JP2020515628A - 標的化された殺蚊毒素 - Google Patents

Abstract

本発明の殺虫毒素は、毒素ドメインに標的化ドメインが融合したものを含む融合毒素ペプチドである。標的化ペプチドは、融合毒素ペプチドを蚊に、殺虫活性を導く様式で結合するよう誘導することにより、蚊との特異的な結合をもたらす。本発明の組換え植物は、蚊に対する特異性を確実なものとする標的化ペプチドを含む殺虫毒素タンパク質を蜜中に発現することにより、殺蚊作用を示す。該組換え植物は、農作物の植物ではなく、１つの蚊種に特異的であるから、安全性のロールモデルとして役立つ。

Description

本願は、引用によりその全体を本書の一部とする、２０１７年４月４日に出願された“Targeted Mosquitocidal Toxins”と題する米国仮特許出願第６２／４８１１９９号に基づく優先権を主張する。

本開示は、蚊の数を減らすための、標的化された殺蚊毒素、および殺蚊毒素を産生するよう組換えられた植物に関する。

蚊は、人々に最も嫌がられる害虫の１つである。蚊は、単に不快なものであるだけでなく、数多くの死に至る疾患および重い疾患を媒介する。世界中で、特に開発途上国において、毎年何百万もの人が、蚊が媒介する疾患によって命を落としている。ウイルス性疾患のうち、ワクチン開発が成功しているのは一部に過ぎない。新たにジカウイルスやチクングニアウイルスの脅威に晒されているように、年々新たな病原体が出現していることから、状況は一層困難なものとなっている。

蚊の数を減らすための試みとしては、水溜まりを無くすことを目指した地域の取り組み、および、一般に普及した殺虫剤の散布がある。これらの試みによる大きな成果は挙がっておらず、殺虫剤散布の場合、非標的の種に対して不都合な影響が及ぶ。米国における蚊駆除は殺虫剤プログラムに大きく依存しているが、殺虫剤は生態学的影響を有し得、例えばサウスカロライナにおいて２０１６年に、ジカウイルスの脅威に対して殺虫剤で対処したことによりミツバチの大量死が起こった。限られた状況では防蚊剤が効果的であるが、日常生活、特に日常の家庭生活においては、防蚊剤を日々適用するという習慣は崩れやすい。現在このように蚊防除手段が講じられているが、蚊を介する疾患感染のリスク、および蚊による不快感を回避するために、夏季には単純に屋内で過ごすようにしている米国市民も多い。

本開示は、蚊に対しては毒性であるが、非標的の昆虫種に対しては毒性でない、標的化された殺虫タンパク質に関する。本開示は、該毒素を産生するように組換えられた植物にも関する。特定の態様において、組換え植物は、蚊に対する特異性を確実なものとする標的化ペプチドを含む殺虫毒素タンパク質を発現する。殺虫毒素は、植物が分泌する蜜中に産生されうる。そのような植物は、蚊が蜜摂取を必ず必要とすることを利用した、生態学的に配慮され、低価格であり、かつ、長期的に有効な方法を表す。

蚊の量は、餌としての蜜に大きく依存する。越冬に備えて、また、他の目的のために、雄は蜜および他の糖供給源のみを栄養源とし、雌は吸血のための飛行活動をそれに依存する。この事実を利用して、殺虫剤を加えた糖の餌は、蚊に対する実行可能な駆除手段であることが示されている。しかしながら、殺虫剤の使用は完全に回避することが望ましい。適切かつ効果的な殺蚊ペプチド送達メカニズムは、生物学的に安全な蚊の駆除を可能にしうる。

特定の生物を標的とする毒性ペプチドが製造されている。抗菌ペプチドの特異性が標的化ペプチドの使用によって改変されており、そのような融合体が大腸菌において高収量で生産されている。黄色ブドウ球菌およびストレプトコッカス・ミュータンスに対し特異的に毒性を示す化学合成された融合ペプチドが製造されている。さらに、標的化された融合ペプチドを発現する組換え植物が、根腐を起こすフザリウム属の真菌およびアブラムシに対し特異的に抵抗性であることが示されている。

本開示は、蚊に対して特異的な標的化ペプチドと毒素ペプチドとが融合された、標的化された融合ペプチドに関する。融合ペプチドが、蚊によってのみ、該毒素の毒性を誘導する何らかの様式で取り込まれるかまたは結合されることが、標的化ペプチドによって確実となる。融合ペプチドが該様式で取り込まれるかまたは結合しない限り、毒素ペプチドに毒性はない。したがって、該ペプチドが蚊に対して標的化されることで、毒素の作用は蚊以外の昆虫に対しては示されない。該標的化された融合ペプチドは、殺蚊毒素としての適用のために、酵母または大腸菌を包含する任意の適当な生体において発現され、次いで抽出、単離または精製されうる。

いくつかの態様において、標的化された融合ペプチドを、蚊による摂取、蚊による消費、蚊への暴露、または蚊による取り込みを確実としうる様式で産生するように、植物を組換える。いくつかの態様において、蜜を分泌する植物を、標的化された融合ペプチドを蜜中に発現するように組換える。蜜は蚊の生活環において重要な成分であり、蚊を強力に誘引する。雄の蚊は、その生存を蜜または糖供給源に依存しており、雌の蚊は、吸血のための飛行のエネルギー源として蜜を必要とする。蜜を分泌しない植物も、標的化された融合ペプチドを発現するように組換えることができ、これは、該ペプチドが、該ペプチド毒素の蚊による消費または摂取を可能とする様式で発現される場合である。

本開示は、標的化された融合ペプチドを産生する組換え殺蚊植物にも関する。いくつかの好ましい態様において、植物は蜜を分泌する植物であるが、植物は木および低木を包含する任意の適当な植物でありうる。組換え殺蚊植物として遺伝子操作されうる好ましい蜜分泌植物は、よくあるガーデンインパチェンス植物を包含し、これは、雨の多い熱帯地域に広く見られる、手入れの必要なく成長する植物で、世界中でよく売れている市販の花卉でもある。インパチェンス（特にインパチェンス・ワレリアナ（Impatiens walleriana））は、蚊誘引性、蜜タンパク質産生量、および形質転換を施す対象としての能力において優れることが、研究により示されている。好ましい態様において、インパチェンス植物を、毒素を蜜においてのみ発現するように組換える。これにより、屋外栽培試験において、蚊を効果的に駆除することができ、ミツバチに対しては毒性は及ばない。該組換え植物は、農作物の植物ではなく、１つの害虫種に特異的であり、毒素の導入遺伝子を周囲の生態系に広める能力を持たないように遺伝子操作することが可能であることから、安全性のロールモデルとして役立つ。

