BR112019020245A2

BR112019020245A2 - Toxinas mosquitocidas direcionadas

Info

Publication number: BR112019020245A2
Application number: BR112019020245-5A
Authority: BR
Inventors: Michel Kearney Christopher; Pruett Grace
Original assignee: Baylor University
Priority date: 2017-04-04
Filing date: 2018-04-03
Publication date: 2020-05-12
Also published as: JP2020515628A; EP3607075A1; EA201992362A1; WO2018187342A1; SG11201909017XA; US11479583B2; MX2019011917A; AU2018250153A1; CN110475867A; CA3057881A1; US20180282757A1; US20230002452A1; JP7112757B2

Abstract

as toxinas inseticidas aqui descritas são peptídeos de toxina fundidos constituídos de um domínio de direcionamento fundido a um domínio de toxina. o peptídeo alvo gera uma associação específica com mosquitos, fazendo com que o peptídeo de toxina fundido se ligue aos mosquitos de uma maneira que leva à atividade inseticida. as plantas transgênicas descritas nesta invenção são mosquitocidas por expressar uma proteína de toxina inseticida no néctar que inclui um peptídeo alvo para garantir a especificidade contra os mosquitos. estas plantas transgênicas servem como modelos de papel para segurança, visto que elas são plantas não cultiváveis e específicas para uma espécie de mosquito.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para TOXINAS MOSQUITOCIDAS DIRECIONADAS.

ANTECEDENTES

[0001] Este pedido reivindica a prioridade ao Pedido de Patente Provisório U.S. No. 62/481.199, intitulado Targeted Moxquitocidal Toxins, depositado em 4 de Abril de 2017, cujos conteúdos inteiros são aqui incorporados por referência.

[0002] A presente invenção refere-se a uma toxina mosquitocida direcionada e às plantas projetadas para produzir uma toxina mosquitocida para o controle de populações de mosquito.

[0003] Os mosquitos representam uma das pragas mais universalmente malvistas. Com exceção de seu fator de perturbação comum, eles são portadores de várias doenças mortais e prejudiciais. As enfermidades transmitidas por mosquitos causam milhões de mortes por todo o mundo a cada ano, particularmente em países em desenvolvimento. O desenvolvimento de vacinas tem sido bem sucedido apenas com uma certa proporção de doenças virais. Estas dificuldades são compostas pelo desenvolvimento de novos patógenos a cada década que passa, tal como as ameaças atuais de Zika e Chikungunya.

[0004] Esforços para controlar as populações de mosquito incluem esforços locais voltados para a remoção de água parada, assim como pulverização de inseticida generalizada e difundida. Estes esforços não apresentaram grande sucesso, e no caso de pulverização de inseticida, possuem efeitos negativos sobre as espécies não direcionadas. Os programas de pesticida têm sido o suporte principal para o controle de mosquitos nos USA, mas os pesticidas podem ter consequências ecológicas, como visto na destruição maciça de abelhas domésticas de 2016 na Carolina do Sul, a partir do tratamento de pesticida em resposta à ameaça de Zika. O repelente de mosquito

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2/24 é eficaz para situações limitadas, mas, com relação à vida diária especialmente para famílias, a disciplina de aplicação diária de repelente pode fracassar. Mesmo com as medidas atuais de controle de mosquito, muitos cidadãos dos USA simplesmente permanecem dentro de casa no verão para evitar o risco de transmissão de doenças, assim como o aborrecimento de mosquitos.

SUMÁRIO

[0005] A presente invenção refere-se às proteínas inseticidas direcionadas que são tóxicas para mosquitos, mas não para as espécies de inseto não direcionadas. A presente invenção refere-se também às plantas projetadas para produzir as toxinas. Nas modalidades particulares, as plantas transgênicas expressam uma proteína de toxina inseticida que inclui um peptídeo alvo para garantir a especificidade contra mosquitos. A toxina inseticida pode ser produzida no néctar produzido pelas plantas. Estas plantas representam uma abordagem ecologicamente sensível, eficaz em termos de custo e de vida longa que alavanca o requisito crítico da população de mosquitos com relação à alimentação de néctar.

[0006] As populações de mosquito são criticamente dependentes de néctar como uma fonte alimentar. Os machos utilizam néctar e outras fontes de açúcar como sua única fonte de nutrição enquanto que as fêmeas dependem dele para energizar seus vôos em busca de sangue, para se prepararem para a hibernação e outros propósitos. Aproveitando este fato, as iscas de açúcar dosadas com pesticidas provaram ser uma medida de controle viável contra mosquitos. No entanto, seria preferível evitar totalmente o uso de pesticidas. Mecanismos de liberação apropriados e eficazes para um peptídeo mosquitocida permitiríam uma estratégia biossegura de controle de mosquitos.

[0007] Peptídeos tóxicos direcionados a organismos específicos

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3/24 têm sido produzidos. A especificidade dos peptídeos antimicrobianos foi alterada utilizando peptídeos alvo e as fusões foram produzidas em alto rendimento em E. coli. Os peptídeos de fusão quimicamente sintetizados especificamente tóxicos para Staphylococcus aureus e Streptococcus mutans têm sido produzidos. Além disso, plantas transgênicas que expressam peptídeos de fusão direcionados foram mostrados de serem especificamente resistentes a fungos e afídeos da podridão da raiz de Fusarium.

[0008] A presente invenção refere-se a um peptídeo de fusão direcionado que possui um peptídeo alvo que é específico para mosquitos e um peptídeo de toxina que são fundidos entre si. O peptídeo alvo garante que o peptídeo de fusão seja absorvido, ou ligado de alguma forma que induz a toxicidade da toxina, por mosquitos apenas. A menos que o peptídeo de fusão seja absorvido ou ligado deste modo, o peptídeo de toxina será desprovido de toxicidade. Consequentemente, o direcionamento do peptídeo aos mosquitos resulta em uma toxina que não tem efeito contra insetos não mosquitos. O peptídeo de fusão direcionado pode ser expresso em qualquer organismo adequado, incluindo levedura ou E. coli, e depois extraído, isolado ou purificado para aplicação como uma toxina mosquitocida.

[0009] Em algumas modalidades, uma planta é projetada para produzir o peptídeo de fusão direcionado de uma maneira que garanta que um mosquito beba, consuma, seja exposto ou de outra forma absorva o peptídeo. Em algumas modalidades, uma planta com néctar é projetada para expressar o peptídeo de fusão direcionado no néctar. O néctar é um componente crítico do ciclo de vida dos mosquitos e é altamente atraente para eles. Os mosquitos machos dependem de néctar ou de uma fonte de açúcar fornecida para a sua sobrevivência, enquanto que os mosquitos fêmeas requerem néctar para prover de

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4/24 energia os seus vôos a procura de sangue. As plantas sem néctar também podem ser projetadas para expressar o peptídeo de fusão direcionado, contanto que ele seja expresso de uma maneira que permita os mosquitos consumir ou absorver a toxina de peptídeo.

