zvyčajne vyššie l_C₅o pre larvy Plutella xylostella, t.j. sú menej účinné, vzhľadom k ich infektivite pre iné druhy hmyzu.

Insekticídne kompozície a prípravky

Predkladaný vynález poskytuje insekticídne kompozície a prostriedky, ktoré obsahujú jeden alebo viacero rekombinantných PxNPV. Výhodne usmrcuje rekombinantný PxNPV podľa predkladaného vynálezu larvy Plutella xylostella účinnejšie ako prirodzený PxNPV alebo rekombinantné verzia iných bakulovírusov (pozri napríklad príklad 11 ďalej).

Insekticídna kompozícia podľa predkladaného vynálezu obsahuje aspoň jeden rekombinantný PxNPV. Insekticídny prípravok obsahuje aspoň jeden rekombinantný PxNPV v insekticídne účinnom množstve a poľnohospodársky prijateľný nosič. Insekticídne účinné množstvo je množstvo, ktoré spôsobuje detekovateľné zníženie zamorenia, ako sa prejaví množstvom alebo počtom hmyzích škodcov v danej oblasti alebo v danom množstve plodín; poškodením spôsobeným hmyzími

587/B ·· ···· ·· ···· ·· · ·· · ·· · ···· • · ··· ··· • ···· · · · · · • ·· · · · · ·· · ···· ·· ·· ·· ·· ··· škodcami; alebo akýmkoľvek iným vhodným parametrom zamorenia. Prípravok môže byť vo forme zmáčavých práškov, dispergovateľných granúl, granúl, suspenzií, emulzií, roztokov pre aerosóly, návnad a iných bežných formách insekticídnych prípravkov. Vhodnými nosičmi sú, napríklad, voda, alkohol, uhľovodíky alebo iné organické rozpúšťadlá alebo minerálne, živočíšne alebo rastlinné oleje alebo prášky ako je mastenec, hlinka, silikát alebo kremelina. Tiež môžu byť obsiahnuté zmáčavé činidlá, poťahovacie činidlá, činidlá na ochranu pred UV žiarením, disperzné činidlá a spojivá. Živiny ako je cukor sa môžu pridať kvôli zvýšeniu príjmu hmyzom a/alebo na prilákanie hmyzu. Činidlá zvyšujúce tekutosť, ako sú napríklad činidlá zvyšujúce tekutosť na báze hlinky, sa môžu pridať kvôli minimalizácii spekania zmáčavých práškov alebo iných suchých prípravkov. Prípravok sa môže vyrobiť vo forme potiahnutých častíc alebo vo forme mikroenkapsulovaného materiálu. Prostriedok musí byť nefytotoxický a nesmie poškodzovať integritu rekombinantného PxNPV obsiahnutého v prípravku tak, aby žiadne zložky prípravku nezhoršovali príjem prípravku hmyzom alebo akúkoľvek funkciu vírusu. Príklady prípravkov sú popísané v EP publikovanej prihláške 0 697 170 A1; PCT prihláške WA 92/191025 a v U.S. patente č. 4 948 586.

Insekticídne prípravky podľa predkladaného vynálezu môžu obsahovať jeden alebo viacero chemických insekticídov a/alebo jedno alebo viacero biologických kontrolných činidiel iných ako PxNPV. Medzi chemické insekticídy patria napríklad pyretroidy, pyrazolíny, organofosfáty, karbamáty, formadíny a pyroly, ktoré sú všetky dobre známe v odbore. Príklady zlúčenín sú popísané v PCT prihláškach 96/03048, 96/01055 a 95/95741. Medzi biologické kontrolné činidlá patria napríklad nonPxNPV bakulovírusy (prirodzené alebo rekombinantné); Bacillus thuringiensis, Nosema polyvora, M. grandis, Bracon mellitor, entomopatogénne huby a členovce.

Predkladaný vynález tiež poskytuje spôsob na ničenie hmyzích škodcov. Spôsob obsahuje kontaktovanie hmyzu s insekticídne účinným množstvom kompozície alebo prípravku podľa predkladaného vynálezu. Vynález tiež poskytuje spôsob na zníženie zamorenia plodín hmyzom, ktorý obsahuje aplikáciu insekticídne účinného množstva kompozície alebo prípravku podľa predkladaného vynálezu do danej oblasti. Insekticídne prípravky sa aplikujú za použitia bežných techník ako je napríklad postrek alebo práškovanie plodín. Zvyčajne sa prípravky aplikujú v dávke

587/B ·· ···· ·· ···· medzi približne 2,4 x 10⁸ a približne 2,4 x 10¹² OB/hektár (OB sú oklúzne telieska).

Účinné dávky závisia napríklad od cieľového hmyzu, použitého rekombinantného

PxNPV a od plodiny, ktorá sa ošetruje. Dávka obsahujúca insekticídne účinné množstvo sa môže určiť odborníkom v odbore za použitia bežných metód.

• · ·· · · · · · · ··· · ··· · ···· ·· ·· ·· ·· ·

Príklady uskutočnenia vynálezu

Nasledujúce príklady dokresľujú, ale neobmedzujú predkladaný vynález.

Príklad 1

Konštrukcia rekombinantného PxNPV obsahujúceho beta-galaktozidázu s deletovaným Egt

Nasledujúce pokusy boli vykonané pre prípravu rekombinantného PxNPV, v ktorom je gén pre vírusovú ecdysteroid glukozyltransferázu (egt) deletovaný a nahradený markerovým génom E. coli pre beta-galaktozidázu (beta-gal).

Zásoba prirodzeného PxNPV, ktorý bol pasážovaný na hmyze, sa plakovo prečistila s použitím bežných postupov popísaných v O' Reilly a kol., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, Oxford University Press, New York, NY, 199) kvôli príprave klonálnej zásoby vírusu pre genetické úpravy. Integrita tejto zásoby, označenej PxNPV-3, bola potvrdená porovnaním charakteru reštrukčných fragmentov s charakterom pôvodnej zásoby PxNPV. Biotesty proti panelu hmyzích druhov tiež potvrdili, že virulencia zodpovedá neklonovanému pôvodnému vírusu.

Obr. 1 ilustruje postup použitý pre konštrukciu prenosového vektoru pre narušenie egt génu v PxNPV inzerciou génu pre beta-galaktozidázu. Blízka podobnosť charakteru reštrikčných fragmentov AcNPV a PxNPV ukazuje na homológiu na úrovni DNA, ktorá umožňuje použitie prenosových vektorov na báze V8 kmeňa AcNPV, ktorý je popísaný v U.S. patente č. 5 662 897. Vektor obsahujúci beta-gal kazetu, označený pmd 216.1, bol pripravený nasledujúcim spôsobom. BamHl-až-Xbal fragment obsahujúci beta-gal gén pod kontrolou Drosophila melanogaster hsp70 promótoru sa izolovať z pAcDyl (Zuidema a kol., J. Gen. Virol., 71, 2201 (1990)). Tento fragment sa potom subklonoval do pBluescript™Sk+. (Stratagene, La Jolla, CA) medzi BamHi a Xbal miesta polylinkéra. Pst „G„ fragment

587/B ·· ·· ··· · · · · ·· ···· ·· ···· ······ ·· ·· ··

AcNPV kmeňa V8vEGTDEL, ktorý obsahuje egt gén a susedný región (pozri U.S. patent č. 5 662 897) sa potom subklonoval do polylinkéra pUC9 v PstI mieste. Vzniknutý plazmid sa označil pmd 205.1.

Konečný prenosový vektor sa pripravil vyhotovením štvorfragmentovej ligácie medzi (i) pBluescript™Sk+ tráveným BamHI a PstI, ktorý bol defosforylovaný teľacou črevnou fosfatázou; (ii) 0,975 kb Bg1 II- až Pvull fragmentom pmd 205.1; (iii) 3,86 kb Smal-až-Xbal beta-gal fragmentom pmd 216.1 a (iv) 1,6 kb Xbal-až-Pstl fragmentom pmd 205.1. Výsledný prenosový vektor, označený pmd 220.2, obsahoval markerový beta-gal gén riadený hsp70 klonovaný do miesta egt delécie.