好ましい態様において、標的化された毒素ペプチドを単離および精製のために発現させるため、または植物を組換え殺蚊植物に形質転換するために、外来遺伝子コンストラクトを用いる。該コンストラクトは好ましくは、異なる側面を含む。植物特異的プロモーター、例えばインパチェンス蜜のプロモーターが用いられる。該コンストラクトから殺蚊毒素ペプチドが発現される。毒素ペプチドとペプチド融合を形成しうる標的化ペプチドも発現され、これは好ましくは、腸上皮への結合のような特異的結合により、蚊を標的とするものである。標的化された毒素は、蚊に対して毒性であるが、非標的の昆虫種に対しては毒性ではない。これら特徴は、毒素ペプチドの殺蚊の側面を達成する。殺蚊蜜分泌植物は、安価であり、大規模化が容易であり、生態学的に安全であり、手入れの必要がほとんどまたは全くない。本技術は、同時に非常に広い地域にわたる蚊駆除を長年にわたり提供することができる。

図１は、標的化されていない増強緑色蛍光タンパク質（enhanced green fluorescent protein（ＥＧＦＰ））の大腸菌発現のためのコンストラクトを示す。 図２は、アエデス属（Aedes）に対し標的化されたＥＧＦＰの大腸菌発現のためのコンストラクトを示す。 図３は、標的化されたＥＧＦＰおよび標的化されていないＥＧＦＰを用いたアエデス・アエギプティ（Aedes aegypti）における蛍光アッセイの結果を示す。 図４は、標的化されていないＨｖ１ａ殺虫毒素の大腸菌発現のためのコンストラクトを示す。 図５は、アエデス属に対し標的化されたＨｖ１ａ殺虫毒素の大腸菌発現のためのコンストラクトを示す。 図６は、標的化された毒素および標的化されていない毒素の経口投与後の、アエデス・アエギプティの生存曲線の比較を示す。 図７は、アエデス属の蚊に対し標的化されたＥＧＦＰおよび標的化されていないＥＧＦＰを用いた、クレクス・キンケファシアタス（Culex quinquefasciatus）蚊における蛍光アッセイの結果を示す。 図８は、アエデス属に対し標的化された毒素および標的化されていない毒素の経口投与後の、クレクス・キンケファシアタスの生存曲線の比較を示す。

本開示は、蚊に対して毒性であるが、他の非標的の種に対しては毒性でない、標的化された毒素ペプチドに関する。本開示は、蚊に対して特異的な毒素をコードする外来遺伝子を発現させる殺蚊植物にも関する。

好ましい態様において、本発明の技術は、蚊に対し標的化された毒素に関する。該毒素は毒素ドメインに標的化ドメインが融合されたものからなる融合毒素ペプチドである。標的化ペプチドは、蚊との特異的な結合をもたらすが、これは例えば、毒性を誘導する様式で融合毒素ペプチドの蚊への結合を引き起こすことによる。好ましい態様において、標的化ペプチドは、特異的にある属または種の蚊を標的とする。疾患の媒介に大きく関わる蚊には、次の３つの種がある：黄熱、ジカ熱、チクングニア熱、デング熱および脳炎を媒介するアエデス・アエギプティ（Aedes aegypti）；マラリアを媒介するアノフェレス・ガンビエ（Anopheles gambiae）；ならびに、ウエストナイルウイルス、脳炎およびフィラリア症を媒介する、さまざまな種のクレクス（Culex）属。好ましい態様において、標的化ペプチドは、アエデス・アエギプティを標的とするよう設計される。デングウイルスの糖タンパク質のドメインIIIは、該ウイルスが蚊の腸上皮細胞にうまく侵入できるように、該ウイルス粒子の該細胞への結合を可能にする活性構造であることがわかっている（Hrobowski (2005) Virology Journal 2:49）。好ましい態様において、殺虫ペプチドをアエデス・アエギプティの腸に対し標的化するために、デングウイルス糖タンパク質のドメインIIIに由来するペプチドを用いる。融合毒素ペプチドを特異的に蚊の腸へ導く標的化タンパク質を用いることで、ミツバチおよび他の受粉媒介体に影響を及ぼすことなく蚊を殺す毒素を得ることができる。

さらなる好ましい態様において、標的化ペプチドは下記配列を有する：ＭＩＧＶＥＰＧＱＬＫＬＮＷＦＫＫ（配列番号１）。

さらなる好ましい態様において、標的化ドメインは、ジカまたはウエストナイルウイルスのドメインIIIの配列に由来しうる。標的化ドメインは、アエデス属の蚊に加えて、他の種の蚊、例えばさまざまな種のクレクス属を標的とするように設計しうる。適当な標的化ドメインは、それが、その由来するウイルスが蚊に特異的に結合するのを可能にするということにおいて、デングウイルス糖タンパク質のドメインIIIと同様に機能するものである。（１）植物において発現可能であり、（２）標的蚊への、毒性を誘導しうる部位（例えば腸）における特異的結合を促進し、非標的の種への結合はもたらさず、（３）選択されたペプチド毒素と融合ペプチドを形成することが可能である限り、任意の適当な標的化ペプチドを使用しうる。デング、ジカおよびウエストナイルウイルスはいずれもフラビウイルスであり、これら各ウイルスのドメインIIIに由来する配列は、本発明において標的化ペプチドとして有効に機能しうる。

殺蚊植物のさらなる好ましい態様において、毒素は、蚊に対し腸への結合によって毒性を示すものが選択される。他の昆虫種に対する毒性を全く持たない毒素を使用する必要はないことに注目すべきである。ペプチドが蚊以外の昆虫によってもインパチェンス蜜から摂取されるとしても、毒素の作用は、毒素に標的化ペプチドが連結されることで確実に、特異的に蚊に対してのみ示される。好ましい態様において、毒素ペプチドはＨｖ１ａクモ毒ペプチドである。この毒素ペプチドは、アブラムシに対して効果的に標的化されている。