[0010] A presente invenção também se refere às plantas mosquitocidas transgênicas que produzem o peptídeo de fusão direcionado. Em algumas modalidades preferidas, as plantas são plantas de néctar, mas elas podem ser quaisquer plantas adequadas, incluindo árvores e arbustos. As plantas de néctar preferidas que podem ser projetadas como plantas mosquitocidas transgênicas incluem a planta do gênero botânico Impatiens de jardim comum, uma planta que cresce sem manutenção requerida por todo os trópicos chuvosos, mas é também a planta de estratificação comercial de venda superior em todo o mundo. Estudos demonstraram que o gênero botânico Impatiens (particularmente a Impatiens walleriana) se sobressai em termos de atratividade de mosquitos, em produção de proteína de néctar e na capacidade de ser geneticamente transformada. Nas modalidades preferidas, uma planta do gênero Impatiens é planejada para expressar uma toxina, unicamente no néctar, a qual é atóxica para abelhas domésticas, mas que controla eficazmente os mosquitos em ensaios de jardim ao ar livre. Estas plantas transgênicas servem como exemplos a serem seguidos com relação à segurança, já que elas são plantas não cultiváveis, são específicas para uma espécie de praga, e podem ser planejadas para não ter nenhuma capacidade de espalhar o transgene da toxina ao ecossistema circundante.

[0011] Nas modalidades preferidas, uma construção genética exógena é utilizada para expressar um peptídeo de toxina direcionado para isolamento e purificação, ou para transformar uma planta em uma planta mosquitocida transgênica. A construção inclui, de preferência,

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5/24 diferentes aspectos. Os promotores específicos de planta, tais como os promotores de néctar de Impatiens, são utilizados. Um peptídeo de toxina inseticida é expresso a partir da construção. Um peptídeo alvo que irá formar uma fusão peptídica com o peptídeo de toxina também é expresso, de preferência para direcionar os mosquitos através da ligação específica, tal como a ligação ao epitélio do intestino. As toxinas direcionadas são tóxicas para os mosquitos, mas não para espécies de insetos não alvos. Estas características executam os aspectos de mosquitocida do peptídeo de toxina. As plantas produtoras de néctar mosquitocidas são baratas, altamente expansíveis, ecologicamente seguras e requer pouca ou nenhuma manutenção. Esta tecnologia é capaz de fornecer controle de mosquito em áreas muito grandes por décadas de uma vez.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0012] A FIGURA 1 mostra uma construção para a expressão de E. coii de proteína fluorescente verde aumentada não direcionada (EGFP).

[0013] A FIGURA 2 mostra uma construção para a expressão de E. colide EGFP direcionada a Aedes.

[0014] A FIGURA 3 mostra os resultados de um ensaio de fluorescência em mosquitos Aedes aegypti utilizando a EGFP direcionada e não direcionada.

[0015] A FIGURA 4 mostra uma construção para a expressão de E. colide toxina inseticida Hv1a não direcionada.

[0016] A FIGURA 5 mostra uma construção para a expressão de E. colide toxina inseticida Hv1 a direcionada ao Aedes.

[0017] A FIGURA 6 mostra uma comparação das curvas de sobrevivência do Aedes aegypti após a administração oral das toxinas direcionadas e não direcionadas.

[0018] A FIGURA 7 mostra os resultados de um ensaio de

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6/24 fluorescência em mosquitos Culex quinquefasciatus utilizando a EGFP direcionada aos mosquitos Aedes e EGFP não direcionada.

[0019] A FIGURA 8 mostra uma comparação das curvas de sobrevivência de Culex quinquefasciatus após a administração oral de toxinas direcionadas ao Aedes e toxinas não direcionadas. DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES PREFERIDAS [0020] A presente invenção refere-se aos peptídeos de toxina direcionados que são tóxicos para mosquitos e não a outras espécies não alvos. A presente invenção refere-se também às plantas mosquitocidas que expressam genes exógenos que codificam as toxinas específicas para mosquitos.

[0021] Nas modalidades preferidas, a presente tecnologia referese a toxinas direcionadas aos mosquitos. As toxinas são peptídeos de toxina fundidos constituídos de um domínio alvo fundido a um domínio de toxina. O peptídeo alvo gera uma associação específica com mosquitos, tal como fazendo com que o peptídeo de toxina fundido se ligue aos mosquitos de uma maneira que induz toxicidade. Nas modalidades preferidas, o peptídeo alvo especificamente visa um gênero ou espécie de mosquito. Existem três espécies particulares de mosquito que são as mais implicadas na disseminação de doença Aedes eegypti, que transporta a febre amarela, Zika, chikungunya, dengue e encefalite, Anopheles gambiae, que carreia malária, e várias espécies do gênero Culex, que carregam o vírus de West Nile, encefalite e filariase. Em uma modalidade preferida, o peptídeo alvo é projetado para direcionar o Aedes aegypti. O domínio III da glicoproteína do vírus da dengue mostrou ser a estrutura ativa que permite que a partícula do vírus da dengue se ligue às células epidérmicas do intestino de mosquitos, a fim de que o vírus entre com sucesso nas células (Hrobowski (2005) Virology Journal 2:49). Em uma modalidade preferida, um peptídeo derivado do Domínio III da

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7/24 glicoproteína do vírus da dengue é utilizado para direcionar os peptídeos inseticidas ao intestino do Aedes aegypti. O uso desta proteína alvo para direcionar o peptídeo de toxina fundido especificamente para o intestino do mosquito resultará na toxina que é letal para o mosquito sem afetar abelhas domésticas e outros polinizadores.

[0022] Em outras modalidades preferidas, o peptídeo alvo possui a seguinte sequência: MIGVEPGQLKLNWFKK (SEQ ID NO:1).