Beta-gal označený PxNPV s deletovaným egt génom sa pripravil homológnou rekombináciou medzi pmd 220.2 a PxNPV-3 DNA súčasne transfektovanými do kultivovaných Sf-9 buniek. 1 μg pmd 220.2 DNA a 250 ng PxNPV-3 DNA sa miešali s 252 pg Lipofectinu (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) v konečnom objeme 200 μΙ TNMFH (JRH Biosciences, Lenexa, KS). Po inkubácii pri teplote okolia po dobu 15 minút sa zmes preniesla do konečného objemu 2,0 ml TNM-FH kompletného média (TNMFH plus 10 % fetálne hovädzie sérum a 1 % plurinic F68 (Gibco BRL, Gaithersburg, MD)). Zmes sa prevrstvila cez 2,75 x 10⁵ Sf-9 buniek, ktoré sa potom kultivovali v jamkách štandardnej 6-jamkovej tkanivovej kultivačnej platne. Bunkám sa menilo médium každých 24 hodín a vyvinutý vírus sa odoberal po ďalších 96 hodinách. Rekombinantné vírusy boli pozitívne na oklúzne telieska (occ+) a exprimovali betagal gén. Rekombinanty (occ+/modré plaky) sa identifikovali troma kolesami plakového prečistenia za prítomnosti 100 pg/ml 5-bróm-4-chlór-3-indolyl-beta-Dgalaktopyranozidu (X-gal). Výsledný vírus sa označil T96-19.1.1.1.

Príklad 2

Konštrukcia priameho ligačného PxNPV vírusového vektora s deletovaným egt génom

587/B ·· ···· ·· ···· ·· · ·· ··· · · · ·· ·· ··· ··· • ···· · · · · · • · · ···· ·· · ···· ·· ·· ·· ·· ···

Nasledujúce pokusy boli vykonané na prípravu priameho ligačného vektoru odvodeného od PxNPV (pozri Medzinárodná patentová prihláška US 94/06079). Tento vektor obsahuje poly-spojovaciu sekvenciu (označenú „Bsu-Sse spojovacia sekvencia,,) inzertovanú do PxNPV genómu v egt mieste.

Na prípravu Bsu-Sse spojovacej sekvencie boli syntetizované dva oligonukleotidy, ktoré mali sekvencie:

5'-CCTCAGGGCAGCTTAAGGCAGCGGACCGGCAGCCTGCAGG-3' (Oligo 32) a

5'-CCTGCAGGCTGCCGGTCCGCTGCCTTAAGCTGCCCTGAGG-3' (Oligo 33).

Po tepelnom spracovaní kódujú tieto dva oligoméry niekoľko miest pre reštrikčné endonukleázy, vrátane Bsu 361 a Sse 83871 miest, ktoré sú použiteľné pri konštrukcii rekombinantných vírusov. Každý sa riedil na koncentráciu 30 pmól/μΙ do pufra kvôli tepelnému spracovaniu obsahujúceho 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM NaCl a 1 mM EDTA. Zmes sa zahriala na 95 °C na dobu 10 minút a potom sa pomaly ochladila na teplotu okolia v priebehu niekoľkých hodín.

Tepelne spracované oligonukleotidy sa inzertovali do pmd 205.1 prenosového vektora nasledujúcim spôsobom. Pmd 205.1 vektor sa trávil Spel, ktorý ho trávi v jedinom mieste umiestnenom tesne pred egt deléciou (obr. 2). Konce tráveného plazmidu sa doplnili Klenowovým fragmentom DNA polymerázy I za prítomnosti všetkých štyroch nukleotidov. 100 ng linearizovaného plazmidu sa potom ligovalo do 15 pmól dvojreťazcovej spojovacej sekvencie pomocou T4 DNA ligázy v celkovom objeme 10 μΙ. Po skončení ligačnej reakcie sa T4 ligáza inaktivovala teplom a zmes sa spracovala polynukleotid kinázou. 8,8 kb DNA prúžok sa prečistil elektroforézou v 1 % agarózovom géli preparatívnej čistoty s nízkou teplotou topenia (BioRad, Richmond, VA). Prúžok gélu obsahujúci 8,8 kb lineárnej DNA sa nechal roztopiť pri 65 °C a ligácia v géli za použitia približne 1/10 gólového prúžku sa použila pre recirkularizáciu DNA, ktorá sa potom použila na transformáciu DH5alfa, E. coli buniek.

587/B ·· ···· ·· ···· ·· ·· · · · ···· • · · · · e · • · · · · ···· ··· ···· · · ···· ·· ·· ·· ·· ·

Vzniknuté plazmidy sa vyšetrovali polymerázovou reťazovou reakciou (PCR) kvôli určeniu orientácie Bsu-Sse spojovacej sekvencie vzhľadom k egt génu. Oligo a 33 boli samostatne párované s oligomérom EGT 1 (5’GCGGCCAATATATTGGCCGTGTTT-3'), ktorý je špecifický pre región egt génu 5' na deléciu. Orientácia Bsu-Sse spojovacej sekvencie v LAB 50.2 je uvedená na obr. 2.

Priamy ligačný vektor PxNPV sdeletovaným egt génom sa pripravil homológnou rekombináciou medzi LAB 50.2 a T96-19.1.1.1 PxNPV vírusovou DNA, ktoré boli súčasne transfektované do kultivovaných Sf9 buniek spôsobom popísaným v príklade 1 za použitia 1 pg LAB 50.2 a 250 ng T96-19.1.1.1 vírusovej DNA. V tomto prípade boli rekombinantné vírusy pozitívne na oklúzne telieska a neexprimovali beta-gal gén. Rekombinantné (occ+/biele) vírusy boli identifikované troma kolesami plakového prečistenia za prítomnosti 100 μg/ml X-gal. Získaný vírus bol označený T97-8.1.1.1 (ATCC prírastkové č. VR-2608).

Príklad 3

Konštrukcia modulárnych expresných vektorov použiteľných na produkciu rekombinantných PxNPV A. pMEV 1-4

Návrh, konštrukcia a použitie vektorov pMEV1, pMEV2, pMEV3 a pMEV4 na expresiu cudzorodých génov pod kontrolou bakulovírusových promótorov sú popísané v Medzinárodnej patentovej prihláške US 94/06079. Tieto vektory majú všeobecnú štruktúru uvedenú na obr. 3. Každý vektor bol odvodený od pBluescript SK+ plazmidu (Stratagene, La Jolla, CA) substitúciou regiónu medzi Sstl a Xhol miestami v pBluescript poly-spojovacej sekvencie expresnou kazetou zloženou z nasledujúcich prvkov: (i) krátkej syntetickej spojovacej DNA s rozpoznávacími miestami pre reštrikčné enzýmy Sstl, Sse 8387I a Stul; (ii) promótorového modulu, ktorý sa skladá z promotoru a kompletného 5' netranslatovaného regiónu (UTR) vybraného AcMNPV vírusového génu; (iii) poly-spojovacieho modulu, ktorý uľahčuje inzerciu požadovaného regiónu kódujúceho proteín; (iv) 3' UTR modulu, ktorý sa

587/B «· ···· ·· ···· ·· · • · ··· ····· • · · · · ··· • ···· ···· · • · · · · · · · · · ···· ·· ·· ·· ·· ··· skladá z kompletného 3'-netranslatovaného regiónu AcMNPV 6.9K génu (základný proteín); a (v) krátkej syntetickej spojovacej DNA s rozpoznávacími miestami pre reštrikčné enzýmy Stul, Bsu36l a Xhol.

Ako je uvedené na obr. 4, promótorové moduly vo vektoroch pMEV1 až pMEV4 sú odvodené z génov, ktoré sú exprimované v rôznych štádiách životného cyklu vírusu. Promótorový modul DA26 génu v pMEV1 a promótorový modul 35K génu v pMEV4 sú odvodené z génov, ktoré sú exprimované v životnom cykle vírusu skoro; to znamená pred zahájením syntézy DNA. Promótorový modul 6.9K génu v pMEV2 je odvodený od „neskorého,, štrukturálneho génu, ktorý je exprimovaný po zahájení syntézy DNA, a promótorový modul polyhedrínového (polh) génu v pMEV3 je odvodený z „veľmi neskorého,, génu, ktorý kóduje hlavnú štrukturálnu zložku vírusových oklúznych teliesok.

Polylinkerový modul bol navrhnutý tak, aby umožnil umiestnenie regiónu kódujúceho proteín do bezprostredného susedstva 5' UTR promótorového modulu bez vloženia ďalších spojovacích sekvencií. Ako je uvedené na obr. 5, polylinkér obsahuje Esp3l miesto, ktoré je umiestnené tak, že trávenie vektoru Esp3l ho štiepi medzi pozíciami -4 a -5 v hornom reťazci promótorového modulu a v spojení medzi promótorovým a polylinkérovým modulom v dolnom reťazci. Spracovanie DNA trávenej Esp3l DNA polymerázou za prítomnosti štyroch štandardných 2'deoxynukleozid trifosfátov (dNTP) vytvorí linearizovaný vektor, ktorý je zakončený lepivým koncom v presnom 3' konci promótorového modulu. Tento segment môže byť naviazaný na 5' fragment zakončený lepivými koncami, ktorého sekvencia začína ATG iniciačným kodónom požadovaného regiónu kódujúceho proteín. Kvôli uľahčeniu priameho klonovania fragmentu kódujúceho proteín je 3' koniec fragmentu pripravený tak, aby obsahoval rozpoznávacie miesto pre jeden z enzýmov, ktoré štiepi polylinkérový modul (ako je ilustrované BamHI na obr. 5) a ako fragment kódujúci proteín, tak vektor sú trávené týmto enzýmom pred ligáciou.