さらなる好ましい態様において、毒素ペプチドは下記配列を有する：ＳＰＴＣＩＰＳＧＱＰＣＰＹＮＥＮＣＣＳＱＳＣＴＦＫＥＮＥＮＧＮＴＶＫＲＣＤ（配列番号２）。

さらなる好ましい態様では、蚊毒性に変換されうる、蜜中に天然に見られる抗菌ペプチドを包含する他の毒素を、融合ペプチドにおいて用いる。（１）植物において発現可能であり、（２）蚊に対して毒性であり、（３）選択された標的化ペプチドと融合ペプチドを形成することが可能である限り、任意の適当な毒素ペプチドを使用しうる。その例には、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）由来の、毒素Ｃｒｙ１１Ｂまたは任意の殺蚊Ｃｒｙ毒素が含まれる。これらは、特に蚊の幼虫に対する毒性が強い。他の適当な毒素の例には、抗菌ペプチドである、ラテロスポルリン（laterosporulin）（ブレビバチルス細菌由来のバクテリオシン）およびアンブリオンマ（Amblyomma）ディフェンシンペプチド−２（アンブリオンマ・ヘブレウム（Amblyomma hebraeum）ダニ由来のディフェンシン）がある。これらはいずれも、組換えタバコ植物においてよく発現される。

さらなる態様において、本発明の融合毒素ペプチドは、適当な毒素ペプチドに適当な標的化ペプチドが適当なリンカーを介して連結されたものからなる。さらなる好ましい態様において、配列番号１の標的化ペプチドおよび配列番号２の毒素ペプチドが、配列：ＧＧＳＧＧＧＳＧＧ（配列番号３）を有するリンカーを介して連結される。

好ましい態様は、融合毒素ペプチドそのもの、および融合毒素ペプチドを製造する方法に関し、該方法は例えば、該ペプチドを大腸菌または酵母において発現させ、次いで抽出、単離または精製して、殺蚊毒素として使用しうる形態とすることによる。蚊に摂取または消費されそうな殺蚊剤を製造するために、融合毒素ペプチドを、任意の適当な担体、例えば糖または蜜様物質と組み合わせうる。該融合毒素ペプチドは蚊に対し、標的化によって特異的であることから、該剤は非標的の種に対し毒性を示さない。

さらなる好ましい態様は、融合毒素ペプチドを、蚊による摂取または消費のために利用可能とする様式で、または蚊に対し取り込むよう暴露する他の様式で発現するように遺伝子操作された、組換え殺蚊植物に関する。蚊は本質的に蜜に強力に誘引されることから、いくつかの好ましい態様において、該組換え殺蚊植物は、蜜分泌植物である。

殺蚊蜜分泌植物の好ましい態様は、最も一般的なガーデンインパチェンス種である、東アフリカ原産のインパチェンス・ワレリアナを利用する。インパチェンスは世界中で最も一般的な花卉である。これは、安価であり、栽培が容易で、維持費がほとんどかからない。インパチェンスは、疾患を媒介するアエデス属（Aedes）およびアノフェレス属（Anopheles）の蚊の生息地域とかなり重なる、雨の多い熱帯地域中で、また、広く雨の多い温帯地域で、手入れしなくても（野性的に）成長できることが、最近の生態学的研究によって示された。インパチェンスの適応地域は、東アメリカ全域、広い範囲のラテンアメリカ、東南アジア、中国、インド、ヨーロッパ、および広い範囲のアフリカを含む。非降霜地域では常時栽培される。降霜地域では、年１回、春に植えられる。

さらに、インパチェンス・ワレリアナは蚊誘引性が高く、また、当業者は困難なく遺伝子操作することができる。インパチェンス・ワレリアナのゲノムは配列決定されている。最も高度に発現される蜜タンパク質（フィロプラニン（phylloplanin）アナログ）の発現を駆動するプロモーター（３ｋｂのＤＮＡ）が構築されており、好ましい態様において、インパチェンス・ワレリアナにおいて蚊に対し標的化された毒素ペプチドの発現を駆動するために用いられる。天然のインパチェンス抗菌ペプチドおよび殺虫ペプチドに対応する遺伝子が、ゲノム配列から単離されうる。それを、さらなる好ましい態様において、ほとんど全部が天然インパチェンスＤＮＡからなり最小限の異種ＤＮＡを含む遺伝子挿入カセットの使用により、蚊に対して標的化することができる。

本発明の組換え殺蚊植物は、生物学的に安全な組換えロールモデルとして特に位置付けられる。本技術は、ＥＰＡおよび公的に受け入れられ易い、いくつかの特徴を有する。第１に、本技術は、元に戻すことが可能である。遺伝子ドライブ計画の場合とは異なり、蚊の駆除は、植物を根こそぎにすることによっていつでも止めることが可能である。例として、インパチェンスは、持続する根茎または塊茎を形成しない。また、該技術は、局地的なものであり、予測可能なものである。駆除地域は、人が該植物を植える場所によって決定される。さらに、いくつかの好ましい植物、例えばインパチェンスは、挿し木によって、または種子から、商業的栽培が可能である。したがって、種子および花粉の毒素遺伝子除去技術（トランスジーンの生態系への放出を回避するため）が、商業的栽培を妨げることはない。また、非標的のミツバチまたは他の非標的の昆虫に対して毒性作用がないことが見込まれる。さらに、これは、医薬として適用されるので、食品ではない。該植物は、ＧＭＯ作物とは異なり、人間の食物連鎖の一部とはならない。また、該適用は、末端使用者により購入され導入される。食品が遠隔の農場で生産されるのとは異なり、本発明では末端使用者が本技術を所有するので、その採用が促進される。さらに、特に栽培植物は、居住地域における生活の一部として馴染んでおり、確立されている。本発明の技術は、蚊の駆除を「風景の一部」とする。