[0023] Nas modalidades preferidas adicionais, os domínios de direcionamento podem ser derivados de sequências de Domínio III dos vírus da Zika ou West Nile. Os domínios de direcionamento podem ser projetados para direcionar outras espécies de mosquitos, tais como várias espécies do gênero Culex, além dos mosquitos Aedes. Os domínios de direcionamento apropriados trabalham similarmente com o Domínio III da glicoproteína do vírus da dengue pelo fato de que eles permitem que os vírus dos quais eles são derivados se liguem especificamente aos mosquitos. Qualquer peptídeo alvo adequado pode ser utilizado contanto que ele (1) possa ser expresso na planta, (2) facilite a ligação específica a um mosquito alvo em um local que irá induzir a toxicidade, tal como o intestino, e não a qualquer espécie não alvo, e (3) é capaz de formar um peptídeo de fusão com a toxina de peptídeo selecionada. Os vírus da Dengue, Zika e West Nile são todos flavivírus e as sequências do Domínio III de cada um destes vírus devem funcionar eficazmente como peptídeos alvo na presente invenção.

[0024] Em outras modalidades preferidas das plantas mosquitocidas, uma toxina é selecionada que é tóxica para mosquitos após a ligação ao intestino. Notavelmente, não é necessário utilizar uma toxina que demonstre uma falta completa de toxicidade para outras espécies de insetos. O peptídeo alvo que é ligado à toxina

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8/24 garante que a toxina afete especificamente apenas os mosquitos, mesmo se o peptideo for absorvido a partir do néctar de Impatiens por outros insetos. Nas modalidades preferidas, o peptideo de toxina é o peptideo de toxina de aranha Hv1a. Este peptideo de toxina foi direcionado aos afídeos com sucesso.

[0025] Em outras modalidades preferidas, o peptideo de toxina possui a seguinte sequência:

SPTCIPSGQPCPYNENCCSQSCTFKENENGNTVKRCD (SEQ ID NO: 2). [0026] As modalidades preferidas adicionais utilizam outras toxinas no peptideo de fusão, incluindo peptideos antimicrobianos naturalmente encontrados no néctar, que podem ser convertidos para a toxicidade de mosquitos. Qualquer peptideo de toxina adequado pode ser utilizado contanto que ele (1) possa ser expresso na planta, (2) seja tóxico para mosquitos, e (3) seja capaz de formar um peptideo de fusão com o peptideo alvo selecionado. Os exemplos incluem a toxina Cry11B ou qualquer uma das toxinas Cry mosquitocida de Bacillus thuringiensis. Estas são altamente tóxicas para as larvas de mosquito em particular. Outras toxinas adequadas incluem laterosporulina (uma bacteriocina da Brevibacillus bacteria) e peptideo de defensina de Amblyomma-2 (uma defensina de carrapato Amblyomma hebraeum), que são peptideos antimicrobianos. Ambos são bastante expressos em plantas de tabaco transgênicas.

[0027] Em modalidades adicionais, o peptideo de toxina fundido é composto de um peptideo alvo adequado conectado a um peptideo de toxina adequado através de um conector adequado. Nas modalidades preferidas adicionais, o peptideo alvo da SEQ ID NO: 1 e o peptideo de toxina da SEQ ID NO: 2 são conectados através de um conector tendo a sequência: GGSGGGSGG (SEQ ID NO:3).

[0028] As modalidades preferidas pertencem ao próprio peptideo de toxina fundido e aos métodos de produção do peptideo de toxina

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9/24 fundido, tal como através da expressão em E. coliou levedura seguido pela extração, isolamento ou purificação do peptídeo em uma forma que pode ser utilizada como uma toxina mosquitocida. O peptídeo de toxina fundido pode ser combinado com qualquer veículo adequado, tal como açúcar ou substância semelhante a néctar, para produzir uma substância mosquitocida que deve ser apropriada para ser absorvida ou consumida por mosquitos. Devido à especificidade direcionada do peptídeo de toxina fundido aos mosquitos, a substância não será tóxica para as espécies não alvo.

[0029] Outras modalidades preferidas referem-se às plantas mosquitocidas transgênicas projetadas para expressar o peptídeo de toxina fundido de uma maneira que torna o peptídeo disponível aos mosquitos para absorção ou consumo, ou de outra forma expõe o peptídeo aos mosquitos para captação. Em algumas modalidades preferidas, as plantas mosquitocidas transgênicas são plantas produtoras de néctar, devido à forte atração natural que os mosquitos têm com relação ao néctar.

[0030] As modalidades preferidas de plantas de néctar mosquitocidas utilizam a espécie mais comum do gênero botânico Impatiens de jardim, Impatiens walleriana, uma planta nativa do Leste Africano. O gênero botânico Impatiens é a planta de estratificação mais comum em todo o mundo. Elas são baratas, fáceis de cultivar e requerem pouca manutenção. Um estudo ecológico recente demonstrou que o gênero botânico Impatiens pode se desenvolver sem manutenção (de modo silvestre) em todos os trópicos chuvosos e também em grande parte das zonas temperadas chuvosas, que combinam rigorosamente os raios de ação das espécies de vetor de mosquito Aedes e Anopheles. Especificamente, a faixa adaptativa do gênero botânico Impatiens inclui todos os USA do leste, a maior parte da América Latina, Sudeste da Ásia, China, índia, Europa e a maior

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10/24 parte da África. Em áreas isentas de geada, existe um plantio permanente. Em zonas de geada, é plantada uma vez por ano na primavera.

[0031] Além disso, a Impatiens walleriana é altamente atrativa para mosquitos e pode ser modificada geneticamente sem dificuldade para aqueles versados na técnica. O genoma da Impatiens walleriana foi sequenciado. O promotor (3 kb de DNA) que aciona a expressão da proteína de néctar mais altamente expressa (um análogo de phylloplanin) foi montado e é utilizado nas modalidades preferidas para conduzir a expressão de peptídeos de toxina direcionados ao mosquito em Impatiens walleriana. Genes que correspondem aos peptídeos antimicrobianos e peptídeos inseticidas do gênero botânico Impatiens nativo podem ser isolados a partir do sequenciamento genômico. Nas modalidades preferidas adicionais, estes podem ser direcionados aos mosquitos através do uso de cassetes de inserção genética que contêm um mínimo de DNA externo, com quase exclusivamente DNA de plantas do gênero botânico Impatiens nativo.