Kľúčovou vlastnosťou týchto vektorov je prítomnosť rozpoznávacích miest pre reštrikčné enzýmy Sse8387l a Bsu36l na jednom z koncov expresnej kazety. Toto umožňuje excíziu inzertovaných sekvencií z modulárneho expresného vektoru a ich

587/B ·· ···· ·· ·· ··· • · · • · • · · • · · ··· · ·· • · · • · · • · · · • · · · ·· ·· ligáciu do priamych ligačných PxNPV vektorov podľa predkladaného vynálezu (pozri napríklad príklad 2, vyššie).

B. pMEV5 a pMEV6

Dva vektory, pMEV5 a pMEV6, boli pripravené tak, aby obsahovali D. melanogaster promótor génu hsp70 (hlavný proteín teplotného šoku). pMEV5 obsahuje 724 bp segment D. melanogaster hsp70 promótora/5' UTR (označený hsp70Bam na obr. 4) v rozsahu od pozície -493 do pozície +231 vzhľadom k štart miestu pre transkripciu hsp70 génu. pMEV6 obsahuje 475 bp segment rovnakého promótora/5' UTR (označený hsp70Xba na obr. PD2), v rozsahu od pozície -244 do pozície +231.

Promótorové moduly použité na prípravu pMEV5 a pMEV6 boli syntetizované PCR amplifikáciou za použitia plazmidu phcHSP70PL (Morris a kol., J. Virol., 66, 7397 (1992)) ako templátu. Oligonukleotidové priméry pre každú reakciu a sekvencie amplifikovaného produktu sú uvedené na obr. 6 a 7 (pre pMEV5 a pMEV6, v príslušnom poradí). Každý z primérov má dvojdielnu štruktúru. 5' časť nemá žiadnu homológiu sekvencie s phcHSP70PL templátom a používa sa na inkorporáciu špecifických reštrikčných miest do koncov konečného PCR produktu. Medzi tieto miesta patria Sstl, Sse8387l a Stul miesta na 5' konci PCR produktu a Esp3 a Xbal miesta na 3' konci PCR produktu (pozri obr. 6 a 7). 3’-časť každého priméru obsahuje sekvencie homologické s phcHSP70PL templátom a definuje jednu hranicu hps70 - špecifickej sekvencie v každom module.

Pred PCR reakciami bol primér (-) reťazca (HSP70Esp) fosforylovaný na svojom 5' konci inkubáciou 200 pmól priméru po dobu 30 minút pri 37 °C v 10 ml reakčnej zmesi obsahujúcej 70 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCb, 5 mM DTT, 1 mM ATP a 10 jednotiek T4 polynukleotid kinázy (New England Biolabs, Beverly, MA). PCR reakcie sa potom vykonali v samostatných Micro Amp skúmavkách (Perkin Elmer, Norwalk, CT) s použitím nasledujúceho postupu. 50 pmól každého priméru sa zmiešalo s 0,25 - 1,0 ng phcHSP70PL DNA v 50 μΙ reakčnej zmesi obsahujúcej 200 μΜ dNTP, 1X klonovaný Pfu polymerázový pufor (Stratagene, La Jolla, CA) a 5 jednotiek klonovanej Pfu DNA polymerázy (Stratagene, La Jolla, CA). Vzorky sa umiestnili do Perkin Elmer Model 9600 termocyklovača (Perkin Elmer,

587/B ·· ··· ·· ···· ·· ·· ··· · · · • · · · · · · • · · · · ···· ···· ·· ·· ·· ··

Norwalk, CT) a spracovali sa v dvoch cykloch pri 1 minúte pri 94 °C (denaturačný stupeň), 1,5 minúte pri 50 °C (stupeň tepelného spracovania) a 3 minútach pri 72 °C (stupeň rozšírenia), po ktorých nasledovalo 28 cyklov 1 minúta pri 94 °C, 1,5 minúty pri 55 °C a 3 minúty pri 72 °C. Pri poslednom cykle bola rozširovacia reakcia vykonávaná po dobu ďalších 7 minút a reakčná zmes sa ochladila na 4 °C. Produkty amplifikácie boli extrahované raz fenolom : chloroformom : izoamylalkoholom (25 : 24 : 1) upraveným na 0,3 M octanom sodným a vyzrážali sa etanolom.

Po rozpustení vo vhodnom reakčnom pufre sa DNA trávila PstI (ktorá ju štiepi v Sse8387l mieste) a fragmenty obsahujúce predpokladané hsp70 promótorové moduly sa prečistili elektroforézou na 1,2 % agarózovom géli s nízkou teplotou topenia s preparatívnym stupňom čistoty (BioRad, Richmond, CA). Základný vektor pre konštrukciu pMEV5 a pMEV6 bol pripravený štiepením pMEV1 EcoRI a doplnením koncov Klenowovým fragmentom DNA polymerázy I za prítomnosti všetkých štyroch nukleotidov. Po sekundárnom štiepení vektoru Sse8387l a defosforylácii koncov pomocou teľacej črevnej alkalickej fosfatázy sa veľký (3,1 kb) fragment obsahujúci pBluescript skelet a 3' UTR a polylinkérové moduly prečistil na agarózovom géli s nízkou teplotou topenia a ligoval sa individuálne s prečistenými hsp70 promótorovými modulmi za vzniku pMEV5 a pMEV6.

C. pMEV5/ADK-AalT a pMEV6/ADK-AalT pMEV5 a pMEV6 vektory popísané vyššie boli ďalej spracované tak, aby obsahovali gén kódujúci AalT, toxín špecifický pre hmyz, ktorý je prítomný v jede východoafrického škorpióna Andoctuonus australi (Hector) (Zlotkin a kol., Biochimie, 53, 1073 (1971)). Keď je AalT injikovaný do telesnej dutiny hmyzej larvy, viaže sa selektívne na napäťovo senzitívne sodíkové kanály a spôsobuje prechodnú kontraktilnú paralýzu. Chronické podávanie toxínu, ktoré sa môže dosiahnuť infekciou lariev bakulovírusmi produkujúcim AalT, je spojené s predĺžením paralýzy a prípadne so smrťou (Stewart a koľ, Náture, 352, 85 (1991); Maeda a kol., Virol., 184, 777 (1991); McCutchen a kol., Biotechnol., 9, 848 (1991)). U.S. patent 5 547 871 popisuje sekvenciu ADK-AalT génu s optimalizovanými kodónmi, v ktorej je sekrécia AalT toxínu riadená signálnym peptidom z génu pre adipokinetický hormón (ADK) Manduca sexta. Inzercia ADK-AalT kódujúceho regiónu do vektorov pMEV1 31 587/B ·· ···· ·· ···· ···· ·· pMEV4 (kvôli získaniu plazmidov pMEV1/ADK-AalT - pMEV4/ADK-AalT) je popísaná v Medzinárodnej patentovej prihláške US 94/06079.

Na konštrukciu pMEV5 a pMEV6 derivátov kódujúcich ADK-AalT sa syntetizoval fragment obsahujúci sekvenciu ADK-AalT génu pomocou PCR za použitia pMEV3/ADK-AalT ako templátu. Primér (+) reťazca, označený PD30, začínal v iniciátorovom ATG kodóne ADK signálneho peptidu. Primér (-) reťazca, označený 69K3UT, bol vybraný tak, aby navodil syntézu DNA za polylinkérovým modulom; to znamená, v 3' UTR pMEV3/ADK-AalT. Sekvencia primérov a amplifikovaného DNA fragmentu sú uvedené na obr. 8.

Pred amplifikáciou bol 5' koniec priméru (+) reťazca defosforylovaný spôsobom uvedeným vyššie pre HSP70Esp. PCR reakcia sa tiež vykonala spôsobom popísaným vyššie, s tou výnimkou, že amplifikácia bola vykonaná pri 25 cykloch 1 minútu pri 94 °C, 1,5 minúty pri 52 °C a 3 minúty pri 72 °C. Po syntéze bola DNA trávená BamHI, ktorý ju štiepi v polylinkérovom module a 274 bp 5'lepivý/3'-BamHI fragment obsahujúci ADK-AalT kódujúci región sa inzertoval do pMEV5 a pMEV6. Štruktúry vzniknutých plazmidov pMEV5/ADK-AalT a pMEV6/ADK-AalT boli potvrdené analýzou reštrikčnými enzýmami a čiastočným určením sekvencie DNA.