したがって、本発明の好ましい態様は、蜜中に殺蚊毒素を発現する殺蚊蜜分泌植物を包含する、殺蚊毒素を発現する組換え植物を製造する方法を含む。本発明の方法は、融合毒素ペプチドが植物によって本質的に発現され実際に現れるように、植物の細胞における融合毒素ペプチドをコードする外来遺伝子コンストラクトの発現を誘導することを含む。融合毒素ペプチドは、毒素ペプチドに蚊標的化ペプチドが融合されたものを含み、蚊に対して特異的に毒性を示す。さらなる好ましい態様において、植物はインパチェンス・ワレリアナである。さらなる好ましい態様において、蚊標的化ペプチドは、アエデス、アノフェレスまたはクレクス属の蚊の１つまたはそれ以上を標的とする。さらなる好ましい態様において、蚊標的化ペプチドは、例えばアエデス・アエギプティ（Aedes aegypti）蚊の腸上皮への結合により、アエデス・アエギプティ蚊を標的とする。さらなる好ましい態様において、毒素ペプチドは、蚊に対する毒性を有するペプチドであり、好ましくはＨｖ１ａクモ毒ペプチドでありうる。さらなる好ましい態様において、融合毒素ペプチドは他の生物に対し毒性を示さない。

本発明の好ましい態様では、植物に特異的なプロモーター、蚊標的化ペプチドをコードする遺伝子、および毒素ペプチドをコードする遺伝子を含む外来遺伝子コンストラクトを用いる。さらなる好ましい態様において、外来遺伝子コンストラクトの発現を植物において誘導するのに、植物の少なくとも１つの蜜産生細胞を外来遺伝子コンストラクトで形質転換して、融合毒素ペプチドを蜜中に発現する組換え植物を作製する。

さらなる好ましい態様は、毒素を蜜以外の組織においては発現しない組換え植物を作製することに関する。このような好ましい態様においては、組換え植物においてターミネーターカセットの発現をも誘導し、該ターミネーターカセットは、植物において蜜産生細胞以外の、例えば種子、花粉、根および葉の細胞に存在する核酸から、該外来遺伝子コンストラクトを排除する。したがって、該組換え植物は融合毒素ペプチドを蜜中に発現し、蜜以外の組織においては発現しない。

本発明のさらなる好ましい態様は、組換え殺蚊植物を包含し、ここで、組換え植物は、その細胞において、融合毒素ペプチドを蚊による消費、蚊への暴露、または広く蚊による取り込みのために利用可能とする様式で、融合毒素ペプチドをコードする外来遺伝子コンストラクトを発現させる。ここで、融合毒素ペプチドは、毒素ペプチドに蚊標的化ペプチドが融合されたものを含み、蚊に対し毒性である。さらなる好ましい態様において、植物は蜜産生植物であり、融合毒素ペプチドは植物の蜜中に発現される。さらなる好ましい態様において、組換え植物はインパチェンス・ワレリアナである。組換え植物のさらなる好ましい態様は、アエデス、アノフェレスまたはクレクス属の蚊、または好ましくはアエデス・アエギプティ（Aedes aegypti）蚊を標的とする融合毒素ペプチドの一部として、蚊標的化ペプチドを発現する。蚊標的化ペプチドは、好ましくはアエデス・アエギプティ蚊の腸上皮に結合しうる。好ましい態様においては通常、毒素ペプチドは、蚊に対する毒性を有するペプチドであり、好ましくは、毒素ペプチドはＨｖ１ａクモ毒ペプチドである。さらなる好ましい態様において、組換え殺蚊植物により発現される融合毒素ペプチドは、他の生物に対しては毒性を示さない。

さらなる好ましい態様は、組換え殺蚊植物の種子を含む。

本発明のさらなる好ましい態様は、組換え殺蚊インパチェンス・ワレリアナ植物を含み、ここで、該組換え植物は、
（ａ）該蜜産生植物の細胞において融合毒素ペプチドをコードする外来遺伝子コンストラクトを発現させ、ここで、該融合毒素ペプチドは、毒素ペプチドに蚊標的化ペプチドが融合されたものを含み、該蚊標的化ペプチドはアエデス・アエギプティ（Aedes aegypti）蚊の腸上皮に結合し、該毒素ペプチドはＨｖ１ａクモ毒ペプチドであり、かつ、
（ｂ）ターミネーターカセットを発現させ、ここで、該ターミネーターカセットは、該植物の蜜産生細胞以外の細胞中の核酸から、該外来遺伝子コンストラクトを排除し、該組換え植物は、蜜以外の組織においては該融合毒素ペプチドを発現しない。

過去の研究において、３７の種の植物が、蚊誘引性、蜜タンパク質産生量、および形質転換される能力について調べられた。それら候補の中で、一般的なガーデンインパチェンス植物（インパチェンス・ワレリアナ）がいずれの域においても優れていた（Chen and Kearney, Acta Tropica (2015) 146:1-88）。その後、蜜および蜜腺器官のプロテオームおよびトランスクリプトームが調べられ、蜜中に産生される主要なタンパク質が同定された。インパチェンスのゲノムからの対応する遺伝子がクローン化され、蜜中におけるペプチド毒素の発現のために用いられる対応するプロモーターが同定された。また、アラビドプシス（Arabidopsis）蜜腺プロモーターが、蜜中にマーカー遺伝子を発現する組換えインパチェンス植物の作製に使用された。このＧＵＳマーカー遺伝子は、アラビドプシス蜜腺特異的プロモーターを使って、インパチェンスにおいて発現された。このことは、該植物が異種タンパク質の蜜送達ベヒクルとして機能しうることを示している。インパチェンスからの蜜トランスクリプトームならびに葉および茎の対照トランスクリプトームが解析されている。

インパチェンス・ワレリアナのゲノムの配列決定および解析により、インパチェンス蜜プロモーターの単離が促進される。蜜腺、茎および葉組織からＲＮＡ−Ｓｅｑデータが、蜜タンパク質から質量分析データが得られている。高度に発現される蜜タンパク質のプロモーターが同定され、クローン化される。そのようなプロモーターは、組換えインパチェンスにおけるＲＦＰ蛍光マーカーの蜜発現について試験される。