[0032] As plantas mosquitocidas transgênicas são posicionadas de forma única para ser um modelo de função de biossegurança transgênica. Esta tecnologia possui várias propriedades que facilitarão a aceitação pelo EPA e o público. Em primeiro lugar, a tecnologia é reversível. Diferentemente das propostas de impulso genético, sempre será possível reverter o controle de mosquitos por meio da erradicação das plantas. O gênero botânico Impatiens, como exemplo, não produz nenhum rizoma ou tubérculo persistente. Da mesma forma, a tecnologia é local e previsível. Áreas de controle são determinadas por onde os seres humanos semeiam as plantas. Além disso, algumas plantas preferidas, tais como as do gênero botânico Impatiens, podem ser produzidas comercialmente por meio de mudas ou sementes. Assim, a tecnologia de corte do gene de toxina de semente e pólen

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11/24 (para evitar o escape do transgene para o ecossistema) não irá interferir com a produção comercial. Também, nenhum efeito tóxico sobre as abelhas domésticas não alvo ou outros insetos não alvo é esperado. Isto também é uma aplicação médica, não um produto alimentar. Ao contrário das culturas de GMO, as plantas não se tornarão parte da cadeia alimentar humana. Esta aplicação também é comprada e instalada pelo consumidor final. Diferente dos produtos alimentares produzidos em fazendas distantes, esta solução é de domínio do consumidor final da tecnologia, o que promove a aceitação. Finalmente, as plantas de jardim em particular são uma parte tradicional e estabelecida da vida residencial. A presente tecnologia torna o controle de mosquitos parte da paisagem.

[0033] Consequentemente, as modalidades preferidas da presente invenção incluem um método para a produção de uma planta modificada que expressa toxinas mosquitocidas, incluindo a planta produtora de néctar mosquitocida que expressa toxinas mosquitocidas no néctar da planta. O método inclui a indução da expressão de uma construção de gene exógeno que codifica um peptídeo de toxina fundido nas células da planta, de tal modo que o peptídeo de toxina fundido está realmente presente e expresso naturalmente pela planta. O peptídeo de toxina fundido inclui um peptídeo alvo de mosquito fundido a um peptídeo de toxina e é especificamente tóxico para os mosquitos. Nas modalidades preferidas adicionais, a planta é Impatiens walleriana. Em outras modalidades preferidas, o peptídeo alvo de mosquito visa um ou mais dos mosquitos Aedes, Anopheles ou Culex. Nas modalidades preferidas adicionais, o peptídeo alvo de mosquito visa os mosquitos Aedes aegypti, tal como através da ligação ao epitélio intestinal de mosquitos Aedes aegypti. Nas modalidades preferidas adicionais, o peptídeo de toxina é um peptídeo que possui toxicidade contra mosquitos e pode preferivelmente ser um

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12/24 peptídeo de toxina de aranha Hv1a. Em outras modalidades preferidas, o peptídeo de toxina fundido carece de toxicidade contra outros organismos.

[0034] As modalidades preferidas da presente invenção utilizam uma construção de gene exógeno que inclui um promotor específico para a planta, um gene que codifica o peptídeo alvo de mosquito, e um gene que codifica o peptídeo de toxina. Nas modalidades preferidas adicionais, a expressão da construção de gene exógeno é induzida na planta através da transformação de pelo menos uma célula produtora de néctar da planta com a construção do gene exógeno para produzir uma planta modificada que expressa o peptídeo de toxina fundido no néctar da planta.

[0035] As modalidades preferidas adicionais referem-se à produção de plantas modificadas que não irão expressar a toxina em tecidos diferentes de néctar. Nestas modalidades preferidas, a expressão de um cassete terminador também é induzida na planta modificada, e o cassete terminador extrai a construção do gene exógeno a partir do ácido nucleico encontrado nas células da planta diferentes das células que produzem néctar, tais como sementes, pólen, raízes e folhas. Assim, a planta modificada expressa o peptídeo de toxina fundido em seu néctar e deixa de expressar o peptídeo de toxina fundido nos tecidos sem néctar.

[0036] Outras modalidades preferidas da presente invenção incluem uma planta mosquitocida modificada, em que a planta modificada expressa uma construção de gene exógeno que codifica um peptídeo de toxina fundido nas células da planta de uma maneira que torna o peptídeo de toxina fundido disponível para o consumo, exposição ou absorção geral pelos mosquitos, em que o peptídeo de toxina fundido compreende um peptídeo alvo de mosquito fundido a um peptídeo de toxina, e em que o peptídeo de toxina fundido é tóxico

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13/24 para mosquitos. Em outras modalidades preferidas, a planta é uma planta produtora de néctar e o peptídeo de toxina fundido é expresso no néctar da planta. Em outras modalidades preferidas, a planta modificada é Impatiens walleriana. As modalidades preferidas adicionais da planta modificada expressam um peptídeo alvo de mosquito como parte do peptídeo de toxina fundido que visa os mosquitos Aedes, Anopheles ou Culex, ou preferivelmente aquele que visa os mosquitos Aedes aegypti. O peptídeo alvo de mosquito pode, de preferência, ligar-se ao epitélio intestinal dos mosquitos Aedes aegypti. Geral mente, nas modalidades preferidas, o peptídeo de toxina é um peptídeo que possui toxicidade contra mosquitos, e preferivelmente o peptídeo de toxina é um peptídeo de toxina de aranha Hv1a. Nas modalidades preferidas adicionais, o peptídeo de toxina fundido expresso pela planta mosquitocida modificada carece de toxicidade contra outros organismos.

[0037] As modalidades preferidas adicionais incluem uma semente da planta mosquitocida modificada.

[0038] Outras modalidades preferidas da presente invenção incluem uma planta de Impatiens walleriana mosquitocida modificada, em que a planta modificada expressa (a) uma construção de gene exógeno que codifica um peptídeo de toxina fundido nas células da planta que produz néctar, em que o peptídeo de toxina fundido compreende um peptídeo alvo de mosquito fundido a um peptídeo de toxina, em que o peptídeo alvo de mosquito se liga ao epitélio intestinal dos mosquitos Aedes aegypti, em que o peptídeo de toxina é um peptídeo de toxina de aranha Hv1a, e (b) cassete terminador, em que o cassete terminador corta a construção de gene exógeno a partir do ácido nucleico encontrado nas células da planta diferentes das células que produzem néctar, e em que a planta modificada deixa de expressar o peptídeo de toxina fundido nos tecidos sem néctar da

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14/24 planta modificada.

EXEMPLO 1

[0039] Em um estudo anterior, 37 espécies de plantas foram avaliadas quanto a atratividade de mosquitos, a produção de proteína de néctar e a capacidade de serem transformadas geneticamente. Entre estes candidatos, a planta do gênero botânico Impatiens de jardim comum (Impatiens walleriana) sobressaiu em todas as áreas (Chen and Kearney, Acta Tropica (2015) 146:1-88). Desde então, o proteoma e o transcriptoma de néctar e de órgãos de secreção de néctar foram examinados e a proteína principal produzida no néctar foi identificada. O gene correspondente do genoma do gênero botânico Impatiens foi clonado, e o promotor correspondente a ser utilizado para expressar uma toxina de peptídeo no néctar foi identificado. Os promotores de secreção de néctar de Arabidopsis também foram utilizados para criar plantas transgênicas do gênero botânico Impatiens que expressam um gene marcador no néctar. O gene marcador GUS foi expresso no gênero botânico Impatiens utilizando promotores específicos de secreção de néctar de Arabidopsis, demonstrando que estas plantas podem servir como veículos de liberação de néctar para as proteínas externas. O transcriptomona de néctar e os transcriptomas de controle de folha e haste, de plantas do gênero botânico Impatiens, foram analisados.