D. MEVS vektory obsahujúce modul ADK signálneho peptidu

Nasledujúce pokusy boli vykonané na prípravu série modulárnych expresných vektorov, ktoré obsahujú DNA kódujúcu ADK signálny peptid (pozri vyššie), ktoré sa môžu použiť na riadenie sekrécie akejkoľvek inzertovanej sekvencie. Pripravila sa séria vektorov (označených pMEV1/ADK až pMEV6/ADK), v ktorých bola 57 bp sekvencia optimalizovaných kodónov pre ADK signálny peptid (zvyšky 1 - 57 na obr. 8) umiestnená medzi promótorové a polylinkérové moduly. Expresné kazety v týchto vektoroch majú všeobecnú štruktúru uvedenú na obr. 9.

Na prípravu série pMEVx/ADK vektorov bol DNA fragment obsahujúci promótorový modul a naviazaný ADJ signálny peptid získaný z príslušných pMEVx/ADK-AalT vektorov pomocou PCR. Primér pre (+) reťazec pre každú reakciu bol oligonukleotid špecifický pre promótor, ktorý navodzuje syntézu DNA na 5' konci promótorového modulu a vkladá reštrikčné miesta pre Sstl, Sse8387l a Stul do 5'

587/B ·· ···· • · · · · · konca amplifikovaného fragmentu. Templáty a priméry pre (+) reťazec pre každú reakciu sú uvedené v nasledujúcej tabuľke.

• * · ···· ·· • · · • · · · ·· ·· • · • · ·· ·

Templat	Primer	Sekvence
pMEVl/ADK- AalT	DA26FZ	5’- AGCAGCGAGCTCCTGCAGGCCTACGCGT AATTCGATATAGAC -3*
pMEV2/ADK- AalT	69KFZ	5'-AGCAGCGAGCTCCTGCAGGCCTATGCCG TGTCCAATTGCAAG -3’
pMEV3/ADK- AaTT	PHF	5’- AGCAGCGAGCTCCTGCAGGCCTGACGCA CAAACTAATATCAC -3'
pMEV4/ADK- AalT	35KPRO1	5*- AGCAGCGAGCTCCTGCAGGCCTCITGAT GTCTCCGATTTC -3'
pMEV5/ADK- AalT	HSP70Bam	5'- AGCAGCGAGCTCCTGCAGGCCTGATCCT TAAATTGTATCCTA -3’
pMEV6/ADK- AaTT	HSP70Xba	5'- AGCAGCGAGCTCCTGCAGGCCTAGAATC CCAAAACAAACTGG -3'

Primér pre (-) reťazec pre každú reakciu, označený ADKRev (5'CGGATCTAGACACGTCTCGGGCCTCAGCGATAATCACGAAGGC-3') navodzuje syntézu od 3' konca ADK signálneho peptidu a vkladá miesta pre Esp3l a Xbal do 3' konca amplifikovaného fragmentu. PCR reakcia sa tiež vykonala spôsobom popísaným vyššie pre pMEV5-6 s tou výnimkou, že amplifikácia sa vykonala pri 25 cykloch 1 minúta pri 94 °C, 1,5 minúty pri 52 ’C a 3 minúty pri 72 °C. DNA syntetizovaná zo všetkých templátov s výnimkou pMEV5/ADK-AalT, bola trávená Pstl, ktorý ju štiepi v Sse8387l mieste pred promótorom a Xbal, ktorý ju štiepi za ADK signálnym peptidom, a fragment obsahujúci promótorový modul a signálny peptid bol inzertovaný medzi Pstl (Sse8387) a Xbal miesta v jednom z existujúcich pMEVx vektorov, ako je pMEV1.

Pretože hspľOBam promótorový modul vpMEV5 obsahuje vnútorné Xbal miesto, musí byť hsp70Bam/ADK modul inzertovaný do pMEVx pracovného rámca v dvoch častiach. Preto bola jedna časť DNA syntetizovaná z pMEV5/ADK-AalT templátu trávená Pstl a Xhol a druhá časť bola trávená Xhol a Xbal. Pstl/Xhol

587/B ·· ···· • · · • · • · • r · ···· ·· ·· ···· ·· ·· ·· · fragment predstavujúci 5' segment hsp70Bam/ADK modulu bol kombinovaný sXhol/Xbal fragmentom predstavujúcim 3' segment hsp70Bam/ADK modulu a bol ligovaný do Pstl/Xbal fragmentu vektoru pripraveného z pMEV1.

Každý pripravený pMEVx/ADK vektor mal identickú štruktúru s príslušným pMEVx vektorom s výnimkou inzercie 57 bp ADK signálneho peptidu medzi promótorom a polylinkérovým modulom.

Príklad 4

Konštrukcia modulárnych expresných vektorov kódujúcich insekticídne toxíny

Nasledujúce pokusy sa vykonali kvôli príprave modulárnych expresných vektorov kódujúcich insekticídne toxíny vhodné na vloženie do rekombinantných PxNPV podľa predkladaného vynálezu.

A. Txp-I

Toxín zákožky svrabovej TxP-l je paralytický neurotoxín izolovaný z jedu zákožky svrabovej, Pyemotes tritici (Tomalski a kol., Toxicon, 27, 151 (1989)). Tox34 gén kóduje prekurzorový proteín s 291 aminokyselinami (Tomalski a kol., Náture, 352, 82(1991)).

Pre testovanie účinnosti tox34 génu v rekombinantných PxNPV sa pripravili tri rôzne Txp-1 konštrukty, ktoré sa odlišovali v aminoterminálnej signálnej sekvencií riadiacej sekréciu toxínu z buniek. Jeden konštrukt obsahoval prirodzenú tox34 aminoterminálnu sekvenciu; jeden obsahoval ADK signálny peptid namiesto aminoterminálnych 40 zvyškov tox34 preproteínu; a jeden obsahoval ADK signálny peptid namiesto aminoterminálnych 26 zvyškov tox34 preproteínu.

Tri rôzne segmenty tox34 génu zodpovedajúce kodónom 1 - 291 (označený tox34), 27 - 291 (označený tox34L) a 40 - 291 (tox34S) sa syntetizovali PCR a upravili na klonovanie do jedného alebo viacerých modulárnych expresných vektorov popísaných vyššie. Templátom pre amplifikačné reakcie bol plazmid pHSP70tox34 (Lu a kol., Biological Control, 7, 320 (1996)). Priméry (+) reťazca pre každú amplifikáciu sú uvedené v nasledujúcej tabuľke.

587/B ·· ···· • · · · · ·

Fragment	Primér	Sekvence
tox34	TOX34ATG	5’ - ATGAAAATTTGTACATmTTATTCC -3'
tox34L	TOX34NT1	5* - gttaaaccititaggtcttttaataatatttcc -3*
tox34S	TOX34NT2	5' - GATAATGGCAATGTCGAATCTGTA - 3'

Primér (-) reťazca označený TOX34CT2, 5'-GTACCCCCGGGATCCAATTT AACACAGTCTTGAATCACTT-3' navodzuje syntézu od 3'-konca tox34 kódujúceho regiónu a vkladá reštrikčné miesta pre BamHl a Xmal (Smal) do 3' konca amplifikovaného fragmentu. Pred amplifikáciou bol 5' koniec každého priméru (+) reťazca fosforylovaný za použitia postupu popísaného vyššie pre primér HSPľOEsp v príklade 3. PCR reakcie boli vykonané spôsobom popísaným v príklade 3, s tou výnimkou, že cykly sa skladali z 2 cyklov 1 minúta pri 94 °C, 1,5 minúty pri 45 °C a 3 minúty pri 72 °C a potom 28 cyklov 1 minúta pri 94 °C, 1,5 minúty pri 55 °C a 3 minúty pri 72 °C.

Po syntéze bola DNA trávená Xmal a 5'-lepivý/3'-Xmal fragmenty tox34 kódujúceho regiónu (označené tox34, tox34L a tox34S) sa prečistili a klonovali do MEV vektorov spôsobom popísaným v príklade 3, s tou výnimkou, že polylinkér bol štiepený Xmal (ktorý ho štiepi v Smal mieste) namiesto BamHl.

Nasledujúca tabuľka zahrňuje zložky, z ktorých bol každý MEVS vektor exprimujúci TxP-l pripravený.