異なる標的化ペプチドが、アエデス・アエギプティ（Aedes aegypti）腸上皮を包含する蚊の腸上皮への単純な結合について試験される。同定された標的ペプチドの１つは、デングウイルスの糖タンパク質のドメインIIIに由来するペプチドである。標的化ペプチド／ｅＧＦＰ融合体が大腸菌において産生され、該融合タンパク質が、摂取されるように、５％スクロースに懸濁される。給餌の後、蚊の腸が蛍光顕微鏡検査によって調べられる。最もよく結合する標的化ペプチドを用いて、標的化ペプチド／Ｈｖ１ａ殺虫ペプチド融合体を包含する標的化ペプチド／殺虫ペプチド融合体が作製される。融合ペプチドは、大腸菌において発現され、精製され、蚊に与えられて、アエデス・アエギプティ死亡率が調べられる。非標的に対して毒性が示されないことを示すために、非標的の生物、例えばミバエに対しても、同様の試験が行われる。

標的化融合ペプチドを発現する組換え植物は、根腐を起こすフザリウム属真菌およびアブラムシに対して特異的に抵抗性であることが示されている。Bonning et al. (2014) Nature Biotechnology 32(1):102においては、Ｈｖ１ａクモ毒ペプチドが植物ルテオウイルスのコートタンパク質に融合された。このウイルスはアブラムシの口針に、コートタンパク質を介して結合し、アブラムシに乗って植物から植物へと伝播する。Ｈｖ１ａペプチドはアブラムシに摂取されてもアブラムシに毒性を示さないが、ルテオウイルスコートタンパク質に融合されると非常に毒性となり、これは他の昆虫ではなくアブラムシに対してのみ特異的である。

最も強力な蜜プロモーターを用いて、さまざまな殺虫ペプチドがインパチェンス蜜内発現能について試験される。最高の腸標的化および殺虫配列を融合した遺伝子を大腸菌において発現させ、蚊に対して、摂取させることにより試験される。最高の融合コンストラクトが、インパチェンスに導入される。得られた植物は、インパチェンス組織培養において豊富に発生させた複数の芽のクラスターから増やされ、野外試験用のストックが準備される。非標的に対して毒性が無いことを示すために、ミツバチ、クサカゲロウ、テントウムシおよび１つのチョウ種を含む非標的に対する死滅アッセイが行われる。

屋外メソコスム試験による野外試験が行われる。いくつかの殺蚊蜜インパチェンスが競合ガーデン植物と混ぜられた混合種試験畑が、居住地域において８’×１０’メッシュケージ内に構成される。蚊が入れられ、死亡率が記録される。

本実施例では、デングウイルス糖タンパク質のドメインIII配列由来のペプチドを用いて、アエデス・アエギプティ（Aedes aegypti）蚊に対し標的化することを示す。該配列は、デングウイルスが蚊の腸壁に結合し、蚊の感染プロセスを開始することを可能にする。該糖タンパク質の活性部分をＥＧＦＰ蛍光タンパク質に融合し、その融合タンパク質（安定化タンパク質ＳＵＭＯを含む）を大腸菌において発現させた。次いで、精製したタンパク質を１０％スクロースに加え、腸において観察される蛍光が真に腸壁への安定な結合によるものであることが確認できるように、パルスチェイス様式で蚊に摂取させた。

ＮＥＢ（New England Biolabs, Ipswich, MA）のコンピテント大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）および１０−ｂｅｔａにおいて大腸菌発現させるために、LifeSensors（Malvern, PA）のpE-SUMOstarベクターを用いた。ＥＧＦＰ、デング／ＥＧＦＰ融合体、毒素Ｈｖ１ａ、およびデング／Ｈｖ１ａ融合体の配列を含む、大腸菌発現のためにコドン最適化されたgBlocksを、ＩＤＴ（Skokie, IL）から入手した。アエデス・アエギプティ（Aedes aegypti）蚊の卵およびクレクス・キンケファシアタス（Culex quinquefasciatus）の幼虫はいずれも、Benzon Research Inc.（Carlisle, PA）から入手した。

下記のものを大腸菌において発現させるために、他の点では同一の２つのコンストラクトを構築した：
１．ＥＧＦＰマーカー
２．標的化されたＥＧＦＰマーカー

これら各コンストラクトは、図１および図２に示される、ＳＵＭＯ安定化タンパク質にペイロードペプチドが融合されたものを含むＳＵＭＯベクターであった。発現は、ｌａｃオペレーター、Ｔ７プロモーターおよびＴ７ターミネーターによって調節した。６×Ｈｉｓタグを、下流の精製のために利用可能とした。ＫａｎＲおよびｌａｃＩを、クローン選択のために含めた。融合タンパク質のアエデス・アエギプティ腸壁への標的化のために、フラビウイルスＥタンパク質のドメインIIIのループ（配列番号１）を用いた。ＥＧＦＰは、蛍光マーカータンパク質遺伝子であった。ＳＵＭＯベクターは市販されており、ＥＧＦＰは標準的なマーカータンパク質である。

ＥＧＦＰ、デング／ＥＧＦＰ融合体、毒素Ｈｖ１ａ、およびデング／Ｈｖ１ａ融合体の配列用のgBlocksを構築した。デング標的化ドメインは、デングウイルスＥ糖タンパク質ドメインIIIの最後の４５ｂｐから採った。合成したgBlocks配列を、該配列をＭｆｅＩおよびＢａｍＨＩの各制限酵素部位で挟むよう設計された配列特異的なプライマーを用い、NEB Q5（登録商標）High-Fidelity DNA Polymeraseを用いて増幅した（NEB, PCR Using...(2018)）。ＰＣＲ増幅産物を１％アガロースゲル上で泳動させ、Promega Wizard（登録商標）SV Gel and PCR Clean-Up Systemを用いてゲル精製した（Promega, Madison, WI（2018)）。精製したＰＣＲ産物およびpE-SUMOstarベクターを、制限酵素ＭｆｅＩおよびＢａｍＨＩにより３７℃で１時間消化した。その後、消化産物を１％アガロースゲル上で泳動させ、Promega Wizard（登録商標）SV Gel and PCR Clean-Up Systemを用いてゲル精製した。NEB T4 DNAリガーゼを用いて、消化ＰＣＲ産物を消化pE-SUMOstarベクター中にライゲートした（NEB, Ligation Protocol...（2018)）。その組換えプラスミドをＮＥＢ １０−ｂｅｔａコンピテント大腸菌にエレクトロポレーションにより導入した後、形質転換されたコロニーを、ＬＢおよび５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む寒天プレート上で選択的に、３７℃で一晩増殖させた。前記のプライマーを用い、ＮＥＢ Ｔａｑポリメラーゼを用いて、陽性に形質転換されたコロニーを確認し、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む１０ｍｌのＬＢに接種し、３７℃の振盪器上で一晩増殖させた（NEB, PCR Protocol...(2018)）。このＬＢ培養物から、Promega Wizard（登録商標）Plus SV Minipreps DNA Purification Systemを用いて陽性組換えプラスミドを精製し、化学的コンピテント化ＮＥＢ ＢＬ２１大腸菌に導入した（Promega, Wizard（登録商標）Plus...(2018)）。