[0040] Sequenciamento e análise do genoma de Impatiens walleriana facilitam o isolamento de promotores de néctar do gênero botânico Impatiens. Dados de RNA-Seq dos órgãos de secreção de néctar, haste e tecidos folhosos têm sido obtidos, assim como os dados de espectrometria de massa das proteínas de néctar. Os promotores de proteínas de néctar altamente expressas são identificados e clonados. Estes promotores são analisados com relação à expressão de néctar do marcador fluorescente RFP nas

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15/24 plantas do gênero botânico Impatiens transgênicas.

[0041] Os peptídeos alvo diferentes são testados quanto à ligação simples ao epitélio intestinal de mosquitos, incluindo epitélio intestinal do Aedes aegypti. Um peptídeo alvo identificado é um peptídeo derivado do Domínio III da glicoproteína do vírus da dengue. As fusões de peptídeo alvo/eGFP são produzidas em E. coli e as proteínas de fusão colocadas em suspensão em sacarose a 5% para absorção. Após a alimentação, as tripas do mosquito são examinadas por microscopia de fluorescência. As sequências de peptídeo alvo são alongadas ou encurtadas para otimizar a ligação. Os melhores peptídeos alvo de ligação são utilizados para produzir as fusões de peptídeo alvo/peptídeo inseticida, incluindo as fusões de peptídeo alvo/peptídeo inseticida Hv1a. Estes peptídeos de fusão são expressos em E. coli, purificados e alimentados em mosquitos para determinar a mortalidade do Aedes aegypti. Um teste semelhante é conduzido em um organismo não alvo tal como as moscas de fruta para demonstrar escassez de toxicidade não alvo.

[0042] As plantas transgênicas que expressam peptídeos de fusão direcionados demonstraram ser especificamente resistentes a fungos e afídeos da podridão da raiz de Fusarium. Em Bonning et al. (2014) Nature Biotechnology 32(1):102, o peptídeo de toxina de aranha Hv1a foi fundido à proteína de revestimento de um luteovírus vegetal. Este vírus se liga naturalmente ao estilete de afídeos através de sua proteína de revestimento, que pega uma carona dentro do afídeo de planta em planta. O peptídeo de Hv1a não é tóxico aos afídeos através da absorção, mas, quando fundido à proteína de revestimento de luteovírus, é muito tóxico, e específico apenas para os afídeos, não outros insetos.

[0043] O promotor de néctar mais forte é utilizado para testar uma variedade de peptídeos inseticidas para o potencial de expressão no

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16/24 néctar de plantas do gênero botânico Impatiens. Os genes que fundem as melhores sequências direcionadas ao intestino e inseticidas são expressos em E. coii e testados contra mosquitos através da absorção. A melhor construção de fusão é colocada na planta do gênero botânico Impatiens. As plântulas resultantes são multiplicadas, para formar estoque para testes de campo, a partir de vários grupos de brotos produzidos prolificamente na cultura de tecidos de plantas do gênero botânico Impatiens. Ensaios de moralidade não alvos são conduzidos, incluindo aqueles para abelhas domésticas, planipenes, joaninhas e uma espécie de borboleta, para demonstrar falta de toxicidade não direcionada.

[0044] Testes de campo são conduzidos utilizando experimentos mesocosmos externos. Jardins de teste de espécies misturadas, contendo várias plantas do gênero botânico Impatiens produtoras de néctar mosquitocida misturadas com plantas de jardim competidoras, são configurados dentro de uma gaiola de malha 8' x 10' em localizações residenciais. Os mosquitos são introduzidos e a mortalidade registrada.

EXEMPLO 2

[0045] Este exemplo demonstra o direcionamento de mosquitos Aedes aegypti através do uso de um peptídeo da sequência de Domínio III da glicoproteína do vírus da dengue. Esta sequência permite que o vírus da dengue se ligue aos revestimentos do intestino do mosquito e inicie o processo de infecção do mosquito. A parte ativa desta glicoproteína foi fundida à proteína fluorescente EGFP e a proteína de fusão (incluindo a proteína de estabilização, SUMO) foi expressa em E. coii. A proteína purificada foi então adicionada a 10% de sacarose e alimentada aos mosquitos de uma maneira de busca por pulso para garantir que qualquer fluorescência observada no intestino fosse verdadeiramente devido à ligação estável ao

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17/24 revestimento do intestino.

[0046] O vetor pE-SUMOstar da LifeSensors (Malvern, PA) foi utilizado para a expressão de Escherichia coli nas cepas de E. coli competentes BL21(DE3) e 10-beta de NEB (New England Biolabs, Ipswich, MA). Otimizadas pelo códon gBlocks para a expressão de E. coli contendo EGFP, as sequências de fusão de Dengue/EGFP, a toxina Hv1a, e de fusão de Dengue/Hv1a foram obtidas da IDT (Skokie, IL). Todas os ovos de mosquito de Aedes aegypti e larvas de Culex quinquefasciatus foram obtidos da Benzon Research Inc. (Carlisle, PA).

[0047] Duas construções de outro modo idênticas foram construídas para expressar o seguinte em E. colr.

1. Marcador de EGFP

2. Marcador de EGFP direcionado

[0048] Cada uma destas construções era um vetor SUMO contendo a proteína de estabilização de SUMO fundida ao peptídeo de carga útil, conforme mostrado na Figura 1 e Figura 2. A expressão foi controlada pelo operador lac, promotor T7 e terminador T7. As marcas 6xHis tornaram-se disponíveis para a purificação a jusante. KanR e lacl foram incluídas para seleção clonal. A alça calibrada da proteína de flavivírus E Domínio III (SEQ ID NO: 1) foi utilizada para direcionar a proteína de fusão para revestimentos de intestino do Aedes aegypti. A EGFP era o gene de proteína marcadora fluorescente. Os vetores SUMO são comercialmente disponíveis, e a EGFP é uma proteína marcadora padrão.