Konstrukt	Vektor	Fragment kóduj ící Txp-I
pMEVl/Tox34	pMEVl	tox34
pMEV5/Tox34	pMEV5	tox34
pMEV6/Tox34	pMEVÓ	tox34
pMEVl/ADK-Tox34L	pMEVl/ADK	tox34L
pMEVl/ADK-Tox34S	pMEVl/ADK	tox34S
pMEV2/ADK-Tox34L	pMEV2/ADK	tox34L
pMEV2/ADK-Tox34S	PMEV2/ADK	tox34S

587/B • · · · · · · · ···· ·· • · · · · · · · • · · · · · · • · · · · ···· ···· ·· ·· ·· ·· ·

B. LqHIT2

Okrem excitačných toxínov, ako je AalT, obsahuje mnoho jedov škorpiónov Buthinae druhý typ toxínu špecifického pre hmyz, ktorý spôsobuje polou, progresívnu atonickú paralýzu (Zlotkin a kol., Biochemistry, 30, 4814 (1991)). Najlepšie preštudovaným členom tejto skupiny je toxín LqhlT2, ktorý sa izoloval od škorpióna Leiurus quinquestriatus hebreaeus. Klonované cDNA pre LghlT2 ukázala prítomnosť 21 aminokyselinového signálneho peptidu a troch C-terminálnych aminokyselín (GlyLys-Lys), ktoré sú odstránené z peptidu post - translačne (Zlotkin a kol., Árch. Insect. Biochem. Physiol., 22, 55 (1993)).

Kvôli výskumu schopnosti LqhlT2 toxínu zlepšovať insekticídnu aktivitu PxNPV bola DNA sekvencia kódujúca zrelý LqhlT2 toxín zostavená a klonované do štyroch rôznych pMEVx/ADK expresných vektorov: pMEV1/ADK, pMEV2/ADK, pMEV5/ADK a pMEV6/ADK. Sekvencia kódujúceho regiónu toxínu uvedená na obr. 10 sa odlišuje od prirodzenej cDNA sekvencie v 27 zo 61 kodónov; tieto zmeny boli vložené tak, aby využitie kodónov v syntetickom kódujúcom regióne pre LqhlT2 odrážalo celkové využitie kodónov v AcMNPV genóme (Ayres a kol., 1994).

Zostavenie DNA fragmentu obsahujúceho kódujúci región pre LqhlT2 sa vykonalo v niekoľkých krokoch. Najprv sa syntetizovali štyri nukleotidy, ktoré spolu predstavujú oba reťazce LqhlT2 kódujúceho regiónu a malú časť 3' susediacej spojovacej DNA sekvencie (obr. 10). Pred použitím boli 5' konce oligonukleotidov LqhlT2F2 (obsahujúce 3' časť (+) reťazca) a LqhlT2R3 (obsahujúce 3' časť (-) reťazca) fosforylované za použitia postupu popísaného v príklade 3. 40 μιτιόΙ každého oligonukleotidu bolo tepelne spracované v 10 μΙ 50 mM NaCI krátkym zahriatím na 95 °C a potom pomalým ochladením zmesi na 60 °C. Celkový objem zmesi sa upravil na 40 μΙ a dve polovice LqhlT2 kódujúceho regiónu (LqhlT2F1 : LqhlT2R3 a LqhlT2F2 : LqhlT2R4) sa ligovali. Z dôvodu prítomnosti produktov neúplnej syntézy v každom oligonukleotide viedla prvotná ligácia k zisku heterogénnej zmesi fragmentov dĺžky 200 - 1000 bp. Požadovaný produkt sa izoloval z tejto zmesi PCR, za použitia 0,5 μΙ ligačnej reakčnej zmesi ako zdroja templátu a oligonukleotidov LqhlT2 PCRF (fosforylovaného na jeho 5' konci) a

587/B ·· ···· ·· ···· • · · · · · B · • · · · · ···· ···· ·· ·· ·« «·

LqhlT2 PCRR ako primérov (obr. 10). Amplifikácia bola vykonaná v 25 cykloch 1 minúta pri 94 °C, 1,5 minúty pri 55 °C a 3 minúty pri 72 °C, ako je popísané v príklade 3. Po syntéze bola DNA trávená BamHI, ktorý štiepi spojovací segment susediaci sterminačným kodónom, a požadovaný 190 bp 5'-lepivý/3'-BamHI fragment sa prečistil gélovou elektroforézou a klonoval sa do MEV vektorov pMEV1/ADK, pMEV2/ADK, pMEV5/ADK a pMEV6/ADK, ako je uvedené v príklade 3 a na obr. 5. Sekvencia LqhlT2 kódujúceho regiónu v každom vektore bola potvrdená sekvenovaním DNA.

B. Omega-ACTX-HV1

Omega - atrakotoxíny sú rodinou insekticídnych peptidových toxínov izolovaných od austrálskych pavúkov. Najlepšie preštudovaným členom tejto rodiny je omega-atrakotoxín-HV1 (omega-ACTX-HV1), 37 - zvyškový peptidový toxín izolovaný z jedu pavúka Hadronyche versuta (Medzinárodná patentová prihláška AU 93/00039). Omega-ACTX-HV1 inhibuje hmyzie vápnikové kanály závislé od napätia a je letálny pre larvy Helicoverpa armigera, ale je neškodný pre novorodené myši.

Na základe aminokyselinovej sekvencie omega-ACTX-HV1 boli navrhnuté dva oligonukleotidy, ktoré predstavujú dva reťazce omega-ACTX-HV1 kódujúceho regiónu a malú časť 3' susediacej spojovacej DNA. Použitie kodónov v omegaACTX-HV1 kódujúcom regióne je navrhnuté tak, aby zodpovedalo použitiu kodónov vAcMNPV genóme (Ayres a kol., 1994). Sekvencie týchto oligonukleotidov sú uvedené na obr. 11. Z dôvodu dĺžky oligonukleotidov ACTXHV1F a ACTXHV1R je značne pravdepodobné, že každý bude významne kontaminovaný produktmi nekompletnej syntézy. Preto bola PCR stratégia podobná stratégii použitej pre LqhlT2 použitá tiež na syntézu fragmentu omega-ACTX-HV1 kódujúceho regiónu vhodného na klonovanie do MEVS vektorov. V tomto prípade sa zmiešalo 0,1 pmól každého oligonukleotidu a zmes sa použila ako templát pre PCR amplifikáciu omega-ACTX-HV1 produktu požadovanej dĺžky. Priméry pre reakciu boli ACTXPCRF (fosforylovaný na svojom 5' konci) a ACTXPCRR. PCR reakcia bola vykonaná spôsobom uvedeným vyššie, stou výnimkou, že amplifikácia sa vykonala v 15 cykloch 1 minúta pri 94 °C, 1,5 minúty pri 55 °C a 3 minúty pri 72 °C. Po amplifikácii bola DNA štiepená BamHI, ktorá štiepi spojovací segment susediaci s terminačným

587/B • · · · · · • · · • · • « · • · · • · · · · · • · ···· ·· • · · • · • · · ·· ·· kodónom a požadovaný 118 bp 5'-lepivý/3'-BamHI fragment sa prečistil gólovou elektroforézou a klonoval sa do MEV vektorov pMEV1/ADK, pMEV2/ADK, pMEV5/ADK a pMEV6/ADK. Sekvencia omega-ACTX-HV1 kódujúceho regiónu v každom vektore bola potvrdená sekvenovaním DNA.

Príklad 5

Konštrukcia rekombinantných PxNPV

Nasledujúce pokusy boli vykonané pre konštrukciu rekombinantných PxNPV kódujúcich insekticidne toxíny.

Vírusová DNA bola pripravená zoklúznych teliesok (O'Reilly a koľ, 1994). Prečistená DNA bola trávená Bsu36l a Sse8387l za použitia približne 5 jednotiek enzýmu/gg DNA. Chromatografia s vylučovaním podľa veľkosti alebo prečistenie gradientom sacharózy sa použilo na separáciu vírusovej genómovej DNA z excidovaného fragmentu. Získaná linearizovaná vírusová DNA sa zrážala etanolom a resuspendovala sa v 10 ml Tris-HCl pH 8,0/1 mM EDTA v koncentrácii 0,2 - 1 μg/μl.