陽性ＢＬ２１形質転換体を、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む２０ｍｌの２×ＹＴ培地において、３７℃の振盪器上で一晩増殖させた。５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む５００ｍｌの２×ＹＴの二次培養に２０ｍｌの初代培養を接種し、ＯＤ６００が０．７となるまで３７℃で振盪（２２０ｒｐｍ）した。この培養物において、０．１ｍＭのＩＰＴＧを加え、１４℃で一晩振盪（１８０ｒｐｍ）することにより、タンパク質発現を誘導した。４℃において８０００×ｇで１時間遠心することによって、細胞を収集した。細胞を１×ＰＢＳに再懸濁し、０．１ｍｇ／ｍｌのリゾチームにより−２０℃で一晩溶解処理した。溶解処理した懸濁液を解凍し、プローブ型ソニケーターを４０％の振幅で用いて超音波処理した。超音波処理されたスラリーを、４℃において８００００×ｇで１時間遠心した。上清を採り、結合および洗浄緩衝液として１×ＰＢＳを、溶出緩衝液として５００ｍＭイミダゾール含有１×ＰＢＳを用いるニッケルカラムクロマトグラフィーにより精製した。精製したタンパク質を、イミダゾールの除去のために、１×ＰＢＳ中で、４℃で一晩透析した。精製したタンパク質を、１ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．２５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ、および０．０５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡと共に１８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に泳動させて、その存在を確認し、濃度をImageJを用いて決定した（Schneider (2012)）。

アエデス・アエギプティ（Ae. aegypti）の卵を、水道水１Ｌおよびフィッシュフードすり身（Tetramin（登録商標）, Tetra, Blacksburg, VA）の入ったプラスチック皿内で育てた。クレクス・キンケファシアタス（C. quinquefasciatus）幼虫は、着荷後すぐにプラスチック皿に入れ、肝粉末を補充したフィッシュフードすり身を与えた。すべてのコロニーを、２７±１℃、７０±５％ＲＨに保った。蚊が蛹期に達したら、成虫となった時に性別判別をし易いように、プラスチックチューブに移した。

各ＥＧＦＰペプチドを用いて、１０％スクロース溶液を調製した。１×ＰＢＳを用いて１０％スクロース溶液を調製して、緩衝液の陰性対照とした。蛍光タンパク質および対照の各スクロース溶液を、４ｍｌ容器内の綿球に適用し、各容器を個別の透明な蚊アッセイチャンバー内に置いた。各チャンバーに雄１０匹および雌１０匹のアエデス・アエギプティおよびクレクス・キンケファシアタス蚊の成虫を入れ、２７±１℃、７０±５％ＲＨに保った。２日後、蚊を１０％スクロースのみを入れたチャンバーに移した。さらに２日後、中腸を採った。実体顕微鏡Stereomicroscope SZX16を蛍光ユニットおよびＧＦＰフィルターと組み合わせて用いて（励起波長：４６０〜４９５ｎｍ、蛍光波長：５１０ｎｍ＋）、蛍光を可視化した。いずれのパルスチェイス実験も３連で行った。

図３に示されるように、ＥＧＦＰは、雄（左図）および雌（右図）のいずれのアエデス・アエギプティ蚊の腸壁に対しても効果的に標的化された。図３中の最下段の図は、デングペプチド標的化ＥＧＦＰは、標的化ＥＧＦＰ含有１０％スクロースを与えた２日間の「パルス」と、その後の、１０％スクロースのみを与えた２日間の「チェイス」の後に、腸壁に結合して留まったことを示している。図３中の中段の図は、陰性対照実験において、非標的化ＥＧＦＰは、１０％スクロースによるチェイスの後に、腸に留まらなかったことを示している。図３中の最上段の図に示されるように、ＰＢＳ緩衝液中に懸濁させた１０％スクロースを与え続けたヌル（null）対照実験においては、蛍光は観察されなかった。

本実施例は、特定の蚊種に特異的なウイルスに由来する宿主結合タンパク質の、該蚊種への標的化のための使用を示す。その結果は、デングウイルス糖タンパク質ドメインIII配列由来のペプチドを使用することにより、アエデス・アエギプティ（Aedes aetypti）蚊が標的化されて殺されることを示す。特に、Ｈｖ１ａ殺虫毒素のアエデス・アエギプティに対する本来弱い毒性が、デング由来標的化ペプチドとの融合によって大きく増強された。

本実施例において、以下のものを大腸菌において発現させるために、他の点では前記実施例２の２つのコンストラクトと同一である２つのコンストラクトを構築した：
１．Ｈｖ１ａ毒素
２．標的化されたＨｖ１ａ毒素

図４および図５に示されるこれらコンストラクトはそれぞれ、ＳＵＭＯ安定化タンパク質にペイロードペプチドが融合されたものを含むＳＵＭＯベクターであった。発現は、ｌａｃオペレーター、Ｔ７プロモーターおよびＴ７ターミネーターによって調節した。６×Ｈｉｓタグを、下流の精製のために利用可能とした。ＫａｎＲおよびｌａｃＩを、クローン選択のために含めた。融合タンパク質のアエデス・アエギプティ腸壁への標的化のために、フラビウイルスＥタンパク質ドメインIIIのループ（配列番号１）を含めた。「毒素」は、Ｈｖ１ａ毒素遺伝子（配列番号２）を指す。