[0049] gBlocks foram construídos para a EGFP, sequências de fusão de Dengue/EGFP, a toxina Hv1a, e de fusão de Dengue/Hv1a. O domínio de direcionamento da Dengue foi tirado do último 45 bp da glicoproteína E Domínio III do vírus da Dengue. As sequências de gBlock sintetizadas foram amplificadas com iniciadores específicos da

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18/24 sequência projetados para flanquear as sequências com os sítios da enzima de restrição para Mfel e BamHI, respectivamente, utilizando a NEB Q5® High-Fidelity DNA Polymerase (NEB, PCR Using...(2018)). Estes produtos amplificados por PCR foram operados em um gel de agarose a 1% e foram purificados em gel com o Promega Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, Madison, Wl (2018)). Os produtos de PCR purificados e o vetor pE-SUMOstar foram digeridos com as enzimas de restrição Mfel e BamHI durante 1 h a 37 Ό. Estes produtos digeridos foram então operados em um gel de agarose a 1% e foram purificados em gel com o Promega Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System. Os produtos de PCR digeridos foram ligados no vetor pE-SUMOstar digerido utilizando a ligase NEB T4 DNA (NEB, Ligation Protocol...(2018)). Estes plasmideos recombinantes foram submetidos à eletroporação em E. coli NEB 10-beta Competent e as colônias transformadas foram então seletivamente cultivadas durante a noite a 37 O em placas de ágar contendo LB e 50 pg/ml de canamicina. As colônias positivamente transformadas foram confirmadas com os iniciadores anteriormente mencionados utilizando a NEB Taq polimerase, inoculadas em 10 ml de LB contendo 50 ug/ml de canamicina, e cultivadas durante a noite em um agitador 37C (NEB, PCR Protocol...(2018)). Os plasmideos recombinantes positivos foram purificados a partir das culturas de LB utilizando o Promega Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System e foram transformados em E. coli NEB BL21 quimicamente competente (Promega, Wizard® Plus...(2018)).

[0050] Transformantes positivos BL21 foram cultivados durante a noite em um agitador a 37 O em 20 ml de caldo 2X YT contendo 50 ug/ml de canamicina. Culturas secundárias de 500 ml de 2X YT contendo 50 ug/ml de canamicina foram inoculadas com 20 ml de culturas primárias e agitadas (220 rpm) a 37 Ό para uma GD600 de

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0,7. A expressão de proteína foi induzida nas culturas com IPTG 0,1 mM e agitação durante a noite (180 rpm) a 14 G. As células foram colhidas com centrifugação em 8000xg durante 1 h a 4 G. As células foram colocadas novamente em suspensão em 1X PBS e submetidas à lise durante a noite a -20 G com 0,1 mg/ml de lisozima. As suspensões submetidas à lise foram descongeladas e submetidas à vibração ultrassônica com um processador ultrassônico de sonda em amplitude de 40%. A suspensão submetida à vibração ultrassônica foi centrifugada a 80.000xg durante 1 h a 4 G. O sobre nadante foi coletado e purificado com cromatografia de coluna de níquel utilizando 1X PBS como a ligação e tampão de lavagem e 1X PBS contendo imidazol 500 mM como o tampão de eluição. As proteínas purificadas foram submetidas à diálise durante a noite a 4 G em 1X PBS para remover o imidazol. As proteínas purificadas foram operadas em gel SDS-PAGE a 18% junto de 1 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,25 mg/ml, 0,1 mg/ml, e 0,05 mg/ml de BSA para confirmar suas presenças e determinar suas concentrações utilizando Imaged (Schneider (2012)). [0051] Ovos de Ae. Aedes aegypti foram elevados em bandejas plásticas contendo 1 L de água da bica e alimento de peixe picado (Tetramin®, Tetra, Blacksburg, VA). Larvas de C. quinquefasciatus foram transferidas para bandejas plásticas após a chegada e receberam o alimento de peixe picado suplementado com pó de fígado. Todas as colônias foram mantidas a 27 + 1 °C, 70 ± 5% de RH. Assim que os mosquitos alcançaram o seu estágio de pupa, eles foram transferidos para tubos plásticos para ajudar na identificação do sexo na fase adulta.

[0052] Cada peptídeo de EGFP foi utilizado para produzir uma solução de sacarose a 10%. Um controle negativo de tampão foi efetuado utilizando 1X PBS para produzir uma solução de sacarose a 10%. Cada proteína fluorescente e a solução de sacarose de controle

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20/24 foram adicionadas a uma bola de algodão dentro de um recipiente de 4 ml e cada recipiente foi colocado em uma câmara de ensaio de mosquito separada transparente. Os mosquitos adultos Ae. aegypti e C. quinquefasciatus 10 machos e 10 fêmeas foram transferidos para cada câmara e armazenados a 27 ± 1 O, 70 ± 5% de R H. Após 2 dias, os mosquitos foram transferidos para câmaras contendo apenas 10% de sacarose. Após mais 2 dias, os intestinos intermediários foram colhidos. A fluorescência foi visualizada sob um Stereomicroscope SZX16 com unidade de fluorescência e um filtro GFP (excitação: 460 a 495 nm, emissão: 510 nm+). Todas as experiências de busca por pulso foram executadas como três réplicas separadas.

[0053] A FIGURA 3 mostra que a EGFP foi direcionada com sucesso aos revestimentos de intestino de Aedes aegypti, para mosquitos tanto machos (esquerda) quanto fêmeas (direita). Os painéis inferiores na FIGURA 3 mostram que a EGFP direcionada ao peptídeo da dengue permaneceu ligada aos revestimentos do intestino após 2 dias de pulso de mosquito se alimentando de sacarose a 10% contendo EGFP direcionada, seguido por 2 dias de busca de alimentação de sacarose a 10% isoladamente. Os painéis intermediários na Figura 3 mostram que nos experimentos de controle negativo, a EGFP não direcionada não permaneceu no intestino após a busca com sacarose a 10%. No experimento de controle nulo mostrado nos painéis superiores da FIGURA 3, nenhuma fluorescência foi vista com alimentação contínua com sacarose a 10% colocada em suspensão em tampão de PBS.

EXEMPLO 3

[0054] Este exemplo demonstra o uso de uma proteína de ligação ao hospedeiro de um vírus específico para uma espécie de mosquito particular para direcionar esta espécie de mosquito. Os resultados demonstram morte direcionada de mosquitos Aedes aegypti através

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21/24 da utilização de um peptídeo da sequência de Domínio III da glicoproteina do virus da dengue. Especificamente, a fraca toxicidade nativa da toxina inseticida Hv1a contra Aedes aegypti foi grandemente aumentada pela sua fusão ao peptídeo alvo derivado da dengue.

[0055] Neste exemplo, duas construções, de outro modo idênticas às duas construções anteriores utilizadas no Exemplo 2, foram construídas para expressar o que se segue em E. colr.