0,5 gg linearizovanej DNA sa potom ligovalo s 15 ng prečisteného Bsu36l/Sse8387l tráveného fragmentu z vhodného MEV vektor v reakčnom objeme 5 μΙ cez noc pri 15 °C. Zmes sa potom použila na transfekciu Sf-9 buniek, ako je popísané v príklade 1. Kultivačné médium sa obmenilo 24 hodín po transfekcii. Po ďalších 72 hodinách sa odobral supernatant kultúry, zriedil sa a použil sa pre reinfekciu Sf-9 buniek kvôli izolácii plakov. Náhodné plaky boli zoškriabané a použili sa na infikovanie jamiek 48-jamkovej platne obsahujúcej 6 x 10⁴ Sf-9 buniek/jamka v 0,5 ml TNM-FH kompletného média. Rekombinanty sa identifikovali za použitia primérov špecifických pre inzertovaný gén. Vírus z plakov dávajúcich pozitívne jamky sa prečistil dvoma ďalšími kolesami plakového prečistenia.

Nasledujúca tabuľka uvádza informácie pre rôzne rekombinantné PxNPV, ktoré boli pripravené.

587/B • · · · · « ·· ····

·· · ···· ·· ··

Vírus	Použitý M EV
PxEGTDEL/35K ADK-AalT	PMEV4/ADK-AalT
PxEGTDEL/hspľOBam ADK-Aa	PMEV5/ADK-AalT
PxEGTDEL/DA26 tox34	PMEV1/tox34
PxEGTDEL/hspľOBam tox34	PMEV5/tox34
PxEGTDEL/hspľOXba tox34	PMEV6/tox34
PxEGTDEL/DA26 ADK-tox34S	PMEV1/ADK-tox34S
PxEGTDEL/DA26 ADK-tox34L	PMEV1/ADK-tox34L
PxEGTDEL/6.9K AD-tox34S	PMEV2/ADK-tox34S
PxEGTDEL/6.9K ADK-tox34L	PMEV2/ADK-tox34L
Ac(V8)EGTDEL/DA26 ADK-AalT	PMEV4/ADK-AalT
PxEGTDEL/DA26 ADK-LqhlT2	PMEV1/ADK-LqhlT2
PxEGTDEL/6.9K ADK-LqhlT2	PMEV2/ADK-LqhlT2
PxEGTDEL/hspľOBam ADK-LqhlT2	PMEV5/ADK-LqhlT2
PxEGTDEL/hspľOXba ADK-LqhlT2	PMEV6/ADK-LqhlT2
PxEGTDEL/DA 26 ADK-omega-ACTX-HV1	PMEV1 /ADK-omega-ACTX-H V1
PxEGTDEL/6.9K ADK-omega-ACTX-HV1	PMEV2/ADK-oemga-ACTX-HV1
PxEGTDEL/hspľOBam ADK-omega-ACTX- HV1	PMEV5/ADK-omega-ACTX-HV1
PxEGTDEL/hspľOXba ADK-omega-ACTX- HV1	PMEV5/ADK-omega-ACTX-HV1

587/B · ···· ···· ·« • · ··· · « · · ···· ·· ·· ·· ·· ·

Príklad 6

Účinnosť rekombinantných PxNPV exprimujúcich insekticídne proteíny

Nasledujúce pokusy boli vykonané kvôli testovaniu insekticídnej účinnosti rekombinantných PxNPV podľa predkladaného vynálezu.

Štandardný test nanesenia vírusu na potravu sa vykonal na druhom instarštádiu lariev Plutella xylostella (vek 2-3 dni, 0,15 - 0,3 mg) kvôli stanoveniu dávky nutnej na dosiahnutie 50 % mortality v testovanej hmyzej populácii (t.j. LC50). Zásoby vírusu boli sériovo riedené v 0,01 % dodecylsíranu sodnom a použili sa 50 μΙ podiely vírusových suspenzií na povrchovú kontamináciu 15 mm okrúhlych oblastí obsahujúcich ľanovým olejom posilnenú Stoneville potravu (Southland Products Incorporated, Lake Village, AK). Jednotlivé larvy boli umiestnené do každej oblasti a kŕmili sa kontaminovanou potravou po dobu trvania testu. Mŕtve larvy sa spočítali dvakrát denne v priebehu prvých troch dní testu a potom aspoň raz denne do nástupu kuklenia v šiestom alebo siedmom dni. Dáta z opakovaných pokusov sa zhrnuli a analyzovali probit analýzou (Finney, 1952). Medián času pre letalitu (LT₅₀) sa stanovil z probit analýzy času do úhynu pri jednej dávke.

Výsledky sú uvedené v nasledujúcich tabuľkách. Kvôli porovnaniu sú koncentrácie oklúznych teliesok (OB) uvedené ako OB/16 cm² potravy.

rPxNPV	LC50 (OB/16 cm2)	LT50 (dni) kone. 4,5 x 104
PxEGTDEL/35K ADK-AalT	9,34 x 102	2,69
wt PxNPV	5,97x104	4,39

587/B ·· ···· ·· ···· • ··· ···· • · · · · · · • ···· ···· • ·· · · ·· ··· ·· ·· ·· ·· ·

Probit hodnoty sa určili zo štyroch vyhotovení s približne 32 larvami/dávka.

rPxNPV	LC50 (OB/16cm2)	TL50 (dni) kone. 4,5 x 103	ĽT5o (dni) kone. 4,5x104
PxEGTDEL/35K ADK-AalT	7 x 102	3,7	3,0
PxEGTDEL/hsp70 ADK-AalT	6 x 102	3,7	2,7
Ac(V8)EGTDEL/DA26 ADK- AalT	6,3 x 105	ND*	4,0

* ND - nie je stanovené

Probit hodnoty boli určené zo štyroch vyhotovení s približne 32 larvami/dávka.

Tieto výsledky ukazujú, že (i) adícia génu pre toxín k PxNPV genómu nielen zvyšuje rýchlosť usmrtenia vírusom, ale tiež výrazne znižuje účinnú LC50 pre larvy Plutella xylostella; a (ii) rekombinantný PxNPV má výrazne nižší ĽC₅₀ s oveľa vyššou rýchlosťou zabíjania v porovnaní s blízko príbuzným rekombinantným AcNPV. Pretože Plutella xylostella je významný škodca na rastlinách, má toto zistenie zásadný význam pri voľbe rekombinantného bakulovírusu pre použitie ako biopesticídu na poľnohospodárskom trhu.

Nasledujúce tabuľky uvádzajú dáta z testov rekombinantných PxNPV exprimujúcich druhý toxín selektívny pre hmyz, tox34.

rPxNPV	LT50 (dni) kone. 4,5 x 103	ĽT50 (dni) kone. 4,5 x 104
PxEGTDEL/DA6 tox34	4,5	3,4
PxEGTDEL/hsp70Bam tox34	2,6	1,9
PxEGTDEL/hspľOXba tox34	2,0	1,8
PxEGTDEL/DA26 ADK-tox34S	3,7	2,7

587/B ·· ···· ·· ···· ·· • · · · · ···· • · · · · ···· · • · · ···· ·· · ···· ·· ·· ·· ·· ···

PxEGTDEL/DA26 ADK-tox34L	3,1	2,4
PxEGTDEL/6.9K ADK-tox34S	2,9	1,6
PxEGTDEL/6.9K ADK'tox34L	3,2	1,8
PxEGTDEL/hspľOBam ADK-AalT	3,0	2,2

Probit hodnoty sa určili zo štyroch vyhotovení s približne 32 larvami/dávka.

rPxNPV	Priemerná LC50 (OB/16cm2)	ĽT50 (dni) kone. 4,5 x 103
PxEGTDEL/hsp70 Xba tox34	0,8x102	2,4
PxEGTDEL/hsp70Bam ADK-AalT	2,9x102	3,3
wt PxNPV	165 x102	4,6 pri kone. 4,5 x 104

Dáta naznačujú, že zvýšená účinnosť rekombinantných PxNPV nie je obmedzená na konštrukty exprimujúce AalT. PxNPV exprimujúce tox34 majú rovnako nízku LT₅₀ a LC₅₀ ako rekombinanty exprimujúce AalT. V niektorých prípadoch (t.j. PxEGTDEL/hspľOXba tox34) vedie expresia tox34 rekombinantným PxNPV k významne nižšej ĽC₅₀ ako rekombinanty exprimujúce AalT.

Všetky patenty, patentové prihlášky, články, publikácie a spôsoby testov tu uvedené sú uvedené ako odkazy vo svojej úplnosti.

Odborníkom v odbore budú po prečítaní uvedeného popisu jasné mnohé variácie predkladaného vynálezu. Takéto jasné variácie spadajú do rozsahu predkladaného vynálezu.