各毒素を５００μｇ／ｍｌに希釈し、１０％スクロース溶液の調製に使用した。ここでも１×ＰＢＳを用いて、緩衝液の陰性対照１０％スクロース溶液を調製した。毒素および対照の各スクロース溶液を、前記のようにして蚊アッセイチャンバー内に配置した。各チャンバーに雄１０匹および雌１０匹のアエデス・アエギプティ（Ae. aegypti）およびクレクス・キンケファシアタス（C. quinquefasciatus）蚊の成虫を入れ、２７±１℃、７０±５％ＲＨに保った。Ｈｖ１ａ毒素、もしくはアエデスを標的とするデング由来ペプチドと融合させたＨｖ１ａ毒素を含む１０％スクロース溶液、またはタンパク質を加えていない１０％スクロース溶液（「緩衝液」）を、蚊に摂取させた。２４時間毎に３日間にわたり、死亡数を記録した。本実験は３連で行った。GraphPad Prism 7を使用して、記録したデータの有意性をログランク（マンテル-コックス）検定により解析し、データを、９５％信頼区間（ＣＩ）を示して生存曲線に表した。

アエデス・アエギプティ標的蚊に対する標的化毒素実験の結果を図６に示す。１０％スクロースのみを与えた蚊において死亡は見られず（「緩衝液」）、単独の毒素を含む１０％スクロースを与えた蚊集団においてはわずかな毒性が見られた。これに対し、デングウイルス由来標的化ペプチドを含むアエデス標的化毒素には、大幅に増強された毒性が認められた。バーは９５％信頼限界を示す。

本実施例は、本発明の標的化メカニズムの特異性が極めて高いことを示す。結果は、デングウイルスの宿主ではないクレクス・キンケファシアタス（Culex quinquefasciatus）蚊により摂取された場合、標的化された毒素は標的化されていない毒素と比較して、毒性が大きくないことを示す。言い換えれば、元の毒素の小さい毒性は、標的化ペプチドによって増強されない。

実施例３に記載されるようにして、同じコンストラクトを使用して、Ｈｖ１ａ毒素、もしくはアエデスを標的とするデング由来ペプチドと融合させたＨｖ１ａ毒素を含む１０％スクロース、またはタンパク質を加えていない１０％スクロース（「緩衝液」）を、クレクス・キンケファシアタス蚊の成虫に摂取させた。この蛍光試験の結果を図７に示す。アエデスに対して標的化されたＥＧＦＰは、雌雄いずれのクレクス・キンケファシアタス蚊の腸壁にも結合しなかった。図７中の最下段の図は、デングペプチド標的化ＥＧＦＰは、それを含む１０％スクロースを与えた２日間の「パルス」と、その後の、１０％スクロースのみを与えた２日間の「チェイス」の後に、腸壁に見られなかったことを示している。図７中の中段の図は、陰性対照実験において、標的化されていないＥＧＦＰは、１０％スクロースによるチェイスの後に、腸に留まらなかったことを示している。図７中の最上段の図は、ＰＢＳ緩衝液中に懸濁させた１０％スクロースを与え続けたヌル対照実験においては、蛍光が見られなかったことを示している。

図８は、アエデスに対して標的化された殺虫ペプチドを非標的のクレクス・キンケファシアタス蚊に与えた場合の生存率の結果を示す。死亡数を毎日カウントした。１０％スクロースのみ（「緩衝液」）、毒素を含む１０％スクロース（「毒素」）、またはデングウイルス由来標的化ペプチドを含むアエデスに対して標的化された毒素を含む１０％スクロース（「デング／毒素」）を与えた蚊の間に、有意な差は無かった。バーは９５％信頼限界を示す。

この結果は、標的化メカニズムが、属レベルでも、高度に特異的であることを示している。ハチおよび他の無関係の受粉媒介体に対する無毒性を検証する試験でも、上記のとおり、より厳しい、異なる蚊種間での試験において特異性が示されているのであるから、同様の結果が得られると考えらえる。

参考文献

以下の文献を引用により本書の一部とする：

Claims (44)

1. 融合毒素ペプチドを含む殺蚊毒素において、該融合毒素ペプチドは、毒素ペプチドに蚊標的化ペプチドが融合されたものを含み、該融合毒素ペプチドは蚊に対して毒性である、殺蚊毒素。
2. 蚊標的化ペプチドが、アエデス属（Aedes）、アノフェレス属（Anopheles）またはクレクス属（Culex）の蚊を標的とする、請求項１に記載の殺蚊毒素。
3. 蚊標的化ペプチドが、アエデス・アエギプティ（Aedes aegypti）蚊を標的とする、請求項１に記載の殺蚊毒素。
4. 蚊標的化ペプチドが、アエデス・アエギプティ蚊の腸上皮に結合する、請求項１に記載の殺蚊毒素。
5. 蚊標的化ペプチドが、フラビウイルスのドメインIIIに由来するペプチドである、請求項１に記載の殺蚊毒素。
6. 蚊標的化ペプチドが、デングウイルスの糖タンパク質のドメインIIIに由来するペプチドである、請求項１に記載の殺蚊毒素。
7. 毒素ペプチドが、蚊に対する毒性を有するペプチドである、請求項１に記載の殺蚊毒素。
8. 毒素ペプチドが、蚊標的化ペプチドと融合されていなければ蚊に対する毒性を示さないペプチドである、請求項１に記載の殺蚊毒素。
9. 毒素ペプチドが、Ｈｖ１ａクモ毒ペプチドである、請求項１に記載の殺蚊毒素。
10. 融合毒素ペプチドが、他の生物に対して毒性を示さない、請求項１に記載の殺蚊毒素。
11. 担体をさらに含む、請求項１に記載の殺蚊毒素。
12. 殺蚊毒素を発現する組換え植物を製造する方法において、
    該植物の標的細胞において、融合毒素ペプチドをコードする外来遺伝子コンストラクト発現させるよう誘導すること；ここで、該融合毒素ペプチドは、毒素ペプチドに蚊標的化ペプチドが融合されたものを含み、該融合毒素ペプチドは蚊に対して毒性である；および
    該融合毒素ペプチドを発現する組換え植物を製造すること
    を含む方法。
13. 植物が蜜分泌植物であり、植物の標的細胞が蜜産生細胞であり、組換え植物は融合毒素ペプチドを該植物の蜜中に発現する、請求項１２に記載の方法。
14. 植物がインパチェンス・ワレリアナ（Impatiens walleriana）である、請求項１３に記載の方法。
15. 蚊標的化ペプチドが、アエデス属、アノフェレス属またはクレクス属の蚊を標的とする、請求項１２に記載の方法。
16. 蚊標的化ペプチドが、アエデス・アエギプティ蚊を標的とする、請求項１２に記載の方法。
17. 蚊標的化ペプチドが、アエデス・アエギプティ蚊の腸上皮に結合する、請求項１２に記載の方法。
18. 蚊標的化ペプチドが、フラビウイルスのドメインIIIに由来するペプチドである、請求項１２に記載の方法。
19. 蚊標的化ペプチドが、デングウイルスの糖タンパク質のドメインIIIに由来するペプチドである、請求項１２に記載の方法。
20. 毒素ペプチドが、蚊に対する毒性を有するペプチドである、請求項１２に記載の方法。
21. 毒素ペプチドが、蚊標的化ペプチドと融合されていなければ蚊に対する毒性を示さないペプチドである、請求項１２に記載の方法。
22. 毒素ペプチドが、Ｈｖ１ａクモ毒ペプチドである、請求項１２に記載の方法。
23. 融合毒素ペプチドが、他の生物に対して毒性を示さない、請求項１２に記載の方法。
24. 外来遺伝子コンストラクトが、該植物に特異的なプロモーター、蚊標的化ペプチドをコードする遺伝子、および毒素ペプチドをコードする遺伝子を含む、請求項１２に記載の方法。
25. 外来遺伝子コンストラクトを発現させるよう誘導するステップが、該植物の少なくとも１つの細胞を該外来遺伝子コンストラクトで、融合毒素ペプチドを発現する組換え植物を生じるように形質転換することを含む、請求項１２に記載の方法。
26. 請求項１２に記載の方法により製造される組換え植物。
    