1. Toxina Hv1a

2. Toxina Hv1 a direcionada

[0056] Cada uma destas construções, mostradas na FIGURA 4 e na FIGURA 5, era um vetor SUMO contendo a proteína de estabilização SUMO fundida ao peptídeo de carga útil. A expressão foi controlada pelo operador lac, promotor T7 e terminador T7. As marcas 6xHis tornaram-se disponíveis para a purificação a jusante. KanR e lacl estavam presentes para seleção clonal. A alça calibrada da proteína de flavivírus E Domínio III (SEQ ID NO: 1) foi incluída para direcionar a proteína de fusão para revestimentos de intestino do Aedes aegypti. Toxina refere-se ao gene de toxina Hv1a (SEQ ID NO: 2).

[0057] Cada toxina foi diluída em 500 ug/ml e utilizada para produzir uma solução de sacarose a 10%. 1X PBS foi utilizado novamente para produzir uma solução de sacarose a 10% de controle negativo de tampão. Cada toxina e solução de sacarose de controle foram adicionadas a uma câmara de ensaio de mosquito conforme descrito acima. Os mosquitos adultos Ae. aegypti e C. quinquefasciatus 10 machos e 10 fêmeas foram transferidos para cada câmara e armazenados a 27 ± 1 O, 70 ± 5% de RH. Os mosquitos foram deixados absorver 10% de sacarose contendo a toxina Hv1a, a toxina Hv1a fundida ao peptídeo derivado da dengue que visa o Aedes, ou nenhuma proteína adicionada (tampão). Os eventos de

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22/24 morte foram registrados a cada 24 horas durante 3 dias. 3 réplicas foram conduzidas para este experimento. O GraphPad Prism 7 foi utilizado para analisar os dados registrados com relação à significância utilizando o teste Log-rank (Mantel-Cox) e para representar os dados em uma curva de sobrevivência com intervalos de confiança de 95% (Cl).

[0058] Os resultados do experimento de toxina direcionada contra mosquitos alvos Ae. aegypti são mostrados na FIGURA 6, Nenhum mosquito morreu que se alimentou apenas com sacarose a 10% (tampão), e uma pequena quantidade de toxicidade foi observada em populações de mosquito alimentadas apenas com sacarose 10% contendo toxina. Em contraste, uma toxicidade grandemente aumentada foi registrada com a toxina direcionada ao Aedes contendo o peptideo alvo do vírus da dengue. As barras indicam limites de confiança de 95%.

EXEMPLO 4

[0059] Este exemplo demonstra a extrema especificidade do mecanismo de direcionamento descrito nesta invenção. Os resultados mostram que a toxina direcionada não possui maior toxicidade do que a toxina não direcionada quando absorvida pelo mosquito Culex quinquefasciatus, o qual não é um hospedeiro para o vírus da dengue. Em outras palavras, a toxicidade mínima da toxina base não é melhorada pelo peptideo alvo.

[0060] Conforme descrito no Exemplo 3, as mesmas construções foram utilizadas e os mosquitos adultos C. quinquefasciatus também foram deixados absorver sacarose a 10% contendo a toxina Hv1a, a toxina Hv1a fundida ao peptideo derivado da dengue que visa o Aedes, ou nenhuma proteína adicionada (tampão). Os resultados do estudo de fluorescência são mostrados na FIGURA 7. A EGFP direcionada para o Aedes não se ligou aos revestimentos do intestino

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23/24 do Culex quinquefasciatus, para os mosquitos machos ou fêmeas. Os painéis inferiores da FIGURA 7 mostram que a EGFP direcionada ao peptídeo da dengue não estava compreendida nos revestimentos do intestino após 2 dias de pulso de alimentação de sacarose a 10% contendo EGFP direcionada, seguido por 2 dias de busca de alimentação de sacarose a 10% isoladamente. Os painéis intermediários na Figura 7 mostram que nos experimentos de controle negativo, a EGFP não direcionada não permaneceu no intestino após a busca com sacarose a 10%. Os painéis superiores da FIGURA 7 mostram que no experimento de controle nulo, nenhuma fluorescência foi vista com alimentação contínua com sacarose a 10% colocada em suspensão em tampão de PBS.

[0061] A FIGURA 8 mostra os resultados em termos de porcentagem de sobrevivência dos mosquitos não alvos Culex quinquefasciatus alimentados com peptídeo inseticida direcionados para Aedes. As contagens de mortalidade foram conduzidas diariamente. Não houve diferença significativa entre mosquitos alimentados por sacarose a 10% isoladamente (Tampão), toxina contendo sacarose a 10% (toxina), ou toxina direcionada ao Aedes contendo o peptídeo alvo do vírus da dengue (Dengue/Toxina). As barras indicam limites de confiança de 95%.

[0062] Isto demonstra que o mecanismo de direcionamento é extremamente específico, mesmo para o nível do gênero. O teste crítico de não toxicidade para abelhas e outros polinizadores não relacionados é esperado produzir os mesmos resultados, visto que este teste mais rigoroso demonstra a especificidade mesmo entre diferentes tipos de mosquitos.

REFERÊNCIAS

[0063] As seguintes publicações são aqui incorporadas por referência.

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Bonning et al. (2014) Nature Biotechnology 32(1):102

Hrobowski (2005) Virology Journal 2:49

Chen & Kearney, Acta Tropica (2015) 146:1-88

NEB. PCR Using Q5® High-Fidelity DNA Polymerase (M0491). NEB (2018).

Promega. Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System. Promega (2018).

NEB. Ligation Protocol with T4 DNA Ligase (M0202). NEB (2018).

NEB. PCR Protocol for Taq DNA Polymerase with Standard Taq Buffer (M0273). NEB (2018).

Promega. Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System. Promega (2018).

Schneider, C. A., Rasband, W. S. & Eliceiri, K. W. NIH Image to Imaged: 25 years of image analysis. Nat. Methods 9, 671-675 (2012).

Claims

1. Toxina mosquitocida, caracterizada pelo fato de que compreende:

um peptídeo de toxina fundido, em que o peptídeo de toxina fundido compreende um peptídeo alvo de mosquito fundido a um peptídeo de toxina, em que o peptídeo alvo de mosquito é um peptídeo que compreende uma sequência de Domínio III da glicoproteina do vírus da dengue, e em que o peptídeo de toxina fundido é tóxico para os mosquitos.

2. Toxina mosquitocida de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o peptídeo alvo de mosquito visa os mosquitos Aedes.

3. Toxina mosquitocida de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o peptídeo alvo de mosquito visa os mosquitos Aedes aegypti.