Claims (57)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Izolovaný rekombinantný bakulovírus pre Plutella xylostella (PxNPV) majúci genetickú alteráciu vzhľadom k prirodzenému PxNPV, kde uvedená alterácia je vybraná zo skupiny zahrňujúcej (a) vloženie alebo deléciu reštrikčného miesta; (b) modifikáciu, deléciu alebo duplikáciu génu kódovaného vírusom; (c) vloženie génu kódujúceho heterológny proteín; a (d) akékoľvek kombinácie vyššie uvedených aiterácií.
2. 2. Rekombinantný bakulovírus podľa nároku 1, ktorý má do svojho genómu vloženú sekvenciu nukleovej kyseliny kódujúcej substanciu ovplyvňujúcu hmyz operatívne naviazanú na promótor schopný aktivácie transkripcie v hmyzej bunke.
3. 3. Rekombinantný bakulovírus podľa nároku 2, kde uvedenou substanciou ovplyvňujúcou hmyz je insekticídny toxín.
4. 4. Rekombinantný bakulovírus podľa nároku 3, kde uvedený toxín je vybraný zo skupiny zahrňujúcej AalT, AaHITI, AaHIT2, LqhlT2, LqqlTI, LqqlT2, BjlT1, BjlT2, LqhP35, LqhalfalT, SmplT2, SmpCT2, SmpCT3, SmpMT, DK9.2, DK11, DK12, μagatoxín, King Kong toxín, Pt6, NPS-326, NPS-331, NPS-373, Tx4(6-1), TxP-1, omega-atratoxíny, alfa-konotoxíny, μ-konotoxíny, chlorotoxín a omega-konotoxíny.
5. 5. Rekombinantný bakulovírus podľa nároku 4, kde uvedený toxín je vybraný zo skupiny zahrňujúcej AalT, TxP-1, LqhlT2 a omega-atrakotoxín.
6. 6. Rekombinantný bakulovírus podľa nároku 4, ktorý ďalej obsahuje sekvenciu kódujúcu heterológny signálny peptid, kde uvedená sekvencia kódujúca signálny peptid je fúzovaná v pracovnom rámci so sekvenciou kódujúcou uvedený toxín.
7. 7. Rekombinantný bakulovírus podľa nároku 6, kde uvedený signálny peptid je vybraný zo skupiny zahrňujúcej pBMHPC-12 signálnu sekvenciu z Bombyx mori; signálnu sekvenciu adipokinetického hormónu zMandura sexta; apolipoforínovú signálnu sekvenciu z Manduca sexta; choriónovú signálnu sekvenciu z Bombyx mori;

   31 587/B ·· ···· ·· ···· • · · · · · · · • · · · · · · • ···· ···· ···· ·· ·· ·· ·· kutikulovú signálnu sekvenciu z Drosophila melanogaster; signálnu sekvenciu esterázy-6 z Drosophila melanogaster; a pohlavne špecifickú signálnu sekvenciu z Bombyx mori.
8. 8. Rekombinantný bakulovirus podľa nároku 2, kde uvedený promótor je hsp70 • promótor.
9. 9. Rekombinantný bakulovirus podľa nároku 8, kde uvedený promótor je vybraný zo skupiny zahrňujúcej hsp70Bam a hsp70 Xba.
10. 10. Rekombinantný bakulovirus podľa nároku 3, kde uvedený promótor je vybraný zo skupiny zahrňujúcej DA26, 35K, 6.9K, polyhedrínový, hsp70 a aktínové promótory.
11. 11. Rekombinantný bakulovirus podľa nároku 3, kde uvedený genóm bol ďalej modifikovaný na inaktiváciu vírusového egt génu.
12. 12. Rekombinantný bakulovirus podľa nároku 3, ktorý ďalej obsahuje sekvenciu nukleovej kyseliny kódujúcej esterázu juvenilného hormónu (JHE) operatívne naviazanú na promótor schopný aktivácie transkripcie v hmyzej bunke.
13. 13. Rekombinantný bakulovirus podľa nároku 5, kde uvedený promótor je hsp70 promótor.
14. 14. Rekombinantný bakulovirus pre Plutella xylostella majúci do svojho genómu vloženú sekvenciu kódujúcu TsP-1 operatívne naviazanú na Drosophilla hsp70 promótor.
15. 15. Rekombinantný bakulovirus pre Plutella xylostella majúci do svojho genómu vloženú sekvenciu kódujúcu AalT operatívne naviazanú na Drosophila hsp70 promótor.

    31 587/B ·· ···· ·· ···· • t • · · · · • · · · • · · · · ···· ·· ·· ·· ·· ·
16. 16. Rekombinantný bakulovírus podľa nároku 1, kde uvedená genetická alterácia tvorí klonovacie miesto neprítomné v prirodzenom PxNPV.
17. 17. Rekombinantný bakulovírus podľa nároku 16, ktorý má do uvedeného klonovacieho miesta vloženú sekvenciu nukleovej kyseliny kódujúcej substanciu ovplyvňujúcu hmyz operatívne naviazanú na promótor schopný aktivácie transkripcie v hmyzej bunke.
18. 18. Rekombinantný bakulovírus podľa nároku 17, kde uvedenou substanciou ovplyvňujúcou hmyz je insekticídny toxín.
19. 19. Rekombinantný bakulovírus podľa nároku 18, kde uvedený toxín je vybraný zo skupiny zahrňujúcej AalT, AaHITI, AaHIT2, LqhlT2, LqqlTI, LqqlT2, BjlT1, BjlT2, LqhP35, LqhalfalT, SmplT2, SmpCT2, SmpCT3, SmpMT, DK9.2, DK11, DK12, μagatoxín, King Kong toxín, Pt6, NPS-326, NPS-331, NPS-373, Tx4(6-1), TxP-1, omega-atratoxíny, alfa-konotoxíny, μ-konotoxíny, chlorotoxín a omega-konotoxíny.
20. 20. Rekombinantný bakulovírus podľa nároku 19, kde uvedený promótor je vybraný zo skupiny zahrňujúcej DA26, 35K, 6.9K, polyhedrínový, hsp70 a aktínové promótory.
21. 21. Rekombinantný bakulovírus podľa nároku 20, kde uvedený genóm bol ďalej modifikovaný na inaktiváciu vírusového egt génu.
22. 22. Rekombinantný bakulovírus podľa nároku 21, ktorý ďalej obsahuje sekvenciu nukleovej kyseliny kódujúcej esterázu juvenilného hormónu (JHE) operatívne naviazanú na promótor schopný aktivácie transkripcie v hmyzej bunke.
23. 23. Rekombinantný bakulovírus pre Plutella xylostella vybraný zo skupiny zahrňujúcej ATCC VR-2607, ATCC VR-2608 a ATCC VR-2609.

    31 587/B • t ···· ·· ···· ·· ·· ··· ··· • · · · · · · • · · · · ···· ···· ·· ·· ·· ··
24. 24. Priamy ligačný vektor obsahujúci genómovú DNA izolovanú z rekombinantného bakulovírusu podľa nároku 1.
25. 25. Priamy ligačný vektor podľa nároku 24, v ktorom uvedená DNA ďalej obsahuje DNA kódujúcu substanciu ovplyvňujúcu hmyz operatívne naviazanú na promótor schopný aktivácie transkripcie v hmyzej bunke.
26. 26. Priamy ligačný vektor podľa nároku 25, kde uvedená substancia ovplyvňujúca hmyz obsahuje insekticídny toxín vybraný zo skupiny zahrňujúcej AalT, AaHITI, AaHIT2, LqhlT2, LqqlTI, LqqlT2, BjlT1, BjlT2, LqhP35, LqhalfalT, SmplT2, SmpCT2, SmpCT3, SmpMT, DK9.2, DK11, DK12, μ-agatoxín, King Kong toxín, Pt6, NPS-326, NPS-331, NPS-373, Tx4(6-1), TxP-1, omega-atratoxíny, alfa-konotoxíny, μ-konotoxíny, chlorotoxín a omega-konotoxíny.
27. 27. Priamy ligačný vektor podľa nároku 26, ktorý ďalej obsahuje sekvenciu kódujúcu heterológny signálny peptid, kde uvedená sekvencia kódujúca signálny peptid je fúzovaná v pracovnom rámci so sekvenciou kódujúcou uvedený toxín.
28. 28. Priamy ligačný vektor podľa nároku 27, kde uvedený signálny peptid je vybraný zo skupiny zahrňujúcej pBMHPC-12 signálnu sekvenciu z Bombyx mori; signálnu sekvenciu adipokinetického hormónu zMandura sexta; apolipoforínovú signálnu sekvenciu z Manduca sexta; choriónovú signálnu sekvenciu z Bombyx mori; kutikulovú signálnu sekvenciu z Drosophila melanogaster; signálnu sekvenciu esterázy-6 z Drosophila melanogaster; a pohlavne špecifickú signálnu sekvenciu z Bombyx mori.
29. 29. Priamy ligačný vektor podľa nároku 25, kde uvedený genóm bol ďalej modifikovaný na inaktiváciu vírusového egt génu.
30. 30. Priamy ligačný vektor podľa nároku 25, ktorý ďalej obsahuje sekvenciu nukleovej kyseliny kódujúcej esterázu juvenilného hormónu (JHE) operatívne naviazanú na promótor schopný aktivácie transkripcie v hmyzej bunke.
31. 31 587/B ·· ···· ·· ···· • · · · · ···· • · · · · s · >1Π · ···· ···· · · · ···· ·· ···· ·· ·· ·· ·· ·