27. その蜜中に殺蚊毒素を発現する組換え植物を製造する方法において、
    蜜を産生する該植物の細胞において、融合毒素ペプチドをコードする外来遺伝子コンストラクトを発現させるよう誘導すること；ここで、該融合毒素ペプチドは、毒素ペプチドに蚊標的化ペプチドが融合されたものを含み、該蚊標的化ペプチドが、デングウイルスの糖タンパク質のドメインIIIに由来するペプチドであり、該毒素ペプチドが、Ｈｖ１ａクモ毒ペプチドであり、該植物がインパチェンス・ワレリアナである；および
    蜜中に該融合毒素ペプチドを発現し、蜜以外の組織においては該融合毒素ペプチドを発現しない組換え植物を製造すること
    を含む方法。
28. 請求項２７に記載の方法により製造される組換え植物。
29. 組換え殺蚊植物において、該組換え植物は、該植物の標的細胞において、融合毒素ペプチドをコードする外来遺伝子コンストラクトを発現させ、該融合毒素ペプチドは、毒素ペプチドに蚊標的化ペプチドが融合されたものを含み、該融合毒素ペプチドは蚊に対して毒性である、組換え殺蚊植物。
30. 植物が蜜分泌植物であり、植物の標的細胞が蜜産生細胞であり、組換え殺蚊植物は融合毒素ペプチドを該植物の蜜中に発現する、請求項２９に記載の組換え殺蚊植物。
31. 植物がインパチェンス・ワレリアナである、請求項３０に記載の組換え殺蚊植物。
32. 蚊標的化ペプチドが、アエデス属、アノフェレス属またはクレクス属の蚊を標的とする、請求項２９に記載の組換え殺蚊植物。
33. 蚊標的化ペプチドが、アエデス・アエギプティ蚊を標的とする、請求項２９に記載の組換え殺蚊植物。
34. 蚊標的化ペプチドが、アエデス・アエギプティ蚊の腸上皮に結合する、請求項２９に記載の組換え殺蚊植物
35. 蚊標的化ペプチドが、フラビウイルスのドメインIIIに由来するペプチドである、請求項２９に記載の組換え殺蚊植物。
36. 蚊標的化ペプチドが、デングウイルスの糖タンパク質のドメインIIIに由来するペプチドである、請求項２９に記載の組換え殺蚊植物。
37. 毒素ペプチドが、蚊に対する毒性を有するペプチドである、請求項２９に記載の組換え殺蚊植物。
38. 毒素ペプチドが、蚊標的化ペプチドと融合されていなければ蚊に対する毒性を示さないペプチドである、請求項２９に記載の組換え殺蚊植物。
39. 毒素ペプチドが、Ｈｖ１ａクモ毒ペプチドである、請求項２９に記載の組換え殺蚊植物。
40. 融合毒素ペプチドが、他の生物に対して毒性を示さない、請求項２９に記載の組換え殺蚊植物。
41. 外来遺伝子コンストラクトが、該植物の蜜に特異的なプロモーター、蚊標的化ペプチドをコードする遺伝子、および毒素ペプチドをコードする遺伝子を含む、請求項２９に記載の組換え殺蚊植物。
42. 請求項２９に記載の組換え植物の種子。
43. 組換え殺蚊インパチェンス・ワレリアナ植物において、該組換え植物は、蜜を産生する該植物の細胞において、融合毒素ペプチドをコードする外来遺伝子コンストラクトを発現させ、該融合毒素ペプチドは、毒素ペプチドに蚊標的化ペプチドが融合されたものを含み、該蚊標的化ペプチドは蚊の腸上皮に結合し、該毒素ペプチドはＨｖ１ａクモ毒ペプチドであり、該組換え植物は、蜜以外の組織においては該融合毒素ペプチドを発現しない、組換え殺蚊インパチェンス・ワレリアナ植物。
44. 組換え殺蚊インパチェンス・ワレリアナ植物において、該組換え植物は、蜜を産生する該植物の細胞において、融合毒素ペプチドをコードする外来遺伝子コンストラクトを発現させ、該融合毒素ペプチドは、毒素ペプチドに蚊標的化ペプチドが融合されたものを含み、該蚊標的化ペプチドはデングウイルスの糖タンパク質のドメインIIIに由来するペプチドであり、該毒素ペプチドはＨｖ１ａクモ毒ペプチドであり、該組換え植物は、蜜以外の組織においては該融合毒素ペプチドを発現しない、組換え殺蚊インパチェンス・ワレリアナ植物。

Images