4. Toxina mosquitocida de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o peptídeo alvo de mosquito se liga ao epitélio do intestino de mosquitos Aedes aegypti.

5. Toxina mosquitocida de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o peptídeo de toxina é um peptídeo que possui toxicidade contra mosquitos.

6. Toxina mosquitocida de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o peptídeo de toxina é um peptídeo que carece de toxicidade contra mosquitos sem fusão ao peptídeo alvo de mosquito.

7. Toxina mosquitocida de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o peptídeo de toxina é um peptídeo de toxina de aranha Hv1a.

8. Toxina mosquitocida de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o peptídeo de toxina fundido carece de

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2/6 toxicidade contra outros organismos.

9. Toxina mosquitocida de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que ainda compreende um veículo.

10. Método para a produção de uma planta modificada que expressa toxinas mosquitocidas, caracterizado pelo fato de que compreende:

a indução de expressão de uma construção de gene exógeno que codifica um peptídeo de toxina fundido nas células alvo da planta, em que o peptídeo de toxina fundido compreende um peptídeo alvo de mosquito fundido a um peptídeo de toxina, em que o peptídeo alvo de mosquito é um peptídeo que compreende uma sequência de Domínio III da glicoproteína do vírus da dengue, e em que o peptídeo de toxina fundido é tóxico para mosquitos; e a produção de uma planta modificada que expressa o peptídeo de toxina fundido.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a planta é uma planta produtora de néctar, as células alvo da planta são células produtoras de néctar, e a planta modificada expressa o peptídeo de toxina fundido no néctar da planta.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a planta é Impatiens walleriana.

13. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o peptídeo alvo de mosquito visa os mosquitos Aedes.

14. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o peptídeo alvo de mosquito visa os mosquitos Aedes aegypti.

15. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o peptídeo alvo de mosquito se liga ao

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3/6 epitélio intestinal de mosquitos Aedes aegypti.

16. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o peptídeo de toxina é um peptídeo que possui toxicidade contra mosquitos.

17. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o peptídeo de toxina é um peptídeo que carece de toxicidade contra mosquitos sem fusão ao peptídeo alvo de mosquito.

18. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o peptídeo de toxina é um peptídeo de toxina de aranha Hv1a.

19. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o peptídeo de toxina fundido carece de toxicidade contra outros organismos.

20. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a construção de gene exógeno compreende um promotor específico para a planta, um gene que codifica o peptídeo alvo de mosquito, e um gene que codifica o peptídeo de toxina.

21. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a etapa de induzir a expressão da construção de gene exógeno compreende transformar pelo menos uma célula da planta com a construção de gene exógeno para produzir uma planta modificada que expressa o peptídeo de toxina fundido.

22. Planta modificada, caracterizada pelo fato de que é preparada pelo método como definido na reivindicação 10.

23. Método para a produção de uma planta modificada que expressa toxinas mosquitocidas no néctar da planta, caracterizado pelo fato de que compreende:

a indução da expressão de uma construção de gene

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4/6 exógeno que codifica um peptídeo de toxina fundido nas células da planta que produz néctar, em que o peptídeo de toxina fundido compreende um peptídeo alvo de mosquito fundido a um peptídeo de toxina, em que o peptídeo alvo de mosquito é um peptídeo que compreende uma sequência do Domínio III da glicoproteína do vírus da dengue, em que o peptídeo de toxina é um peptídeo de toxina de aranha Hv1a, e em que a planta é Impatiens walleriana; e a produção de uma planta modificada que expressa o peptídeo de toxina fundido no néctar da planta modificada e não expressa o peptídeo de toxina fundido nos tecidos sem néctar da planta modificada.

24. Planta modificada, caracterizada pelo fato de que é preparada pelo método como definido na reivindicação 23.

25. Planta mosquitocida modificada, caracterizada pelo fato de que a planta modificada expressa uma construção de gene exógeno que codifica um peptídeo de toxina fundido nas células alvo da planta, em que o peptídeo de toxina fundido compreende um peptídeo alvo de mosquito fundido a um peptídeo de toxina, em que o peptídeo alvo de mosquito é um peptídeo que compreende uma sequência do Domínio III da glicoproteína do vírus da dengue, e em que o peptídeo de toxina fundido é tóxico para os mosquitos.

26. Planta mosquitocida modificada de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo fato de que a planta é uma planta produtora de néctar, as células alvo da planta são células produtoras de néctar, e a planta mosquitocida modificada expressa o peptídeo de toxina fundido no néctar da planta.

27. Planta mosquitocida modificada de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo fato de que a planta é Impatiens walleriana.

28. Planta mosquitocida modificada de acordo com a

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5/6 reivindicação 25, caracterizada pelo fato de que o peptídeo alvo de mosquitos visa os mosquitos Aedes.

29. Planta mosquitocida modificada de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo fato de que o peptídeo alvo de mosquito visa os mosquitos Aedes aegypti.

30. Planta mosquitocida modificada de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo fato de que o peptídeo alvo de mosquito se liga ao epitélio do intestino de mosquitos Aedes aegypti.

31. Planta mosquitocida modificada de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo fato de que o peptídeo de toxina é um peptídeo que possui toxicidade contra mosquitos.

32. Planta mosquitocida modificada de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo fato de que o peptídeo de toxina é um peptídeo que carece de toxicidade contra mosquitos sem fusão ao peptídeo alvo de mosquito.

33. Planta mosquitocida modificada de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo fato de que o peptídeo de toxina é um peptídeo de toxina de aranha Hv1a.

34. Planta mosquitocida modificada de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo fato de que o peptídeo de toxina fundido carece de toxicidade contra outros organismos.

35. Planta mosquitocida modificada de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo fato de que a construção de gene exógeno compreende um promotor específico para o néctar da planta, um gene que codifica o peptídeo alvo de mosquito, e um gene que codifica o peptídeo de toxina.

36. Semente da planta modificada como definida na reivindicação 25.

37. Planta Impatiens walleriana mosquitocida modificada, caracterizada pelo fato de que a planta modificada expressa uma

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6/6 construção de gene exógeno que codifica um peptídeo de toxina fundido nas células da planta que produz néctar, em que o peptídeo de toxina fundido compreende um peptídeo alvo de mosquito fundido a um peptídeo de toxina, em que o peptídeo alvo de mosquito é um peptídeo que compreende uma sequência do Domínio III da glicoproteina do vírus da dengue, em que o peptídeo de toxina é um peptídeo da toxina de aranha Hv1a, e em que a planta modificada deixa de expressar o peptídeo de toxina fundido nos tecidos sem néctar da planta modificada.