    31. Priamy ligačný vektor obsahujúci genómovú DNA izolovanú z rekombinantného bakulovírusu podľa nároku 16.
32. 32. Priamy ligačný vektor obsahujúci genómovú DNA izolovanú z rekombinantného bakulovírusu podľa nároku 19.
33. 33. Priamy ligačný vektor obsahujúci genómovú DNA izolovanú z rekombinantného bakulovírusu podľa nároku 23.
34. 34. Insekticídny prípravok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje rekombinantný bakulovírus pre Plutella xylostella (PxNPV) majúci genetickú alteráciu vzhľadom k prirodzenému PxNPV a poľnohospodársky prijateľný nosič, kde uvedená alterácia je vybraná zo skupiny zahrňujúcej (a) vloženie alebo deléciu reštrikčného miesta; (b) modifikáciu, deléciu alebo duplikáciu génu kódovaného vírusom; (c) vloženie génu kódujúceho heterológny proteín; a (d) akékoľvek kombinácie vyššie uvedených alterácií.
35. 35. Insekticídny prípravok podľa nároku 34, vyznačujúci sa tým, že uvedený rekombinantný bakulovírus má do svojho genómu vloženú sekvenciu nukleovej kyseliny kódujúcej substanciu ovplyvňujúcu hmyz operatívne naviazanú na promótor schopný aktivácie transkripcie v hmyzej bunke.
36. 36. Insekticídny prípravok podľa nároku 35, vyznačujúci sa tým, že uvedenou substanciou ovplyvňujúcou hmyz je insekticídny toxín, vybraný zo skupiny zahrňujúcej AalT, AaHITI, AaHIT2, LqhlT2, LqqlTI, LqqlT2, BjlT1, BjlT2, LqhP35, LqhalfalT, SmplT2, SmpCT2, SmpCT3, SmpMT, DK9.2, DK11, DK12, μ-agatoxín,

    King Kong toxín, Pt6, NPS-326, NPS-331, NPS-373, Tx4(6-1), TxP-1, omegaatratoxíny, alfa-konotoxíny, μ-konotoxíny, chlorotoxín a omega-konotoxíny.
37. 37. Insekticídny prípravok podľa nároku 36, vyznačujúci sa tým, že uvedený rekombinantný bakulovírus ďalej obsahuje sekvenciu kódujúcu heterológny signálny peptid, kde uvedená sekvencia kódujúca signálny peptid je fúzovaná v pracovnom rámci so sekvenciou kódujúcou uvedený toxín.

    31 587/B ·· ···· ·· ···· • · · · · ···· • · · · · · ·

    Λ 4 · ······· · ········· ·«·« ·· ·· ·· ·· ·
38. 38. Insekticídny prípravok podľa nároku 37, vyznačujúci sa tým, že signálny peptid je vybraný zo skupiny zahrňujúcej pBMHPC-12 signálnu sekvenciu zBombyx mori; signálnu sekvenciu adipokinetického hormónu zMandura sexta; apolipoforínovú signálnu sekvenciu z Manduca sexta; choriónovú signálnu sekvenciu z Bombyx mori; kutikulovú signálnu sekvenciu z Drosophila melanogaster; signálnu t sekvenciu esterázy-6 z Drosophila melanogaster; a pohlavne špecifickú signálnu sekvenciu z Bombyx mori.

    I
39. 39. Insekticídny prípravok podľa nároku 36, vyznačujúci sa tým, že uvedený genóm bol ďalej modifikovaný kvôli inaktivácii vírusového egt génu.
40. 40. Insekticídny prípravok podľa nároku 36, vyznačujúci sa tým, že uvedená genetická alterácia tvorí klonovacie miesto neprítomné v prirodzenom PxNPV.
41. 41. Insekticídny prípravok podľa nároku 40, vyznačujúci sa tým, že uvedený bakulovírus má do uvedeného klonovacieho miesta vloženú sekvenciu nukleovej kyseliny kódujúcej substanciu ovplyvňujúcu hmyz operatívne naviazanú na promótor schopný aktivácie transkripcie v hmyzej bunke.
42. 42. Insekticídny prípravok podľa nároku 41, vyznačujúci sa tým, že uvedenou substanciou ovplyvňujúcou hmyz je insekticídny toxín.
43. 43. Insekticídny prípravok podľa nároku 42, vyznačujúci sa tým, že uvedený * toxín je vybraný zo skupiny zahrňujúcej AalT, AaHITI, AaHIT2, LqhlT2, LqqlTI, . LqqlT2, BjlT1, BjlT2, LqhP35, LqhalfalT, SmplT2, SmpCT2, SmpCT3, SmpMT,

    DK9.2, DK11, DK12, μ-agatoxín, King Kong toxín, Pt6, NPS-326, NPS-331, NPS373, Tx4(6-1), TxP-1, omega-atratoxíny, alfa-konotoxíny, μ-konotoxíny, chlorotoxín a omega-konotoxíny.
44. 44. Insekticídny prípravok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje rekombinantný bakulovírus pre Plutella xylostella podľa nároku 2 a poľnohospodársky prijateľný nosič.

    31 587/B ·· ···· ·· ···· • · · · • · · • · · · • · · · ···· ·· ·« ·· • · · · · • · · · • · « · · • · · · · ·· ·· ·
45. 45. Insekticídny prípravok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje rekombinantný bakulovírus pre Plutella xylostella podľa nároku 4 a poľnohospodársky prijateľný nosič.
46. 46. Insekticídny prípravok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje rekombinantný bakulovírus pre Plutella xylostella podľa nároku 7 a poľnohospodársky prijateľný nosič.
47. 47. Insekticídny prípravok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje rekombinantný bakulovírus pre Plutella xylostella podľa nároku 14 a poľnohospodársky prijateľný nosič.
48. 48. Insekticídny prípravok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje rekombinantný bakulovírus pre Plutella xylostella podľa nároku 15 a poľnohospodársky prijateľný nosič.
49. 49. Insekticídny prípravok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje rekombinantný bakulovírus pre Plutella xylostella podľa nároku 20 a poľnohospodársky prijateľný nosič.
50. 50. Insekticídny prípravok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje rekombinantný bakulovírus pre Plutella xylostella podľa nároku 23 a poľnohospodársky prijateľný nosič.
51. 51. Spôsob ničenia hmyzu, vyznačujúci sa tým, že obsahuje kontaktovanie uvedených škodcov s insekticídne účinným množstvom insekticídneho prípravku podľa nároku 44.
52. 52. Spôsob ničenia hmyzu, vyznačujúci sa tým, že obsahuje kontaktovanie uvedených škodcov s insekticídne účinným množstvom insekticídneho prípravku podľa nároku 45.

    31 587/B

    ·· • a ···· • aa aaa a a • • a a a aa • • • • · • a a a a a a • • · • • • · a a a • 4·· a· • a aa a a aaa
53. 53. Spôsob ničenia hmyzu, vyznačujúci sa tým, že obsahuje kontaktovanie uvedených škodcov s insekticídne účinným množstvom insekticídneho prípravku podľa nároku 46.
54. 54. Spôsob ničenia hmyzu, vyznačujúci sa tým, že obsahuje kontaktovanie uvedených škodcov s insekticídne účinným množstvom insekticídneho prípravku podľa nároku 47.
55. 55. Spôsob ničenia hmyzu, vyznačujúci sa tým, že obsahuje kontaktovanie uvedených škodcov s insekticídne účinným množstvom insekticídneho prípravku podľa nároku 48.
56. 56. Spôsob ničenia hmyzu, vyznačujúci sa tým, že obsahuje kontaktovanie uvedených škodcov s insekticídne účinným množstvom insekticídneho prípravku podľa nároku 49.
57. 57. Spôsob ničenia hmyzu, vyznačujúci sa tým, že obsahuje kontaktovanie uvedených škodcov s insekticídne účinným množstvom insekticídneho prípravku podľa nároku 50.